CN1865959A - 一种电极阵列微芯片传感器、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及电极阵列微芯片传感器领域。具体的说，本发明设计了一种集成三电极体系的多通道阵列微芯片传感器，它由电极阵列微芯片和检测池组成；电极阵列微芯片是由工作电极阵列、对电极及参比电极组成。本发明首次实现了集成化多通道电极阵列芯片传感器的微型化，微芯片表面所形成的电解池体积不大于50微升，微型化的实现增加了检测灵敏度、准确性和检测速度；同时降低生产成本和检测成本。本发明可以应用于化工、生物、医药、环保等行业的样品检测分析，具有高通量、高灵敏度和低检测限等诸多优点。

Description

一种电极阵列微芯片传感器、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及电极阵列微芯片传感器领域。具体的说，本发明设计了一种集成三电极体系的多通道阵列微芯片传感器。本发明还提供了该微芯片传感器的制备方法与应用。

背景技术

微型化、集成化、智能化与高通量已成为生物/化学分析领域的重要研究方向。他们以其鲜明的优点已经在疾病诊断与预测、药物筛选、基因表达谱分析、新基因的发现、基因突变检测及基因测序等领域获得了引人注目的成就，包括从学术研究到商业应用等领域都得到了全方位的发展。将分析检测***微型化后集成到一块微小芯片上，可以实现样品需要量少、检测时间短、灵敏度高、检测下限低、多通道、高通量检测等诸多特点。这种分析芯片在微小空间内可集成了大量的测试单元，将微芯片与相关的测试技术及数据处理软件相结合，将可进一步实现原位、在线的微全分析***，给传统生物分析和临床检测带来根本变革。

MEMS(微电子机械加工技术)在制作不同的微型化分析装置方面扮演了一个重要的角色。MEMS工艺加工的阵列电极芯片被广泛应用于电化学生物传感器、电子舌或电子鼻、毛细管电泳及高效液相色谱的检测器等等。特别是阵列蛋白质芯片与电化学检测技术相结合在检测疾病相关标志物方面有重要的潜能。

综合专利检索及文献查新，现在大部分的多通道电化学阵列芯片只是工作电极阵列的形式，很少有集成三电极体系的。以“electrodes array”问关键词对美国专利进行检索，查到7篇相关专利。其中专利(860329，Electrochemicalsensor/detector system and method和576289，Electrochemical sensor/detector systemand method)分别提出了一种基于微电极阵列的电化学检测***；专利(869102，Electrode array for development and testing of materials和681285，Method of usingan array of electrodes for high throughput development and testing of materials)分别介绍了一种用于原材料检测的电极阵列；专利(485201，Sensor array for detectingelectrical characteristics of fluids)公开了一种用于检测流体导电特征分布的传感器阵列；上述专利只是实现了检测体系的多通道，并未实现工作电极阵列与参比电极及对电极的集成。而在专利(492369，Unitary multiple electrode sensor和541566，Unitary multiple electrode sensor)中则分别公开了一种用于检测血液、血液组分样品或其它测试样品分析的多电极传感器，然而其中单通道的三电极体系是孤立分布在不同的样品井中的，还不具备多通道传感器的特征。

以“电极阵列”或“电极芯片”为关键词对中国专利进行检索，共检索到6篇相关专利。其中专利(01136952，电极阵列型基因芯片及其制作方法)公开了一种电极阵列型基因芯片及其制作方法，属于生命科学领域，涉及一种具有对基因进行检测、识别、鉴定、诊断功能的器件。该基因芯片选用金丝或表面镀金的金属丝作为电极，电极排成阵列并固定在芯片基底上，电极的一端用作探针的探头，部分或全部探头表面生长并固化有探测基因，电极的另一端用作引脚；专利(03129410，微电极阵列芯片传感器)提供了一种硅基表面的微电极阵列芯片传感器，该微电极阵列由叉指状微电极组成；专利(03159801，多电极阵列及其制造方法和03252672，一种多电极阵列)涉及多电极阵列技术，特别是一种多电极阵列结构。该多电极阵列由微孔阵列、单电极和固定树脂组成，其单电极为直角形，置于微孔阵列的垂直孔中，单电极的尾部较头部长，水平延伸，单电极的头部呈尖状，伸出微孔阵列的垂直孔，在单电极的部分水平尾部与微孔阵列的上表面上方有固定树脂；专利(98811070，毫微电极阵列和200530002301，电极阵列传感器)所述的电极阵列传感器也都仅仅是工作电极的阵列化，并未实现与参比电极及对电极的集成化。另外，据文献追新检索，目前只有美国Michael S.Wilson小组于2006年4月(Michael S.Wilson and Weiyan Nie，Analytical Chemistry2006，78(8)，2507-2513)提出过基于玻璃基底集成三电极体系的免疫蛋白质芯片。但是，此处免疫蛋白质芯片的电解池是通过粘合硅垫圈粘结聚碳酸酯井形成的，体积(0.5-1.5mL)比较大，同时又由于未在玻璃基底表面实现微加工，因此并未实现整个检测体系的微型化。

目前，蛋白质免疫微芯片的检测方法主要还是放射免疫、酶连免疫或化学发光检测，这几种方法都需对反应物先行进行标记，然后才能进行免疫反应的检测。而标记过程的存在极易给检测体系带来干扰，使体系目标物的测定准确性产生误差，产生的干扰信号还会影响测定的特异性；并且标记过程的存在还进一步增加了检测成本。

从以上分析可以看出，现阶段电化学免疫蛋白质芯片虽然已经突破了单通道的局限，但在集成化与微型化方面仍有待进一步发展，使电化学检测在免疫蛋白质芯片中的优势得到充分发挥。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种电极阵列微芯片传感器，以期实现检测体系的微型化、集成化与智能化。

本发明的另一个目的是提供了上述微芯片传感器的制备方法。

本发明的另一个目的是提供了上述微芯片传感器的应用，即将微芯片传感器与控制仪器相连，通过一定的操作，实现对环境样品的分析检测。

本发明提供了一种电极阵列微芯片传感器，它由电极阵列微芯片和检测池组成，电极阵列微芯片是由工作电极阵列、对电极及参比电极组成，工作电极阵列相对平行，阵列中间是对电极，对电极中间是参比电极，工作电极与多通道一一相应，电极的引线引出端分别位于微芯片的四边，密封电极引线后形成的检测池位于微芯片表面。

本发明的电极阵列微芯片中，工作电极是圆盘电极，分为两组，呈轴对称平行分布在芯片两侧；对电极及参比电极亦呈轴对称，分别独立分布在微芯片内侧。

本发明中，工作电极的数量可根据实际需要而定，例如为2-10对。

本发明中，作为电极阵列微芯片的基质材料可以是硅、普通玻璃、优质石英以及有机聚合物材料等。在本发明的一个实施例中，采用单晶硅片作为基质。

本发明中，电极阵列微芯片及各电极的尺寸、工作电极的数量均可根据集成度及实际需要确定。在本发明的一个实施例中，制备了一种集成工作电极阵列、对电极及参比电极的电极阵列硅微芯片，工作电极阵列通道数为6通道。

本发明中，电极阵列微芯片与外接控制设备之间通过引线和电极连接。该阵列电极微芯片的电极可采用各种金属材料制成。在本发明的一个实施例中采用钛金材料制作工作电极与对电极，采用钛镍银材料制作参比电极基底。引线的引入是利用压片技术将微芯片压制到一个设计好的管芯中，从而引出导线。

本发明的电极阵列微芯片中，电极阵列微芯片表面所形成的电解池容积大小为10-50微升。

本发明的电极阵列微芯片中，圆盘工作电极直径为0.2-2毫米，对电极与参比电极的宽度为0.1-0.5毫米。各电极之间的距离为0.1-1毫米。

本发明的电极阵列微芯片中，各电极与基质材料边缘的距离为0.5-2毫米。

另一方面，本发明提供了上述电极阵列微芯片传感器的制备方法，它包括以下步骤：

1.对基质进行第一次光刻，用脱膜(lift-off)工艺制作工作电极及对电极；

2.对基质进行第二次光刻，用脱膜工艺制作参比电极基底；

3.对基质划片，然后将单片微芯片压片、引线并封装；

4.参比电极制作。

如前所述，作为电极阵列微芯片的基质材料可以是硅、普通玻璃、优质石英以及有机聚合物材料等。在本发明的一个实施例中，采用单晶硅片作为基质。

在单晶硅片上制作电极的方法也有很多，在本发明的一个实施例中，采用蒸镀的方法。在蒸镀之前，要先设计制作相应的掩膜。根据实验要求及单晶硅尺寸进行芯片图形设计，然后将设计好的图形分别制作成掩膜板。

上述电极阵列微芯片传感器的制备方法可按如下步骤具体操作：

1.单晶硅片的预处理

(1)清洗直径2.5-7.5英寸的单晶硅片表面进行清洗。

(2)氧化生成SiO₂绝缘基底：氧化炉内，氧气存在，300-800℃条件下，单晶硅表面热氧化生成一层约200-700纳米厚的SiO₂薄层。

2.电极制作

(1)工作电极及对电极的制作使用光刻机进行第一次光刻(版图去掉银后剩下的图形)；蒸发台下依次蒸发Cr或Ti5-20纳米，金200-600纳米，lift-off，制作出金工作电极阵列及对电极。

(2)参比电极基底的制作第二次光刻(银的图形)；依次蒸发Cr5-20纳米，Ni5-20纳米，Ag300-700纳米，lift-off，制作出银基底电极。

3.使用划片机对前述单晶硅片进行划片，然后将单片微芯片室温下(25±2℃)通过504万能胶黏合到陶瓷底座上，手动引线仪引线，利用硅橡胶黏合剂室温下进行微芯片的封装。硅橡胶黏合剂固化后，微芯片表面即形成10-50微升的电解池。

4.参比电极制作微芯片表面所形成电解池内加入10-50微升的5-50毫摩尔浓度的氯化钾溶液，以芯片表面银作为工作电极，外接铂丝对电极及银、氯化银丝参比电极，0.05-0.5V(相对于银/氯化银丝电极)下氧化50-300秒(上海辰华仪器公司CHI1030电化学工作站)。

本发明还提供了上述电极阵列微芯片传感器的应用。即将传感器与控制设备相连接，对加入微芯片表面电解池内不同的电解质或样品分别进行分析、检测。

临床免疫学检测是指根据抗原、抗体特异性反应的原理，利用已知的抗体去检测相应的疾病标志物抗原，通过检测结果给临床诊断提供依据。临床免疫学检测自提出到被广泛应用经过了长期而又扎实的发展，以我国为例，我国临床免疫学检测基本经历了放射免疫检测(兴起于20世纪70年代)；酶联免疫检测(兴起于20世纪80年代)；以化学发光为代表的光生物学标记免疫检测技术(20世纪90年代开始推广使用)三个阶段。上述三种免疫检测方法在目前医疗市场上并存。令人遗憾的是，目前医院采用的大部分为昂贵的进口设备。经综合分析，以上三种免疫检测方法有以下问题需要解决：操作复杂，检测时间长；仪器设备昂贵，检测成本较高；方法的准确性有待提高，存在假“阳性”；单指标检测，无法做到多种相关疾病标志物同时检测的要求；样品需要量大，加重病人痛苦。本发明的应用之一就是侧重于解决现阶段临床免疫分析所存在的上述问题。

将电极阵列微芯片与CHI1030电化学工作站相连，首先加入聚合单体及待共聚抗体，一定电化学条件下，生成抗体-聚合物膜。然后利用这层抗体-聚合物膜去特异性的检测样品中相对应的抗原。其原理是抗体可以以物理包埋及氢键等作用力方式与电化学高分子聚合物共聚生成抗体-聚合物膜。然后利用抗原-抗体的特异性反应达到利用抗体-聚合物膜去检测样品中相对应的抗原的目的。

具体操作步骤如下：

首先，生成抗体-聚合物膜。在电极阵列微芯片表面所形成的电解池内加入10-50微升的聚合单体-抗体溶液，将电极阵列微芯片的各引线连接到多通道电化学工作站的对应的工作电极、对电极及参比电极连线端口。一定的电化学条件下生成抗体-聚合物膜。

通过更换前述聚合单体溶液及改变其中所含抗体的种类，可以在同一微芯片传感器的不同的电极位置固定上不同的抗体，从而制备出多通道的免疫微芯片传感器。

其次，消除所生成的抗体-聚合物膜的非特异性吸附。在已生成抗体-聚合物膜的微芯片传感器表面的电解池内加入合适的溶液与抗体-聚合物膜一定温度下作用一段时间。

最后，样品的检测。将待测样品加入到已消除非特异性吸附的微芯片传感器表面所形成的电解池内。通过选定的电化学手段对样品进行检测分析。

在本发明中，通过MEMS工艺加工的电极阵列微芯片首次实现了集成化多通道电极阵列芯片传感器的微型化，微芯片表面所形成的电解池体积不大于50微升，微型化的实现同时增加了检测灵敏度和检测速度；并且由于MEMS工艺可以实现大批量生产并且生产过程具高度重现性，从而使得阵列电极微芯片传感器在制作成本大大降低的同时，给实际样品的检测提供了可能。在本发明所提供的电极阵列微芯片传感器的应用中，通过无标记电化学检测实现了多通道免疫蛋白质芯片对实际血清样品的检测，从而避免了标记免疫检测方法存在的前述问题，进一步提高了免疫检测的灵敏度和准确性，同时降低了检测下限。

本发明充分发挥了集成式多通道电极阵列微芯片的优势，真正实现了检测体系的微型化、集成化与智能化。本发明的电极阵列微芯片传感器除了可以应用于临床免疫分析，还可应用于分析检测化工、生物、医药、环保等行业的样品，具有高通量、高灵敏度和低检测限等诸多优点。另外，本发明可以实现工业化批量化生产，相对现有的检测技术大大降低了检测成本。因此，本发明在临床免疫分析及环境样品检测等领域将有非常广阔的应用前景。

附图说明

图1为阵列电极微芯片的设计图。其中1为单晶硅片的SiO₂绝缘基底，2为圆盘工作电极，3为参比电极，4为对电极，5为工作电极引线引出端，6为参比电极引线引出端，7为对电极引线引出端。圆盘工作电极直径为0.2-2毫米，对电极与参比电极的宽度为0.1-0.5毫米。各电极之间的距离为0.1-1毫米，各电极与基质材料边缘的距离为0.5-2毫米。

图2为封装后的芯片示意图。其中1为单晶硅片的SiO₂绝缘基底，2为圆盘工作电极，3为参比电极，4为对电极，5为工作电极引线引出端，6为参比电极引线引出端，7为对电极引线引出端，8为陶瓷底座。

图3为封装后的芯片横截面示意图。其中8为陶瓷底座，9为封装后在芯片表面形成的检测池。电极阵列微芯片传感器表面所形成的电解池大小为10-50微升。

具体实施方式

实施例1电极阵列微芯片传感器的制作

1.单晶硅片的预处理

(1)清洗直径2.5-7.5英寸的单晶硅片表面先按照以下过程进行清洗，。1#液(NH₃∶H₂O₂∶H₂O＝1∶2∶7)煮沸10分钟，去离子水冲洗15min；再用2#液(HCl∶H₂O₂∶H₂O＝1∶2∶7)煮沸10分钟，去离子水冲洗15分钟，红外灯下烘干。

(2)氧化生成SiO₂绝缘基底：国产氧化炉内，氧气存在，500℃条件下热氧化生成一层约500纳米厚的SiO₂薄层。

2.电极制作

(1)工作电极及对电极的制作使用德国卡尔休斯光刻机进行第一次光刻(版图去掉银后剩下的图形)；国产蒸发台下依次蒸发Cr或Ti10纳米，金400纳米，lift-off，制作出金工作电极阵列及对电极。其中，圆盘工作电极直径为1毫米，对电极宽度为200微米，各电极间距离为200微米。

(2)参比电极基底的制作第二次光刻(银的图形)；依次蒸发Cr10纳米，Ni10纳米，Ag500纳米，lift-off，制作出银基底电极。其中，银电极宽度为200-400微米。

3.使用国产划片机对前述单晶硅片进行划片，然后将单片微芯片室温下通过504万能胶黏合到陶瓷底座上，国产手动引线仪引线，利用硅橡胶黏合剂室温下进行微芯片封装。硅橡胶黏合剂固化后，微芯片表面即形成10-50微升的电解池。

4.参比电极制作微芯片传感器表面电解池内加入50微升的10毫摩尔浓度的氯化钾溶液，以芯片表面银作为工作电极，外接铂丝对电极及银、氯化银丝参比电极，0.1V(相对于银/氯化银丝电极)下氧化120秒(CHI1030电化学工作站)。

实施例2用于人血清样品中多种疾病标志物的高通量检测

1.多通道电极阵列微芯片传感器的制作

参照实施案例1的方法制作6通道的电极阵列微芯片传感器。

2.抗体-聚合物膜的生成

在微芯片传感器表面所形成的电解池内加入50微升的10毫摩尔浓度的pH7.0磷酸缓冲溶液，其中含10毫摩尔浓度的邻苯二胺聚合单体及3微克/毫升的待共聚抗体。将电极阵列微芯片传感器的各引线连接到多通道电化学工作站的对应的工作电极、对电极及参比电极连线端口。室温下利用循环伏安法(CV)生成抗体-聚合物膜。实验条件如下：扫描范围(0-0.8V)，扫描速度(100毫伏/秒)，扫描圈数(2圈)。

通过微芯片传感器表面冲洗(10毫摩尔浓度的pH7.0磷酸缓冲溶液冲洗3次)、更换前述待聚合溶液(改变所含抗体的种类)及仪器控制，可以在同一微芯片传感器的不同的电极位置固定上不同的抗体，从而制备出多通道的免疫微芯片传感器。其中前述所共聚的抗体分别有透明质酸结合蛋白、层粘连蛋白抗体及IV型胶原抗体。

所生成的抗体-聚合物膜为CV，电化学交流阻抗谱，扫描电镜，共聚焦荧光显微镜等表征手段所证实。

3.抗体-聚合物膜表面非特异性的消除

在已生成抗体-聚合物膜的微芯片传感器表面的电解池内加入10纳克/毫升的牛血清白蛋白溶液或稀释100倍的正常人学清，与微芯片传感器表面的抗体-聚合物膜在室温下(25度左右)作用30分钟。随后微芯片传感器表面以10毫摩尔浓度的pH7.0磷酸缓冲溶液冲洗3次。通过上述操作，即可有效消除抗体-聚合物膜的非特异性吸附问题。

该结果为CV所证实。

4.样品的检测

在已消除非特异性吸附的微芯片传感器表面加入50微升的1毫摩尔浓度的二茂铁甲醇探针溶液(内含10毫摩尔浓度pH7.0磷酸缓冲液)，CV法测定各电极的原始响应。实验参数如下，扫描范围：-0.3至0.5伏；扫描速度：100毫伏/秒；扫描圈数：1。随后在探针溶液中加入0.5-1微升待测样品，室温下(25度左右)作用30分钟，再测定各电极的响应。线性工作曲线通过线性标准加入法获得，实际样品的浓度可通过标准加入法或直接在工作曲线上拟合得到。测定结果表明，利用多通道电极阵列微芯片传感器，对标准混合抗原溶液(3种肝纤维化标志物：透明质酸，IV-C胶原，层粘连蛋白)的相对标准误差为0-13.6％；对实际血清样品，与利用放免法所得到的结果对照，相对标准偏差为0-19.6％。对同一样品连续测定5次，相对标准偏差为2.13％。利用多通道阵列电极微芯片传感器对3种肝纤维化标志物：透明质酸，IV-C胶原，层粘连蛋白的检测下限分别为1纳克/毫升，0.5纳克/毫升和1纳克/毫升。

以上结果表明，本发明所研制的集成三电极体系的阵列电极微芯片传感器可以成功的应用于实际样品的高效、快速检测。

Claims (10)

1.一种电极阵列微芯片传感器，其特征在于，它由电极阵列微芯片和检测池组成，电极阵列微芯片是由工作电极阵列、对电极及参比电极组成，工作电极阵列相对平行，阵列中间是对电极，对电极中间是参比电极，工作电极与多通道一一相应，电极的引线引出端分别位于微芯片的四边，密封电极引线后形成的检测池位于微芯片表面。

2.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，工作电极是圆盘电极，分为两组，呈轴对称平行分布在芯片两侧；对电极及参比电极亦呈轴对称，分别独立分布在微芯片内侧。

3.如权利要求2所述的传感器，其特征在于，圆盘工作电极直径为0.2-2毫米。

4.如权利要求2所述的传感器，其特征在于，工作电极为2-10对。

5.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，作为电极阵列微芯片的基质材料是硅、普通玻璃、优质石英或者有机聚合物材料。

6.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，对电极与参比电极的宽度为0.1-0.5毫米。

7.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，电极阵列微芯片表面所形成的检测池容积大小为10-50微升。

8.如权利要求1所述的传感器，其特征在于，各电极之间的距离为0.1-1毫米。

9.如权利要求1所述传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1)对基质进行第一次光刻，用脱膜工艺制作工作电极及对电极；

(2)对基质进行第二次光刻，用脱膜工艺制作参比电极基底；

(3)对基质划片，然后将单片微芯片压片、引线并封装；

(4)参比电极制作。

10.如权利要求1所述传感器的应用，其特征在于，将传感器与控制设备相连接，对加入微芯片表面检测池内的电解质或样品进行分析、检测。

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