CN1840539A

CN1840539A - 海燕皂苷及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN1840539A
Application number: CN 200510042579
Authority: CN
Inventors: 郭承华; 董新伟; 刘传琳; 刘扬瑞
Original assignee: Individual
Current assignee: Yantai University
Priority date: 2005-03-29
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2006-10-04

Abstract

本发明公开了从海洋棘皮动物海燕中提取的海燕皂苷，及其制备方法和用途，它是以新鲜海燕为原料经粉碎，加入适量溶剂浸提，将提取液减压浓缩，得浓缩液，将上述步骤得到的浓缩液进行柱层析，以洗脱液洗脱后，再以另一种洗脱液洗脱，收集该洗脱液，减压浓缩，干燥后得海燕皂苷，海燕皂苷的溶血指数大于5000H.I./g，且上述方法制得的海燕皂苷具有明确的止咳、祛痰、平喘作用。

Description

海燕皂苷及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及海洋生物资源开发利用和天然活性物质筛选应用技术领域，具体地讲是用棘皮动物门、海星纲、有棘目、海燕科动物海燕制备一种海燕皂苷及其制备方法，及海燕皂苷在祛痰、镇咳、平喘方面的新用途。

背景技术：

海燕(Asterina pectinifera)为我国黄渤海海域常见底栖动物，主要分布于烟威渔场近岸水域、渤海中部及长山岛附近海域，在分类上属棘皮动物门，海星纲，有棘目，海燕科，在传统中医中可入药，李时珍在《本草纲目》中将之列入介部，有较为详细的描述。传统中医理论认为，海燕可平肝和胃，制酸止痛，在我国民间，曾广泛用于治疗胃溃疡、甲状腺肿大、腹泻、中耳炎、癫痫等疾病。现代研究表明，海燕含有海星皂苷、甾醇、氨基酸、多肽、多糖、脂类等多种生物活性物质，其中海星皂苷是其特有的动物性甾体皂苷，具有抗癌、抗菌、抗炎和持续降压等多种生理和药理活性。作为我国黄渤海海域棘皮动物的优势种之一，海燕在山东沿海特别是胶东半岛有大量分布，资源丰富、成本低廉，是一种具有巨大开发利用价值的良好海洋资源，但是，由于食用不当可引起食物中毒，危害人体健康等原因，海燕这种潜在生物资源一直未能得到充分的开发利用，不仅如此，作为危及海产养殖的有害生物，海燕因处于底栖动物食物链的顶端，喜食扇贝、牡蛎等软体动物，对正常的海水养殖和生产还是一种威胁。因此，迄今为止，大量的海燕资源不但没有发挥其应有的食用和药用价值，而且对人类的生活和生产产生了一定程度的危害。为充分开发海燕的食用和药用价值，发明申请人此前曾采用经典溶剂法对海燕皂苷提取进行了初步研究，经典的海燕皂苷提取方法为溶剂法，是将海燕粉碎成粉末状，用甲醇或乙醇提取，将提取液抽滤后真空浓缩，浓缩液用苯脱脂，脱脂后调PH值，用透析袋进行透析，再用水饱和的正丁醇萃取，正丁醇萃取液真空浓缩，用丙酮沉淀，离心，收集沉淀，真空干燥得海燕皂苷。此法工艺复杂，提取周期长，溶剂消耗大，产率低且皂苷质量不稳定。

众所周知，天然皂苷具有广泛的生理和药理活性，是医药工业生产和研究开发的重要原材料。迄今为止，虽然人们在植物中发现了大量的皂苷，但在动物界，只发现海星、海参等棘皮动物含有皂苷。海星纲动物资源非常丰富，自然储量很大，种类繁多，世界上已报道过的种类超过1,000种，在我国也有100多种，有药用开发价值的海星占较大比例，但是开发利用和研究报道的海星种属很少。研究表明，海星皂苷结构复杂，分离及精制十分困难，海星皂苷组成和活性在不同种属之间存在较大差异，不同海域、不同季节、不同种属海星体内的皂甙分布、化学结构和生物活性存在特异性，在生物活性方面，海星皂苷具有抗癌、抗血栓、抗溃疡、抗病毒、抗衰老、壮阳及持续降压等多种作用，为解决癌症、心脑血管疾病等一系列长期困扰人类健康的重大疾病的治疗问题提供了一条新的途径，其潜在的开发应用前景广阔。比较而言，海燕和海燕皂苷的研究相对较少，海燕(Asterina pectinifera)作为我国黄渤海海域常见的海星纲棘皮动物，在山东沿海特别是胶东半岛有大量分布，资源丰富，是海星皂苷的重要来源，但一直未得到充分的开发利用。海燕皂苷的应用开发，可以变废为宝，充分发挥海燕皂苷的生物活性和独特疗效，改善人类生活质量，造福于人，造福于社会。

流行病学研究表明，呼吸***疾病发病率占总人口患病率的16％，占城市人口总死亡率的第三位。呼吸***疾病多伴有痰多、咳嗽、哮喘等症状。痰是人体的气管分泌物，正常情况下这种分泌物可以调节人体吸入空气的温度和湿度，并随着呼吸被无意识的吞入和排除，但不会被咳出，任何咳谈痰动作都意味着呼吸***存在异常情况，如果气管内积存有待咳出的痰，就可能通过气管引起感染，同时，有待咳出的痰通常是极为粘稠的，因此，咳痰常常使患者感到痛苦，为了便于排痰、避免感染、减轻患者痛苦，临床上通常使用祛痰药；哮喘是长期危害人类健康的常见疾病，据世界卫生组织统计，目前，哮喘患者约占世界60亿人口的3.4％；我国至少有2500万哮喘患者，其中约1000万是儿童。哮喘素有治愈难、费用高的特点，哮喘患者人均年医疗费用高达2000元，以10％的治疗率和1500万人次计算，全国哮喘患者年医疗费用可达30亿元人民币。目前，哮喘治疗药物主要是气管舒张剂、皮质类固醇激素等化学合成药物，在疗效和安全方面存在一定局限性，医、患双方都迫切需要疗效明确、安全可靠、质量稳定的新型平喘药物。

发明内容：

本发明的目的是克服上述已有技术的不足，而提供一种海燕皂苷及其制备方法及其在祛痰、镇咳、平喘方面的应用。主要解决了海燕皂苷制备工艺复杂，皂苷质量不稳定及海燕皂苷在祛痰、镇咳、平喘方面的功能评价及海燕资源开发利用的问题。

为了达到上述目的，本发明是这样实现的：海燕皂苷，其特殊之处在于它是由下述方法制得，以海燕为原料经粉碎，加入适量溶剂浸提，将提取液减压浓缩，得浓缩液，将上述步骤得到的浓缩液进行柱层析，以洗脱液洗脱除去杂质后，再以另一洗脱液洗脱，收集该洗脱液，减压浓缩，干燥后得海燕皂苷，海燕皂苷的溶血指数大于5000H.I./g。

本发明还提供了海燕皂苷的制备方法，它是由下述方法制得，以海燕为原料经粉碎，加入适量溶剂浸提，将提取液减压浓缩，得浓缩液，将上述步骤得到的浓缩液进行柱层析，以洗脱液洗脱除去杂质后，再以另一洗脱液洗脱，收集该洗脱液，减压浓缩，干燥后得海燕皂苷。

本发明的海燕皂苷的制备方法的一种优选方案为，所述的粉碎为新鲜海燕采用直接绞碎、冷冻粉碎、干燥后粉碎中的任意一种方式。

本发明的海燕皂苷的制备方法的另一种优选方案为，所述的溶剂为水、乙醇、甲醇、不同浓度的含水乙醇、不同浓度的含水甲醇中的任意一种。

本发明的海燕皂苷的制备方法的另一种优选方案为，所述的提取为加入3-20倍海燕粉末重量的蒸馏水、乙醇、甲醇、不同浓度的含水乙醇、不同浓度的含水甲醇中的任意一种进行室温提取12-144小时；提取也可为加入3-20倍海燕粉末重量的蒸馏水、乙醇、甲醇、不同浓度的含水乙醇、不同浓度的含水甲醇中的任意一种进行加热提取1-10小时，加热温度为50-80℃。

本发明的海燕皂苷的制备方法的一种优选方案为，所述的柱层析为大孔树脂柱层析，上样量为大孔树脂重量的1％-100％，上样量指浓缩步骤的浓缩液的重量。

本发明的海燕皂苷的制备方法的另一种优选方案为，所述的柱层析为硅胶柱层析，上样量为硅胶重量的1％-30％，上样量指浓缩步骤的浓缩液的重量。

本发明的海燕皂苷的制备方法的一种优选方案为，采用大孔树脂柱层析的洗脱，是先用2-10倍大孔树脂吸附体积的蒸馏水进行洗脱，控制洗脱速度为1-3倍大孔树脂吸附体积/小时，再用20％、50％、80％乙醇依次洗脱，洗脱条件与用蒸馏水洗脱相同，并收集上述50％乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥或冷冻干燥，得海燕皂苷。

本发明的海燕皂苷的制备方法的一种优选方案为，采用硅胶柱层析的洗脱，是分别以乙酸乙酯、乙醇进行梯度洗脱，洗脱体积均为硅胶柱吸附体积的3-10倍，洗脱速度为1-3倍硅胶吸附体积/小时，收集上述乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥或冷冻干燥，得海燕皂苷。

本发明提供了海燕皂苷在制备具有祛痰、镇咳、平喘作用的功能食品和药物方面的应用。

本发明制得的海燕皂苷的溶血活性为：溶血指数大于5000H.I./g。

溶血指数(hemolytic index，H.I.)是指在一定条件下能使血液中红细胞完全溶解的最低皂苷浓度的倒数。溶血指数的测定，一方面，常常需要配制一系列不同浓度的皂苷溶液来进行实验，“完全溶血”或“开始溶血”这一指标以及所谓的“最稀皂苷溶液的浓度”则难以完全排除操作者主观因素的干扰。本发明是采用分光光度计测定吸收曲线，观察最大吸光值的方法来判断是否达到完全溶血。此方法测定溶血指数具有简便、快捷、准确的优点。其计算公式如下：

H . I . = \frac{V}{P / 100 \times S}

V——试管内液体的总量(mL)；

P——皂苷溶液的浓度(以百分数表示，％)；

S——使试管中的红细胞完全溶解所需皂苷溶液的最小体积(mL)。

在本实验中即为在波长540nm处吸光值达到最大且基本不再变化时所对应的皂苷溶液体积。

海燕皂苷溶血活性的测定：

海燕皂苷的生物活性以每克试样溶血指数(H.I./g)表示，溶血指数的具体测定方法如下：

(1)称取氯化钠9g，用蒸馏水溶解并稀释定容至1000mL，配成0.9％的生理盐水；

(2)抽取大鼠动脉血液，加柠檬酸钠抗凝，然后用生理盐水混匀后离心(2500rpm，5min)，重复洗涤2-3次，至上清液无红色即可；

(3)去上清液后，根据沉积的红血球的体积，用生理盐水配成2％的红细胞悬液；

(4)精确称取0.1g干燥后待检样品，用少量生理盐水溶解后定容至100mL，即配成0.1％(1mg/mL)的样品溶液；

(5)取洁净的小试管26支，按照0.1mL的递增量依次加入0-2.5mL样品溶液，然后每管分别补加相应量的生理盐水，使各试管的体积均达2.5mL。边振荡边加入2.5mL的红细胞悬液，使各管体积达到5mL。加完后轻摇15min，以使其完全混合(摇动过程中避免产生泡沫)，置室温下(20-25℃)静置12hr；

(6)以2500rpm离心5min，小心的吸取上清液，测定其在540nm处的吸光值(以下简称A540)。参比溶液为2.5mL生理盐水与2.5mL红细胞悬液的混悬液经离心后的上清；

(7)以皂苷溶液的体积为横坐标，A540为纵坐标作图，即得皂苷引起溶血的剂量—效应(A540)曲线，找出A540达到最大值所需皂苷溶液的最小体积S(mL)。根据下述计算公式即可求得样品的溶血指数。

H . I . = \frac{V}{P / 100 \times S}

本发明的海燕皂苷具有下述药效，(下述实验所用的海燕皂苷均为实施例1方法制备)：

1、海燕皂苷的祛痰作用：

实验原理：采用小鼠苯酚红***法，利用苯酚红小鼠腹腔注射后部分从气道***的特点，测定小鼠气道苯酚红的***量，以判断海燕皂苷祛痰作用。

1.1实验材料：

急支糖浆，太极集团涪陵制药厂，批号0312101；

氯化铵片，西博华制药有限责任公司，批号030602；

海燕皂苷，用0.5％羧甲基纤维素钠配成不同浓度的溶液；

苯酚红，上海试剂三厂，以生理盐水配制成2.5％浓度备用；

氢氧化钠，烟台三和化学试剂有限公司，以去离子水配成1mol/L。

实验仪器：BIO-RAD Model 550，USA；

实验动物：清洁级昆明种小鼠，雌雄兼有，体重18-22g；

1.2实验方法

1.2.1苯酚红标准曲线作法：将苯酚红用生理盐水稀释成5个浓度即12.5、6.25、3.13、1.56、0.78μg/ml，用加样器各移取1ml，分别滴加0.1ml氢氧化钠(1mol/L)，振荡混匀，用BIO-RAD Model 550测570nm处A值，求直线回归。

1.2.2气管酚红排泌：取小鼠50只，随机分为5组：空白对照组，急支糖浆组(0.15ml/10g)，海燕皂苷1(20mg/kg)组，海燕皂苷2(40mg/kg)组和氯化铵组(1000mg/kg)，除氯化铵组外其余各组均灌胃给药2天，第3天连同氯化铵组给药1小时后，小鼠腹腔注射2.5％酚红生理盐水溶液0.2ml/10g小鼠，30分钟后脱臼处死小鼠，分离气管，沿甲状软骨小缘剪断再向近心端延长0.5cm剪断，放入1ml生理盐水溶液中，振荡10分钟，加入1mol/L氢氧化钠0.1ml，混匀后用BIO-RAD Model 550在570nm测定含量。

1.3结果与讨论

1.3.1苯酚红标准曲线：

标准曲线：

苯酚红浓度g/ml)	0.78	1.56	3.13	6.25	12.5
苯酚红浓度g/ml)	0.78	1.56	3.13	6.25	12.5	OD值	0.097	0.183	0.351	0.651	1.125

1.3.2气管酚红排泌结果：

表1海燕皂苷对小鼠祛痰作用的影响(n＝10， x±s)

组别	给药剂量	动物数(只)	苯酚红OD值	气管苯酚红排泌(μg/ml)
组别	给药剂量	动物数(只)	苯酚红OD值	气管苯酚红排泌(μg/ml)	空白对照组急支糖浆组海燕皂苷1组海燕皂苷2组氯化铵组	——15ml/kg20mg/kg40mg/kg1000mg/kg	1010101010	0.184±0.0120.206±0.017^0.242±0.012^0.297±0.015^0.220±0.020^

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与空白对照组比较。

表1结果表明，海燕皂苷20mg/kg剂量组使小鼠气管苯酚红排泌量增加，具有较强的祛痰作用；海星皂苷40mg/kg剂量组能使小鼠气管苯酚红排泌量明显增加，具有显著的祛痰作用。

2、海燕皂苷的镇咳作用

本实验是以海燕皂苷对浓氨水致咳小鼠的影响为模型，评价海燕皂苷的镇咳作用。

实验原理：

氨水(25％-28％)等刺激性物质气雾吸入呼吸道内，刺激呼吸道上皮下的感受器，可以引起咳嗽。测定小鼠给药前后咳嗽潜伏期以及2min内小鼠咳嗽次数的变化，观察海燕皂苷对浓氨水致咳小鼠的影响。

2.1实验材料

磷酸可待因，青海制药厂，批号960605；

海燕皂苷，用0.5％羧甲基纤维素钠配成不同浓度的溶液；

氨水，烟台三和化学试剂有限公司，批号030618；

实验仪器：超声雾化器，PARIMASTER；

实验动物：清洁级昆明种小鼠，雌雄兼有，体重18-22g；

2.2实验方法

取小鼠40只，随机分为4组：空白对照组，磷酸可待因组(5mg/kg)，海燕皂苷1(20mg/kg)组和海燕皂苷2(40mg/kg)组，各组连续灌胃给药2天，第3天各组给药60分钟后，把小鼠放入500ml玻璃钟罩内(每次1只)，连接PARIMASTER超声雾化器，恒压将氨水(25％-28％)均匀的喷入玻璃钟罩内，喷雾5S，然后观察并记录小鼠的咳嗽潜伏期(s)(从喷雾氨水开始至出现咳嗽所需的时间)和2min内咳嗽次数。以T检验比较各受试药组与空白对照组的差异。

2.3结果与讨论

表2海燕皂苷对浓氨水致咳小鼠影响(n＝10， x±s)

组别	剂量	致咳潜伏期(s)		致咳次数
		致咳潜伏期(s)		致咳次数		给药前	给药后	给药前	给药后
		空白对照组磷酸可待因组海燕皂苷1组海燕皂苷2组	——5mg/kg20mg/kg40mg/kg	24.5±3.424.0±3.724.8±3.025.0±2.6	25.1±2.828.4±2.328.0±3.031.8±5.0	给药前	给药后	给药前	给药后	21.7±3.121.0±3.621.8±3.725.0±2.7	20.3±6.413.1±5.9^17.0±4.1^13.6±3.4^*

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与空白对照组比较。

表2结果表明，海燕皂苷(20mg/kg)能够延长致咳潜伏期，减少2min内咳嗽次数(与NS组比较，P＜0.05)；海燕皂苷(40mg/kg)明显延长致咳潜伏期，减少2min内咳嗽次数(与NS组比较，P＜0.01)，说明海燕皂苷(40mg/kg)具有较强的镇咳作用。

3、海燕皂苷的平喘作用；

本实验是以海燕皂苷对组胺致喘豚鼠的作用为模型，评价海燕皂苷的平喘作用。

实验原理：

不少药物当以气雾法给予豚鼠可引起支气管痉挛、窒息，从而导致抽搐而跌倒。这种动物模型可用于观察药物的支气管平滑肌松弛作用。目前最常用的引喘药物是组胺和乙酰胆碱。本实验用于观察海燕皂苷对组胺致喘豚鼠的作用。

3.1实验材料

氨茶碱片，桂林制药厂，批号030201

海燕皂苷，用0.5％羧甲基纤维素钠配成不同浓度的溶液；

组胺，

实验仪器：超声雾化器，PARIMASTER；

实验动物：豚鼠，雌雄兼有，体重200-250g；

3.2实验方法：

豚鼠50只，逐一测定其引喘潜伏期，取其潜伏期150s以内的豚鼠备用。

选取豚鼠40只，体重200-250g，随机分为4组，每组10只，空白对照组，氨茶碱组(125mg/kg)，海燕皂苷1(20mg/kg)组和海燕皂苷2(40mg/kg)组，各组连续灌胃给药2天，第3天各组给药60分钟后，将豚鼠逐一放入玻罩(容积约4L)内，用PARIMASTER超声雾化器以恒压喷入1g/L组胺和20g/L乙酰胆碱等量混合液20S，然后密切注意豚鼠的反应，观察从喷药开始到喘息性惊厥发生的引喘潜伏期，以T检验比较各受试药组与空白对照组之差异。

3.3结果与讨论

表3海燕皂苷对豚鼠引喘潜伏期的影响(n＝10， x±s)

组别	剂量	引喘潜伏期(s)
组别	剂量	引喘潜伏期(s)	空白对照组氨茶碱组海燕皂苷1组海燕皂苷2组	——125mg/kg20mg/kg40mg/kg	54.1±14.983.3±12.1^*69.4±8.0^80.3±13.9^**

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与空白对照组比较。

表3结果表明，海燕皂苷(20mg/kg)能延长引喘潜伏期(与NS组比较，P＜0.05)；海燕皂苷(40mg/kg)明显延长引喘潜伏期(与NS组比较，P＜0.01)；说明海燕皂苷(40mg/kg)的平喘作用较强。

根据以上的实验可知，本发明的海燕皂苷在治疗祛痰、镇咳、平喘方面有良好的效果，其可加入药剂学所允许的赋形剂制成除针剂以外的口服液、片剂、胶囊、气雾剂等其它各种剂型。因为皂苷的水溶液大多能破坏红细胞而具有溶血作用，若将其水溶液注射入静脉中，毒性极大，低浓度水溶液就能产生溶血现象。皂苷的水溶液肌内注射易引起组织坏死，口服则无溶血作用。皂苷能溶血是因为多数皂苷能与胆甾醇结合生成不溶性的分子复合物。当皂苷水溶液与红细胞接触时，与红细胞膜上的胆甾醇结合，生成不溶于水的复合物沉淀，破坏了血红细胞的正常渗透，使细胞内渗透压增加而发生崩解，从而导致溶血现象，因而不能制成针剂。

本发明的海燕皂苷及其制备方法和用途与已有技术相比具有突出的实质性特点和显著进步，1、制备工艺简单，提取周期短，溶剂消耗小，产率高且质量稳定；2、动物实验证实海燕皂苷具有明确的祛痰、镇咳、平喘作用，可用于相关功能的功能食品和医药用品的制造，海燕皂苷的应用开发，可以变废为宝，充分发挥海燕皂苷的生物活性和独特疗效，改善人类生活质量，造福于人，造福于社会；3、海燕皂苷制备工艺的完善和海燕皂苷祛痰、镇咳、平喘作用的发现为海燕这种海洋生物资源的开发利用提供了一条新的途径。

具体实施方式：

为了更好地理解与实施，下面结合实施例详细说明本发明，需要强调的是以下实施例是为了更详细的说明本发明的实施方法，而不是为了限制本发明。

实施例1，将新鲜海燕置阴凉干燥处风干，用中药粉碎机粉碎成20-40目颗粒，称取10Kg海燕干粉，加入200Kg的80％乙醇，室温提取144h，将提取液在0.08MPa，50℃条件下减压浓缩，得10L浓缩液，将上述浓缩液以5L/h的速度上AB-8大孔树脂柱进行吸附，大孔树脂用量为10Kg，吸附体积经测定为5000ml，吸附完成后，先用50L蒸馏水对大孔树脂柱进行洗脱，控制洗脱速度为15L/h，再用50L 20％乙醇、50L 50％乙醇、50L 80％乙醇依次洗脱，控制洗脱速度为5L/h，收集上述50％乙醇洗脱液，0.08MPa，50℃条件下减压浓缩，0.08MPa，50℃条件下真空干燥，得海燕皂苷，溶血活性检测显示海燕皂苷的溶血指数为6800H.I./g。

实施例2，将新鲜海燕10Kg直接用绞肉机绞碎成20-60目颗粒，加入100L的80％乙醇，室温提取72小时，收集提取液，0.08MPa，50℃条件下将提取液减压浓缩，得浓缩液2L，将上述浓缩液以1L/h的速度上NKA大孔树脂柱进行吸附，大孔树脂用量为2Kg，吸附体积经测定为800ml，吸附完成后，先用5L蒸馏水对大孔树脂柱进行洗脱，控制洗脱速度为1.5L/h，再分别用8L的20％、50％、80％乙醇依次洗脱，洗脱条件与用蒸馏水洗脱相同，收集上述50％乙醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得海燕皂苷。

实施例3，将新鲜海燕10Kg冷冻后用绞肉机绞碎成20-60目颗粒，加入30L的甲醇，室温提取12小时，收集提取液，0.08MPa，50℃条件下将提取液减压浓缩，得浓缩液2L，将上述浓缩液以1L/h的速度上NKA-9大孔树脂柱进行吸附，大孔树脂用量为2Kg，吸附体积经测定为1000ml，吸附完成后，先用4L蒸馏水对大孔树脂柱进行洗脱，控制洗脱速度为1L/h，再分别用4L的20％、50％、80％乙醇依次洗脱，洗脱条件与用蒸馏水洗脱相同，收集上述50％乙醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得海燕皂苷。

实施例4，将新鲜海燕10Kg冷冻后绞碎，加入30Kg的蒸馏水，80℃条件下搅拌提取10h，收集提取液，0.08MPa，80℃条件下将提取液减压浓缩，得浓缩液5L，将上述浓缩液以6L/h的速度上DA-101大孔树脂柱进行吸附，大孔树脂用量为5Kg，吸附体积经测定为2L，吸附完成后，先用20L蒸馏水进行洗脱，控制洗脱速度为6L/h，再分别用20L的20％、50％、80％乙醇依次洗脱，控制洗脱速度为4L/h，收集上述50％乙醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得海燕皂苷。

实施例5，将新鲜海燕10Kg干燥后粉碎成20-60目颗粒，加入50Kg 60％乙醇，50℃条件下加热提取5h，收集提取液，0.08MPa，50℃条件下将提取液减压浓缩，得浓缩液5L，将上述浓缩液以1L/h的速度上AB-8大孔树脂柱进行吸附，大孔树脂用量为2Kg，吸附体积经测定为1L，吸附完成后，先用10L蒸馏水进行洗脱，控制洗脱速度为3L/h，再分别用10L的20％、50％、80％乙醇依次洗脱，控制洗脱速度为1L/h，收集上述50％乙醇洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥，得海燕皂苷。

实施例6，将新鲜海燕10Kg干燥后粉碎成20-60目颗粒，加入200Kg 80％乙醇，50℃条件下加热提取1h，收集提取液，0.08MPa，50℃条件下将提取液减压浓缩，得浓缩液0.5L，将上述浓缩液用0.2Kg 60-100目柱层析硅胶拌样，挥干溶剂上100-200目硅胶柱，硅胶用量为1.5Kg，吸附体积经测定为1.5L，分别以10L乙酸乙酯、15L乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，0.08MPa，50℃条件下减压浓缩，0.08MPa，50℃条件下真空干燥，得海燕皂苷。

实施例7，将新鲜海燕10Kg直接绞碎，加入10Kg甲醇，50℃条件下加热提取10h，收集提取液，0.08MPa，50℃条件下将提取液减压浓缩，得浓缩液0.8L，将上述浓缩液用0.2Kg 60-100目柱层析硅胶拌样，挥干溶剂上100-200目硅胶柱，硅胶用量为2Kg，吸附体积经测定为2L，分别以10L乙酸乙酯、20L乙醇进行梯度洗脱，收集乙醇洗脱液，0.08MPa，50℃条件下减压浓缩，0.08MPa，50℃条件下真空干燥，得海燕皂苷。

以本发明方法制得海燕皂苷按以下实施例方法制得可使用的制剂。

实施例1，海燕皂苷口服液

海燕皂苷0.5克蒸馏水10毫升

海燕皂苷溶解后按常规方法经灌装、封口等步骤生产即得海燕皂苷口服液。

实施例2，海燕皂苷硬胶囊 1000粒配方

海燕皂苷100克淀粉100克

海燕皂苷、淀粉混匀，装入1000粒硬胶囊中即得海燕皂苷硬胶囊。

实施例3，海燕皂苷片剂

海燕皂苷500克淀粉25克硬脂酸镁5克

海燕皂苷、淀粉、硬脂酸镁按常规方法压片、包衣即得海燕皂苷片剂。

此外，在不违背本发明的精神内，可以对给定的实施例进行各种变化和改进，由本领域中的技术人员认识到的可选择的实施例，也被包括在权利要求的范围内。

Claims

1、海燕皂苷，其特征在于它是由下述方法制得，以海燕为原料经粉碎，加入适量溶剂浸提，将提取液减压浓缩，得浓缩液；将上述步骤得到的浓缩液进行柱层析，以洗脱液洗脱除去杂质后，再以另一洗脱液洗脱，收集该洗脱液，减压浓缩，干燥后得海燕皂苷，海燕皂苷的溶血指数大于5000H.I./g。

2、权利要求1所述的海燕皂苷的制备方法，其特征在于它是由下述方法制得，以海燕为原料经粉碎，加入适量溶剂浸提，将提取液减压浓缩，得浓缩液，将上述步骤得到的浓缩液进行柱层析，以洗脱液洗脱除去杂质后，再以另一洗脱液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥后得海燕皂苷。

3、根据权利要求2所述的海燕皂苷的制备方法，其特征在于所述的粉碎为新鲜海燕采用直接绞碎、冷冻粉碎、干燥后粉碎中的任意一种方式。

4、根据权利要求2所述的海燕皂苷的制备方法，其特征在于所述的溶剂为水、乙醇、甲醇、不同浓度的含水乙醇、不同浓度的含水甲醇中的任意一种。

5、根据权利要求2所述的海燕皂苷的制备方法，其特征在于所述的提取为加入3-20倍海燕粉末重量的蒸馏水、乙醇、甲醇、不同浓度的含水乙醇、不同浓度的含水甲醇中的任意一种进行室温提取12-144小时；提取也可为加入3-20倍海燕粉末重量的蒸馏水、乙醇、甲醇、不同浓度的含水乙醇、不同浓度的含水甲醇中的任意一种进行加热提取1-10小时，加热温度为50-80℃。

6、根据权利要求2所述的海燕皂苷的制备方法，其特征在于所述的柱层析为大孔树脂柱层析，上样量为大孔树脂重量的1％-100％，上样量指浓缩步骤的浓缩液的重量。

7、根据权利要求2所述的海燕皂苷的制备方法，其特征在于所述的柱层析为硅胶柱层析，上样量为硅胶重量的1％-30％，上样量指浓缩步骤的浓缩液的重量。

8、根据权利要求6所述的海燕皂苷的制备方法，其特征在于所述的洗脱，是先用2-10倍大孔树脂吸附体积的蒸馏水进行洗脱，控制洗脱速度为1-3倍大孔树脂吸附体积/小时，再用20％、50％、80％乙醇依次洗脱，洗脱条件与用蒸馏水洗脱相同，并收集上述50％乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥或冷冻干燥，得海燕皂苷。

9、根据权利要求7所述的海燕皂苷的制备方法，其特征在于所述的洗脱，分别以乙酸乙酯、乙醇进行梯度洗脱，洗脱体积均为硅胶柱吸附体积的3-10倍，洗脱速度为1-3倍硅胶吸附体积/小时，收集上述乙醇洗脱液，减压浓缩，真空干燥或冷冻干燥，得海燕皂苷。

10、权利要求1所述的海燕皂苷在制备具有祛痰、镇咳、平喘作用的功能食品和药物方面的应用。