CN1864706A - 苦碟子注射液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种苦碟子注射液及其制备方法，属于药物制剂领域。本发明的苦碟子注射液采用菊科药材抱茎苦荬菜，经提取、纯化等处理过程，再加入适量的辅料制成的适宜人体使用的供静脉滴注用的注射液。本发明的制备方法更有效地保留了原药材中的有效成分，并尽量减少了非有效成分的含量，改传统的水提醇沉工艺为乙醇热回流，保留原有的酸沉工艺，去除了对环境污染较大的氧化钙沉淀法，采用大孔吸附树脂层析的纯化方法，提高了药品纯度，采用选择性更强，更能减少有效成分损失的超滤方法，保证了药品的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及一种苦碟子注射液及其制备方法，属于药物制剂领域。
背景技术
苦碟子为菊科苦荬菜属抱茎苦荬菜IXERIS SONCHIFOLIA(BGE.)HANCE植物的全草，春季开花时采收，洗净泥土，晒干，即得。长20～60cm，根茎粗短，根长圆锥形，有分枝，棕黄色。茎、枝圆柱形，表面光滑，呈淡灰绿色或淡黄棕色，茎下部表面常为红紫色，折断面中央具白色疏松的髓，基生叶数枚，大多卷曲，破碎，完整者展平后呈矩圆形，长3.5～8cm，先端急尖或钝圆，基部下延成柄，边缘具锯齿或不整齐的羽状深裂，上表面灰绿色，下表面色较浅；茎生叶互生，较小，卵状矩圆形，长2.5～6cm，宽0.7～1.5cm先端渐尖，长尾状，基部耳状抱茎，全缘或羽状***，头状花序多数，排列成伞房状圆锥花序；总苞圆筒形；总苞片2层，外层5枚，极小，卵状椭圆形，长约1mm，内层8枚，披针形，长5～7cm；舌状花黄色，先端截形，5齿裂，瘦果黑色，纺锤形，长2～3mm，10条纵肋，沿肋具短刺；冠毛白色。
国家药品监督管理局标准WS-10354(ZD-0354)-2002公开了苦碟子注射液的制法，该制法使用氧化钙沉淀法，对环境污染较大，其活性炭除细菌内毒素及脱色的工艺，选择性较差，产品纯度低，有效成分损失大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种苦碟子注射液，该产品采用菊科药材抱茎苦荬菜，经提取、纯化等处理过程，再加入适量的辅料制成的适宜人体使用的供静脉滴注用的注射液。
本发明的另一目的在于提供上述苦碟子注射液的制备方法。
本发明所述的方法为：
A.取苦碟子药材，洗净加40-70％乙醇13-25倍量，浸泡1-5h，加热至80-100℃热回流提取30-70分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.20～1.30；浓缩液在搅拌下加0.8-2.5倍体积乙酸乙酯萃取，重复2-5次，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯得酯相；
B.用20％盐酸将萃取后水层PH调节为2.0-3.0，静置12-30h，取沉淀；沉淀加10-25倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的0.3-1倍，先用1-3倍柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用2-4.5倍柱体积的60-85％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味即得水相；
C.合并酯相和水相，浓缩，60℃真空干燥，得中间体；中间体用丙二醇溶解，加入注射用水及辅料，调节pH值为7.0～7.5，超滤膜超滤，得有效成分；经后处理得成品。
上述步骤C中的浓缩干燥选用夹层不锈钢锅，用蒸汽加热进行浓缩，实验表明，当药材提取物浓缩到相对密度为1.20～1.30时(80℃)，已无乙醇味，同时，因搅拌困难，锅壁表面的稠膏易于炭化，使浓缩操作难于进行，故将浓缩工艺参数定为：苦碟子药材洗脱液在蒸汽夹层锅中浓缩至相对密度为1.20～1.30(80℃)，方可进行干燥。
干燥工艺采用中药浸膏常用的真空干燥，通过预试验可知，浸膏含水量低于4％时，再延长干燥时间，并不能使含水量有明显下降，故本实验拟采用60℃、70℃、80℃三种条件进行干燥，以干燥后浸膏的含水量达4％时，所用时间多少，并结合中间体膏粉的外观性状，用成品处方中的溶剂(含0.83％氯化钠及8％丙二醇的水溶液)复溶后溶液颜色深浅，来决定干燥所用的温度；
实验过程为：取稠膏1500g，分为三分，分别于真空干燥箱中，设定干燥温度分别为60℃、70℃、80℃进行干燥，测定当干膏含水量达4％时，所用时间，并同时对干膏外观性状等进行检查，结果如下表：
| 编号 | 干燥温度 | 干燥时间 | 干膏外观性状 | 复溶后溶液颜色 |
| 1 | 60℃ | 36h | 棕黄色块状固体，较松 | 棕黄色澄明液体，溶解快 |
| 2 | 70℃ | 33h | 棕黄色块状固体，较松 | 棕黄色澄明液体，溶解较慢 |
| 3 | 80℃ | 32h | 棕黑色块状固体，较硬 | 棕黄色澄明液体，溶解慢 |
由上表结果可见，70℃、80℃的干燥时间并不比60℃更少，同时温度升高，所得干膏颜色加深，复溶时溶解速度变慢，但复溶后溶液的颜色差别不大，故将干燥工艺定为：60℃真空干燥至干膏水分低于4％。
现有苦碟子注射液内的有效成分含量比较低，无须使用增溶剂。而本发明产品中，总黄酮及内酯A的含量均比较高，需使用增溶剂来提高有效成分的溶解度。本发明选用丙二醇作为增溶剂，试验方法如下：
称取中间体6份，每份73.1mg(含总黄酮60mg)，分别加不同量的丙二醇，加热充分溶解。分别加水80ml，调pH到7.0～7.5，再加水至100ml，过滤测总黄酮的含量。通过试验，达到了预期效果(丙二醇用量5％～10％)。结果见下表：
| 试验号 | 理论用量(mg/100ml) | 增溶后的含量(mg/100ml) | |||||
| PG5.0％ | PG6.0％ | PG7.0％ | PG8.0％ | PG9.0％ | PG10.0％ | ||
| 1 | 60.1 | 48.9 | 52.8 | 59.3 | 60.0 | 60.1 | 60.1 |
| 2 | 60.7 | 49.5 | 53.4 | 59.5 | 59.7 | 59.7 | 59.6 |
| 3 | 58.0 | 47.3 | 53.2 | 56.6 | 57.7 | 57.8 | 57.7 |
通过实验可以看出，丙二醇用量在8.0％时，增溶效果比较理想，用量增大效果并不明显，下面我们再通过总黄酮的转溶率数据统计，来说明丙二醇的最佳用量。
| 试验号 | 中间体中总黄酮(mg/以每瓶用量计) | 丙二醇每100ml用量，总黄酮的转溶率(％) | ||
| 7.0ml | 8.0ml | 9.0ml | ||
| 1 | 60.1 | 98.7 | 99.8 | 100.0 |
| 2 | 60.7 | 98.0 | 98.4 | 98.4 |
| 3 | 58.0 | 97.6 | 99.5 | 99.7 |
| --- | 平均值 | 98.1 | 99.2 | 99.4 |
由上表可以看出，丙二醇用量为8.0％时，总黄酮的转溶率已接近完全，可做为最佳用量。
由于中药制剂中成份复杂，内含大量易氧化物质，在长期保存过程中，会逐渐被氧化，影响产品质量，故本发明中考虑加入适量抗氧剂来保证产品质量。又由于用于注射剂的抗氧剂需严格控制使用剂量，故参考《药剂辅料大全》以及有关注射剂的常用附加剂，在本发明产品中加适量的亚硫酸氢钠做为抗氧剂，并参照复方氨基酸注射液(18AA)说明书中亚硫酸氢钠的用量，做如下的筛选实验：
称取苦碟子中间体960mg，用96ml丙二醇加热溶解，加水约860ml，搅拌同时加入氯化钠9.96g，充分溶解。使用0.02mol/L的NaOH调溶液pH为7.0～7.5；补水至1200ml，过0.22μm滤器，将滤液做为原液，分成12瓶，每瓶100ml，分为4组，每组3瓶。每组按下表分别加不同剂量的亚硫酸氢钠，115℃30min水浴灭菌，40℃放置10天，检测不同亚硫酸氢钠用量对各项指标的影响(每组3瓶检测后计算其平均值)，结果见下表：
| 处方 | 性状 | 含量(/ml) | 澄明度 | 不溶性微粒 | ||
| 总黄酮(mg) | 内酯A(μg) | ≥10μm | ≥25μm | |||
| 1(未加) | 棕黄色液体， | 55.3 | 6.2 | 不合格 | ------ | ------ |
| 2(0.05％) | 棕黄色澄明液体 | 54.6 | 5.7 | 合格 | 56.4 | 11.3 |
| 3(0.10％) | 棕黄色澄明液体 | 54.1 | 5.8 | 合格 | 13.2 | 0.9 |
| 4(0.20％) | 棕黄色澄明液体 | 54.7 | 5.8 | 合格 | 17.2 | 1.9 |
说明：不溶微粒项下的“----”表示未进行检查。
由上表结果可见，未加亚硫酸氢钠的处方，10天后样品澄明度即不合格，故未做不溶性微粒检查；而加有亚硫酸氢钠样品的性状均合格，其中又以用量为0.10％(w/v)的样品，各项指标最为合适，故决定在本发明产品的注射液处方中加亚硫酸氢钠的量为0.10％(w/v)。
本发明依据《中药注射剂研究的技术要求》中有关安全性试验项目及要求，以第3管是否溶血，是否有细胞凝聚的现象，来判断氯化钠的作用量是否适当。由于浸膏中的水溶性物质占有一定的浓度，调等渗所用氯化钠的量，本发明选用0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％连续做三个批次，氯化钠用量均为0.5％、0.6％溶液分层不明显，0.7％溶液分层，但上层溶液浅红色，0.8％、0.9％溶液明显分层，与对照管基本一致。
为进一步选择氯化钠最佳用量，本发明选用同一批提取物，氯化钠用量为0.8％、0.83％、0.9％，依据《中药注射剂研究的技术要求》中有关安全性试验项目及要求，进行溶血试验。(注：所采血液为兔血)结果见下表：
| 观察时间 | 第三管试验情况(药液0.30ml) | 第六管(对照管) | ||
| 氯化钠用量0.8％ | 氯化钠用量0.83％ | 氯化钠用量0.9％ | ||
| 15min | 分层，上层约0.08ml | 分层，上层约0.12ml | 分层，上层约0.10ml | 分层，上层约0.14ml |
| 30min | 分层，上层约0.22ml | 分层，上层约0.18ml | 分层，上层约0.22ml | 分层，上层约0.26ml |
| 45min | 分层，上层约0.50ml | 分层，上层约0.50ml | 分层，上层约0.50ml | 分层，上层约0.50ml |
| h | 分层，上层几乎无色 | 分层，上层几乎无色 | 分层，上层几乎无色 | 分层，上层无色 |
| 2h | 上层药液色，下层红色 | 上层药液色，下层红色 | 上层药液色，下层红色 | 上层无色，下层红色 |
| 3h | 上层药液色，下层红色 | 上层药液色，下层红色 | 上层药液色，下层红色 | 上层无色，下层红色 |
| 4h | 上层药液色，下层红色 | 上层药液色，下层红色 | 上层药液色，下层红色略有药物状沉淀 | 上层无色，下层红色 |
由上表结果可见，采用0.83％的氯化钠调节等渗，药液与血液等渗，可保证临床用药安全。
为进一步确认所选氯化钠浓度对本品等渗调节程度，采用冰点下降法做如下的苦碟子氯化钠注射液渗透压试验：
| 试验号 | 原液冰点下降值 | 加氯化钠(0.83％)后冰点下降值 |
| 1 | 0.0486 | 0.51 |
| 2 | 0.0491 | 0.52 |
| 3 | 0.0493 | 0.53 |
| 4 | ------ | 0.52(0.9％NaCl) |
通过以上试验可以看出原液加0.83％氯化钠，冰点下降值与0.9％氯化钠的冰点下降值基本接近，说明0.83％氯化钠用量可保证药液的等渗；故确定本品处方中使用0.83％的氯化钠。
上述步骤A中使用乙酸乙酯萃取的次数优选为4次。
按上述方法取苦碟子药材乙醇热回流提取液，浓缩至1ml相当于原生药4g，加1∶1(体积/体积)乙酸乙酯萃取，反复几次，合并各次乙酸乙酯层，加热回收乙酸乙酯后，测定溶液中总黄酮、内酯A含量，以萃取次数、总黄酮保留率、内酯A保留率为指标，检查水相中的有效成分的残留，结果如下：
| 试验号 | 萃取次数 | 酯层浸膏收率％ | 水层浸膏收率％ | 水层保留率(％) | |
| 总黄酮 | 内酯A | ||||
| 1 | 1 | 1.08 | 17.12 | 94.07 | 83.77 |
| 2 | 2 | 1.89 | 16.31 | 89.61 | 68.72 |
| 3 | 3 | 2.56 | 15.64 | 85.93 | 54.12 |
| 4 | 4 | 3.14 | 15.06 | 82.75 | 48.08 |
| 5 | 5 | 3.25 | 14.95 | 81.59 | 45.05 |
保留率＝乙酸乙酯萃取后药液含量/乙酸乙酯萃取前药液含量×100％
试验数据表明萃取次数提高，水层内酯A保留率降低，萃取四次以后，水层内酯A的含量降低已不明显，继续萃取效果不佳，而且会出现水层与酯层难以分离的现象，故决定优选4次萃取。
乙酸乙酯萃取后的萃取液中含有大量的乙酸乙酯，因此对乙酸乙酯进行回收，既可重复利用以降低生产成本，减少环境污染，又可减少乙酸乙酯对产品的影响。采用普通回收工艺，待浓缩液已无明显的乙酸乙酯味，且浓缩操作难于进行时，停止浓缩操作，此时检查浓缩液的相对密度为1.20～1.30(80℃)，所得浓缩液即为所需的酯相。
苦碟子内的总黄酮由多种黄酮组成，其中木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷等主要有效成分在酸性条件下容易沉淀从而与其它杂质分离。
传统小针的酸沉条件中采用50％的硫酸做沉淀剂，部分原因在于在先操作中使用了氧化钙乳做沉淀剂，使用硫酸可将溶液中残留的氧化钙进一步沉淀完全，减少由于纯化操作引入新杂质的量；本发明对此工艺条件进行了优化，不采用氧化钙乳沉淀剂，一方面可避免引入新的杂质，对产品质量造成影响，另一方面可避免由于使用氧化钙乳沉淀剂所造成的环境污染。
传统小针的酸沉法纯化，收取的是上清液，弃去沉淀。由于有效成分主要在沉淀中，因此收得率很低。又由于本发明只是考虑不同pH值条件下，纯化工艺的效果，因此，采用注射剂生产中常用的盐酸溶液或氢氧化钠溶液做为pH调节剂，可满足工艺要求；同时，本品在后续的制剂工艺中，还加入适量的氯化钠做渗透压调节剂，因此，酸沉工艺中调节pH值所加入的少量盐酸溶液或氢氧化钠溶液，由于其所引入氯离子或钠离子的量极少，且在通过大孔树脂层析时可被清除，因而不会对成品质量造成影响。
另一方面，通过酸沉工艺总黄酮的纯度达不到要求，因而本发明中，进一步的纯化采用了大孔树脂层析，通过将酸沉工艺后的沉淀用水稀释，并用NaOH溶液调pH至6.5-7.2，溶液内的总黄酮将重新溶解，会增加大孔树脂的上柱量，同时酸沉上清中也含有部分有效成分，因此，对乙酸乙酯萃取水层进行酸处理之后，考察不同pH值条件下，酸沉前后溶液中总黄酮及内酯A的保留率，大孔树脂的上柱量等，可以了解酸沉效果，具体操作如下：
取水层浓缩液70ml，加水至140ml，平均分为7分，分别用盐酸或氢氧化钠调pH为7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0，另一份不调，观察溶液外观变化，静置24小时，溶液离心分离沉淀，上清液检查总黄酮的保留率、溶液外观等，结果见下表：
| 实验号 | pH条件 | 外观 | 上柱量(ml)(500ml树脂柱) | 总黄酮保留率(％) |
| 1 | 未调(6.3) | 棕黑色澄清液体 | 300 | 100.0 |
| 2 | 7.0 | 棕黑色澄清液体 | ---- | 100.0 |
| 3 | 6.0 | 棕黄色澄清液体 | ---- | 100.0 |
| 4 | 5.0 | 略有沉淀，棕黄色微浑液体 | ---- | 94.8 |
| 5 | 4.0 | 有少许沉淀，棕黄色微浑液体 | ---- | 75.4 |
| 6 | 3.0 | 有大量沉淀，浅黄色浑浊液体 | 900 | 24.9 |
| 7 | 2.0 | 有大量沉淀，浅黄色浑浊液体 | ---- | 25.8 |
说明：①保留率＝酸沉后药液含量/酸沉前药液含量×100％；②“----”表明此项操作未进行。
由上表可见，随溶液pH值降低，沉淀量增加，当pH值为4.0时，总黄酮的保留率有较明显的降低，pH值小于4.0时，外观可见沉淀大量生成，同时总黄酮的保留率已有显著的降低，但由于pH2.0时总黄酮的保留率与pH3.0时差别不大，而将本发明酸沉条件定为pH2.0～3.0，较为适宜。
将酸沉后的沉淀用水稀释后pH值调至7.0，颜色依然较深，表明溶液中还保留有大量色素，故仍应采取措施进一步纯化，除去色素成分，而传统的沉淀法纯化工艺已无法满足要求，因此，考虑采用目前中药生产中广泛使用的大孔树脂层析，对酸沉后的药液进行纯化处理，应可满足生产及临床应用的要求。
本发明将苦碟子酸沉后的沉淀稀释液，通过大孔树脂进行有效成分的富集，去除杂质后，再用适当溶剂进行洗脱，从而达到分离、纯化的目的。
市售大孔吸附树脂D101内部往往含有未被聚合的单体、致孔剂和其他有机物质，在树脂使用之前，必须经过预处理，以除去杂质。预处理方法：将树脂用95％乙醇湿法装柱，用95％乙醇在柱上洗脱，至流出液与水1∶2混合不产生混浊，然后用水洗至无醇味，备用。
取处理后符合要求的D101型大孔吸附树脂各20ml，按不同流速加已处理好的，符合上柱要求的苦碟子药材萃取酸沉淀稀释液(按药材与树脂量1∶2计)，分次加样，每次5ml，直到流出液中用薄层色谱法可检出黄酮斑点为止；结果见下表：
| 实验号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| 流速(ml/min) | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 |
| 泄漏时加样体积(ml) | 35 | 35 | 30 | 30 | 25 | 20 |
试验结果显示，随着流速的加快，吸附量有所降低，但流速过慢影响效率，因此本发明选择4ml/min为宜。
取苦碟子药材40g，萃取酸沉液后，按下表的比例配制，用处理后符合要求的D101大孔吸附树脂每份20ml，进行饱和吸附试验，清液检出黄酮为泄漏；结果见下表：
| 药液浓度(每ml相当于药材g) | 样品体积(ml) | 树脂体积(ml) | 上清液黄酮TLC检查 | 泄漏前处理量(ml) |
| 0.5 | 20 | 20 | - | 160 |
| 1 | 10 | 20 | - | 140 |
| 2 | 5 | 20 | - | 110 |
| 3 | 3.4 | 20 | + | 80 |
说明：上清液黄酮检查项下“-”表示未检出，“+”表示检出。
由上表可见，上柱前的药液浓度会影响吸附效率，当采用每ml药液相当于原药材3g的浓缩液时，上清液已可检出黄酮，故本发明在上柱前，将药液浓缩至每1ml相当于原生药2g。
将苦碟子药材酸沉上清液调成不同pH值进行大孔树脂吸附实验。
取苦碟子药材酸沉淀稀释至2200ml做为原液，将原液平均分成11分，用稀盐酸或稀氢氧化钠溶液分别调pH为3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，另一份不调，然后各取100ml，分别置于250ml烧杯中，分别加入经处理过的D101大孔树脂100ml，吸附三个小时；测定吸附后的溶液中，总黄酮的保留率、大孔树脂的吸附率，同时以大孔树脂吸附率对溶液pH做图，结果见下表及图2：
| 试验号 | 溶液pH值 | 总黄酮转移率(％) | 总黄酮的树脂吸附率(％) |
| 1 | 原液(3.8) | 6.02 | 6.02 |
| 2 | 3.08 | 4.39 | 4.39 |
| 3 | 3.51 | 5.53 | 5.53 |
| 4 | 4.06 | 8.55 | 8.55 |
| 5 | 4.98 | 46.8 | 46.8 |
| 6 | 5.99 | 72.9 | 72.9 |
| 7 | 7.00 | 80.5 | 80.5 |
| 8 | 7.45 | 83.1 | 83.1 |
| 9 | 7.96 | 83.3 | 83.3 |
| 10 | 8.45 | 78.0 | 78.0 |
| 11 | 8.95 | 60.0 | 60.0 |
说明：
1、转移率＝(原液中含量-吸附后药液的含量)÷原液中含量×100％
2、大孔树脂吸附率＝总黄酮转移率＝(原液中总黄酮量-吸附后药液的总黄酮量)/原液中总黄酮量×100％
由上表及图2见，当pH值介于7.0～8.0时，总黄酮吸附效率最高，表明在实验条件下总黄酮转移率较高，故可将吸附前药液pH定为7.0～8.0。
由于中间体经D101大孔树脂处理后，仍还含有大量色素，颜色较深，故需要脱色处理。活性炭是注射剂常用的脱色材料，同时还可除去药液中的细菌内毒素，因此，参照苦碟子注射液制法，采用活性炭脱色及除细菌内毒素，并以总黄酮及内酯A损失率及处理后药液的颜色、药液的细菌内毒素为指标进行了考察。
试验方法：称取苦碟子中间体1920mg，用192ml丙二醇加热溶解，加水1500ml，搅拌同时加入氯化钠19.92g，亚硫酸氢钠2.4g，充分溶解。使用0.02mol/L的NaOH调溶液pH为7.0～7.5；补水至2400ml做为原液，将原液分成24瓶，每瓶100ml，分为8组，每组3瓶。每组按下表分别加不同剂量的活性炭，吸附30分钟后脱炭，检测加活性炭前后各项指标的变化。每组3瓶检测后计算其平均值，结果见下表：
| 样品 | 活性炭g/100ml | 总黄酮 | 内脂A | 药液颜色 | 细菌内毒素 | ||
| 含量(mg/ml) | 损失率(％) | 含量(mg/ml) | 损失率(％) | ||||
| 1 | 未加 | 54.9 | 0.0 | 0.67 | 0.0 | ++++ | +++ |
| 2 | 0.05 | 50.8 | 7.4 | 0.31 | 53.7 | ++++ | + |
| 3 | 0.10 | 44.2 | 19.5 | 0.09 | 86.6 | +++ | + |
| 4 | 0.20 | 38.7 | 29.5 | 0 | 100.0 | +++ | - |
| 5 | 0.30 | 32.6 | 40.6 | 0 | 100.0 | +++ | - |
| 6 | 0.40 | 26.1 | 52.5 | 0 | 100.0 | ++ | - |
| 7 | 0.50 | 20.5 | 62.6 | 0 | 100.0 | + | - |
| 8 | 1.00 | 10.8 | 80.3 | 0 | 100.0 | + | - |
说明：
1、药液颜色项下的“++++”表示药液颜色较深；“+”表示药液颜色较浅。
2、细菌内毒素项下的“+”表示细菌内毒素检查呈阳性；“-”表示细菌内毒素检查呈阴性。
由上表可见，随着活性炭量增加，总黄酮和内酯A大量被吸附，活性炭用量达0.20％时，细菌内毒素即可合格，但药液颜色需活性炭浓度达到0.40％时才能合格，此时内酯A已被吸附完全，总黄酮已损失过半，因而，采用活性炭脱色和除细菌内毒素不理想。
因此本发明采用超滤方法，避免了活性炭使用中存在的问题。由于又要考虑到能除热源，而热源的分子量一般在15万以上，故超滤膜分子量越小，除细菌内毒素越有保证，但同时过滤的速度就越慢，另外又需考虑对药液有效成分较少吸附等诸多因素，通过反复试验及比较，选用1万分子量的聚醚砜的超滤膜。
试验方法：称取苦碟子中间体4000mg，用400ml丙二醇加热溶解，加水3000ml，搅拌下加氯化钠41.5g，亚硫酸氢钠5.0g，充分溶解。使用0.02mol/LNaOH调溶液pH为7.0～7.5。补水至5000ml，常温下超滤，采用分子量为1万分子量的聚醚砜超滤膜，操作压力为1.2KPa/C m2，结束后检查滤液中总黄酮及内酯A的损失率，结果见下表：
| 样品 | 总黄酮 | 内酯A | 药液颜色 | 细菌内毒素 | ||
| 含量(mg/100ml) | 损失率(％) | 含量(mg/100ml) | 损失率(％) | |||
| 超滤前 | 56.0 | - | 0.67 | - | ++++ | ++ |
| 超滤后 | 47.9 | 14.5 | 0.56 | 16.6 | ++ | - |
说明：
1、损失率＝1-超滤后药液含量÷超滤前药液含量×100％
2、药液颜色项下的“++++”表示药液颜色较深；“++”表示药液颜色较浅。
3、细菌内毒素项下的“+”表示细菌内毒素检查呈阳性；“-”表示细菌内毒素检查呈阴性。
4、超滤前不存在损失问题，故“----”表示未检测。
由上表结果可见，超滤对指标成分基本没有影响，同时药液的颜色有极大的改观，超滤后药液细菌内毒素检查合格，故本发明选用超滤工艺做为制剂工艺的脱色及除细菌内毒素工艺。
本发明注射液采用水浴灭菌方法，设备为山东新华医疗器械厂生产。对灭菌条件进行了选择，按常规大容量注射液灭菌条件定为：115℃30min及121℃30min，均可保证成品无菌，实验方法如下；
称取苦碟子中间体4000mg，用400ml丙二醇加热溶解，加水3000ml，搅拌下加氯化钠41.5g，亚硫酸氢钠5.0g，充分溶解；使用0.02mol/L的NaOH溶液或0.1mol/L的HCl溶液调药液pH在7.0-7.5；补水至5000ml，常温下超滤，采用分子量为1万的聚醚砜超滤膜，操作压力为1.2KPa/cm2，药液灌封于100ml玻璃输液瓶中，分为两份，分别于115℃30min及121℃30min条件下水浴灭菌，检查药液灭菌前后各项指标的变化，结果见下表：
| 项目 | 颜色 | pH | 澄明度 | 不溶性微粒(个/ml) | 总黄酮(mg/ml) | 内酯A(μg/ml) | 无菌检查 | |
| ≥10μm | ≥25μm | |||||||
| 灭菌前 | 棕黄色 | 7.55 | 合格 | 7 | 0 | 0.5519 | 5.8 | 不合格 |
| 115℃30min | 棕黄色 | 6.13 | 合格 | 10 | 0 | 0.5475 | 5.4 | 合格 |
| 121℃30min | 棕黑色 | 5.33 | 不合格 | 28 | 3 | 0.5364 | 5.7 | 合格 |
根据上表的试验结果可见，灭菌温度上升，时间加长，样品的颜色加深，pH值显著下降，不溶性微粒逐渐增多，121℃、30min灭菌条件下，澄明度即不合格，内酯A含量基本稳定，但黄酮含量随灭菌温度升高，时间加长，呈下降趋势，表明灭菌温度越高，时间越长，对药液的质量影响越明显；尽管两种灭菌条件均可保证无菌合格，但相比之下，选择115℃30min灭菌条件为生产灭菌条件，更为合理。
为了考察大孔树脂的洗脱吸附性能，采用梯度洗脱的方法观察各种有效成分的分布规律，以确定最佳洗脱液处方。
实验方法：
①取已用95％乙醇处理好的D101大孔树脂510ml上柱，并用水(1200ml)冲至无醇味。
②取苦碟子药材酸沉淀稀释液125ml，调pH值至7.95上柱，用纯化水洗脱。
③从流出液带色时的第二瓶开始收集，每瓶500ml(1-A、1-B)，纯化水洗柱过程的收集液为(2-A、2-B)。
④用不同浓度乙醇各600ml洗脱，并收集不同浓度的洗脱液，每瓶300ml(编号A、B)。
⑤各次洗脱液分别取1ml，用水浴蒸发至近干，然后分别加水至15ml，用紫外检测总黄酮含量，计算总黄酮的转移率，结果见下表：
| 样品编号 | 洗脱液 | 收集量(ml) | 总黄酮转移率(％) | 总黄酮/固形物(％) | ||
| 实测值 | 均值 | 实测值 | 均值 | |||
| 1-A | 漏出液 | 500 | 4.46 | 4.59 | 10.9 | 10.9 |
| 1-B | 500 | 4.72 | 10.8 | |||
| 2-A | 纯化水 | 500 | 6.71 | 6.88 | 17.7 | 18.9 |
| 2-B | 500 | 7.04 | 20.0 | |||
| 3-A | 10％乙醇 | 300 | 2.69 | 2.87 | 76.5 | 79.2 |
| 3-B | 300 | 3.05 | 81.9 | |||
| 4-A | 20％乙醇 | 300 | 5.71 | 6.15 | 66.1 | 62.3 |
| 4-B | 300 | 6.59 | 58.5 | |||
| 5-A | 30％乙醇 | 300 | 8.34 | 8.72 | 60.2 | 65.8 |
| 5-B | 300 | 9.10 | 71.4 | |||
| 6-A | 40％乙醇 | 300 | 9.44 | 9.18 | 70.8 | 69.5 |
| 6-B | 300 | 8.91 | 68.2 | |||
| 7-A | 50％乙醇 | 300 | 7.41 | 6.03 | 67.7 | 66.7 |
| 7-B | 300 | 4.65 | 65.7 | |||
| 8-A | 60％乙醇 | 300 | 2.36 | 2.73 | 32.9 | 25.5 |
| 8-B | 300 | 3.10 | 18.1 | |||
| 9-A | 70％乙醇 | 300 | 2.68 | 2.22 | 28.8 | 27.8 |
| 9-B | 300 | 1.76 | 26.8 | |||
| 10-A | 80％乙醇 | 300 | 0.90 | 0.66 | 25.4 | 23.1 |
| 10-B | 300 | 0.41 | 20.8 |
说明：转移率＝洗脱药液含量/柱前药液含量×100％
将总黄酮转移率对洗脱液浓度做图，结果见图3。
从图3可以看出，纯化水洗脱时，出现总黄酮第一洗脱峰，应是某种黄酮类极性较强的物质首先被洗出，其余较弱极性的黄酮类物质集中在20％～60％乙醇浓度区间被洗出，成为总黄酮第二个洗脱峰。由上述结果可知，用80％乙醇洗脱大孔树脂，能够将总黄酮都洗出来。故确定大孔树脂洗脱以80％乙醇为洗脱溶剂。
按照梯度洗脱时各组分分布的规律，结合生产实际，将洗脱梯度简化，取符合上柱要求的苦碟子药材萃取酸沉液125ml，加于已处理好的D101型大孔树脂柱(500ml)上，用纯化水1000ml进行清洗，再用80％乙醇洗脱，洗脱6个柱体积，将各乙醇洗脱液合并，浓缩至每ml相当于原药材2g时，检查药液的外观，测定总黄酮的转移率及总黄酮占固型物重量百分比，结果见下表：
| 实验号 | 外观 | 总黄酮转移率(％) | 总黄酮/固型物(％) |
| 1 | 棕黄色澄清液体 | 27.2 | 61.8 |
| 2 | 棕黄色澄清液体 | 27.3 | 59.5 |
| 3 | 棕黄色澄清液体 | 27.4 | 61.1 |
| 平均值 | ------ | 27.3 | 60.8 |
说明：转移率＝洗脱药液含量÷上柱前药液含量×100％
由上表结果可见，采用80％的乙醇做为洗脱液，可将有效成分顺利洗脱，总黄酮的转移率与吸附时基本相同，表明洗脱近于完全，总黄酮占总固型物的重量百分比也符合要求(＞50％)，溶液颜色也比酸沉上清液有较大改善。
大孔吸附树脂的再生：树脂的每一次再生，可用95％的高浓度乙醇洗脱，但当树脂使用了若干周期后，它的吸附性能下降，此时需用酸碱处理，则树脂的吸附能力又可恢复，此即树脂的再生。
树脂再生过程一般为：在柱内加入高于树脂层10cm的2-3％HCl溶液浸泡2小时，然后用同浓度的盐酸2～3个柱体积过柱，用水洗至中性；继用3-5％的NaOH溶液同法浸泡1～2小时后，再用2～3柱体积同浓度NaOH溶液过柱，最后用水洗至中性即可。
树脂纯化的具体工艺参数：树脂柱径高比1.2∶12(φ12cm、H120cm)，上柱吸附流速4～6ml/min；洗脱流速水洗：45ml/min；80％乙醇：30ml/min，吸附温度为室温。
上述超滤膜优选使用分子量为1万的超滤膜。
上述辅料可以是氯化钠0.6-0.9％、亚硫酸氢钠0.05-0.1％、甘露醇0.5～25％、右旋糖苷0.5～20％、蔗糖0.1～30％、乳糖0.1～30％或者其中两种或两种以上的混合物。
所述的后处理可以是：加注射用水，灌封于瓶中密封，于115℃水浴灭菌30分钟，得成品；也可以是：无菌条件下灌装，冷冻干燥，得成品。
本发明的制备方法更有效的保留了原药材中的有效成分，并尽量减少了非有效成分的含量，改传统的水提醇沉工艺为乙醇热回流，保留原有的酸沉工艺，去除了对环境污染较大的氧化钙沉淀法，采用大孔吸附树脂层析的纯化方法，提高了药品纯度，采用选择性更强，更能减少有效成分损失的超滤方法，保证了药品的疗效。
附图说明
图1是实施例1的制备流程图
图2是黄酮大孔树脂吸附与溶液pH值的关系
图3是大孔树脂洗脱曲线
具体实施方式
实施例1
取20Kg苦碟子药材，洗净，加60％乙醇18倍体积量，浸泡3h，加热，在100℃下，热回流提取50分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.20，每1ml相当于原生药4g；浓缩液在搅拌下加同体积乙酸乙酯萃取，重复4次，水层备用，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，得酯相。
用20％盐酸将萃取后水层pH调节为2.0，静置24h，取沉淀备用，沉淀加16倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的1/2倍，先用相当于2个柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用相当于3倍量柱体积的80％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味，得水相。
合并酯相和水相，浓缩，60℃真空干燥，得中间体，用8000ml丙二醇溶解，加入30Kg注射用水，再加入处方量的氯化钠830g、亚硫酸氢钠100g，搅拌均匀，调节pH值为7.0，用1万分子量的超滤膜超滤，加注射用水70Kg，溶液检查澄明度及含量合格后，灌封于100ml玻璃输液瓶中，加塞，压盖，于115℃水浴灭菌30分钟，检查合格后，即得成品。
实施例2
取20Kg苦碟子药材，洗净，加60％乙醇18倍体积量，浸泡3h，加热，在80℃下，热回流提取50分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.30，每1ml相当于原生药4g；浓缩液在搅拌下加同体积乙酸乙酯萃取，重复4次，水层备用，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，得酯相。
用20％盐酸将萃取后水层pH调节为2.0，静置24h，取沉淀备用，沉淀加16倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的1/2倍，先用相当于2个柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用相当于3倍量柱体积的80％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味，得水相。
合并酯相和水相，浓缩，60℃真空干燥，得中间体，用8000ml丙二醇溶解，加入30Kg注射用水，再加入处方量的氯化钠830g、亚硫酸氢钠100g，搅拌均匀，调节pH值为7.5，用1万分子量的超滤膜超滤，加注射用水70Kg，溶液检查澄明度及含量合格后，灌封于100ml玻璃输液瓶中，加塞，压盖，于115℃水浴灭菌30分钟，检查合格后，即得成品。
实施例3
取20Kg苦碟子药材，洗净，加50％乙醇20倍体积量，浸泡4.5h，加热，在85℃下，热回流提取60分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.20；浓缩液在搅拌下加1.5倍体积乙酸乙酯萃取，重复4次，水层备用，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，得酯相。
用20％盐酸将萃取后水层pH调节为2.0，静置12h，取沉淀备用，沉淀加10倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的1倍，先用相当于2个柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用相当于2倍量柱体积的85％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味，得水相。
合并酯相和水相后的操作同实施例1，制得成品。
实施例4
取20Kg苦碟子药材，洗净，加40％乙醇25倍体积量，浸泡5h，加热，在90℃下，热回流提取70分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.30；浓缩液在搅拌下加0.8倍体积乙酸乙酯萃取，重复5次，水层备用，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，得酯相。
用20％盐酸将萃取后水层pH调节为2.0，静置18h，取沉淀备用，沉淀加20倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的1/3倍，先用相当于1个柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用相当于2.5倍量柱体积的80％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味，得水相。
合并酯相和水相，浓缩，60℃真空干燥，得中间体，用8000ml丙二醇溶解，加入30Kg注射用水，再加入200g甘露醇，用0.22μm的微孔滤膜过滤，无菌条件下灌装于西林瓶中，放入冷冻干燥箱中，进行预冻结，冻干箱温度维持在-40℃，时间为4小时，然后将冷凝器制冷，使冷凝管达到-60℃，同时启动真空泵，使压力降至2Pa，使物料中的水分升华为水蒸气，该水蒸气不断在冷凝管上结霜，同时搁板开始梯度加温至0℃，每1小时升温10℃，保持5小时，得干燥粉末，即冻干制剂。
实施例5
取20Kg苦碟子药材，洗净，加65％乙醇15倍体积量，浸泡2h，加热，在95℃下，热回流提取45分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.20；浓缩液在搅拌下加2倍体积乙酸乙酯萃取，重复3次，水层备用，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，得酯相。
用20％盐酸将萃取后水层pH调节为2.0，静置20h，取沉淀备用，沉淀加25倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的0.7倍，先用相当于1.5个柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用相当于4.5倍量柱体积的70％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味，得水相。
合并酯相和水相，浓缩，60℃真空干燥，得中间体，用8000ml丙二醇溶解，加入30Kg注射用水，加入甘露醇20g、右旋糖苷200g、蔗糖100g、用0.22μm的微孔滤膜过滤，无菌条件下灌装于西林瓶中，放入冷冻干燥箱中，进行预冻结，冻干箱温度维持在-50℃，时间为2小时，然后将冷凝器制冷，使冷凝管达到-60℃，同时启动真空泵，使压力降至2Pa，使物料中的水分升华为水蒸气，该水蒸气不断在冷凝管上结霜，同时搁板开始梯度加温至0℃，每1小时升温10℃，保持8小时，得干燥粉末，即冻干制剂。
实施例6
取20Kg苦碟子药材，洗净，加70％乙醇13倍体积量，浸泡1h，加热，在100℃下，热回流提取30分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.20；浓缩液在搅拌下加2.5倍体积乙酸乙酯萃取，重复2次，水层备用，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯，得酯相。
用20％盐酸将萃取后水层pH调节为2.0，静置30h，取沉淀备用，沉淀加12倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的1/2倍，先用相当于2个柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用相当于3.5倍量柱体积的60％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味，得水相。
合并酯相和水相，浓缩，60℃真空干燥，得中间体，用8000ml丙二醇溶解，加入30Kg注射用水，加入甘露醇250g、右旋糖苷100g、蔗糖5g、乳糖1g，用0.22μm的微孔滤膜过滤，无菌条件下灌装于西林瓶中，放入冷冻干燥箱中，进行预冻结，冻干箱温度维持在-35℃，时间为4.5小时，然后将冷凝器制冷，使冷凝管达到-55℃，同时启动真空泵，使压力降至5Pa，使物料中的水分升华为水蒸气，该水蒸气不断在冷凝管上结霜，同时搁板开始梯度加温至0℃，每1小时升温10℃，保持6小时，得冻干制剂。
实验例
按实施例1的方法，试制十批样品，检查样品质量，结果表明，十批样品质量稳定，工艺参数确实可靠，能够满足临床用质量标准的要求，具体结果见下表：
| 批号 | 成品率(％) | 澄明度 | pH | 总黄酮(mg/ml) | 内酯A(μg/ml) | 固形物(mg/ml) |
| 1 | 85.5 | 合格 | 6.35 | 0.64 | 9.88 | 11.40 |
| 2 | 86.2 | 合格 | 6.39 | 0.61 | 8.06 | 11.42 |
| 3 | 86.0 | 合格 | 6.25 | 0.73 | 13.82 | 11.57 |
| 4 | 84.3 | 合格 | 6.76 | 0.46 | 17.83 | 11.30 |
| 5 | 85.7 | 合格 | 6.48 | 0.58 | 5.82 | 11.50 |
| 6 | 86.0 | 合格 | 5.95 | 0.83 | 7.28 | 11.39 |
| 7 | 86.1 | 合格 | 6.39 | 0.77 | 14.68 | 11.53 |
| 8 | 85.4 | 合格 | 6.25 | 0.50 | 16.02 | 11.28 |
| 9 | 87.7 | 合格 | 6.76 | 0.66 | 13.22 | 11.54 |
| 10 | 84.4 | 合格 | 6.48 | 0.45 | 8.85 | 11.35 |
Claims (10)
1、一种苦碟子注射液，其特征在于，所述注射液由以下方法制备得到：
A.取苦碟子药材，洗净加40-70％乙醇13-25倍量，浸泡1-5h，加热至80-100℃热回流提取30-70分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.20～1.30；浓缩液在搅拌下加0.8-2.5倍体积乙酸乙酯萃取，重复2-5次，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯得酯相；
B.用20％盐酸将萃取后水层PH调节为2.0-3.0，静置12-30h，取沉淀；沉淀加10-25倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的0.3-1倍，先用1-3倍柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用2-4.5倍柱体积的60-85％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味即得水相；
C.合并酯相和水相，浓缩，60℃真空干燥，得中间体；中间体用丙二醇溶解，加入注射用水及辅料，调节pH值为7.0～7.5，超滤膜超滤，得有效成分；经后处理得成品。
2、根据权利要求1所述的注射液，其特征在于，所述的注射液为小水针、大容量注射剂或冻干粉针剂。
3、一种苦碟子注射液的制备方法，其特征在于，所述的方法为：
A.取苦碟子药材，洗净加40-70％乙醇13-25倍量，浸泡1-5h，加热至80-100℃热回流提取30-70分钟，过滤，回收乙醇，滤液浓缩至相对密度1.20～1.30；浓缩液在搅拌下加0.8-2.5倍体积乙酸乙酯萃取，重复2-5次，合并乙酸乙酯层，回收乙酸乙酯得酯相；
B.用20％盐酸将萃取后水层PH调节为2.0-3.0，静置12-30h，取沉淀；沉淀加10-25倍体积的纯化水，调节pH值为7.0，过已处理好的D101树脂，树脂用量相当于药材量的0.3-1倍，先用1-3倍柱体积的水洗，弃去水洗脱液；再用2-4.5倍柱体积的60-85％乙醇进行洗脱，收集醇洗脱液，回收乙醇，至洗脱液无明显的醇味即得水相；
C.合并酯相和水相，浓缩，60℃真空干燥，得中间体；中间体用丙二醇溶解，加入注射用水及辅料，调节pH值为7.0～7.5，超滤膜超滤，得有效成分；经后处理得成品。
4、根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的后处理可以是：
(1)加注射用水，灌封于瓶中密封，于115℃水浴灭菌30分钟，得成品；
或者是
(2)无菌条件下灌装，冷冻干燥，得成品。
5、根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述的超滤膜为分子量小于或等于1万的超滤膜。
6、根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述的辅料可以是氯化钠0.6-0.9％、亚硫酸氢钠0.05-0.1％、甘露醇0.5～25％、右旋糖苷0.5～20％、蔗糖0.1～30％、乳糖0.1～30％或者其中两种或两种以上的混合物。
7、根据权利要求3或4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C中的浓缩干燥为：浓缩至相对密度为1.20～1.30时，在60℃真空干燥至干膏水分低于4％或采用喷雾干燥法。
8、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述亚硫酸氢钠的量为0.10％(w/v)。
9、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述丙二醇的用量为8.0％。
10、根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述氯化钠用量为0.83％。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Assignee: Guangdong Bozhou Pharmaceutical Co., Ltd. Assignor: Guangdong Shixin medcine Co., Ltd. Contract record no.: 2011440000401 Denomination of invention: Injection liquid of Ixeris sonchifolia (Bge.) Hance and preparation method thereof Granted publication date: 20100512 License type: Exclusive License Open date: 20061122 Record date: 20110427 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20100512 Termination date: 20210517 |