CN1859927A - 评估器官功能的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种分析器官或组织损伤的方法，包括以下步骤：(a)用染料标记所述器官或组织；(b)获得关于所述器官或组织的生物异源物质代谢和/或细胞状况的多个指标；和(c)从所述指标分析所述器官或组织损伤。

Description

评估器官功能的方法
技术领域
本发明涉及评估器官功能的方法。更具体地说，本发明涉及可视地分析和/或定量地测定关于微观解剖学定向(microanatomicalorientation)血管***和/或排出途径的多个指标的方法。
背景技术
尽管威斯康星大学溶液的使用已经改善了肝脏移植的平均保存时间，但是原发性移植物无功能和最初的功能低下的发生仍在持续(1-3)。这种功能障碍的临床发生率和产生的移植物存活损失取决于保存时间(1-4)。在延长的冷局部缺血之后的再灌注损伤是引起移植物衰竭的关键点。在保存期间，肝细胞膨胀并形成气泡(6-8)。在再灌注时，在实质细胞中的这些变化被恢复，而不引起它们的不可逆损伤(6-8)。另一方面，窦状隙内皮细胞丧失了它们的生存力，枯否细胞被活化(6-10)。根据使用保存在UW溶液中的大鼠肝脏移植物的上述的研究，当窦状隙细胞出现变化时的临界保存时间长于约16小时(6，7)。在这些移植物中，细胞受到损伤，引起血小板捕集(10)、纤维蛋白沉积(11)和白细胞边缘化(margination)(12)。在保存较短时间的移植物中，据报道肝脏ATP含量在再灌注后很好地恢复，暗示实质细胞是存活的(13，14)。
除了这些数据之外，还没有仔细地调查肝细胞是否丧失它们的功能而不显示出不可逆的损伤，然后干扰整体的移植物功能。尽管在上述研究(13-15)中测量了胆汁排出量、牛磺胆酸和溴磺基酞(bromosulfophtalein)的清除率，即使当保存时间延长到18个小时，他们未能证明肝细胞中的这种功能改变(13)。除了这些研究之外，关于冷局部缺血后移植物排出胆汁成分的能力方面的改变，仅获得了很少的信息。这些指标包括肝细胞产生用于胆汁形成的渗透驱动力、排出胆汁盐或有机阴离子的能力；因而，谷胱甘肽和胆红素的排出可以充当检测移植物中早期肝细胞变化的标记。排出有机阴离子的能力可以确定移植物解毒生物异源物质的效力和冷局部缺血后高胆红素血症的严重度，临床移植中异体移植物功能障碍的风险系数(2，16)。
发明内容
本发明的目的是提供一种评估器官功能的方法。基于上述发现，本发明人继续进行了进一步的研究。
在尝试测定冷局部缺血后移植物的这种能力时，我们在此检验了与保存时间有关的胆汁样品的成分方面的变化，显示了作为肝细胞上的早期事件的、减少的谷胱甘肽和胆红素的排出。这个事件被证明是广谱抗药性相关蛋白2(Mrp2)的细胞质重定位的结果，蛋白2是一种用于有机阴离子的胆汁排出的ATP依赖性转运蛋白。我们的结果表明，这个转运蛋白的功能被减弱了，而移植物明显维持了它们的整体能量耗费，没有显示任何显著的肝细胞损伤。此外，这种肝细胞方面的变化的机制看起来涉及移植物中枯否细胞中的血栓烷合成，所述移植物处于相当短时间的冷局部缺血条件下；即8小时。
本申请提供了以下发明：
(1)一种分析器官或组织损伤的方法，包括以下步骤：
(a)用染料标记器官或组织；
(b)获得关于所述器官或组织的生物异源物质代谢和/或细胞状况的多个指标；和
(c)从所述指标分析所述器官或组织损伤。
(2)(1)的方法，其中所述器官或组织是选自肝、肾、肺、胰腺和胃肠道的至少一种。
(3)(1)或(2)的方法，其中所述步骤(b)进一步包括获得血管***和/或排出途径的微观解剖学定向的步骤。
(4)(1)到(3)中任一项的方法，其中所述分析可视地和/或定量地进行。
(5)(1)到(4)中任一项的方法，其中所述细胞状况是选自细胞生存力、细胞损伤、分子转运和线粒体功能的至少一种。
(6)一种评估药物毒性的方法，包括以下步骤：
(a)用染料标记器官或组织；
(b)对所述器官或组织施用测试药物；
(c)获得关于所述器官或组织的生物异源物质代谢和/或细胞状况的多个指标；
(d)从所述指标分析所述器官或组织损伤；和
(e)评估所述药物是否对所述器官或组织具有毒性。
(7)(6)的方法，其中所述器官或组织是选自肝、肾、肺、胰腺和胃肠道的至少一种。
(8)(6)或(7)的方法，其中所述步骤(b)进一步包括获得血管***和/或排出途径的微观解剖学定向的步骤。
(9)(6)到(8)中任一项的方法，其中所述分析可视地和/或定量地进行。
(10)权利要求6到9中任一项的方法，其中所述细胞状况是选自由细胞生存力、细胞损伤、周围细胞中的分子转运、生物活性化合物的产生、血流和组织氧化的至少一种。
附图的简要说明
附图1显示了经历了冷保存和随后的再灌注的肝脏移植物的胆汁排出量的时间曲线。空心圆圈表示来自非局部缺血对照肝脏的数据。空心的、阴影的和实心的方形表示来自分别暴露于8、16、24小时冷保存条件的移植物的数据。实心三角形表示来自48小时保存的移植物的数据。数值是5个独立实验的平均值±SE。TC(+)和TC(-)：在存在和不存在30μmol/L牛磺胆酸钠的情况下收集的数据。R：开始再灌注。注意到，胆汁盐非依赖性和依赖性的排出量，在16小时保存的移植物中都下降了。*与来自对照的数据比较P＜0.05。与来自16小时移植物的数据比较P＜0.05。#与来自24小时移植物的数据比较P＜0.05。
附图2显示了持续的冷局部缺血对胆汁成分的胆汁浓度的影响。胆汁成分的数据是在开始再灌注后20分钟收集的。A：胆汁盐(图表A)。B：磷脂。C：胆汁中还原谷胱甘肽(GSH)的浓度。D：再灌注之前和20分钟之后在对照和16小时保存的移植物中测量的GSH的肝脏含量。E：胆汁中胆红素(BR)-IXα的浓度。F：再灌注之前和20分钟之后在对照和16小时保存的移植物中测量的BR-IXα的肝脏含量。数值是5-7个独立实验的平均值±SE。*与来自对照肝脏的数据比较P＜0.05。#与来自16小时组的数据比较P＜0.05。与来自暴露于20分钟再灌注的对照移植物的数据比较P＜0.05。
附图3显示了冷局部缺血-再灌注的移植物中，在肝细胞羧基荧光素(CF)排入胆小管的动力学方面的改变。A：在消除丙磺舒之前(基础加载)、10分钟和25分钟之后记录的小管CF排出的代表图。注意到，在24小时冷局部缺血-再灌注的移植物(箭头)中，胆小管网络的蜂巢模式的破裂。彩条表示用已知CF浓度校准了的荧光强度。条：30μm。B：胆小管网络的再灌注诱导的破裂方面的差异，是通过保存在冷局部缺血各个持续时间的移植物中CF填充的多边形的密度判断的。*与来自对照肝脏的数据比较P＜0.05。C：显示了组当中相差不大的CF加载的起始肝细胞CF浓度。数值是5个独立实验的平均值±SE。
附图4显示了通过使羧基荧光素(CF)的胆小管排出可视化的Mrp2功能体内定量分析。A：显示来自单独肝细胞的染料排出的代表性系列图片。上图：来自在存在1.5mM丙磺舒(PB(+))的情况下灌注的移植物的图象。下图：来自消除丙磺舒(PB(-))后获得的图象。注意到，在细胞中时间依赖性的荧光减少，之后是在周围的胆小管中染料的浓缩和消失。保留在细胞中的染料是应当注意的。B：肝细胞CF荧光的衰减。用丙磺舒处理(实心圆圈)或不用丙磺舒处理(空心圆圈)的移植物中肝细胞CF浓度，相对于时间半对数性地标绘，从而直线代表了指数曲线。插图：标准曲线表示了CF的浓度和8位灰度水平之间的关系。[CFapp]：CF的表观浓度。在小于3μmol/L的浓度下CF浓度与灰度水平线性相关(r2＝0.996，p＜0.05)。C：来自肝细胞的CF排出的半衰期(T1/2)方面的差异。数值是每个组中5个独立实验的平均值±SE。*与来自对照肝脏的数据比较P＜0.05。EHBR：从Eisai高胆红素血症大鼠分离的移植物。PB：用1.5mM丙磺舒灌注的移植物。
附图5显示了在冷局部缺血-再灌注时肝脏移植物将羧基荧光素(CF)排入胆汁的能力方面的改变。A：在暴露于变化的冷局部缺血持续时间的移植物中胆汁CF排出的时间差异。空心圆圈：在消除1.5mM丙磺舒—一种Mrp2抑制剂后立即灌注的对照移植物。空心和阴影方形：分别经历了8小时和24小时冷保存，随后在不存在丙磺舒的情况下再灌注的移植物。阴影圆圈：在存在丙磺舒的情况下标准再灌注的移植物。实心圆圈：从Eisai高胆红素血症大鼠分离的标准灌注的移植物。数值是5个独立实验的平均值±SE。T0：灌注液中消除丙磺舒的时间。插图：CF浓度和荧光强度之间的线性关系。B：在变化的再灌注持续时间收集的胆汁中相对CF浓度方面的改变，和枯否细胞(KC)的损耗的影响。左图：在对照(0小时，虚线)和8小时保存的肝脏移植物(8小时，实线)之间胆汁CF排出的衰减方面的差异。右图：通过静脉注射脂质体密封的二氯亚甲基二膦酸(LDD)耗尽KC的影响。空心圆圈：对照(0小时，虚线)。空心方形：8小时保存的移植物(8小时，实线)。数据是来自4个独立实验的测量的平均值±SE。与对照肝脏中CF排除的衰减比较*P＜0.05。C：在8小时冷保存的肝脏中通过LDD和/或用OKY-046(OKY)处理耗尽KC[KC(-)]对延长T1/2值的影响，OKY-046是一种血栓烷A2合酶的抑制剂。IM：吲哚美辛。在保存和冲洗液中OKY和IM的浓度分别是240μmol/L和28μmol/L。注意到，在KC耗尽的移植物中OKY的抑制作用消失了。数值是5-6个独立实验的平均值±SE。*与来自对照肝脏的数据比较P＜0.05。与8小时保存的移植物中的数据比较P＜0.05。
附图6显示了在暴露于8小时冷局部缺血和60分钟再灌注(8小时/R)的肝脏移植物中Mrp2的细胞内分布的破裂，枯否细胞(KC)耗尽步骤[KC(-)]或用OKY-046(OKY)处理的影响。A：用抗丙烯醛单克隆抗体5F6对Mrp2的Western印迹分析和免测沉淀。M：分子标记。B：Mrp2分布的免疫荧光分析。左图：使用藻红蛋白标记的抗Mrp2单克隆抗体(M2III-6)的单着色。条：30μm。右图：使用FITC标记的ZO-1抗体和藻红蛋白标记的M2III-6抗体的双免疫着色。条：10μm。C.肝细胞的Mrp2定位的半定量分析。％I-Mrp2(cyt/bc)；对比在胆小管测量的那些，Mrp2相关的免疫反应性的细胞质强度。数值是来自4个独立肝脏的40-60个肝细胞/移植物中的测量的平均值±SE。*与来自对照肝脏的数据比较P＜0.05。与从8hr/R-KC(+)组收集的数据比较P＜0.05。
实施发明的最佳方式
以下，将更详细地描述本发明。
尽管枯否细胞(KC)已经被认为在冷局部缺血后肝细胞的损伤中起到决定性的作用，它们在非坏死性移植功能障碍中的作用仍是未知的。这项研究目的是阐明KC在冷局部缺血后肝脏移植物中所起的作用。用脂质体密封的二氯亚甲基二膦酸处理或不处理的大鼠肝脏被保存在4℃的威斯康星大学溶液中8-24小时，在监视胆汁排出量和成分的情况下再灌注，二氯亚甲基二膦酸是一种KC减耗剂。通过原位激光共焦微荧光自显影评定肝细胞排出胆汁的能力。冷局部缺血-再灌注移植物在8小时降低了它们的胆汁排出量而没有任何显著的细胞损伤。这个事件与谷胱甘肽和胆红素-IXα减弱的排除相符，暗示了这些有机阴离子的受抑制的转运。机制涉及广谱抗药性蛋白-2(Mrp2)的细胞内重定位。羧基荧光素的胆汁排出的动力学分析显示了染料从肝细胞排出到胆小管中的显著的延迟，所述羧基荧光素是经由这种转运蛋白排出的荧光探针。在8小时冷局部缺血移植物中，通过Mrp2从细胞质重分配到小管膜，KC-耗尽治疗显著地减弱了这种由Mrp2介导的胆汁阴离子转运方面的下降。此外，这些机制看起来涉及KC中的血栓烷A2合酶，因为在KC耗尽的移植物中，对于CF排出和Mrp2的细胞质内在化，阻断这种酶的改善的影响消失了。总之，这些结果表明，KC活化是非坏死性肝细胞功能障碍的重要决定因素，危害了冷局部缺血后移植物的解毒能力和有机阴离子代谢的稳态。
在本说明书中，使用了一些缩写：BC，胆小管；BR-IXα，胆红素-IXα；CF，5-羧基荧光素；CFDA，5-羧基荧光素双醋酸盐；EHBR，Eisai高胆红素血症大鼠；GSH，还原谷胱甘肽；KC，枯否细胞；LDD，脂质体密封的二氯亚甲基二膦酸；Mrp2，广谱抗药性蛋白2；TXA2，血栓烷A2。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种分析器官或组织功能障碍和/或损伤的方法。所述方法包括以下步骤：
(a)用一种或两种染料标记所述器官或组织；
(b)获得表明细胞和/或器官功能的多个指标，所述功能是关于分子转运和排出、生物异源物质代谢和/或所述器官或组织的细胞状况；和
(c)从所述指标分析所述器官或组织损伤。
在本发明中，器官或组织损伤是指坏死、细胞凋亡或细胞质膜的破裂。
为了在活体状况下标记器官或组织，可以采用使用染料(例如荧光染料、罗丹明或荧光素盐或碘化丙锭)的常规方法。例如，这些染料可以采用对实验动物静脉注射或腹膜内注射，或用受控的浓度血管内灌注到肝脏、肾、胰腺、胃肠道或肺的分离的灌注器官制品，来加载。
多个指标是指细胞生存力、线粒体膜电位、无氧的自由基、阴离子或阳离子的跨细胞膜转运、细胞质膜电位，和包括细胞凋亡或坏死的细胞死亡。多个指标的实例包括，但不限于生物异源物质代谢和细胞生存力。
生物异源物质代谢是指在身体内降解的任何类型的外源试剂或药物的代谢和/或分解代谢。
细胞状况是指活细胞的任何类型的功能状态，包括分子转运(例如，细胞内和细胞周的分子转运)、膜电位、线粒体功能、生物活性化合物的产生(生物活性物的产生)、血流和组织氧化、阴离子和阳离子的摄取和排出、和丧失了生存力，例如坏死或细胞凋亡的细胞的状态。细胞状况的实例包括但不限于细胞生存力和细胞损伤。
在本发明的一个实施方式中，术语″胞和它们的包围组织，例如微血管***和细胞间隙，包括淋巴***和/或***(例如，肝脏中的胆小管***)之间的地理关系。因而，微观解剖学定向的实施例包括但不限于肝脏中的胆小管网络。
术语″
动脉、毛细血管和小静脉。
术语″排放到细胞间隙中的途径。
在本发明中，可以采用监视整个器官的功能参数来可视地或定量地研究器官或组织损伤。术语″的定量信息的活体图象。术语″的数值。整个器官功能参数包括但不限于胆汁排出量、胆汁成分例如胆汁酸、磷脂、胆固醇和碳酸氢盐的测定。
在本发明的另一个实施方式中，提供了一种评估药物毒性的方法。在本发明中，包括以下步骤：
(a)用染料标记器官或组织；
(b)对所述器官或组织施用测试药物；
(c)获得关于所述器官或组织的生物异源物质代谢和/或细胞状况的多个指标；和
(d)从所述指标分析所述器官或组织损伤；和
(e)评估所述药物是否对所述器官或组织具有毒性。
在本发明中，药物毒性是指试剂或药物对活细胞的任何类型的有害作用，包括已知酶或转运蛋白的功能。药物的实例包括但不限于ABC转运蛋白的抑制剂(例如，作为mrp2的抑制剂的丙磺舒、环孢素、阿霉素、顺铂、甲腈咪胍，等等)。
词语″
某些指标来分析器官或组织损伤，可以评估药物毒性。例如，当任何ABC转运蛋白的功能指标变化时，评估为该药物(例如，ABC转运蛋白)对所述器官或组织有毒性。当所述指标保持稳定时，评估为该药物(例如，ABC转运蛋白)对所述器官或组织没有毒性。
本发明提供了证据，证据肝细胞进行有机阴离子的Mrp2依赖性排出的减弱的能力，是显示移植物功能障碍的早期事件的原因，所述移植物功能障碍由器官或细胞损伤，例如冷局部缺血和随后的短时间再灌注所引起。在肝细胞上的这种变化是细微的和非坏死性的，但严重到足以引起整个移植物水平上谷胱甘肽和胆红素的细胞生产和排出之间的不平衡。冷局部缺血的持续时间延长直到16小时，诱导了以胆小管的扩张和消失为特征的胆小管功能障碍，而如果冷保存的持续时间不超过8小时，它们的多边形网络保持原样。对我们的知识而言，这种暴露于相对短时间冷局部缺血的肝细胞的非坏死性功能障碍，是否是由包括KC的窦状隙细胞的缺血后反应所介导的，还是未知的。如在此所显示的，经由Mrp2的排出有机阴离子的降低的能力通过耗尽KC被完全地恢复，表明这种窦状隙细胞涉及功能障碍的机制。
在8小时冷局部缺血后的移植物重Mrp2介导的转运的损伤，是由这种转运蛋白的细胞质重定位所引起的，但是既不是由胆小管网络的破裂，也不是由转运蛋白本身的氧化修饰所引起的；这与我们的上述观察结果相一致，所述观察结果是8小时冷局部缺血和再灌注在肝脏移植物中没有显示任何显著的氧化应力(14)。cAMP是胆小管分选Mrp2的决定因子(32，40，41)，cAMP中的改变在KC介导的功能障碍中不太可能起到作用，因为不管是否存在KC其含量没有不同。ATP的肝细胞含量是转运蛋白功能的另一个决定因素，但可能起到很小的作用，即使起到作用，在机制方面，因为在经历了8小时冷局部缺血的KC耗尽的和对照移植物之间，任何差异都是显著的。由于在正常肝脏中KC耗尽不改变Mrp2排出有机阴离子的能力，在移植物中转运蛋白功能的这种改变看来是由KC的反应所引起，除非移植物经历了冷局部缺血-再灌注这种反应不会被触发。尽管详细的机制仍是未知的，当前的结果表明涉及TXA2合酶，这是一种与TX有关的酶，TX是从KC释放的***素类化合物的主要类别(37，38)。在KC耗尽的移植物中酶抑制剂的阻碍效果被完全消除了，这种观察结果使我们想到，KC构成了TX的主要来源，TX触发了Mrp2进入肝细胞的细胞质的内在化。尽管TXA2被认为对各种类型的细胞发挥了强烈的生物学作用，上述研究提供了一种证据，TXA2的相对稳定的代谢产物TXB2，能够激活非溶酶体蛋白酶，从而触发原代培养的肝细胞的水泡形成(42)。因而，KC衍生的TX影响肝细胞功能的进一步的机制是必需的。
根据用受控量的CF预加载的移植物新开发的染色排阻分析方法显示，Mrp2的重定位在肝细胞水平发生，因袭整个移植物功能的显著退化。如附图3中所见，8小时的保存显著地降低了胆汁的谷胱甘肽排出，而没有显示组织含量方面的任何变化，如果有的话。因为这种有机阴离子充当了产生不依赖胆汁酸的胆汁形成的渗透驱动力的主要物质，在胆汁中它的减少会引起排出量方面的下降。这种观点也与我们的观察结果相符，8小时保存的移植物显示了排出量的明显减少。
关于这点，在移植物中BR-IXα的内源产生和胆汁排出之间的不平衡在当前的研究中是非常令人感兴趣的。如附图2所示，在灌注的20分钟内对照肝脏可以排出约75％的内源BR-IXα到胆汁中，与我们的上述研究相符(24)。另一方面，胆汁色素的这种快速消除在16小时冷局部缺血性移植物中没有发生。根据BR-IXα的胆汁浓度判断(附图2F)，色素的绝对量升高了，但与非冷局部缺血的对照移植物相比决没有减少。由于释放到循环中的BR-IXα的量可以忽略(数据未显示)，这些结果表明，冷局部缺血的移植物在最初的20分钟再灌注期间，比根据将色素排入胆汁的能力所预期的那些，合成了更多量的色素。这种观点与我们的观察结果很好地一致，移植物诱导了血红素加氧酶-1，血红素降解的压力诱导酶(43)。从冷局部缺血后的移植物的抗氧化应力反应来看，这个事件具有病理生理学的重要性。近来我们报道了，低剂量的胆红素可以改善氧化应力，从而保护冷局部缺血后的肝脏移植物，尽管它的过度剂量是明显有害的(31，43)。在暴露于冷局部缺血的移植物中，再灌注会引起两个重要的事件，关键性地支配肝脏的胆红素代谢；提高血红素降解和经由Mrp2的BR-IXα延迟因而，这两个事件的组合作用会引起这种抗氧化剂积累到足以保护肝细胞，而在再灌注的后期它们的延续效果引起肝细胞的损伤和高胆红素血症。
KC充当了类二十烷酸的强力产生者，而肝细胞和在它们的膜上表达的ATP结合盒转运蛋白分别帮助了它们的降解和排除(38，39)。另一方面，在冷局部缺血后的移植物中，抗氧化剂有机阴离子，例如谷胱甘肽和胆红素，为它们向胆汁的排出共用Mrp。因而，在KC介导的类二十烷酸合成和从肝细胞中除去它们之间的平衡可以决定抗氧化阴离子在周围肝细胞中的重新分配，从而支配肝脏移植的功能结果。倘若谷胱甘肽和BR-IXα的细胞内和细胞间动力学的定量信息是可以获得的，来检测KC产生的血栓烷是否能充当针对随后的移植物氧化应力的早期警报机制，KC介导的对Mrp介导的有机阴离子转运的改变值得进一步研究。
实施例
在下文中，参考以下实施例更详细地描述本发明。应当注意的是，本发明的技术范围不受这些实施例的限制。
材料和方法
动物制备
在此描述的实验方案是经Keio医科大学的动物关照委员会提供的我们的制度原则批准的。雄性Wistar大鼠(220-260g，CLEAJapan，Tokyo)和Eisai高胆红素血症大鼠(EHBR)(220-260g，Sankyo Inc.，Tokyo)容许自由取得实验室食物和饮用水，在实验前24小时被禁食。这些大鼠的肝脏在体外用充氧的Krebs-Henseleit缓冲液作为基线灌注液进行灌注(17，18)，保存在4℃威斯康星大学溶液中持续希望的时长(14)。必要时，在根据我们的上述研究制备用于冷保存的体外肝脏灌注物之前24小时，静脉注射脂质体密封的二氯亚甲基二膦酸(LDD)预先处理大鼠(14，19)。如先前描述的，通过免疫组织化学判断，这个步骤几乎完全地消除了枯否细胞(20)。冷保存之后，用40ml的乳酸盐Ringer溶液的转运注射剂轻轻地冲洗移植物，用含有或不含30μmol/L牛磺胆酸钠的充氧的缓冲液，以单程的模式恒流(32mL/min)灌注(14，21)。对于某些实验，以期望的浓度向UW溶液以及冲洗溶液中添加OKY-046或吲哚美辛(IM)，OKY-046是血栓烷A2(TXA2)合酶的抑制剂，吲哚美辛是环加氧酶的抑制剂(22)。
胆汁和组织成分确定
用胆汁样品测定总胆汁盐、磷脂、还原谷胱甘肽(GSH)和胆红素-IXα(BR-IXα))的浓度(23，24)。通过使用24G7的酶联免疫吸附测定测定BR-IXα(24)。这个单克隆抗体可以识别BR-IXα，BR-IXα是特别地经由较早描述的HO反应产生的末端血红素降解产物(24，25)。按较早的描述测定乳酸脱氢酶(LDH)的活性(17)。在肝脏移植物中的腺苷三磷酸(ATP)通过在其他地方描述的荧光素/荧光素酶法测定(14，21)。移植物中的环AMP通过酶联免疫吸附分析测定(BiotrakTM***，Amersham Biosciences，Buckinghamshire)。
羧基荧光素的胆汁排出率的分析
羧基荧光素(CF)是通过Mrp2从各种细胞排出的有机阴离子(26，27)。这个染料的酯前体，CF双醋酸盐(CFDA)，在存在1.5mmol/L丙磺舒的情况下以50nmol/L转运地加载到肝脏上，丙磺舒是Mrp2的强力抑制剂(26，28)。这个试剂可以进入肝细胞，通过酯酶被水解成CF，以排到胆汁中(14，17，29)。在CFDA加载10分钟后，用无丙磺舒的缓冲液灌注肝脏以触发CF排出到胆汁中。在冷局部缺血组中，保存的移植物在存在丙磺舒的情况下用含有缓冲液的CFDA加载10分钟，之后除去丙磺舒，随后再灌注50分钟。从这些制备物收集的胆汁样品进行深度冷冻，直到使用96孔多通道荧光分光光度计进行荧光测量。在440nm的上照明之下进行测量，产生510nm荧光的染料的等消光波长不受样品pH值的干扰(26)。样品中CF浓度用已知浓度的溶于磷酸盐缓冲盐水的CF进行标定。如稍后在结果中所见的，CF浓度似乎随时间指数地下降。根据这个假定，胆汁CF的生命期被确定为指数式衰减的T1/2。因而，该方法对于加载到灌注的肝脏上的CF的初始量不敏感。
肝细胞CF排出的原位可视化
使用上述方案用CF加载的肝脏移植物通过早先描述的活体激光共焦微荧光自显影进行观察(14，20，30)。如稍后在结果中所见的，CF在存在丙磺舒的情况下被显著地加载到肝细胞中。在除去试剂时，染料立即被肝细胞排出，排到胆小管(BC)中，显示出蜂巢网络，最终从实质中消失。为了检测染料排出是否取决于Mrp2的功能，一些移植物用含有1.5mmol/L丙磺舒的缓冲液再灌注。激光共焦微荧光自显影通过装备有加强CCD摄像机(C5810，Hamamatsu Photonics)和多孔激光共焦处理器(CSU-10，YokogawaElectric Co.)的反型显微镜(Diaphot 300，Nikon/Sankei))捕捉。所有的微荧光图象都数字化处理为8位灰度水平图象。为了校准荧光强度，在试管内制备已知的浓度的CF，在同样的照相机光学参数下捕获图象。使用数字图象处理器通过可变的方格(2×2μm2)测量肝细胞中的灰度水平(18，31)。在单个实验中分析目标显微镜视野中的至少10个不同肝细胞。假定在肝脏表面测量的荧光强度与在溶液中测量的相一致，使用标定线将灰度水平转变为直观的CF浓度，称为CFapp。
我们还进行了形态测定来检查BC网络中的结构变化作为肝细胞损伤的指标。如稍后在结果中所见的，功能正常的肝细胞以围绕BC的多边形CF填充为特征，而那些损伤的肝细胞通过围绕BC网络的部分消失来判断。计算目标区域中这种由CF填充的完整BC围绕的完整肝细胞的数目。对于这种评估，在单个实验中分析约0.05mm2的肝脏表面。
亚细胞Mrp2分配的免疫组织化学分析
为了评估移植物的肝细胞中的Mrp2，根据上述研究，固定肝脏样品，切片，用单克隆抗体M2III-6着色(32)。通过藻红蛋白共轭的抗鼠IgG使切片上的抗原可视化，如在别处描述的通过激光共焦微荧光自显影在488nm观察(20，30)。为了检测BC定位和Mrp2肝细胞内在化，用针对ZO-1，在肝细胞连接点上表达的另一个标记物的单克隆抗体对切面进行双免疫着色(33)。为了以半定量方式测定蛋白分配方面的变化，将Mrp2的单着色的微荧光图象转化为单色8位图象(14)。在单个肝细胞的细胞质区和小管区都测量灰度水平(1-256)。在单个细胞上为每个区域选择至少5个不同部位来计算细胞质强度相对相应的小管强度的相对值。在4个不同移植物中的40-60个肝细胞中进行这种测量，来构建Mrp2相关的免疫反应性的细胞质强度的百分比的直方图，定义为％I-Mrp2(cyt/bc)。这个指标的升高说明Mrp2内在化方面的增加。在对照移植物和那些暴露于冷局部缺血的、有或没有KC耗尽步骤、存在或不存在TXA2合酶抑制剂的移植物之间，比较直方图。
为了检查各组之间整个肝脏移植物中Mrp2表达方面的差异，用相同的单克隆抗体进行Western印迹分析。我们还通过用抗体M2III-6将蛋白免疫沉淀，接着用抗丙烯醛单克隆抗体(5F6)进行Western分析，研究了Mrp2的氧化修饰方面的改变(34，35)。
统计学分析
通过就ANOVA和Fischer’s多重比较测试来确定不同实验组之中数据的统计学显著性。P＜0.05被认为是显著的。
结果
在肝脏移植物中胆汁排出量的保存时间依赖性的降低
为了测试肝脏移植物的生存力，测量静脉的灌注液中乳酸脱氢酶的释放，作为细胞溶解作用的指标。如表1中所见，暴露于冷局部缺血少于24小时的移植物没有显示出乳酸脱氢酶的任何显著的升高。
表1.冷保存的持续时间对于移植物的静脉灌注液中LDH释放的影响
  冷保存时间(小时)   5分钟-R   60分钟-R
  对照8162448   20±631±721±845±8878±377*   35±1125±934±643±221206±719*
数据表示的是在开始时(0分钟)和开始再灌注60分钟后(0-24小时；n＝5，48小时；n＝3)对移植物的测量的平均值±SE(mIU/min/g肝脏)。*与其他组的数值相比P＜0.05。
在48小时，乳酸脱氢酶的释放在开始和60分钟再灌注的结尾变得明显的，显示了在当前实验条件下，在暴露少于24小时的冷局部缺血移植物中坏死性细胞死亡是不可检测的。附图1说明了在经历不同时长的冷局部缺血的移植物中胆汁排出量与再灌注时间有关的时间曲线。如在表盘A中可见，其中添加了牛磺胆酸钠，暴露于8小时缺血的移植物升高了它们的排出量达到可与30分钟的对照相比的水平，但在开始再灌注后50-60分钟降低了。在暴露于延长的冷局部缺血16-48小时的移植物中，这种排出量的降低变得更加明显。附图1的表盘B显示了在灌注液中不存在牛磺胆酸钠的情况下监视的胆汁恢复的时间曲线。可见，冷局部缺血处理长于16小时的组别显示了排出量方面的显著降低。
在冷局部缺血后的肝脏中谷胱甘肽和胆红素的胆汁排出方面的改变
经历了16和24小时冷局部缺血的移植物中胆汁流动方面的显著下降的观察结果使我们确定胆汁成分是胆汁淤积变化的原因。附图2说明了在开始再灌注后20分钟测量的胆汁成分的数据，这些数据作为冷局部缺血的保存时间的函数来绘制。可见，在任何长度的保存时间中胆汁盐的浓度没有展现出任何显著降低，而在暴露于8到24小时冷局部缺血的组中，磷脂在浓度和流量方面都显示了显著的降低(附图2A和2B)。考虑到磷脂主要是从肝细胞排到胆区室中的，这些数据表明在保存长于8小时的移植物中肝细胞功能障碍的存在。
我们接下来在监视GSH的组织含量的情况下检查了GSH的胆汁排出(附图2C)。在8小时GSH方面的胆汁浓度显著地降低了，随冷保存时间的延长而下降。然后我们检查了GSH的肝脏含量：如在附图2D中所见，在再灌注前和再灌注20分钟后肝脏GSH含量没有变化。在保存了16小时的移植物中，作为使用含GSH的威斯康星大学溶液的结果，该含量表面上提高了。然而，在20分钟再灌注时，在从循环中除去GSH时，该含量被快速地压抑到对照水平，显示了16小时冷局部缺血后的20分钟再灌注没有改变移植物中的基础GSH含量。这些结果表明，只要保存时间短于16小时，在冷局部缺血后的肝脏中胆汁GSH排出方面的下降是由其向胆汁的转运所引起，而不是由其在移植物中的减少所引起。由于GSH是经由Mrp2排出的，我们接下来检查了BR-IXα的胆汁浓度方面的变化，BR-IXα是由同样的转运蛋白排出的胆汁色素。如在附图2F中所见，在8小时缺血组中在最初的20分钟再灌注中BR-IXα的胆汁浓度显著地升高了，在16小时保存的组中达到最大。最后，在经历了24小时冷局部缺血的移植物中，BR-IXα的初始浓度突然地降低了。附图2F说明了移植物将内源BR-IXα清除到胆汁中的能力。如在对照移植物中所见，这中胆汁色素的肝脏含量在最初的20分钟灌注中显著地降低了。另一方面，在16小时处理的移植物中相同持续时间的再灌注没有引起这种下降。这些结果表明，16小时移植物产生BR-IXα的能力重新超过了它们将该色素排入胆汁的能力。
通过羧基荧光素排阻对Mrp2功能的全局和局部评定
在GSH和BR-IXα的胆汁排出方面的改变提供了这样的可能性，Mrp2从肝细胞中清除这些有机阴离子的能力在暴露于延长的冷局部缺血的移植物中被削弱了。然而，由于在各组之间谷胱甘肽和BR-IXα的初始量不同，对这些内源阴离子的胆汁排出的测量不能容许我们对移植物的有机阴离子排出能力进行公平的比较。为了克服了这个困难，用CF加载移植物，CF是一种外源有机阴离子，检查它从肝细胞到胆汁的清除。如在附图3A的左表盘所见，肝细胞的CF加载看来在暴露于不同的时长(0-24小时)的冷局部缺血的移植物之中是可比较的。这在附图3C中通过荧光强度测量被确认，显示了肝细胞是存活的。这同样与显示了不显著的LDH释放的结果相一致(表1)。丙磺舒是Mrp2的抑制剂，在除去丙磺舒后被立即加载到肝细胞中的CF，被快速地排到胆小管中，10分钟内在小叶上形成了蜂窝状网络(附图3A中中间的栏)。在25分钟(右栏)，在细胞质内微小的荧光是可检测的，如果有的话。在经历了冷局部缺血再灌注的移植物中，出现了胆汁CF排出方面的两个主要变化：根据在25分钟基础荧光的升高判断的肝细胞染料排阻的延迟，和在10分钟收集的显微照片中显示的胆小管网络的消失和变形。在暴露于延长的冷局部缺血24小时的移植物中，这些变化变得明显(附图3A中的底端行)。
在10分钟捕获的这些微荧光图象中对胆小管的部位的仔细扫描显示了小管网络的结构方面最小的、但可察觉的变化。如在附图3B中所见，完全地被CF填充的BC围绕的肝细胞的数目随冷局部缺血持续时间的升高而降低。在保存了16小时的移植物中这种多角形的减少变得很明显。由于在0到24小时之间的缺血持续时间内，加载到肝细胞中的初始CF是可比较的，BC中的形态变化看来最初在16小时冷局部缺血时出现。换句话说，暴露于8小时冷局部缺血的移植物没有展现出BC网络的形态学方面任何显著的变化。
通过监视移植物的肝细胞中荧光方面的时序变化，以定量的方式进一步检查CF排阻的延迟(附图4A)。可见，当不断地灌注丙磺舒时，染料留在细胞中，展现出轻微的下降而没有显示小管的排出。如在附图4B中标绘的，在肝细胞测量的灰度水平允许我们确定从干细胞排出的CF的T1/2。附图4C说明了各组之间的T1/2值。在不存在丙磺舒的情况下，T1/2大约为6分钟，而在存在丙磺舒的情况下，衰减实质上被降低了，表明对Mrp2转运的接近完全的抑制。可见，8小时冷局部缺血的移植物排出CF的T1/2显著地更高，范围介乎对照值和在EHBR的肝脏中测量的值之间。可以推测，在这个突变物种中与丙磺舒处理的组相比更小的T1/2值是由于经由Mrp3将染料代偿性排出到窦状隙间隔的结果(36)。
在8小时冷局部缺血的移植物中KC耗尽对胆汁CF排出的影响
然后，我们尝试评估8小时冷局部缺血的移植物整体上排出CF的能力。为此，测定染料排出的T1/2值(附图5)。在除去丙磺舒(附图5A中T0)后，胆汁中的CF浓度短暂地升高丙逐渐地回到基础水平。在存在丙磺舒的情况下(阴影的圆圈)，或在分离自EHBR的移植物中(实心圆圈)都没有观察到这种短暂升高，表明Mrp2与胆汁CF排出有关。当在保存8小时和16小时的整个肝脏移植物中分析CF排出时，衰减似乎比对照中的更慢。使用从8小时缺血移植物中收集的数据，根据再灌注时间标绘胆汁样品中CF浓度对比峰值(10分钟)的对数值(附图5B)。然后比较用KC耗尽和不用KC耗尽处理的移植物之间的染料排阻的T1/2值。可见，在未用LDD(KC(+))处理的肝脏中，与对照相比，8小时冷局部缺血展现了延长的T1/2值。在KC耗尽的移植物中，在两个组别之间的T1/2方面的这种差异完全消失。应注意的是，在非冷局部缺血的对照肝脏中，KC耗尽步骤本身不改变T1/2值，表明仅当移植物经历了冷局部缺血-再灌注时KC耗尽的改善效果才变得明显。
为了揭示这样的机制，即在8小时冷局部缺血的移植物中的KC通过mrp2导致延长的CF排出，我们检查了与血栓烷的关联，血栓烷是在冷局部缺血条件后从活化的KC释放的主要***素类化合物(37，38)。为此，检查OKY-046的影响，OKY-046是TXA2合酶的抑制剂。如在附图5C中所见，以240μmol/L将这个试剂应用到保存器和冲洗液中几乎完全地消除了CF排出的T1/2值的增加。因为TXA2合酶抑制剂可能提高花生四烯酸合成其他***素类化合物(例如PGE2和PGF2α)的可用性，我们检查了吲哚美辛(IM)是否可以减小或增加T1/2值，吲哚美辛是抑制通过环加氧酶途径，包括TX产生的所有***素类化合物的抑制剂。如所示，这种抑制剂也几乎完全地减弱了延长的T1/2值。此外，当KC被耗尽时OKY-046对8小时冷局部缺血移植物的影响消失了，表明与TX的关联是KC依赖性的。
8小时冷局部缺血的Mrp2细胞内重定位和其由KC耗尽的衰减
因为已知在内毒素处理的肝脏中KC下调节Mrp2(39)，我们检查了这种变化是否被牵涉到转运蛋白功能障碍的机制之中。如Western印迹分析所示，在8小时冷局部缺血的移植物中(附图6A)以及24小时缺血的移植物中(数据未显示)Mrp2蛋白的量不变。我们还检查了蛋白本身是否由于缺血后的氧化损伤被氧化性地修饰。然而，根据使用抗丙烯醛抗体的免测沉淀法判断，没有发现明显的变化。然后，检查了在8小时冷局部缺血的移植物中该蛋白的肝细胞定位是否被改变。如在附图6B中所示，在8小时缺血-再灌注的移植物重，其在BC中的定位被显著地降低了，而在肝细胞的细胞质中的背景荧光升高了。如在下方的表盘重所示，用ZO-1(绿色)的双免疫着色揭示了，Mrp2(红色)在BC中的共定位被显著地破坏，而其在细胞质中的强度升高，表明了蛋白的内在化。在用KC耗尽或用OXY-046处理的移植物中这种变化被减弱了。而内在化指标的％I-Mrp2(cyt/bc)值显示了，8小时的冷局部缺血-再灌注显著地增强了Mrp2内在化，用KC耗尽处理或用TXA2合酶的阻断处理改善了转运蛋白的胆小管重定位。
我们测定了8小时冷局部缺血-再灌注后在KC(+)和KC(-)移植物中ATP和cAMP的肝脏含量差异，但在两个组别中没有任何显著的意义(分别是ATP含量3.4±0.9 vs 2.9±1.1μmol/g肝脏，和cAMP含量8.9±1.0 vs 9.2±0.5pmol/g肝脏)。这些结果表明通过KC耗尽的这种ATP结合蛋白的细胞内恢复的改善不是由ATP和cAMP的组织含量的改变引起的。
工业实用性
本发明对于恢复临床前试剂是有用的，所述临床前试剂早先因为其器官毒性被放弃。总的说来，在常规的临床化学中显示肝脏毒性的化合物的毒性的详细机制很大程度上仍是未知的。如果通过本发明的方法详细检查这样的化合物，发现仅阻断转运蛋白功能而不影响细胞生存力，对于应用于临床用途对化学结构进行微小修改将是有效的。(2)将当前方法应用于植入了人类癌细胞的免疫缺陷大鼠，容许我们检查任何类型的药物递送的特异性和肿瘤细胞体内聚集或到完整组织的积累。这种应用对于检查体外植入的癌症中抗癌试剂的递送和消除是极为有用的，因为转运蛋白例如mrp2的功能是肿瘤抗药性的重要决定因素。用于筛选潜在的抗癌和抗血栓形成剂的潜力的临床试验的应用。
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为了各种目的，所有的文献在此通过引用被合并。

Claims (10)

1.一种分析器官或组织损伤的方法，包括以下步骤：
(a)用染料标记器官或组织；
(b)获得关于所述器官或组织的生物异源物质代谢和/或细胞状况的多个指标；和
(c)从所述指标分析所述器官或组织损伤。
2.权利要求1的方法，其中所述器官或组织是选自肝、肾、肺、胰腺和胃肠道的至少一种。
3.权利要求1或2的方法，其中所述步骤(b)进一步包括获得血管***和/或排出途径的微观解剖学定向的步骤。
4.权利要求1到3中任一项的方法，其中所述分析可视地和/或定量地进行。
5.权利要求1到4中任一项的方法，其中所述细胞状况是选自细胞生存力、细胞损伤、分子转运和线粒体功能的至少一种。
6.一种评估药物毒性的方法，包括以下步骤：
(a)用染料标记器官或组织；
(b)对所述器官或组织施用测试药物；
(c)获得关于所述器官或组织的生物异源物质代谢和/或细胞状况的多个指标；和
(d)从所述指标分析所述器官或组织损伤；和
(e)评估所述药物是否对所述器官或组织具有毒性。
7.权利要求6的方法，其中所述器官或组织是选自肝、肾、肺、胰腺和胃肠道的至少一种。
8.权利要求6或7的方法，其中所述步骤(b)进一步包括获得血管***和/或排出途径的微观解剖学定向的步骤。
9.权利要求6到8中任一项的方法，其中所述分析可视地和/或定量地进行。
10.权利要求6到9中任一项的方法，其中所述细胞状况是选自细胞生存力、细胞损伤、周围细胞中的分子转运、生物活性化合物的产生、血流和组织氧化的至少一种。
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