CN1839157A - 抗白介素－22抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

公开了与白介素－22(IL－22)、尤其是人IL－22结合的抗体及其抗原结合片段，以及它们在调节IL－22相关免疫应答中的用途。本文所公开的抗体可用于诊断、预防或治疗IL－22相关免疫性疾病，例如自身免疫性疾病(例如关节炎)。

Description

抗白介素-22抗体及其应用
                        发明领域
本发明涉及结合白介素-22(IL-22)、尤其是人IL-22的抗体及其抗原结合片段，以及它们在调节IL-22相关活性中的用途。本文所公开的抗体可用于诊断、预防和/或治疗IL-22相关疾病，例如自身免疫性疾病(例如关节炎)。
                        发明背景
白介素-22(IL-22)是II类细胞因子，其序列与IL-10同源。其表达是在T细胞中被IL-9或ConA上调(Dumoutier L.等(2000)Proc NatlAcad Sci USA 97(18)：10144-9)。进一步研究表明，给予LPS，可在体内诱导IL-22 mRNA的表达，而IL-22调节指示急性期反应的参数(Dumoutier L.等(2000)，参见上文；Pittman D.等(2001)Genes andImmnunity 2：172)。综上所述，这些观察结果表明，IL-22在炎症中起作用(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3)：223-40)。
据认为，IL-22与受体复合物结合，所述复合物由两个II类细胞因子受体家族(cytokine receptor family，CRF2)成员IL-22R和IL-10R2组成(Xie M.H.等(2000)J Biol Chem 275(40)：31335-9；Kotenko S.V.等(2001)J Biol Chem 276(4)：2725-32)。在多种器官中都可组成型地表达IL-22受体的两条链。来自这些器官的上皮细胞系响应体外IL-22(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3)：223-40)。IL-22诱导JAK/STAT3和ERK途径的活化，以及介导其它MAPK途径(Dumoutier L.等(2000)，参见上文；Xie M.H.等(2000)，参见上文；Dumoutier L.等(2000)J Immunol 164(4)：1814-9；Kotenko S.V.等(2001)J Biol Chem 276(4)：2725-32；Lejeune，D.等(2002)J Biol Chem 277(37)：33676-82)。
CRF2成员是IFNα/β、IFNγ、凝血因子VIIa、IL-10和IL-10的相关蛋白IL-19、IL-20、IL-22、IL-24的受体，以及最新鉴定的IFN样细胞因子IL-28和IL-29的受体(Kotenko S.V.(2002)Cytokine &Growth Factor Reviews 13(3)：223-40；Kotenko，S.V.等(2000)Oncogene19(21)：2557-65；Sheppard，P.等(2003)Nature Immunology 4(1)：63-8；Kotenko，S.V.等(2003)Nature Immunology 4(1)：69-77)。除了这些膜受体以外，CRF2家族还包括一种可溶性蛋白，即IL-22结合蛋白(IL-22BP)，它对IL-22具有特异性并能阻断其活性(Dumoutier，L.等(2001)J Immunol 166(12)：7090-5；Kotenko，S.V.等(2001)J Immunol 166(12)：7096-103；Xu，W.等(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(17)：9511-6；Gruenberg，B.H.等(2001)Genes & Immunity 2(6)：329-34；Wei C-C等(2003)Genes & Immunity 4：204-211)。尽管IL-22受体复合物对IL-22来说是独特的，然而，每条链(即IL-22R和IL-10R2)与其它CRF2成员共享，以确定IL-20、IL-24(IL-22R/IL-20R2)、IL28、IL29(IFN-λR1/IL-10R2)和IL-10(IL-10R1/IL-10R2)的功能性受体(Dumoutier，L.等(2001)J.Immunol.167(7)：3545-9；Wang，M.等(2002)J Biol Chem277(9)：7341-7；Parrish-Novak，J.等(2002)J Biol Chem 277(49)：47517-23；Kotenko，S.V.等(1997)EMBO J.16(19)：5894-903；Spencer，S.D.等(1998)J Exp Med 187(4)：571-8)。
由CRF2组成的受体的两条链，对信号转导来说都是必要的。所组成的受体的一条链以前已经根据其对细胞因子的高亲和力而被确定为配体结合链(例如IFNγR1)。另一条链(例如IFNγR2)已表征为辅助链，其单独表现出对细胞因子的最小亲和力(Kotenko，S.V.等(2000)Oncogene 19(21)：2557-65)。最新的结果表明，这两条受体链都可提供结合亲和力，至少对于IL-10和IL-22来说(Xie M.H.等(2000)J BiolChem 275(40)：31335-9；Kotenko S.V.等(2001)J Biol Chem 276(4)：2725-32；Logsdon，N.J.等(2002)J Interferon Cytokine Res 22(11)：1099-112)。
                        发明概述
本申请至少部分提供IL-22结合剂，例如与具有高亲和性和特异性的白介素-22(“IL-22”)、特别是人IL-22结合的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体及其抗原结合片段在本文中也分别称为“抗IL-22抗体”和“其片段”。在一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段是IL-22拮抗剂，因此能降低、中和和/或拮抗至少一种IL-22相关活性。例如，抗IL-22抗体或其片段可与IL-22(例如IL-22的表位)结合并干扰其相互作用，所述相互作用例如IL-22与IL-22受体复合物或其亚基(例如单独的IL-22R或IL-10R2)之间的结合，所述受体复合物例如包括IL-22受体(“IL-22R”)和白介素-10受体2(“IL-10R2”)的复合物。因此，本发明的抗体及其片段可用于干扰(例如抑制、阻断或减少)例如IL-22与IL-22受体复合物或其亚基之间结合的相互作用。
另外，申请人已经表明，在小鼠胶原诱发的关节炎(CIA)模型中，体内给予IL-22，能诱导急性期反应的参数，并且因使用中和抗IL-22抗体而降低IL-22活性，从而缓解炎性症状。在发炎部位，IL-22mRNA的表达被上调。因此，IL-22拮抗剂，例如中和抗IL-22抗体及其片段，可用于在体内诱导免疫抑制。因此，本发明的抗IL-22抗体或其片段可用于诊断、治疗和/或预防IL-22相关疾病，例如自身免疫性疾病(例如多发性硬化、关节炎疾病例如类风湿性关节炎)；呼吸性疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD))；皮肤(例如银屑病)、心血管***(例如动脉粥样硬化)、神经***(例如阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease))、肾脏(例如肾炎)、肝脏(例如肝炎)和胰腺(例如胰腺炎)等的炎性症状。
因此，一方面，本发明的特征在于一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与IL-22、尤其是哺乳动物IL-22(例如人IL-22或鼠IL-22)的相互作用(例如结合)。在一个实施方案中，所述抗体或其片段是中和抗体，例如它降低或抑制一种或多种IL-22相关活性，例如趋化因子分泌(例如GRO1的分泌)；急性期反应、STAT蛋白(例如STAT-3蛋白)等激酶的磷酸化、细胞增殖(例如HEPG2增殖和/或磷酸化)等。抗IL-22抗体或其片段可以以高亲和力与IL-22结合，其亲和常数(Kd)小于10E-7M，优选10E-8M、10E-9M、10E-10M，更优选10E-11M或更高亲和力。在其它实施方案中，抗IL-22抗体或其片段可中和一种或多种IL-22相关活性，其ED50至少为约60nM，通常约为5nM-200pM或更强。在其它实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22结合，其动力学范围为10E3-10E7l/Ms，通常为10E4-10E6l/Ms。在又一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段的解离动力学范围为10E-2-10E-6l/s，通常为10E-3-10E-6l/s。在一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22(例如人IL-22)结合，其亲和力和/或动力学类似于单克隆抗体Ab-04或Ab-02；所述单克隆抗体Ab-04由ATCC保藏号为PTA-5255的杂交瘤细胞系产生，而Ab-02由ATCC保藏号为PTA-5254的杂交瘤细胞系产生。可使用例如生物传感器技术(Biacore)，检测抗IL-22抗体或其片段的亲和力(参见以下实施例5和22)。可以使用本文所述的例如HEPG2细胞的STAT磷酸化测定或BaF3增殖测定，检测抗IL-22抗体的抑制活性(ED50)(参见例如实施例20-21)。
在一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv片段)是单克隆抗体或单一特异性抗体。抗体或其片段也可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体或体外产生的抗体。在又一些实施方案中，所述抗体具有选自以下的重链恒定区：例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE；更具体地讲，选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一个实施方案中，所述抗体具有选自例如κ或λ的轻链。
在另一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22、尤其是哺乳动物IL-22例如人IL-22(例如其氨基酸序列为SEQ ID NO：2的人IL-22，或者SEQ ID NO：2的约氨基酸34-179的成熟人IL-22序列，或者与其至少有85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列)特异性结合。在其它实施方案中，所述抗体或其片段与IL-22片段特异性结合，例如与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列毗连的至少10、20、50、75、100、150或170个氨基酸的片段，或者与其至少有85％、90％、95％、99％或更高同一性的序列。在一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与人IL-22特异性结合，而基本上不与来自非人类物种的IL-22交叉反应，所述非人类物种的IL-22例如鼠(例如小鼠或大鼠)的IL-22。在其它实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与两个或两个以上形式的哺乳动物IL-22结合，所述哺乳动物IL-22例如人IL-22、非人类灵长类(例如猴子)的IL-22和鼠(例如小鼠或大鼠)的IL-22。
在一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22、尤其是哺乳动物IL-22例如人IL-22或鼠IL-22的表位结合，所述表位例如线状表位或构象表位。在另一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与选自以下的复合物结合：例如IL-22和IL-22R(“IL-22/IL-22R”)，IL-22和IL-10R2(“IL-22/IL-10R2”)，IL-22、IL-22R和IL-10R2(“IL-22/IL-22R/IL-10R2”)。在一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22和IL-22R的复合物结合，因而形成抗IL-22抗体或其片段、IL-22和IL-22R的复合物。抗IL-22抗体或其片段的结合可增加复合物的稳定性，并因而干扰复合物与IL-10R2的相互作用。
在其它实施方案中，所述抗体或其片段与IL-22结合，并干扰(例如抑制、阻断或减少)IL-22与IL-22受体复合物(例如包含IL-22R和IL-10R2的复合物)之间的相互作用(例如结合)。在其它实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22结合并干扰(例如抑制、阻断或减少)IL-22与IL-22受体复合物(例如IL-22R或IL-10R2)的亚基之间的相互作用(例如结合)。在又一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22结合并干扰(例如抑制、阻断或减少)IL-22和IL-22R复合物(“IL-22/IL-22R”)和IL-10R2之间的相互作用(例如结合)。在另一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22结合并干扰(例如抑制、阻断或减少)IL-22和IL-10R2复合物(“IL-22/IL-10R2”)和IL-22R之间的相互作用(例如结合)。
在另一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段与IL-22结合蛋白(IL-22BP)(例如哺乳动物IL-22BP(例如人IL-22BP或鼠IL-22BP))竞争性结合IL-22，例如哺乳动物IL-22(例如人IL-22或鼠IL-22)。
干扰IL-22与IL-22R结合的抗IL-22抗体的非限制性实例是“Ab-04”。Ab-04(在本文中也称为大鼠单克隆抗体“P3/2”)与人IL-22结合并中和至少一种IL-22活性(参见实施例5、16、17、20和21)。产生Ab-04的杂交瘤细胞系于2003年6月5日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏号PTA-5255。干扰IL-22与IL-10R2结合的抗IL-22抗体的另一个非限制性实例是“Ab-02”。Ab-02(在本文中也称为大鼠单克隆抗体“P3/3”)与小鼠IL-22和人IL-22结合并中和至少一种IL-22活性(参见实施例5、16、17、20和21)。产生Ab-02的杂交瘤细胞系于2003年6月5日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏号PTA-5254。
在一个实施方案中，所述抗体或其片段与IL-22(例如鼠IL-22或人IL-22)特异性结合，并竞争性抑制第二抗体与IL-22(例如与IL-22(例如人IL-22或鼠IL-22)上的靶表位)结合。第二抗体可以是单克隆抗体，其由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段包含至少一个抗原结合区，例如单克隆抗体的可变区，所述单克隆抗体由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生。在又一个实施方案中，所述抗体或其片段包含至少一个、两个、三个或四个单克隆抗体的可变区，所述单克隆抗体由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段包含至少一个或两个单克隆抗体的重链可变区，所述单克隆抗体由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生。在另一个实施方案中，所述抗体或其片段包含至少一个或两个单克隆抗体的轻链可变区，所述单克隆抗体由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生。在又一个实施方案中，所述抗体或其片段包含至少一个、两个或三个单克隆抗体的重链可变区的互补决定区(CDR)，所述单克隆抗体由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生。在又一个实施方案中，所述抗体或其片段包含至少一个、两个或三个单克隆抗体轻链可变区的CDR，所述单克隆抗体由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生。在又一个实施方案中，所述抗体或其片段包含至少一个、两个、三个、四个、五个或六个单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的CDR，所述单克隆抗体由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生。在另一个实施方案中，所述单克隆抗体是由选自例如PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生的。
本文所述的抗IL-22抗体或其片段可以衍生或连接到另一个功能性分子，例如另一个肽或蛋白(例如Fab′片段)。例如，融合蛋白或抗体或抗原结合部分，可以与一种或多种其它分子实体功能性连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其它方式)，所述分子实体例如抗体(例如双特异性或多特异性抗体)、毒素、放射性同位素、细胞毒剂或细胞抑制剂。
在又一个实施方案中，单独给予IL-22结合剂，例如IL-22拮抗剂(例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段)或其药物组合物，或者在联合疗法中给予，意即与其它药物联用，所述药物例如用于治疗IL-22相关疾病的治疗药。IL-22相关疾病的实例包括但不限于选自以下的一种或多种疾病：自身免疫性疾病，例如关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、狼疮相关性关节炎或关节强硬性脊椎炎)、硬皮病、***性红斑狼疮、脉管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎性肠病(IBD)、节段性回肠炎(Crohn’sdisease)、糖尿病(I型)；皮肤(例如银屑病)、心血管***(例如动脉粥样硬化)、神经***(例如阿尔茨海默病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)和胰腺(例如胰腺炎)等的炎性疾病；心血管疾病，例如胆固醇代谢紊乱、氧自由基损害、局部缺血；创伤愈合相关疾病；呼吸性疾病，例如哮喘和COPD(例如囊性纤维化)；败血症；移植物排斥和***反应。在一个实施方案中，IL-22相关疾病是关节炎，例如选自以下的一种或多种疾病：类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎或关节强硬性脊椎炎；呼吸性疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)；或皮肤(例如银屑病)、心血管***(例如动脉粥样硬化)、神经***(例如阿尔茨海默病)、胰腺(例如胰腺炎)以及胃肠器官(例如结肠炎、节段性回肠炎和IBD)等的炎性疾病。
联合疗法可包括一种或多种IL-22结合剂与一种或多种其它治疗药一起配制和/或一起给药；所述IL-22结合剂例如IL-22拮抗剂(例如抗IL-22抗体或其片段)，所述其它治疗药例如在本文中更详细描述的一种或多种细胞因子抑制剂和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药(例如***抗炎药)、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒剂或细胞抑制剂。
可与一种或多种IL-22结合剂(例如IL-22拮抗剂(例如抗IL-22抗体或其片段))一起给予和/或一起配制的优选其它治疗药的实例，包括但不限于以下一种或多种药物：TNF拮抗剂(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体、或其与TNF结合的抗原结合片段；TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白EnbrelTM)、p55 kD TNF受体-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂)；IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21/IL-21R的拮抗剂；T细胞和B细胞消耗剂(depleting agent)(例如抗CD4或抗CD22抗体)；小分子抑制剂，例如甲氨蝶呤和来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2的抑制剂；NSAID；p38抑制剂、TPL-2、Mk-2和NFkb的抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1抑制剂(例如小分子抑制剂、其抗体，例如抗P-选择蛋白抗体)；***受体β(ERB)激动剂或ERB-NFκb拮抗剂。可与一种或多种抗IL-22抗体或其片段一起给予和/或一起配制的优选其它治疗药的实例包括一种或多种以下药物：TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白EnbrelTM)；甲氨蝶呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物，例如CCI-779。
不受理论的束缚，申请人相信，IL-22通过例如起到组织炎症(而不是全身炎症)的放大器或调节剂的作用，发挥其局部炎症效应。因此，使用例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段，抑制IL-22活性，可提供更有效的组织特异性抗炎活性(而不是***性抗炎模式)。此外，使用例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段，抑制局部IL-22活性，可提供有用的候选者，用于与***抗炎模式联用。
另一方面，本发明提供药物组合物等组合物，其包含药物可接受的载体和至少一种IL-22结合剂，例如IL-22拮抗剂(例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段)。在一个实施方案中，药物组合物等组合物包含两种或两种以上的上述IL-22结合剂(例如抗IL-22抗体或其片段)的组合。本发明的范围内也包括IL-22拮抗剂(例如抗IL-22抗体或其片段)与药物例如以下治疗药的组合：例如在本文中更详细描述的一种或多种细胞因子抑制剂和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药(例如***抗炎药)、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒剂或细胞抑制剂。
Ab-02或Ab-04所识别的IL-22(例如人IL-22)的表位也包括在本发明的范围内。
另一方面，本发明的特征是一种降低、抑制或减少患者的急性期反应的方法。所述方法包括给予所述患者IL-22结合剂，例如IL-22拮抗剂(例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段)，其用量足以降低、抑制或减少患者的急性期反应。在一个实施方案中，所述患者是罹患IL-22相关疾病的哺乳动物，例如人，所述疾病例如呼吸性疾病、炎性疾病和自身免疫性疾病。在一个实施方案中，IL-22结合剂供局部给药用，例如经局部、皮下或其它不是体循环的给药方式。
另一方面，本发明的特征是一种调节例如干扰(例如抑制、阻断或减少)IL-22与IL-22受体复合物或其亚基(例如单独的IL-22R或IL-10R2)之间的相互作用(例如结合)的方法。所述方法包括：任选提供IL-22和IL-22受体复合物或其亚基(例如可溶性IL-22受体复合物或其亚基，或膜结合IL-22受体复合物或其亚基，例如表达IL-22受体复合物或其亚基的细胞)；在允许IL-22与IL-22受体复合物或其亚基之间相互作用以形成IL-22/IL-22受体混合物的情况下，使IL-22接触IL-22受体复合物或其亚基；和使IL-22/IL-22受体混合物接触至少一种IL-22结合剂，例如至少一种本文所述的抗IL-22抗体或其片段，因而调节例如干扰(例如抑制、阻断或减少)其相互作用。
所述方法可在体外用于细胞(例如在无细胞***中)、用于例如体外或离体的培养物中。例如，表达IL-22受体的细胞可在培养基中进行体外培养，接触步骤可因培养基中加入一种或多种抗IL-22抗体或其片段(例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段)而得以实现。或者，所述方法可以在患者细胞上进行，例如作为体内(例如治疗性或预防性)方案的一部分。
另一方面，本发明的特征是一种治疗或预防患者IL-22相关疾病的方法，所述治疗例如治疗、抑制、缓解、延迟或预防IL-22相关的疾病发作或防止其复发。该方法包括：给予所述患者IL-22结合剂，例如IL-22拮抗剂(例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段)，其用量足以治疗或预防IL-22相关的疾病。在一个实施方案中，IL-22结合剂供局部给药用，例如经局部、皮下或其它不是体循环的给药方式。
IL-22结合剂(例如IL-22拮抗剂(例如抗IL-22抗体或其片段))可单用或与本文所述的其它治疗性方式联合给予患者。在一个实施方案中，所述患者是罹患IL-22相关疾病的哺乳动物，例如人，所述疾病例如呼吸性疾病、炎性疾病和自身免疫性疾病。
IL-22相关疾病的实例包括但不限于选自以下的一种或多种疾病：自身免疫性疾病，例如关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎、狼疮相关性关节炎或关节强硬性脊椎炎)、硬皮病、***性红斑狼疮、脉管炎、多发性硬化、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、重症肌无力、炎性肠病(IBD)、节段性回肠炎、糖尿病(I型)；心血管疾病，例如胆固醇代谢紊乱、氧自由基损害、局部缺血、动脉粥样硬化；创伤愈合相关疾病；呼吸性疾病，例如哮喘和COPD(例如囊性纤维化)；皮肤(例如银屑病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)和胰腺(例如胰腺炎)等的炎性疾病；败血症；癌症(例如实体瘤或软组织肿瘤)；移植物排斥和***反应。在一个实施方案中，IL-22相关疾病是是关节炎，例如选自以下的一种或多种疾病：类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎或关节强硬性脊椎炎(优选类风湿性关节炎)；呼吸性疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)；和皮肤(例如银屑病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)和胰腺(例如胰腺炎)等的炎性疾病。
在其它实施方案中，本发明提供一种治疗(例如降低、缓解)或预防患者的一种或多种关节炎(例如类风湿性关节炎)相关症状的方法。所述方法包括给予所述患者IL-22结合剂，例如IL-22拮抗剂(例如抗IL-22抗体或其片段)，其用量足以治疗(例如减少、缓解)或预防一种或多种关节炎症状。可以治疗性或预防性或两者兼有之给予IL-22抗体。IL-22结合剂(例如IL-22拮抗剂例如抗IL-22抗体或其片段)可单用或与本文所述其它治疗方式联合给予患者。优选所述患者是罹患本文所述的IL-22相关疾病的哺乳动物，例如人。
另一方面，本发明提供一种检测样品(例如生物样品，例如血清、血浆、组织、活检组织)中IL-22的存在的体外方法。所述方法可用于诊断疾病，例如免疫细胞相关疾病。所述方法包括：(i)使样品或对照样品与本文所述的抗IL-22抗体或其片段接触；和(ii)检测抗IL-22抗体或其片段与样品或对照样品之间复合物的形成，其中相对于对照样品来说，样品中复合物的形成具有统计学上显著性变化时，即表明样品中存在IL-22。
再一方面，本发明提供一种检测IL-22存在的体内方法(例如患者体内造影)。所述方法可用于诊断疾病，例如IL-22相关疾病。所述方法包括：(i)在允许抗体或片段与IL-22结合的条件下，将本文所述的抗IL-22抗体或其片段给予患者或对照受试者；和(ii)检测抗体或片段与IL-22之间的复合物的形成，其中相对于对照受试者来说，患者体内复合物的形成具有统计学上显著性变化时，即表明存在IL-22。
优选所述抗体或其片段用可检测物质直接或间接进行标记，以便检测结合或未结合抗体。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质和放射性物质。
也公开了将治疗药或细胞毒剂等药物体内传递或靶向表达IL-22的细胞的方法。
供治疗和诊断用的包含本发明IL-22结合剂(例如IL-22拮抗剂(例如抗IL-22抗体或其片段))的药盒和试剂盒也包括在本发明的范围内。
除非另有说明，否则本文所用的所有科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员公知的含义。尽管方法与材料都类似于或等同于本发明实践或实验中所用的方法与材料，但是以下描述了合适的方法与材料。所有出版物、专利申请、专利和本文所提到的其它参考文献都通过引用全部结合到本文中。在有矛盾的情况下，本说明书，包括定义，将会作调整。另外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而不是限制性的。
根据以下详述和权利要求书，本发明的其它特征和优势将会是显而易见的。
                        附图简述
图1是一幅示意图，显示用于分析IL-22抗体在体内对鼠关节炎模型的影响的实验方案。
图2是一幅图，显示采用治疗性治疗方案，用IL-22抗体或对照治疗关节炎小鼠后的身体评分。
图3是一幅图，显示采用预防性治疗方案，用IL-22抗体或对照治疗关节炎小鼠后的身体评分。
图4是一幅图，显示用IL-22抗体或对照治疗重症关节炎小鼠后的身体评分。
图5是一幅图，显示用IL-22抗体或对照后，具有给定组织学级别的脚爪的相对百分率。
图6A-6B是IL-22与IL-22R和IL-10R2之间相互作用的线性图。图6A是线性图，显示bio-IL-22与固定化IL-22R-Fc结合，而没有检测到与IL-10R2-Fc结合。反相结合实验结果见图6B。可溶性IL-22R-Fc(而不是IL-10R2-Fc)与固定化bio-IL-22结合。这些结果表明，IL-22与IL-22R之间具有相对强的相互作用，而IL-10R2-Fc与IL-22之间仅有弱亲合力。
图7A-7B显示在CHO条件培养基中受体Fc融合物的特征。图7A是蛋白质印迹图，显示在还原(+βME)和非还原(-βME)条件下，将表达IL-22R-Fc、IL-10R2-Fc或两者的受体Fc的CHO细胞的条件培养基，在SDS-PAGE凝胶上进行分离。将SDS-PAGE凝胶转印到膜上，然后用直接针对人IgG Fc、IL-22R或IL-10R2的多克隆抗体进行检测。在还原条件(+βME，图7A)下，IL-22R和IL10R2-Fc CHO细胞系分泌人Fc融合蛋白，其中分子量为约60kD的种类是IL-22R-Fc，而分子量为约85kD的种类是IL-10R2-Fc。图7B是线性图，显示用表达IL-22R-Fc(■)、IL-10R2-Fc(○)或两者(▲)的CHO细胞的条件培养基的ELISA结果。ELISA板用兔抗人IL-22R抗体包被。也加入1∶1的两种同型二聚体的混合物，作为对照(△)。用生物素化山羊抗人IL-10R2抗体、再用链霉抗生物素-HRP，检测结合受体。结果见图7A-7B，表明受体Fc融合蛋白是从CHO细胞分泌的，为同型二聚体和异型二聚体。共同表达IL-22R/IL-10R2-Fc的CHO细胞多半分泌异型二聚体和IL-10R2-Fc同型二聚体。
图8A-8B是IL-22与IL-22R和IL-10R2相互作用的线性图，无论是作为Fc融合异型二聚体还是随机排列的同型二聚体。在图8A中，使50ng/ml来自表达IL-22R-Fc(■)、IL-10R2-Fc(○)或IL-22R-Fc和IL-10R2-Fc这两者(▲)的CHO CM的总Fc，捕获在抗人IgG包被孔上。然后向各孔加入不同浓度的bio-IL-22。结合bio-IL-22随即用链霉抗生物素-HRP进行检测。在图8B中，使以下不同浓度的总Fc捕获到抗人IgG包被孔上：IL-22R-Fc CM和无关Fc蛋白(■)、IL-22R-FcCM和IL-10R2-Fc CM(△)或来自共表达细胞的IL-22R-Fc/IL-10R2-FcCM和对照Fc蛋白的1∶1混合物(▲)。然后将bio-IL-22(30ng/ml)加入到各孔中。结合bio-IL-22随即用链霉抗生物素-HRP进行检测。图8A-8B所示结果表明，IL-22R的ECD是IL-10R2在IL-22结合中的作用检测所需要的。当两种ECD都存在时，检测到IL-22结合增加。
图9A-9B是IL-10R2和IL-22/IL-22R之间相互作用的线性图。在加入bio-IL-22之前、同时或之后，对加入IL-10R2-Fc同型二聚体的作用进行评价。图9A是线性图，显示用来自CM并捕获到人IgG包被孔上的IL-22R-Fc的ELISA结果。bio-IL-22随即用链霉抗生物素-HRP进行检测(长划虚线)。不同浓度的IL-10R2-Fc和生物素化IL-22也一并加入，然后检测结合的bio-IL-22(◆)。也先加入来自CM的不同浓度的IL-10R2-Fc，随即将bio-IL-22加入到各孔中，然后检测结合的bio-IL-22(◇)。在图9B中，使来自CM的50ng/ml IL-22R-Fc捕获到抗人IgG包被孔上。然后将bio-IL-22加入到各孔中。随即用链霉抗生物素-HRP检测结合的bio-IL-22(实线)。也可与PBS-1％BSA(长划虚线)或不同浓度的IL-10R2-Fc(●)一起再温育1小时后，检测结合的bio-IL-22。本文所示结果表明，在其增强IL-22结合作用之前，对IL-10R2的结合需要IL-22与IL-22R之间的相互作用。
图10A-10C表示用大鼠单克隆抗人IL-22抗体(Ab-02或Ab-04)对IL-22活性的抑制作用。在图10A中，系列稀释的抗体与固定浓度的IL-22在细胞培养基中预温育。该培养基，包括IL-22与抗体的复合物，一起加到HEPG2细胞上。然后，制备细胞裂解物，经凝胶电泳分离蛋白，转印，然后用对P-STAT3具有特异性的抗体进行检测。单独与IL-22(+)或不与IL-22(-)温育的细胞，分别作为阳性对照和阴性对照。这两种抗体都能阻断IL-22对细胞的活性：随着抗体浓度增加，P-STAT3的检出下降。在图10B中，使50ng/ml来自CM的IL-22R-Fc捕获到抗人IgG包被孔上。生物素化IL-22(30ng/ml)单独预温育(长划虚线)或与不同浓度的Ab-02(●)、Ab-04(▲)、抗IL-10R2(+)或对照抗体(-)预温育30分钟，再向各孔加入固定化IL-22R-Fc。随即用链霉抗生物素-HRP检测结合的生物素化IL-22。(C)将50ng/ml来自表达IL-22R-Fc和IL-10R2-Fc的CHO细胞的CM的总Fc，在抗人IgG包被孔中温育。生物素化IL-22(5ng/ml)单独预温育(长划虚线)或与不同浓度的Ab-02(●)、Ab-04(▲)、抗IL-10R2(+)或对照抗体(-)预温育30分钟，再向各孔加入固定化IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc。随即用链霉抗生物素-HR检测结合的生物素化IL-22。这些结果表明，Ab-02和Ab-04都中和IL-22的活性。Ab-04阻断IL-22与IL-22R之间的相互作用，而Ab-02阻断IL-22与IL-10R2之间的相互作用。
图11A-11C表示用IL-22BP-Fc对IL-22活性的抑制作用。在图11A中，使50ng/ml来自CM的IL-22R-Fc捕获到抗人IgG包被孔上。生物素化IL-22(30ng/ml)单独预温育(长划虚线)或与不同浓度的IL-22BP-Fc()预温育30分钟，再向各孔加入固定化IL-22R-Fc。随即用链霉抗生物素-HRP检测结合的生物素化IL-22。背景用短划虚线表示。在图11B中，将50ng/ml来自表达IL-22R-Fc和IL-10R2-Fc的CHO细胞的CM的总Fc，在抗人IgG包被孔中温育。生物素化IL-22(5ng/ml)单独预温育(长划虚线)或与不同浓度的IL-22BP-Fc()一起预温育30分钟，再向各孔加入固定化IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc。随即用链霉抗生物素-HRP检测结合的生物素化IL-22。在图11C中，将CM中的50ng/ml IL-22BP-Fc在抗人IgG包被孔上温育。生物素化IL-22(1ng/ml)单独预温育(长划虚线)或与不同浓度的Ab-02(●)或Ab-04(▲)或对照大鼠抗体(-)预温育30分钟，再向各孔加入固定化IL-22BP-Fc。随即用链霉抗生物素-HRP检测结合的生物素化IL-22。图11A-11C显示IL-22BP以与Ab-04类似的方式抑制IL-22活性，而Ab-02则不同。
图12是示意图，显示IL-22/IL-22R/IL-10R2受体复合物的装配。抗体由Ab-04表示，其与IL-22表位结合，该结合导致对IL-22与IL-22R之间相互作用的阻断。认为Ab-04以与IL-22结合蛋白(IL-22BP)类似的水平，阻断IL-22与IL-22R之间的相互作用。由Ab-02所代表的抗体与IL-22表位结合，该结合导致对IL-22与IL-10R2之间相互作用的阻断。认为Ab-02减少或阻断IL-22/IL-22R和IL-10R2之间的复合物的形成。
图13是一幅图，表示大鼠抗人IL-22单克隆抗体对IL-22活性的抑制。固定浓度的IL-22与不同浓度的Ab-02(●)或Ab-04(▲)或对照抗体(-)在细胞培养基中预温育，再加入到用pSTAT-TA-Luc载体瞬时转染的HepG2细胞中。
图14是一幅图，表示大鼠抗人IL-22单克隆抗体和IL-22BP-Fc对IL-22活性的抑制。固定浓度的IL-22与不同浓度的Ab-04(▲)或IL-22BP-Fc(□)在细胞培养基中预温育，再加入到用pSTAT-TA-Luc载体瞬时转染的HepG2细胞中。
图15是一幅图，表示大鼠抗人IL-22单克隆抗体对IL-22活性的抑制。固定浓度的IL-22与不同浓度的Ab-02(●)或Ab-04(▲)或对照抗体(-)在细胞培养基中预温育，再加入到同时表达IL-22R和IL-10R2受体的BaF3细胞中。
                        发明详述
白介素22(“IL-22”)是一种细胞因子，是在先天性免疫应答和适应性免疫应答中诱导出来的。当给予患者时，它可以诱导急性期反应，表明在炎症机制中IL-22的作用。与IL-22一起形成信号复合物的受体链是IL-22受体(“IL-22R”)和IL-10受体2(“IL-10R2”)，是II类细胞因子受体家族的两个成员。在一个实施方案中，申请人在基于ELISA的实验中，用生物素化细胞因子和受体胞外结构域(ECD)Fc融合二聚体，表征了这些蛋白之间的相互作用。申请人表明，IL-22对IL-22R的ECD具有可测量的亲和性，而对单独的IL-10R2则没有可测量的亲和性(实施例12)。IL-22对作为Fc异型二聚体的IL-22R/IL-10R2 ECD具有更大的亲和力(实施例13)。目前的研究进一步表明，IL-10R2与IL-22/IL-22R之间缔合所产生的表面结合。申请人相信，IL-10R2 ECD在其细胞因子受体复合物中进一步稳定了IL-22的结合(实施例14和15)。在其它实施方案中，产生了中和抗IL-22抗体，并对其结合特异性、亲和性和IL-22中和活性，进行了表征(实施例5、16、17、20、21和22)。在一个实施方案中，中和大鼠IL-22抗体和IL-22BP(分泌型IL-22结合蛋白及其天然拮抗剂)，都说明IL-22表位对于IL-22R ECD的识别是直接需要的。在又一个实施方案中，大鼠单克隆抗体限定了分离的IL-22区对IL-10R2 ECD的作用是重要的。另外，申请人已表明，给予IL-22，在体内诱导急性期反应参数，而且，中和抗IL-22抗体降低了IL-22活性，在小鼠胶原诱发的关节炎(CIA)模型中能缓解炎性症状(实施例9)。IL-22 mRNA的表达在发炎部位被上调。因此，IL-22拮抗剂，例如中和抗IL-22抗体及其片段，可用于在体内诱导免疫抑制。
因此，本申请人至少部分提供抗体及其抗原结合片段，其高亲和性和特异性地与IL-22、尤其是人IL-22结合。在一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段降低、抑制或拮抗至少一种IL-22相关活性。例如，抗IL-22抗体或其片段可与IL-22(例如IL-22的表位)结合，并干扰IL-22与IL-22受体复合物(例如包含IL-22受体(“IL-22R”)和白介素-10受体2(“IL-10R2”)或其亚基(例如单独的IL-22R或IL-10R2)的复合物)之间的相互作用(例如结合)。因此，本发明的抗体及其片段可用于干扰(例如抑制、阻断或降低)IL-22与IL-22受体复合物或其亚基之间的相互作用(例如结合)。因此，本发明的抗IL-22抗体或其片段可用于诊断、治疗或预防IL-22相关疾病，例如自身免疫性疾病，例如关节炎(例如类风湿性关节炎)；呼吸性疾病(例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)；和皮肤(例如银屑病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)和胰腺(例如胰腺炎)等的炎性疾病。
为了更容易理解本发明，首先定义下面的一些术语。在发明详述中还会给出其它的定义。
本文所用的术语“白介素-22”或“IL-22”是指与IL-10同源的II类细胞因子，其在T细胞中被IL-9或ConA上调(Dumoutier L.等(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(18)：10144-9)。细胞因子IL-22的表达被LPS所刺激，但是IFN-γ并不显著刺激它。IL-22主要由活化的人和小鼠Th1产生，而不是由Th2、CD4+细胞产生。IL-22调节指示急性期反应的参数(Dumoutier L.等(2000)，参见上文；Pittman D.等(2001)Genesand Immunity 2：172；WO 00/65027；Gabay，C.(1999)New EnglandJournal of Medicine 340(6)：448-454)和指示炎症的参数(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3)：223-40；WO00/65027)。据信，IL-22与受体复合物结合，所述受体复合物是由两个II类细胞因子受体家族(cytokine receptor family，CRF2)成员IL-22受体(在本文中也称为″IL-22R”)和IL-10受体2(在本文中也称为″IL-10R2”)组成。这两个受体的核苷酸序列和氨基酸序列描述于Xie M.H.等(2000)J Biol Chem 275(40)：31335-9(人IL-22R)；Kotenko S.V.等(2001)J Biol Chem 276(4)：2725-32(人IL-10R2)。在多种器官中都可组成型地表达IL-22受体的两条链。来自这些器官的上皮细胞系响应体外IL-22(Kotenko S.V.(2002)Cytokine & Growth Factor Reviews13(3)：223-40)。IL-22诱导JAK/STAT3和ERK途径的活化，以及介导其它MAPK途径(Dumoutier L.等(2000)，参见上文；Xie M.H.等(2000)，参见上文；Dumoutier L.等(2000)J Immunol 164(4)：1814-9；Kotenko S.V.等(2001)J Biol Chem 276(4)：2725-32；Lejeune，D.等(2002)J Biol Chem 277(37)：33676-82)。这些参考文献的内容通过引用全部结合到本文中。
因此，术语“IL-22”是指细胞因子(优选哺乳动物细胞因子，例如鼠或人的细胞因子)，其能与IL-22受体(例如IL-22R或IL-10R2或其复合物(优选哺乳动物，例如鼠或人来源的)的相互作用(例如结合)，并且具有下述特征之一：(i)天然存在的哺乳动物IL-22多肽或其片段的氨基酸序列，例如SEQ ID NO：2(人)或SEQ ID NO：4(鼠)所示氨基酸序列或其片段；(ii)基本上与SEQ ID NO：2(人)或SEQ ID NO：4(鼠)所示氨基酸序列或其片段具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％同源性的氨基酸序列；(iii)由天然存在的哺乳动物IL-22核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：1(人)或SEQ ID NO：3(鼠)或其片段)所编码的氨基酸序列；(iv)由与SEQ ID NO：1(人)或SEQ ID NO：3(鼠)或其片段所示核苷酸序列基本上具有例如至少85％、90％、95％、98％、99％的同源性的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；(v)由与天然存在的IL-22核苷酸序列或其片段(例如SEQ ID NO：1(人)或SEQ ID NO：3(鼠)或其片段)简并的核苷酸序列所编码的氨基酸序列；或(vi)在严格性条件(例如高度严格性条件)下与前述核苷酸序列之一杂交的核苷酸序列。优选的IL-22多肽具有一种或多种IL-22相关活性，例如本文所述的活性。
依据布达佩斯条约，将人IL-22 cDNA于1999年4月28日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，10801University Boulevard，Manassas，Virginia，U.S.A.20110-2209)，作为原始保藏物，并给予保藏号为ATCC 207231。对公众能得到该保藏材料的所有限制，将会在该专利授权时被不可撤销地注销，除非在37C.F.R.§1.808(b)所规定的要求内，而且有关保藏的条款要符合37C.F.R.§1.806。
短语“IL-22相关活性”是指成熟IL-22多肽(例如哺乳动物，例如分别具有SEQ ID NO：2和4所示氨基酸序列的人IL-22或鼠IL-22)等IL-22多肽的一种或多种生物活性，包括但不限于(1)与IL-22受体(例如IL-22R或IL-10R2或其复合物，优选哺乳动物，例如鼠或人来源的)的相互作用(例如结合)；(2)与一种或多种信号转导分子结合；(3)刺激JAK/STAT3、ERK和MAPK等蛋白激酶的磷酸化和/或活化；(4)调节例如刺激或降低IL-22效应细胞(例如来自肾脏、肝脏、结肠、小肠、甲状腺、胰腺、皮肤等的上皮细胞)的增殖、分化、效应细胞功能、细胞溶解活性、细胞因子或趋化因子分泌和/或存活；(5)调节至少一种急性期反应的参数，例如代谢变化、肝变化、造血变化(例如贫血、血小板升高)或神经内分泌变化，或者变化(例如急性期蛋白增加或降低，例如血纤蛋白原和/或血清淀粉状蛋白A增加，或白蛋白降低)；和/或(6)调节至少一种炎症期参数，例如调节细胞因子介导的促炎作用(例如发热和/或***素合成，例如PGE2合成)，调节细胞免疫应答，调节细胞因子、趋化因子(例如GRO1)或淋巴因子的产生和/或分泌(例如促炎细胞因子的产生和/或分泌)。
术语“急性期反应”是本领域公认的，参见例如Gabay，C.(1999)New England Journal of Medicine 340(6)：448-454)。
本文所用的IL-22拮抗剂(例如抗体)的“治疗有效量”是指以单剂量或多剂量给予患者(例如人患者)的药物的有效量，使其治愈、缓解一种或多种疾病症状或降低其严重程度，或使患者的生存期比未经该治疗的患者的生存期更长。
本文所用的IL-22拮抗剂(例如抗体)的“预防有效量”是指以单剂量或多剂量给予患者(例如人患者)的药物的有效量，使其预防或延迟疾病的发作或复发，所述疾病例如本文所述的疾病。
术语“诱导”、“减少”、“抑制”、“增强”、“提高”、“降低”等，例如表示两种状态之间数量上的差异时，是指两种状态之间数量上至少具有统计学上显著性差异。
本文所用的“IL-22拮抗剂”是指减少、抑制或消除IL-22多肽(例如人IL-22多肽)或其片段的一种或多种生物活性的药物。优选所述拮抗剂与IL-22多肽的相互作用(例如结合)。使用IL-22拮抗剂的拮抗作用不一定表明IL-22相关生物活性的总的消除。IL-22拮抗剂包括但不限于针对人IL-22蛋白的抗体；受体的可溶性形式或人IL-22所涉及的其它靶标；针对受体或人IL-22所涉及的其它靶标的抗体；和抑制或干扰人IL-22与其受体或其它靶标之间相互作用的肽和小分子化合物。在一个实施方案中，IL-22拮抗剂具有与Ab-02相似的结合特性(例如它与相同或相似表位结合)。在另一个实施方案中，IL-22拮抗剂具有与Ab-04相似的结合特性(例如它与相同或相似表位结合)。
本文所用的“IL-22激动剂”是指能增强、诱导或提高IL-22多肽的一种或多种生物活性的药物。
本文所用的术语“抗体”是指包含至少一个、优选两个重(H)链可变区(在本文中缩写为VH)以及至少一个、优选两个轻(L)链可变区(在本文中缩写为VL)的蛋白。VH区和VL区可进一步分为超变区和构架区(FR)，前者称为“互补决定区”(“CDR”)，其分布在更为保守的构架区中。已经精确测定了构架区和CDR的长度(参见Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242，和Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917，其通过引用结合到本文中)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，按以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
所述抗体还可包含重链恒定区和轻链恒定区，因而分别形成免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链。在一个实施方案中，所述抗体是两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链是彼此通过例如二硫键连接的。重链恒定区由以下三个结构域组成：CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域组成。重链可变区和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述因子包含免疫***的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)。
本文所用的术语“免疫球蛋白”是指由基本上由免疫球蛋白基因所编码的一种或多种多肽组成的蛋白。已鉴定的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)是由NH2-端的可变区基因(约110个氨基酸)和COOH-端的κ或λ恒定区基因所编码的。同样，全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)是由可变区基因(约116个氨基酸)和其它上述恒定区基因之一(例如γ(编码约330个氨基酸))所编码的。
本文所用的“同种型”是指由重链恒定区基因所编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
本文所用的术语抗体的“抗原结合片段”(或简称“抗体部分”，或“片段”)是指全长抗体的一个或多个片段，其保留与抗原(例如CD3)特异性结合的能力。结合片段的实例包括在术语抗体的“抗原结合片段”范围内，其包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含在铰链区以二硫键相连的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等(1989)Nature  341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域即VL和VH，是由各自的基因所编码的，但是可以用重组方法，通过合成的接头使它们彼此连接，所述接头能使它们成为一条蛋白单链，其中VL区和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等(1988)Science  242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA  85：5879-5883)。所述单链抗体预期也包括在术语抗体的““抗原结合片段”之内。这些抗体片段可用本领域技术人员已知的常规技术而获取，而且这些片段经筛选可以相同的方式用作完整抗体。
术语“联用”在本文中是指基本上同时(一起或序贯)给药。如果是序贯给药，在给予第二种化合物的同时，优选两种化合物中的第一种在治疗部位上仍处于有效浓度。
与本文所公开的序列类似或同源的序列(例如至少约85％序列同一性)也是本申请的一部分。在一些实施方案中，序列同一性可以是约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高。或者，当核酸区段在选择性杂交条件(例如高度严格性杂交条件)下，可与互补链杂交时，即具有基本同一性。核酸可存在于完整细胞、细胞裂解物中，或呈部分纯化或基本纯化形式。
两个序列之间的“同源性”或“序列同一性”(这两个术语在本文中可互换使用)的计算进行如下。为了最佳比较目的，将序列进行比对(例如为了进行最佳比对，可在第一和第二氨基酸序列或核酸序列中或两者中引入空位，而且为了比较的目的，非同源序列可以忽略不计)。在一个优选的实施方案中，为了进行比较而比对的参考序列的长度为参考序列长度的至少30％、优选至少40％、更优选至少50％、甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％、80％、90％、100％。然后，比较相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么所述分子在该位置上是相同的(本文所用的氨基酸或核酸的“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列间％同一性是两个序列共享的相同位置数的函数，其中考虑了空位数和每个空位的长度，它们是为了两个序列最佳比对的目的而引入的。
两个序列间的序列比较和确定％同一性，可以采用数学算法而完成。在一个优选的实施方案中，两个氨基酸序列间的％同一性采用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法而得出，所述算法结合到GCG软件包(可得自http：//www.gcg.com)的GAP程序中，用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，其空位权重为16、14、12、10、8、6或4，而长度权重为1、2、3、4、5或6。在再一个优选的实施方案重，两个核苷酸序列间％同一性运用GCG软件包(可得自http：//www.gcg.com)的GAP程序而得出，用NWSgapdna.CMP矩阵，其空位权重为40、50、60、70或80，而长度权重为1、2、3、4、5或6。一组特别优选的参数(和应当采用的参数，如果技术人员不知道用什么参数来确定某分子是否是在本发明的序列同一性或同源性限制范围内的话)是Blossum 62打分矩阵，其空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。两个氨基酸或核苷酸序列间的％同一性也可用E.Meyers和W.Miller((1989)CABIOS，4：11-17)的算法而得出，所述算法结合到ALIGN程序(第2.0版)中，用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。
本文所用的术语“在严格性条件下杂交”是指杂交和洗涤条件。严格性条件是本领域技术人员已知的，可在以下文献中找到：CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。有水方法和无水方法描述于该参考文献中，两种方法都可采用。严格性杂交条件的一个优选实例是在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，在约45℃进行杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于50℃洗涤一次或多次。严格性杂交条件的另一个实例是在6X SSC中，在约45℃进行杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于55℃洗涤一次或多次。严格性杂交条件的再一个实例是在6X SSC中，在约45℃进行杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于60℃洗涤一次或多次。优选的严格性杂交条件是在6X SSC中，在约45℃进行杂交，再在0.2XSSC、0.1％SDS中，于65℃洗涤一次或多次。特别优选的严格性杂交条件(和应当采用的条件，如果技术人员不知道用什么条件来确定某分子是否是在本发明的杂交限制范围内的话)是在0.5M磷酸钠、7％SDS中，于65℃杂交，再在0.2X SSC、0.1％SDS中，于65℃洗涤一次或多次。
人们知道，IL-22多肽和拮抗剂(例如本发明的其抗体)可具有其它保守或非必需氨基酸取代，这些取代对其功能基本上没有影响。“保守氨基酸取代”是这样的取代：其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括带有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，带有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，带非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，带β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和带芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
IL-22蛋白、片段和编码所述蛋白的多核苷酸
IL-22核苷酸序列和氨基酸序列是本领域已知的，见下文。也可按照已知方法通过对保藏的克隆进行测序而确定每个克隆的核苷酸序列。预测的氨基酸序列(无论是全长形式还是成熟形式)都可以根据所述核苷酸序列来确定。也可通过在合适的宿主细胞中表达克隆、收集蛋白并测定其序列，来确定由特定克隆所编码的蛋白的氨基酸序列。
本文所用的“分泌型”蛋白是在合适宿主细胞中表达后经跨膜转运的蛋白质，包含因其氨基酸序列中有信号序列而转运的蛋白质。“分泌型”蛋白包括但不限于从表达它们的细胞中全部分泌的蛋白(例如可溶性蛋白)或部分分泌的蛋白(例如受体)。“分泌型”蛋白也包括但不限于跨越内质网膜而转运的蛋白。
人IL-22的核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO：1)，并且包含聚(A)尾。所公开的核苷酸序列包含可读框，而且对应于前述核苷酸序列的全长IL-22蛋白的氨基酸序列据报道在SEQ ID NO：2中。成熟IL-22的氨基酸序列对应于SEQ ID NO：2的约氨基酸34-179。
   1  GAATTCGGCC AAAGAGGCCT ACAGGTTCTC CTTCCCCAGT CACCAGTTGC
  51  TCGAGTTAGA ATTGTCTGCA ATGGCCGCCC TGCAGAAATC TGTGAGCTCT
 101  TTCCTTATGG GGACCCTGGC CACCAGCTGC CTCCTTCTCT TGGCCCTCTT
 151  GGTACAGGGA GGAGCAGCTG CGCCCATCAG CTCCCACTGC AGGCTTGACA
 201  AGTCCAACTT CCAGCAGCCC TATATCACCA ACCGCACCTT CATGCTGGCT
 251  AAGGAGGCTA GCTTGGCTGA TAACAACACA GACGTTCGTC TCATTGGGGA
 301  GAAACTGTTC CACGGAGTCA GTATGAGTGA GCGCTGCTAT CTGATGAAGC
 351  AGGTGCTGAA CTTCACCCTT GAAGAAGTGC TGTTCCCTCA ATCTGATAGG
 401  TTCCAGCCTT ATATGCAGGA GGTGGTGCCC TTCCTGGCCA GGCTCAGCAA
 451  CAGGCTAAGC ACATGTCATA TTGAAGGTGA TGACCTGCAT ATCCAGAGGA
 501  ATGTGCAAAA GCTGAAGGAC ACAGTGAAAA AGCTTGGAGA GAGTGGAGAG
 551  ATCAAAGCAA TTGGAGAACT GGATTTGCTG TTTATGTCTC TGAGAAATGC
 601  CTGCATTTGA CCAGAGCAAA GCTGAAAAAT GAATAACTAA CCCCCTTTCC
 651  CTGCTAGAAA TAACAATTAG ATGCCCCAAA GCGATTTTTT TTAACCAAAA
 701  GGAAGATGGG AAGCCAAACT CCATCATGAT GGGTGGATTC CAAATGAACC
 751  CCTGCGTTAG TTACAAAGGA AACCAATGCC ACTTTTGTTT ATAAGACCAG
 801  AAGGTAGACT TTCTAAGCAT AGATATTTAT TGATAACATT TCATTGTAAC
 851  TGGTGTTCTA TACACAGAAA ACAATTTATT TTTTAAATAA TTGTCTTTTT
 901  CCATAAAAAA GATTACTTTC CATTCCTTTA GGGGAAAAAA CCCCTAAATA
 951  GCTTCATGTT TCCATAATCA GTACTTTATA TTTATAAATG TATTTATTAT
1001  TATTATAAGA CTGCATTTTA TTTATATCAT TTTATTAATA TGGATTTATT
1051  TATAGAAACA TCATTCGATA TTGCTACTTG AGTGTAAGGC TAATATTGAT
1101  ATTTATGACA ATAATTATAG AGCTATAACA TGTTTATTTG ACCTCAATAA
1151  ACACTTGGAT ATCCTAAAAA AAAAAAAAAA AAAGCGGCCG C
1152  (SEQ ID NO：1)
所编码多肽的多肽序列如下所示。
1    MAALQKSVSS FLMGTLATSC LLLLALLVQG GAAAPISSHC RLDKSNFQQP
51   YITNRTFMLA KEASLADNNT DVRLIGEKLF HGVSMSERCY LMKQVLNFTL
101  EEVLFPQSDR FQPYMQEVVP FLARLSNRLS TCHIEGDDLH IQRNVQKLKD
151  TVKKLGESGE IKAIGELDLL FMSLRNACI (SEQ ID NO：2)
编码鼠IL-22的核苷酸序列和所编码的多肽序列如下所示。
1     GAATTCGGCC AAAGAGGCCT ACCTAAACAG GCTCTCCTCT CAGTTATCAA
51    CTGTTGACAC TTGTGCGATC TCTGATGGCT GTCCTGCAGA AATCTATGAG
101   TTTTTCCCTT ATGGGGACTT TGGCCGCCAG CTGCCTGCTT CTCATTGCCC
151   TGTGGGCCCA GGAGGCAAAT GCGCTGCCCG TCAACACCCG GTGCAAGCTT
201   GAGGTGTCCA ACTTCCAGCA GCCATACATC GTCAACCGCA CCTTTATGCT
251   GGCCAAGGAG GCCAGCCTTG CAGATAACAA CACAGATGTC CGGCTCATCG
301   GGGAGAAACT GTTCCGAGGA GTCAGTGCTA AGGATCAGTG CTACCTGATG
351   AAGCAGGTGC TCAACTTCAC CCTGGAAGAC GTTCTGCTCC CCCAGTCAGA
401   CAGGTTCCAG CCCTACATGC AGGAGGTGGT GCCTTTCCTG ACCAAACTCA
451   GCAATCAGCT CAGCTCCTGT CACATCAGCG GTGACGACCA GAACATCCAG
501   AAGAATGTCA GAAGGCTGAA GGAGACAGTG AAAAAGCTTG GAGAGAGTGG
551   AGAGATCAAG GCGATTGGGG AACTGGACCT GCTGTTTATG TCTCTGAGAA
601   ATGCTTGCGT CTGAGCGAGA AGAAGCTAGA AAACGAAGAA CTGCTCCTTC
651   CTGCCTTCTA AAAAGAACAA TAAGATCCCT GAATGGACTT TTTTACTAAA
701   GGAAAGTGAG AAGCTAACGT CCATCATTAT TAGAAGATTT CACATGAAAC
751   CTGGCTCAGT TGAAAAAGAA AATAGTGTCA AGTTGTCCAT GAGACCAGAG
801   GTAGACTTGA TAACCACAAA GATTCATTGA CAATATTTTA TTGTCACTGA
851   TGATACAACA GAAAAATAAT GTACTTTAAA AAATTGTTTG AAAGGAGGTT
901   ACCTCTCATT CCTTTAGAAA AAAAGCTTAT GTAACTTCAT TTCCATAACC
951   AATATTTTAT ATATGTAAGT TTATTTATTA TAAGTATACA TTTTATTTAT
1001  GTCAGTTTAT TAATATGGAT TTATTTATAG AAACATTATC TGCTATTGAT
1051  ATTTAGTATA AGGCAAATAA TATTTATGAC AATAACTATG GAAACAAGAT
1101  ATCTTAGGCT TTAATAAACA CATGGATATC ATAAAAAAAA AAAAAAAAAA
1151  AAAAAAAAGC GGCCGC  (SEQ ID NO：3)
上述参考多核苷酸序列所编码的多肽的氨基酸序列如下所示：
1    MAVLQKSMSF SLMGTLAASC LLLIALWAQE ANALPVNTRC KLEVSNFQQP
51   YIVNRTFMLA KEASLADNNT DVRLIGEKLF RGVSAKDQCY LMKQVLNFTL
101  EDVLLPQSDR FQPYMQEVVP FLTKLSNQLS SCHISGDDQN IQKNVRRLKE
151  TVKKLGESGE IKAIGELDLL FMSLRNACV* (SEQ ID NO：4)
短于全长的IL-22蛋白的任何形式都可用于本发明的方法和组合物，只要其保留与IL-22受体结合的能力。可以通过编码全长IL-22蛋白的多核苷酸相应片段在宿主细胞中表达，产生IL-22片段(例如短于全长的IL-22蛋白)。这些相应的多核苷酸片段也是本发明的一部分。如上所述的修饰的多核苷酸可以通过标准分子生物学技术来制备，所述技术包括合适的所需缺失突变体的构建、定点诱变方法或通过使用合适的寡核苷酸引物的聚合酶链式反应。
所述蛋白片段可以是线状形式，或者可以用已知方法将其环化，所述方法例如描述于H.U.Saragovi等，Bio/Technology  10，773-778(1992)和R.S.McDowell等，J.Amer.Chem.Soc. 114，9245-9253(1992)，这两篇文献都通过引用结合到本文中。所述片段可以与免疫球蛋白等载体分子融合，用于许多目的，所述目的包括增加蛋白结合部位的化合价。例如，所述蛋白的片段可以通过“接头”序列与免疫球蛋白的Fc部分融合。对于所述蛋白的二价形式，所述融合物可以与IgG分子的Fc部分连接。其它免疫球蛋白同种型也可用于产生所述融合物。例如，蛋白-IgM融合物产生本发明蛋白的十价形式。
IL-22蛋白及其片段包含这样的蛋白质：其氨基酸序列长度至少为所公开的蛋白质长度的25％(更优选至少50％和最优选至少75％)，并且具有与所公开的蛋白质至少60％序列同一性(更优选至少75％同一性；最优选至少90％或95％同一性)，其中序列同一性是通过比较蛋白质的氨基酸序列而确定的，当进行比对以达到最大化重叠和同一性，同时最小化序列空位时。本发明也包括这样的蛋白和蛋白片段：其含有优选包含8个或更多(更优选20个或更多、最优选30个或更多)毗连氨基酸的区段，所述区段与所公开蛋白的任何区段共享至少75％序列同一性(更优选至少85％同一性；最优选至少95％同一性)。
在另一个实施方案中，本发明的蛋白、蛋白片段和重组蛋白包括可以根据至少一个“IL-22受体结合基序”的存在而确定的蛋白、蛋白片段和重组蛋白。本文所用的术语“IL-22受体结合基序”包括氨基酸序列或残基，这些序列和残基对于IL-22与其所需受体结合来说是重要的。在一个优选的实施方案中，IL-22蛋白含有包含SEQ IDNO：2的约氨基酸50-60的IL-22受体结合基序。在另一个实施方案中，IL-22蛋白含有包含SEQ ID NO：2的约氨基酸63-81的IL-22受体结合基序。在又一个实施方案中，IL-22蛋白含有包含SEQ ID NO：2的约氨基酸168-177的IL-22受体结合基序。在一个优选的实施方案中，IL-22蛋白含有包含SEQ ID NO：2的氨基酸50-60、氨基酸63-81和/或约氨基酸168-177中的至少一个的IL-22受体结合基序。
在又一个实施方案中，IL-22受体结合基序具有与选自以下的氨基酸序列有至少95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：2的氨基酸50-60、SEQ ID NO：2的氨基酸63-81和SEQ ID NO：2的氨基酸168-177。在另一个实施方案中，本发明的蛋白、蛋白片段和重组蛋白包括可以根据至少一个、两个、三个、四个或更多N联糖基化位点的存在而识别的蛋白、蛋白片段和重组蛋白。可以通过多核苷酸序列的比对和最佳序列互补区域的识别，来确定长度。
载体和宿主细胞
IL-22多核苷酸可以与表达控制序列(例如Kaufman等，NucleicAcids Res. 19，4485-4490(1991)中公开的pMT2表达载体或pED表达载体)操作性连接，以便重组产生蛋白。许多合适的表达控制序列是本领域已知的。表达重组蛋白的通用方法也是已知的，并在以下文献举例说明：R.Kaufman(1990)Methods in Enzymology  185，537-566。本文所定义的“操作性连接”是指本发明的分离的多核苷酸和表达控制序列位于同一载体或细胞内，其方式使得用连接的多核苷酸/表达控制序列所转化(转染)的宿主细胞能表达所述蛋白。
本文所用的术语“载体”是指能够转运与其连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它是环状双链DNA环，其中可连接其它DNA区段。另一种类型的载体是病毒载体，其中其它DNA区段可连接到病毒基因组中。某些载体在导入它们的宿主细胞中能自我复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞后，可整合到宿主细胞基因组中，因而可随宿主基因组复制而复制。此外，某些载体能指导与其操作性连接的基因的表达。所述载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。一般而言，用于重组DNA技术的表达载体通常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明包括其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其行使相同的功能。
术语“调节序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)，其控制抗体链基因的转录或翻译。所述调节序列描述于例如以下文献：Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)。本领域技术人员将会理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，可取决于待转化的宿主细胞的选择、所需蛋白的表达水平等因素。对于哺乳动物宿主细胞的表达来说，优选的调节序列包括在哺乳动物细胞中指导蛋白高水平表达的病毒元件，例如来自以下的启动子和/或增强子：FF-la启动子和BGH聚A、巨细胞病毒(CMV)(例如CMV启动子/增强子)、猿猴病毒40(SV40)(例如SV40启动子/增强子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒。有关病毒调节元件及其序列的进一步描述，可参见例如Stinski的美国专利第5,168,062号、Bell等的美国专利第4,510,245号和Schaffner等的美国专利第4,968,615号。
本发明的重组表达载体可携带额外序列，例如在宿主细胞中调节载体复制的序列(例如复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于选择其中导入载体的宿主细胞(参见例如Axel等的美国专利第4,399,216、4,634,665和5,179,017号)。例如，在导入载体的宿主细胞中的选择性标记基因通常具有抗药性，所述药物例如G418、潮霉素或甲氨蝶呤。优选的选择性标记基因包含二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于dhfr-宿主细胞，用甲氨蝶呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。
许多类型的细胞可作为合适的宿主细胞，用于表达IL-22蛋白或其融合蛋白。能表达功能性IL-22蛋白的任何细胞类型都可使用。合适的哺乳动物宿主细胞包括例如猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、人肾293细胞、人表皮A431细胞、人Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、来自灵长类原代体外组织培养物的细胞株、原代外植体、HeLa细胞、小鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、Mlx或C2C12细胞。
也可通过在一种或多种昆虫表达载体中，将本发明分离的多核苷酸与合适的控制序列操作性连接，使用昆虫表达***，产生IL-22蛋白或其融合蛋白。用于杆状病毒/昆虫细胞表达***的材料与方法是以试剂盒形式市售的，得自例如Invitrogen，San Diego，Calif.U.S.A.(MaxBacd试剂盒)，所述方法是本领域众所周知的，描述于Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)，所述文献通过引用结合到本文中。IL-22蛋白的可溶性形式也可用如上所述的合适的分离的多核苷酸，在昆虫细胞中产生。
或者，IL-22蛋白或其融合蛋白可以在酵母等低等真核生物或细菌等原核生物中产生。合适的酵母菌株包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)菌株、假丝酵母属(Candida)或能表达异源蛋白的任何酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或能表达异源蛋白的任何细菌菌株。
在细菌中表达，能导致形成含有重组蛋白的包涵体。因此，需要对重组蛋白进行重折叠，以便产生有活性或活性更高的材料。从细菌包涵体中正确获取折叠的异源蛋白的一些方法是本领域已知的。这些方法通常包括从包涵体中溶解所述蛋白，然后用离液剂使蛋白完全变性。当蛋白质的一级氨基酸序列中存在半胱氨酸残基时，它通常需要在允许正确形成二硫键(氧化还原***)的环境中完成重折叠。重折叠的通用方法公开于Kohno，Meth.Enzym.，185：187-195(1990)。EP 0433225，同时待审的美国专利申请顺序号08/163,877描述了其它合适的方法。
IL-22蛋白或其融合蛋白也可表达为转基因动物的产物，例如表达为转基因母牛、山羊、猪或绵羊的乳汁成分，所述转基因动物的特征是体细胞或生殖细胞中含有编码IL-22蛋白或其融合蛋白的多核苷酸序列。
可通过在表达所需蛋白必需的培养条件下培养转化的宿主细胞，制备IL-22蛋白或其融合蛋白。所得的表达蛋白然后可以从培养基或细胞提取物中纯化出来。IL-22蛋白或其融合蛋白的可溶形式可从条件培养基中纯化出来。可通过从表达细胞中制备总膜成分并用非离子型去垢剂(例如Triton X-100)萃取膜，制备本发明IL-22蛋白的膜结合形式。
可采用本领域技术人员已知的方法，纯化IL-22蛋白。例如，本发明的IL-22蛋白可用市售的蛋白浓缩滤器(例如Amicon或MilliporePellicon超滤单元)进行浓缩。浓缩步骤之后，浓缩液可加到纯化基质例如凝胶过滤介质上。或者，可使用离子交换树脂，例如，具有悬挂(pendant)二乙氨基乙基(DEAE)或聚亚乙基亚胺(polyetheyleneimine，PEI)基团的基质或物质。该基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或通常用于蛋白质纯化的其它种类。或者，可以采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括含磺基丙基或羧基甲基的各种不溶性基质。优选磺基丙基基团(例如S-Sepharose柱)。从培养上清液中纯化IL-22蛋白或融合蛋白，也可包括一个或多个过柱步骤，例如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-toyopearl或Cibacrom blue 3GASepharose等亲和树脂；或通过疏水作用层析，用苯基醚、丁基醚或丙基醚等树脂；或通过免疫亲和层析。最后，可以使用一种或多种反相高效液相层析(RP-HPLC)步骤，用疏水RP-HPLC介质，例如具有悬挂甲基或其它脂族基团的硅胶，进一步纯化IL-22蛋白。包含抗IL-22蛋白抗体的亲和柱也可用于按照已知方法进行纯化。上述纯化步骤的部分步骤或全部步骤，以不同组合或与其它已知方法组合，也可用于提供基本上纯化的分离的重组蛋白。优选分离的IL-22蛋白是纯化的，使得它基本上不含其它哺乳动物蛋白。
本发明的IL-22蛋白或融合蛋白也可用于筛选能与IL-22结合的药物(例如IL-22拮抗剂，例如抗IL-22抗体)。用所需结合蛋白(无论是否固定化)的结合测定是本领域众所周知的，可用于使用本发明IL-22蛋白的该目的。基于纯化细胞或基于蛋白(无细胞)的筛选试验可用于鉴定所述药物。例如，IL-22蛋白可以纯化形式固定到载体上，可以测定纯化IL-22蛋白的结合配体或潜在配体。
IL-22多肽也可通过已知的常规化学合成而制备。通过合成手段构建本发明蛋白的方法，对本领域技术人员来说是已知的。由于与蛋白共享一级、二级或三级结构和/或构象特征，合成构建的蛋白序列可具有与其共同的生物学特性，包括蛋白质活性。因此，在治疗性化合物的筛选和抗体开发的免疫学方法中，它们可以用作天然纯化蛋白的生物活性代用品或免疫代用品。
抗IL-22抗体及其抗原结合片段
在其它实施方案中，IL-22拮抗剂是与IL-22(优选哺乳动物(例如人或鼠)IL-22)结合的抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗IL-22抗体或其片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv片段)是单克隆抗体或单特异性抗体。抗体或其片段也可以是针对人IL-22的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或体外产生的抗体。
IL-22多肽也可用于免疫动物，以得到与IL-22多肽特异性反应的多克隆抗体和单克隆抗体。所述抗体可用完整的IL-22作为免疫原而获得，或通过使用IL-22片段而获得。较小的IL-22片段也可用于免疫动物。肽免疫原在羧基端还可含有半胱氨酸残基，并与匙孔血蓝蛋白(KLH)等半抗原缀合。其它肽免疫原可通过用硫酸酪氨酸残基取代酪氨酸残基而产生。所述肽的合成方法是本领域已知的，例如见R.P.Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85：2149-2154(1963)；J.L.Krstenansky等，FEBS Lett.211，10(1987)。与IL-22蛋白结合的中和抗体或非中和抗体(优选单克隆抗体)也可用于治疗本文所述的IL-22相关疾病。这些中和单克隆抗体能阻断IL-22与IL-22受体(例如IL-22R或IL-10R2或其组合)的结合。
以下实施例5详细描述了抗IL-22抗体的产生。干扰IL-22与IL-22R结合的抗IL-22抗体的非限制性实例是“Ab-04”。Ab-04(在本文中也称为大鼠单克隆抗体“P3/2”)与人IL-22结合，并中和人IL-22活性(参见实施例5、16和17)。产生Ab-04的杂交瘤细胞系于2003年6月5日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏号PTA-5255。干扰IL-22与IL-10R2结合的抗IL-22抗体的另一个非限制性实例是“Ab-02”。Ab-02(在本文中也称为大鼠单克隆抗体“P3/3”)与小鼠IL-22和人IL-22结合并中和小鼠IL-22和人IL-22的活性(参见实施例5、16和17)。产生Ab-02的杂交瘤细胞系于2003年6月5日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏号PTA-5254。
用携带人免疫球蛋白基因(而不是小鼠***)的转基因小鼠，可产生针对IL-22的人单克隆抗体(mAb)。来自这些用目标抗原免疫的转基因小鼠的脾细胞，用于产生杂交瘤，该杂交瘤分泌对人蛋白表位具有特异性亲和力的人mAb(参见例如Wood等，国际申请WO91/00906，Kucherlapati等，PCT公布号WO 91/10741；Lonberg等，国际申请WO92/03918；Kay等，国际申请92/03917；Lonberg，N.等1994 Nature 368：856-859；Green，L.L.等，1994 Nature Genet.7：13-21；Morrison，S.L.等，1994 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855；Bruggeman等，1993 Year Immunol 7：33-40；Tuaillon等，1993PNAS 90：3720-3724；Bruggeman等，1991 Eur J Immunol 21：1323-1326)。
也可通过重组DNA技术领域技术人员已知的其它方法，产生单克隆抗体。已经开发了一个替代方法，称为“组合抗体展示(combinatorial antibody display)”方法，鉴定并分离具有特定抗原特异性的抗体片段，并且可用于产生单克隆抗体(关于组合抗体展示的详细说明，参见例如Sastry等，1989 PNAS 86：5728；Huse等，1989Science 246：1275；和Orlandi等，1989 PNAS 86：3833)。用如上所述的免疫原免疫动物后，克隆所得B细胞库的所有抗体。通过使用寡聚引物混合物和PCR，获取免疫球蛋白分子各群体可变区的DNA序列的方法，通常是已知的。例如，对应于5′前导(信号肽)序列和/或构架1(FR1)序列的混合寡核苷酸引物，以及对应于保守3′恒定区引物的引物，可用于从各种鼠抗体经PCR扩增重链可变区和轻链可变区(Larrick等，1991，Biotechniques 11：152-156)。类似的策略也可用于从人抗体扩增人重链可变区和轻链可变区(Larrick等，1991，Methods：Companion to Methods in Enzymology 2：106-110)。
包含嵌合免疫球蛋白链的嵌合抗体，可通过本领域已知的重组DNA技术而制备。例如，编码鼠(或其它物种)单克隆抗体分子Fc恒定区的基因，用限制酶消化，以去除编码鼠Fc的区域，并取代编码人Fc恒定区的基因的相对部分(参见Robinson等，国际专利公布号PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等，美国专利第4,816,567号；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988 Science 240：1041-1043)；Liu等(1987)PNAS 84：3439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.139：3521-3526；Sun等(1987)PNAS 84：214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.47：999-1005；Wood等(1985)Nature 314：446-449；和Shaw等，1988，J.Natl Cancer Inst.80：1553-1559)。
可以通过本领域已知方法，使抗体或免疫球蛋白链人源化。可通过用人Fv可变区等同序列取代不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列，而产生人源化抗体(包括人源化免疫球蛋白链)。产生人源化抗体的通用方法由以下文献提供：Morrison，S.L.，1985，Science 229：1202-1207，Oi等，1986，BioTechniques 4：214，和Queen等，US5,585,089、US 5,693,761和US 5,693,762，所述文献的内容通过引用全部结合到本文中。这些方法包括编码至少一个重链或轻链的全部或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列的分离、操纵和表达。对于本领域技术人员来说，所述核酸的来源是众所周知的，并且例如可得自产生针对预先确定的靶标的抗体的杂交瘤。然后，编码人源化抗体或其片段的重组DNA可以克隆到合适的表达载体中。
可通过CDR-移植或CDR取代，制备人源化或CDR-移植抗体分子或免疫球蛋白，其中一个、两个或所有免疫球蛋白链的CDR都可以被取代。参见例如美国专利5,225,539；Jones等，1986 Nature 321：552-525；Verhoeyan等，1988 Science 239：1534；Beidler等，1988 J.Immunol.141：4053-4060；Winter，US 5,225,539，所有这些文献的内容通过引用全部结合到本文中。Winter描述了CDR-移植方法，所述方法可用于制备本发明的人源化抗体(1987年3月26日申请的UK专利申请GB 2188638A；Winter，US 5,225,539)，所述文献的内容通过引用结合到本文中。特定人抗体的所有CDR都可以用至少一部分非人类CDR取代，或者仅有部分CDR可以被非人类CDR取代。仅有必要取代人源化抗体与预先确定的抗原结合所需的CDR的数量。
通过缺失、添加或取代抗体其它部分(例如恒定区)而修饰的单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体，也包括在本发明范围内。例如，抗体可以通过以下方法修饰：(i)缺失恒定区；(ii)用另一个恒定区取代原有恒定区，所述另一个恒定区例如能增加抗体半寿期、稳定性或亲和性的恒定区，或来自另一物种或抗体类别的恒定区；或(iii)修饰恒定区内的一个或多个氨基酸，以改变例如糖基化位点的数目、效应细胞功能、Fc受体(FcR)结合、补体固定等。
改变抗体恒定区的方法是本领域已知的。可以通过在抗体恒定部分用一个不同的残基取代至少一个氨基酸残基，产生具有改变的功能(例如对细胞上的FcR或补体C1组分等效应配体的改变的亲和性)的抗体(参见例如EP 388,151 A1、US 5,624,821和US 5,648,260，所述文献的内容全都通过引用结合到本文中)。当用于鼠时，可以描述类似的改变，或者其它物种免疫球蛋白可降低或消除这些功能。
例如，可通过用侧链上具有合适官能团的残基取代指定残基，或者通过引入带电荷的官能团(例如谷氨酸或天冬氨酸，或许芳族非极性残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或丙氨酸)，来改变抗体Fc区(例如IgG，例如人IgG)对FcR(例如FcγR1)或对Clq结合的亲和性(参见例如US 5,624,821)。
药物组合物
IL-22结合剂(例如IL-22拮抗剂(例如抗IL-22抗体及其抗原结合片段))，当与药物可接受的载体混合后，可用作药物组合物。除了IL-22-激动剂或拮抗剂和载体之外，所述组合物还可含有各种稀释剂、填充剂、盐类、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和本领域众所周知的其它材料。术语“药物可接受的”是指无毒材料，其不干扰活性成分的生物学活性的功效。载体的特性将会取决于给药途径。
本发明的药物组合物可以呈脂质体形式，其中IL-22-拮抗剂除了与其它药物可接受的载体联用外，还与两亲性试剂(例如以聚集形式存在成为胶束、不溶性单层的脂质、脂质晶体或在水溶液中呈片层形式)联用。用于脂质体制剂的合适脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫脑苷酯、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆酸等。所述脂质体制剂的制备在本领域技术人员水平范围内，并在以下文献中公开：例如美国专利第4,235,871号；美国专利第4,501,728号；美国专利第4,837,028号；和美国专利第4,737,323号，所有这些文献都通过引用结合到本文中。
在本发明治疗方法或使用的实践中，将治疗有效量的IL-22拮抗剂给予患者，例如哺乳动物(例如人)。IL-22拮抗剂可以按照本发明的方法单用或与其它疗法(例如以下详述的抗炎药)联合给予。当与一种或多种药物联合给予时，IL-22拮抗剂可以与第二药物同时或序贯给予。如果是序贯给药的话，主治医师将会决定给予IL-22拮抗剂以及其它药物的合适顺序。
可以以各种常规途径，给予用于药物组合物或实践本发明的方法的IL-22拮抗剂，所述途径例如口服摄取、吸入或皮肤、皮下或静脉内注射。优选静脉内给予患者。
当治疗有效量的IL-22拮抗剂是经口服给药时，所述结合剂将呈片剂、胶囊剂、粉剂、溶液剂或酏剂的形式。当以片剂给药时，本发明的药物组合物还可含有固体载体，例如明胶。片剂、胶囊剂和粉剂含有约5-95％的结合剂，优选含有约25-90％的结合剂。当以液体形式给药时，可加入液体载体，例如水、石油、动物油或植物油例如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油，或合成油。药物组合物的液体形式还可含有生理盐水、葡萄糖或其它糖液，或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。当以液体形式给药时，药物组合物含有约0.5-90％(重量)的结合剂，优选约1-50％的结合剂。
当治疗有效量的IL-22拮抗剂是经静脉内、皮肤或皮下注射给予时，所述结合剂将呈无热源、胃肠外可接受的水溶液形式。具有适当的pH、等渗性、稳定性等的所述胃肠外可接受的蛋白溶液的制剂在本领域技术范围内。除了结合剂外，供静脉内、皮肤或皮下注射用的优选药物组合物还应含有等渗溶媒，例如氯化钠注射液、林格注射液、葡萄糖注射液和氯化钠注射液、乳酸林格注射液或本领域已知的其它溶媒。本发明的药物组合物也可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。
本发明药物组合物中IL-22结合剂的用量将会取决于所治疗疾病的性质和严重程度，以及该患者以前曾接受的治疗的性质。最终，主治医师将会决定用于治疗每个患者的结合剂的用量。开始，主治医师将给予低剂量的结合剂，并观察患者的反应。可给予更大剂量的结合剂，直到所述患者达到最佳治疗效果，而且在该点通常不再继续增加剂量。预期用于本发明方法的实践的不同药物组合物应含有约0.1μg至约100mg IL-22结合剂/千克体重。
用本发明药物组合物进行静脉内疗法的持续时间将会不同，取决于所治疗疾病的严重程度和每个患者的情况和潜在的特异反应。预期每次应用IL-22结合剂的持续时间范围将在12-24小时连续静脉内给药。最后，主治医师将会决定本发明药物组合物的静脉内疗法的合适持续时间。
IL-22激动剂和IL-22拮抗剂的用途
IL-22是一种参与促炎反应的细胞因子，所述促炎反应例如诱导急性期反应。如以下实施例所述，IL-22诱导变化，所述变化与由炎性细胞因子(例如IL-1和TNFα)所引起的变化相关，IL-22抑制剂缓解类风湿性关节炎的症状。因此，IL-22和/或提高IL-22水平或模拟IL-22作用的药物(和本发明的其它分子)在某些临床适应症中用作激动剂，该分子的拮抗剂用于其它临床情况下，特别是在需要调节炎性状态的情况下。激动剂或拮抗剂是否是优选的，要取决于特定的疾病病理方面，例如所涉及的细胞类型，刺激物的性质和细胞微环境。
人IL-22激动剂包括但不限于人IL-22蛋白及其片段、其缺失突变体和***突变体；以及与其受体或人IL-22所涉及的其它靶标之间相互作用的肽和小分子化合物。人IL-22拮抗剂包括但不限于针对人IL-22蛋白的抗体；受体的可溶性形式或人IL-22所涉及的其它靶标；针对受体或人IL-22所涉及的其它靶标的抗体；和抑制或干扰人IL-22与其受体或其它靶标之间相互作用的肽和小分子化合物。
一方面，本发明的特征是一种抑制至少一种IL-22相关活性的方法，即通过使细胞例如上皮细胞与IL-22拮抗剂(例如抗IL-22抗体或其抗原结合片段)接触，其用量足以抑制其活性。也可将IL-22拮抗剂(例如本文所述的中和抗体)给予患者，对于该患者需要抑制免疫性IL-22相关活性。这些疾病包括例如自身免疫性疾病(例如关节炎)、呼吸性疾病或炎性疾病。申请人已经表明，在小鼠胶原诱发的关节炎(CIA)动物模型中，通过使用中和抗IL-22抗体，降低IL-22的活性，缓解炎性症状(实施例9)。在CIA小鼠的脚爪中，IL-22mRNA的表达被上调(实施例10)。因此，IL-22拮抗剂可用于在体内诱导免疫抑制，例如用于治疗或预防患者的IL-22相关疾病。本文所用的术语“患者”是指包括人和非人类动物。优选的人类动物包括具有以异常IL-22活性为特征的病人。本发明的术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类灵长类、啮齿动物、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
可以治疗或预防的IL-22相关疾病的非限制性实例，包括但不限于移植物排斥、自身免疫性疾病(包括例如糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎)、多发性硬化、脑脊髓炎、重症肌无力、***性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括特应性皮炎和湿疹性皮炎)、斯耶格伦综合征(Sjren′s Syndrome)、节段性回肠炎、口疮性溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、椎关节强硬性关节病、关节强硬性脊椎炎、内源性哮喘、变应性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、***炎、直肠炎、药疹、麻风性可逆反应、麻风性结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、变应性脑脊髓炎、急性坏死性出血性脑病、特发性双侧进行性感觉神经性听力损失、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血、特发性血小板减少、多软骨炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)、慢性活动性肝炎、史蒂文斯-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、特发性口炎性腹泻、扁平苔藓、格雷夫斯病(Graves′disease)、结节病、原发性胆汁性肝硬化、后葡萄膜炎和间质性肺纤维化)；呼吸性疾病，例如哮喘或COPD；皮肤(例如银屑病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)和胰腺(例如胰腺炎)等的炎性疾病；移植物抗宿主病和***反应，例如特应性***反应；和癌症(例如实体瘤或软组织肿瘤)。优选可用本发明结合剂治疗的疾病包括关节炎(例如类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病性关节炎和关节强硬性脊椎炎(优选类风湿性关节炎))、多发性硬化、I型糖尿病、狼疮(SLE)、IBD、节段性回肠炎、COPD、哮喘、脉管炎、***反应、硬皮病和皮肤(例如银屑病)、肝脏(例如肝炎)、肾脏(例如肾炎)和胰腺(例如胰腺炎)等的炎性疾病。
在另一个实施方案中，IL-22拮抗剂，单用或与本文所述的其它治疗药(例如TNF拮抗剂)联用，可用于治疗多发性骨髓瘤和相关的B淋巴细胞性恶性肿瘤(Brenne，A.等(2002)Blood第99卷，第10期：3756-3762)。
在一个实施方案中，在联合疗法中给予IL-22拮抗剂(例如其药物组合物)，即与用于治疗病理性病症或障碍(例如免疫性疾病和炎性疾病)的治疗药等其它药物联用。本文所用的术语“联用”是指基本上同时(一起或序贯)给药。如果是序贯给药，在给予第二种化合物的同时，优选两种化合物中的第一种在治疗部位上仍处于有效浓度。
例如，联合疗法可包括一种或多种IL-22拮抗剂(例如，本文所述的针对IL-22的抗体或其抗原结合片段(例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体或其抗原结合片段))与一种或多种其它治疗药一起配制和/或一起给药，所述其它治疗药例如在本文中更详细描述的一种或多种细胞因子抑制剂和生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂和/或细胞毒剂或细胞抑制剂。此外，本文所述的一种或多种IL-22拮抗剂可用于与本文所述的两种或两种以上治疗药联用。
所述联合疗法可有利地用于给予低剂量治疗药，从而避免可能的毒性或各单一疗法相关的并发症。此外，本文所公开的治疗药作用途径与IL-22受体途径不同，因而有望增强IL-22拮抗剂的作用和/或与IL-22拮抗剂协同作用。不受理论的束缚，申请人认为，IL-22通过例如起到组织炎症(而不是全身炎症)的放大器或调节剂的作用，发挥其局部炎症效应。申请人的观念是根据(至少部分根据)以下发现：IL-22R的表达看来限于局部组织部位，而不是在循环免疫细胞。
因此，使用例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段，抑制IL-22活性，可提供更有效的组织特异性、抗炎活性，而不是***性抗炎模式。此外，使用例如本文所述的抗IL-22抗体或其片段，抑制局部IL-22活性，可提供有用的候选者，用于与本文所述的***性抗炎模式联用。
在一个实施方案中，本文所述的一种或多种IL-22拮抗剂可与一种或多种其它治疗药一起配制和/或一起给药；所述其它治疗药例如其它细胞因子拮抗剂或生长因子拮抗剂(例如可溶性受体、肽抑制剂、小分子、配体融合物)；或与其它靶标结合的抗体或其抗原结合片段(例如与其它细胞因子或生长因子、其受体或其它细胞表面分子结合的抗体)；和抗炎细胞因子或其激动剂。可与本文所述的IL-22拮抗剂联用的药物的非限制性实例包括但不限于一种或多种白介素(IL)或其受体的拮抗剂，例如IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、和IL-21/IL-21R的拮抗剂；细胞因子或生长因子或其受体的拮抗剂，例如肿瘤坏死因子(TNF)、LT、EMAP-II、GM-CSF、FGF和PDGF。IL-22拮抗剂也可与针对以下细胞表面分子的抗体等的抑制剂联用：CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90或它们的配体，包括CD154(gp39或CD40L)或LFA-1/ICAM-1和VLA-4/VCAM-1(Yusuf-Makagiansar H.等(2002)Med Res Rev 22(2)：146-67)。可与本文所述的IL-22拮抗剂联用的优选拮抗剂包括IL-1、IL-12、TNFα、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21/EL-21R的拮抗剂。
这些药物的实例包括IL-12拮抗剂，例如与IL-12(优选人IL-12)结合的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，所述抗体例如在WO 00/56772，Genetics Institute/BASF中公开的抗体；IL-12受体抑制剂，例如抗人IL-12受体的抗体；和IL-12受体(例如人IL-12受体)的可溶性片段。IL-15拮抗剂的实例包括针对IL-15或其受体的抗体(或其抗原结合片段)，例如针对人IL-15或其受体的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体，IL-15受体的可溶性片段和IL-15结合蛋白。IL-18拮抗剂的实例包括这样的抗体：例如针对人IL-18的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，IL-18受体的可溶性片段和IL-18结合蛋白(IL-18BP，Mallet等(2001)Circ.Res.28)。IL-1拮抗剂的实例包括白介素-1转化酶(ICE)抑制剂例如Vx740、IL-1拮抗剂例如IL-1RA(ANIKINRA，AMGEN)、sIL 1RII(Immunex)和抗IL-1受体抗体(或其抗原结合片段)。
TNF拮抗剂的实例包括针对TNF(例如人TNFα)的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体(或其抗原结合片段)，例如D2E7(人TNFα抗体，U.S.6,258,562；BASF)、CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356(人源化抗TNFα抗体；Celltech/Pharmacia)、cA2(嵌合抗TNFα抗体；RemicadeTM，Centocor)；抗TNF抗体片段(例如CPD870)；TNF受体的可溶性片段，所述TNF受体例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白，EnbrelTM；Immunex；参见例如Arthritis & Rheumatism(1994)第37卷，S295；J.Invest.Med.(1996)第44卷，235A)，p55kd TNFR-IgG(55kD TNF受体-IgG融合蛋白(Lenercept))；酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂(例如α-磺酰基异羟肟酸衍生物，WO 01/55112，和N-羟基甲酰胺TACE抑制剂GW 3333，-005，或-022)；和TNF-bp/s-TNFR(可溶性TNF结合蛋白；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S284；Amer.J.Physiol.-Heart andCirculatory Physiology(1995)第268卷，第37-42页)。优选的TNF拮抗剂是TNF受体的可溶性片段，所述TNF受体例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG和TNFα转化酶(TACE)抑制剂。
在其它实施方案中，本文所述的IL-22拮抗剂可与一种或多种以下药物联合用药：IL-13拮抗剂，例如可溶性IL-13受体(sIL-13)和/或抗IL-13抗体；IL-2拮抗剂，例如DAB 486-IL-2和/或DAB 389-IL-2(IL-2融合蛋白；Seragen；参见例如Arthritis & Rheumatism(1993)第36卷，1223)，和/或抗IL-2R抗体，例如抗Tac(人源化抗IL-2R；ProteinDesign Labs，Cancer Res.1990年3月1日；50(5)：1495-502)。另一种联合疗法包括sIL-21拮抗剂与非耗尽抗CD4抑制剂(IDEC-CE9.1/SB210396(非耗尽性致敏性(primatized)抗CD4抗体；IDEC/SmithKline)的组合。再一些优选的联合药物包含共刺激途径拮抗剂CD80(B7.1)或CD86(B7.2)，所述拮抗剂包括抗体、可溶性受体或拮抗性配体；以及p-选择蛋白糖蛋白配体(PSGL)、抗炎细胞因子，例如IL-4(DNAX/Schering)；IL-10(SCH 52000；重组IL-10DNAX/Schering)；IL-13和TGFβ，及其激动剂(例如激动剂抗体)。
在其它实施方案中，一种或多种IL-22拮抗剂可以与一种或多种抗炎药、免疫抑制剂或代谢抑制剂或酶抑制剂一起配制和/或一起给予。可与本文所述的IL-22拮抗剂联合使用的药物或抑制剂的非限制性实例包括但不限于一种或多种以下药物：非甾体抗炎药(NSAID)，例如布洛芬、替尼达普(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)，第39卷，第9期(增刊)，S280))、奈普生(参见例如Neuro Report(1996)第7卷，第1209-1213页)、美洛昔康、吡罗昔康、双氯芬酸和吲哚美辛；柳氮磺吡啶(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S281)；皮质类固醇，例如***龙；细胞因子抑制性抗炎药(CSAID)；核苷酸生物合成抑制剂，例如嘌呤生物合成抑制剂、叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤(N-[4-[[(2，4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸)；和嘧啶生物合成抑制剂，例如二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)抑制剂(例如来氟米特(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S131；Inflammation Research(1996)第45卷，第103-107页)。用于与IL-22拮抗剂联用的优选治疗药包括NSAID、CSAID(DHODH)抑制剂(例如来氟米特)和叶酸拮抗剂(例如甲氨蝶呤)。
其它抑制剂的实例包括一种或多种以下药物：皮质类固醇(口服、吸入和局部注射)；免疫抑制药，例如环孢菌素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制剂，例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779(Elit.L.(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(8)：1249-53；Huang，S.等.(2002)Current Opinion Investig.Drugs 3(2)：295-304)；干扰促炎细胞因子信号转导的药物，所述促炎细胞因子例如TNFα或IL-1(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)；COX2抑制剂，例如塞来考昔及其变体，MK-966，参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)、S81)；磷酸二酯酶抑制剂，例如R973401(磷酸二酯酶IV型抑制剂；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282))；磷脂酶抑制剂，例如胞质磷脂酶2(cPLA2)抑制剂(例如三氟甲酮类似物(U.S.6,350,892))；血管上皮细胞生长因子或生长因子受体抑制剂，例如VEGF抑制剂和/或VEGF-R抑制剂；和血管生成抑制剂。与IL-22拮抗剂联用的优选的治疗药包括免疫抑制药，例如环孢菌素、他克莫司(FK-506)；和mTOR抑制剂，例如西罗莫司(雷帕霉素)或雷帕霉素衍生物，例如可溶性雷帕霉素衍生物(例如雷帕霉素酯衍生物，例如CCI-779；COX2抑制剂，例如塞来考昔及其变体；和磷脂酶抑制剂，例如胞质磷脂酶2(cPLA2)抑制剂(例如三氟甲酮类似物)。
可与IL-22拮抗剂联合使用的其它治疗药的实例包括一种或多种以下药物：6-巯基嘌呤(6-MP)；硫唑嘌呤、磺胺碳酸吖嗪(sulphasalazine)；美沙拉秦；奥沙拉秦氯喹/羟氯喹；青霉胺；金硫丁盐(aurothiornalate)(肌内和口服)；硫唑嘌呤；秋水仙素(cochicine)；β-2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗(salmeteral))；黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)；色甘酸盐；奈多罗米；酮替芬；异丙阿托品和氧托品；麦考酚酸吗乙酯；腺苷激动剂；抗血栓药；补体抑制剂；和肾上腺素能药。
下面进一步详细讨论本文所公开的IL-22拮抗剂与其它治疗药的组合，用于治疗或预防特定免疫性疾病。
可以与IL-22拮抗剂联用以治疗或预防关节炎(例如类风湿性关节炎、炎性关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎和银屑病性关节炎)的药物的非限制性实例，包括一种或多种以下药物：本文所述的IL-12拮抗剂，NSAID；CSAID；TNF拮抗剂例如本文所述的TNFα拮抗剂；本文所述的非耗尽抗CD4抗体；本文所述的IL-2拮抗剂；抗炎细胞因子，例如IL-4、IL-10、IL-13和TGFα，或其激动剂；本文所述的IL-1拮抗剂或IL-1受体拮抗剂)；本文所述的磷酸二酯酶抑制剂；本文所述的COX-2抑制剂；伊洛前列素(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S82)；甲氨蝶呤；沙利度胺(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)和沙利度胺相关药物(例如Celgen)；来氟米特；血纤蛋白溶酶原激活抑制剂，例如氨甲环酸；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S284)；细胞因子抑制剂，例如T-614；参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)；***素E1(参见例如Arthritis &Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S282)；硫唑嘌呤(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S281)；白介素-1转化酶(ICE)抑制剂；zap-70和/或lck抑制剂(酪氨酸激酶zap-70或lck抑制剂)；本文所述的血管内皮细胞生长因子抑制剂或血管内皮细胞生长因子受体抑制剂；本文所述的血管生成抑制剂；皮质类固醇抗炎药(例如SB203580)；TNF转化酶抑制剂；白介素-11(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S296)；白介素-13(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S308)；白介素-17抑制剂(参见例如Arthritis & Rheumatism(1996)第39卷，第9期(增刊)，S120)；金；青霉胺；氯喹；羟氯喹；苯丁酸氮芥；环磷酰胺；环孢菌素；总淋巴辐射；抗胸腺细胞球蛋白；CD5-毒素；口服肽和胶原；氯苯扎利二钠；细胞因子调节剂(CRA)HP228和HP466(Houghten Pharmaceuticals，Inc.)；ICAM-1反义硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(ISIS 2302；Isis Pharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；***；奥古蛋白；聚硫酸糖胺聚糖；二甲胺四环素；抗IL2R抗体；海洋鱼油和植物脂质(鱼和植物种子脂肪酸；参见例如DeLuca等(1995)Rheum.Dis.Clin.NorthAm.21：759-777)；金诺芬；保泰松；甲氧芬那酸；氟芬那酸；静脉内免疫球蛋白；齐留通；麦考酚酸(RS-61443)；他克莫司(FK-506)；西罗莫司(雷帕霉素)；氨普立糖(therafectin)；克拉曲滨(2-氯脱氧腺苷)；和阿扎立平。优选的联合药物包括一种或多种IL-21拮抗剂与甲氨蝶呤或来氟米特的组合，以及在中度或重度类风湿性关节炎的情况下与环孢菌素联用。
与IL-22拮抗剂联合用于治疗关节炎的优选抑制剂的实例，包括TNF拮抗剂(例如与TNF结合的嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或体外产生的抗体或其抗原结合片段；TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白、EnbrelTM)、p55kD TNF受体-IgG融合蛋白；TNF酶拮抗剂，例如TNFα转化酶(TACE)抑制剂)；IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21/IL-21R的拮抗剂；T细胞和B细胞消耗剂(depletingagent)(例如抗CD4或抗CD22抗体)；小分子抑制剂，例如甲氨蝶呤和来氟米特；西罗莫司(雷帕霉素)及其类似物，例如CCI-779；Cox-2和cPLA2抑制剂；NSAID；p38抑制剂、TPL-2抑制剂、Mk-2抑制剂和NFkb抑制剂；RAGE或可溶性RAGE；P-选择蛋白或PSGL-1抑制剂(例如小分子抑制剂，其抗体，例如抗P-选择蛋白的抗体)；***受体β(ERB)激动剂或ERB-NFkβ拮抗剂。可以与一种或多种IL-22拮抗剂一起配制和/或一起给予的最优选的其它治疗药，包括一种或多种以下药物：TNF受体的可溶性片段，例如p55或p75人TNF受体或其衍生物，例如75kd TNFR-IgG(75kD TNF受体-IgG融合蛋白、EnbrelTM；甲氨蝶呤、来氟米特或西罗莫司(雷帕霉素)或其类似物，例如CCI-779。
可以与IL-22拮抗剂联用以治疗或预防多发性硬化的药物的非限制性实例包括以下药物：干扰素，例如干扰素-1α(例如AvonexTM；Biogen)和干扰素-1β(BetaseronTM；Chiron/Berlex)；共聚物1(Cop-1；CopaxoneTM；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；高压氧；静脉内免疫球蛋白；克拉曲滨(clabribine)；本文所述的TNF拮抗剂；皮质类固醇；***龙；甲泼尼龙；硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；甲氨蝶呤；4-氨基吡啶；和替扎尼定。可与IL-22拮抗剂联合使用的其它拮抗剂包括其它人细胞因子或生长因子的抗体或其它人细胞因子或生长因子的拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-11、GM-CSF、FGF和PDGF。本文所述的IL-21拮抗剂可以与抗体联用，所述抗体是针对以下细胞表面分子的：例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80、CD86、CD90或其配体。IL-22拮抗剂也可以与以下药物联用：例如如上所述的甲氨蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸吗乙酯、来氟米特、NSAID，例如，布洛芬、皮质类固醇例如***龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗血栓药、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰本文所述的促炎细胞因子信号转导的药物、IL-1β转化酶抑制剂(例如Vx740)、抗P7s、PSGL、TACE抑制剂、T细胞信号转导抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤(azathloprine)、6-巯基嘌呤、血管紧张素转化酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物和抗炎细胞因子(例如IL-4、IL-10、IL-13和TGF)。
可以与IL-22拮抗剂联合用于多发性硬化的治疗药的优选实例包括干扰素-β、例如IFNb-1α和IFNb-1β；克帕松(copaxone)、皮质类固醇、IL-I抑制剂、TNF抑制剂、针对CD40配体和CD80的抗体、IL-12拮抗剂。
可以与IL-22拮抗剂联合用于治疗或预防炎性肠病或节段性回肠炎的药物的非限制性实例包括以下药物：布***(budenoside)；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉秦；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；本文所述的TNF拮抗剂；IL-4、IL-10、IL-13和/或TGFβ细胞因子或其激动剂(例如激动剂抗体)；白介素-11；葡糖苷酸或葡聚糖-缀合的***龙、***或布***的前体药物；ICAM-1反义硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(ISIS 2302；IsisPharmaceuticals，Inc.)；可溶性补体受体1(TP10；T Cell Sciences，Inc.)；缓释型美沙拉秦；甲氨蝶呤；血小板活化因子(PAF)拮抗剂；环丙沙星；和利多卡因。
在一个实施方案中，IL-22拮抗剂可以与一种或多种抗体联用，所述抗体针对参与调节免疫应答的其它靶标，所述免疫应答例如移植物排斥或移植物抗宿主病。可以与本发明IL-21/IL21R拮抗剂联合用于治疗或预防免疫应答的药物的非限制性实例包括以下药物：抗细胞表面分子的抗体，所述细胞表面分子包括但不限于CD25(白介素-2受体-α)、CDlla(LFA-1)、CD54(ICAM-1)、CD4、CD45、CD28/CTLA4、CD80(B7-1)和/或CD86(B7-2)。在又一个实施方案中，IL-22拮抗剂与一种或多种常用免疫抑制药(例如环孢菌素A或FK506)联用。
因此，本发明的另一方面涉及药盒，所述药盒用于联合给予IL-22拮抗剂和其它治疗性化合物。在一个实施方案中，所述药盒包含配制在药物载体中的一种或多种结合剂和至少一种药物例如治疗药，其配制为合适的一种或多种独立的药物制剂。
诊断分析
检测生物样品中IL-22蛋白或核酸存在与否的示例性方法包括：采集试验患者的生物样品，使该生物样品与能检测IL-22蛋白或编码IL-22蛋白的核酸(例如mRNA、基因组DNA)的化合物或试剂接触，使得在生物样品中能检测出IL-22蛋白或核酸的存在。检测IL-22mRNA或基因组DNA的优选试剂是标记的核酸探针，其能与IL-22mRNA或基因组DNA杂交。核酸探针可以是例如全长IL-22核酸例如SEQ ID NO：1的核酸或片段或IL-22核酸部分，例如长度至少为15、30、50、100、250或500个核苷酸并且在严格性条件下足以与IL-22mRNA或基因组DNA特异性杂交的寡核苷酸。用于本发明诊断分析的其它合适探针如本文所述。
检测IL-22蛋白的优选试剂是能与IL-22蛋白结合的抗体，优选抗体具有可检测标记。抗体可以是多克隆抗体，或更优选为单克隆抗体。可使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。术语“标记”用于探针或抗体时，包括通过将可检测的物质与探针或抗体偶联(即物理连接)直接标记探针或抗体，以及通过与直接标记的另一试剂反应而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括用荧光标记的第二抗体检测第一抗体，再用生物素末端标记DNA探针，其可用荧光标记的链霉抗生物素来检测。术语“生物样品”包括从患者体内分离的组织、细胞和生物体液，以及患者体内存在的组织、细胞和体液。也就是说，本发明的检测方法可用于在体外以及体内检测生物样品中的IL-22mRNA、蛋白或基因组DNA。例如，检测IL-22mRNA的体外技术包括RNA杂交和原位杂交。检测IL-22蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光。检测IL-22基因组DNA的体外技术包括DNA杂交。此外，检测IL-22蛋白的体内技术包括将标记的抗IL-22抗体导入患者体内。例如，抗体可用放射性标记物标记，其在患者体内的存在和位置可通过标准造影技术来检测。
在一个实施方案中，生物样品含有来自试验患者的蛋白分子。或者，生物样品可含有来自试验患者的mRNA分子或来自试验患者的基因组DNA分子。优选的生物样品是经常规方法从患者体内分离的血清样品。
在另一个实施方案中，所述方法还包括从对照受试者体内获得对照生物样品，使所述对照样品与能检测IL-22蛋白、mRNA或基因组DNA的化合物或试剂接触，使得可以检测到生物样品中存在的IL-22蛋白、mRNA或基因组DNA，然后将对照样品中存在的IL-22蛋白、mRNA或基因组DNA与试验样品中存在的IL-22蛋白、mRNA或基因组DNA进行比较。本发明也包括在生物样品中检测IL-22存在的试剂盒。例如，所述试剂盒可包含标记的化合物或试剂(例如，探针或抗体)，其能检测生物样品中的IL-22蛋白或mRNA；检测样品中IL-22含量的方法；和将样品中IL-22含量与标准品进行比较的方法。所述化合物或试剂可包装在合适容器中。试剂盒还可包括用试剂盒来检测IL-22蛋白或核酸的使用说明书。
筛选试验
本文所述的拮抗剂可用于测定生物活性的试验中，包括用于高通量筛选的一组多蛋白；以产生抗体或诱发另一免疫应答；在设计用于定量测定生物体液中蛋白(或其受体)水平的试验中作为试剂(包括标记试剂)；作为优先表达相应蛋白的组织标记(所述表达是组成型的或者是在特定的组织分化或发育阶段或在疾病状态中)；以及分离相关受体或配体。其后的实施例中描述的方法可用于筛选结合相互作用的肽或小分子抑制剂或激动剂。
这些研究实用性的任一项或所有都可作为研究成果，开发成为商业化的试剂级或试剂盒形式。
用于以上所列出的用途的方法，对于本领域技术人员来说是众所周知的。公开所述方法的参考文献包括但不限于“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis编著，1989，和“Methods inEnzymology：Guide to Molecular Cloning Techniques”，AcademicPress，Berger，S.L和A.R.Kimmel编著，1987。
IL-22和本发明抗体的活性可通过以下方法进行测定：
胸腺细胞或脾细胞细胞毒性的合适的测定法包括但不限于以下文献中描述的方法：Current Protocols in Immunology，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober编著，Pub.Greene Publishing Associates和Wiley-Interscience(第3章，In Vitroassays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19；第7章，Immunologicstudies in Humans)；Herrmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2488-2492，1981；Herrmann等，J.Immunol.128：1968-1974，1982；Handa等，J.Immunol.135：1564-1572，1985；Takai等，J.Immunol.137：3494-3500，1986；Takai等，J.Immunol.140：508-512，1988；Herrmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2488-2492，1981；Herrmann等，J.Immunol.128：1968-1974，1982；Handa等，J.Immunol.135：1564-1572，1985；Takai等，J.Immunol.137：3494-3500，1986；Bowman等，J.Virology 61：1992-1998；Takai等，J.Immunol.140：508-512，1988；Bertagnolli等，Cellular Immunology 133：327-341，1991；Brown等，J.Immunol.153：3079-3092，1994。
用于T细胞依赖性免疫球蛋白反应和同种型转换的测定法(其鉴定调节T细胞依赖性抗体应答和影响Th1/Th2分布型的蛋白等)包括但不限于以下文献中的描述：Maliszewski，J.Immunol.144：3028-3033，1990；和用于B细胞功能的测定法：In vitro antibody production，Mond，J.J.和Brunswick，M.Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan主编，第1卷，第3.8.1-3.8.16页，John Wiley and Sons，Toronto.1994。
混合淋巴细胞反应(MLR)测定法(其鉴定主要产生Th1和CTL应答的蛋白等)包括但不限于以下文献中的描述：Current Protocols inImmunology，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober编著，Pub.Greene Publishing Associates andWiley-Interscience(第3章，In Vitro assays for Mouse LymphocyteFunction 3.1-3.19；第7章，Immunologic studies in humans)；Takai等，J.Immunol.137：3494-3500，1986；Takai等，J.Immunol.140：508-512，1988；Bertagnolli等，J.Immunol.149：3778-3783，1992。
树突细胞依赖性测定法(其鉴定由树突细胞产生的蛋白等，该蛋白激活幼稚T细胞)包括但不限于以下文献中描述的方法：Guery等，J.Immunol.134：536-544，1995；Inaba等，Journal of ExperimentalMedicine 173：549-559，1991；Macatonia等，Journal of Immunology 154：5071-5079，1995；Porgador等，Journal of Experimental Medicine 182：255-260，1995；Nair等，Journal of Virology 67：4062-4069，1993；Huang等，Science 264：961-965，1994；Macatonia等，Journal of ExperimentalMedicine 169：1255-1264，1989；Bhardwaj等，Journal of ClinicalInvestigation 94：797-807，1994；和Inaba等，Journal of ExperimentalMedicine 172：631-640，1990。
淋巴细胞存活/凋亡测定法(其鉴定在超抗原诱导后预防细胞凋亡的蛋白并鉴定调节淋巴细胞体内平衡的蛋白等)包括但不限于以下文献中描述的方法：Darzynkiewicz等，Cytometry 13：795-808，1992；Gorczyca等，Leukemia 7：659-670，1993；Gorczyca等，Cancer Research53：1945-1951，1993；Itoh等，Cell 66：233-243，1991；Zacharchuk，Journal of Immunology 145：4037-4045，1990；Zamai等，Cytometry 14：891-897，1993；Gorczyca等，International Journal of Oncology .1：639-648，1992。
影响T细胞定型和发育早期步骤的蛋白的测定法包括但不限于以下文献中描述的方法：Antica等，Blood 84：111-117，1994；Fine等，Cellular Immunology 155：111-122，1994；Galy等，Blood 85：2770-2778，1995；Toki等，Proc.Nat.Acad Sci.USA 88：7548-7551，1991。
对通过以上筛选方法所鉴定的调节剂在合适动物模型中进行测试，例如确定用所述药物治疗的功效、毒性或副作用。或者，在本文所述的至少一个体外或原位测定中，对调节剂进行测试。
IL-22激动剂或拮抗剂测定效果
IL-22激动剂或拮抗剂的活性可通过以下方法进行测定：
T细胞或胸腺细胞增殖的测定法包括但不限于以下文献中描述的方法：Current Protocols in Immunology，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober编著，Pub.GreenePublishing Associates and Wiley-Interscience(第3章，In Vitro assays forMouse Lymphocyte Function 3.1-3.19；第7章，Immunologic studies inHumans)；Takai等，J.Immunol.137：3494-3500，1986；Bertagnolli等，J.Immunol.145：1706-1712，1990；Bertagnolli等，Cellular Immunology133：327-341，1991；Bertagnolli等，J.Immunol.149：3778-3783，1992；Bowman等，J.Immunol.152：1756-1761，1994。
细胞因子的产生和/或脾细胞、***细胞或胸腺细胞增殖的测定法包括但不限于以下文献中描述的方法：Polyclonal T cellstimulation，Kruisbeek，A.M.和Shevach，E.M.Current Protocols inImmunology.J.E.Coligan主编，第1章，第3.12.1-3.12.14页，John Wileyand Sons，Toronto.1994；和Measurement of mouse and human Interferonγ，Schreiber，R.D.Current Protocols in Immunology.J.E.Coligan主编，第1卷，第6.8.1-6.8.8页，John Wiley and Sons，Toronto.1994。
造血细胞和淋巴细胞生成细胞增殖和分化的测定法包括但不限于以下文献中描述的方法：Measurement of Human and MurineInterleukin 2 and Interleukin 4，Bottomly，K.，Davis，L.S.和Lipsky，P.E.Current Protocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan主编，第1卷，第6.3.1-6.3.12页，John Wiley and Sons，Toronto.1991；deVries等，J.Exp.Med.173：1205-1211，1991；Moreau等，Nature 336：690-692，1988；Greenberger等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：2931-2938，1983；Measurement of mouse and human interleukin 6-Nordan，R.CurrentProtocols in Immunology.J.E.e.a.Coligan主编，第1卷，第6.6.1-6.6.5页，John Wiley and Sons，Toronto.1991；Smith等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83：1857-1861，1986；Measurement of human Interleukin 11-Bennett，F.，Giannotti，J.，Clark，S.C.和Tumer，K.J.Current Protocols inImmunology.J.E.e.a.Coligan主编，第1卷，第6.15.1页，John Wiley andSons，Toronto.1991；Measurement of mouse and human Interleukin 9-Ciarletta，A.，Giannotti，J.，Clark，S.C.和Turner，K.J.Current Protocols inImmunology.J.E.e.a Coligan主编，第1卷，第6.13.1页，John Wiley andSons，Toronto.1991。
用于响应抗原的T细胞克隆测定法(其鉴定影响APC-T细胞相互作用的蛋白并通过测定增殖和细胞因子产生而指导T细胞效应)包括但不限于以下文献中描述的方法：Current Protocols inImmunology，J.E.Coligan，A.M.Kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach，W Strober编著，Pub.Greene Publishing Associates andWiley-Interscience(第3章，In Vitro assays for Mouse LymphocyteFunction；第6章，Cytokines and their cellular receptors；第7章，Immunologic studies in Humans)；Weinberger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：6091-6095，1980；Weinberger等，Eur.J.Immun.11：405-411，1981；Takai等，J.Immunol.137：3494-3500，1986；Takai等，J.Immunol.140：508-512，1988。
本发明由非限制性实施例进一步说明。本申请以及序列表中引用的所有参考文献、专利和已公布的专利申请都通过引用结合到本文中。
                        实施例
实施例1：克隆“IL-22”的鉴定和表征
本发明的多核苷酸已鉴定为克隆“IL-22”。按照以下方法，分离克隆IL-22。从鼠cDNA文库中鉴定鼠EST，所述文库是由ConA和源自骨髓的树突细胞所激活的脾细胞制备的。用选择cDNA编码的分泌蛋白的方法，来鉴定EST(参见美国专利第5,536,637号)。鼠EST序列用于分离来自相同的DNA文库的全长鼠克隆。鼠克隆序列分析表明与白介素-10(IL-10)的显著同源性。
为了分离鼠克隆的人同源物，根据与IL-10同源的鼠序列区，构建PCR引物。使用所述引物，在来自PHA/PMA-刺激的人PBMC的cDNA文库中进行扩增，得到很大的PCR产物。对该PCR产物进行序列分析，证实是鼠cDNA的同源物。从部分人克隆序列，构建寡核苷酸，用于从PBMC文库分离全长人克隆。
IL-22是全长人克隆，其包括分泌蛋白(在本文中也称为“IL-22”蛋白)的完整编码序列。对其氨基酸序列进行分析，表明与hIL-10约有23％的同源性。根据推定的IL-10受体-结合基序，通过计算机建模，认为IL-22中具有包括类似功能的三个基序。这些是SEQ ID NO：2的残基50-60、残基63-81和残基168-177的区域。数据库分析表明，IL-22同其它物种的IL-10一样也表现出类似的同源水平。
据报道，目前确定的IL-22的核苷酸序列是在SEQ ID NO：1内，并且包括聚(A)尾。据报道，对应于前述核苷酸序列的IL-22蛋白的氨基酸序列是在SEQ ID NO：2内。
实施例2：IL-22蛋白的表征
用合适表达载体中的IL-22cDNA转染CHO细胞，产生稳定表达并分泌全长IL-22蛋白的细胞系。用合适的IL-22表达载体瞬时转染的COS细胞，用于产生IL-22蛋白，供分析用。用市售脂转染试剂(Gibco)完成转染。有趣的是，观察到表达IL-22的COS细胞不均匀地脱落，在细胞培养单层上形成孔洞。转染COS细胞的条件培养基用于证明IL-22蛋白的细胞因子样活性。对细胞裂解物进行蛋白质印迹分析表明，Stat-3在肾系膜组织衍生细胞系中被磷酸化(被激活)，当该细胞暴露给IL-22表达细胞的条件培养基时，表现出巨噬细胞样的特性(MES-13；参见Dumoutier等(2000)J.of Immunology 164：1814-1819)。另外，Stat-3的磷酸化是在经IL-22蛋白处理的非转染COS细胞中诱导的。
对IL-22蛋白(来自本文所述的转染COS细胞系)进行电泳分析表明，所表达的蛋白存在一系列大小不同的范围。在电泳之前，用N-聚糖酶处理来自COS的IL-22蛋白，结果在未经处理的IL-22中产生一个对应于最大迁移率的条带(例如最低分子量)。这与所提议的糖基化事件是一致的，所述事件可发生在IL-22氨基酸序列(SEQ IDNO：2的氨基酸残基54-56、68-70、97-99和176-178)中鉴定的推定的N联糖基化位点上。
Edman N端测序证明，成熟IL-22蛋白的N-端从SEQ ID NO：2的34位残基(丙氨酸)开始。产生表达载体，其中“6x组氨酸”亲和标记物和FLAG附加表位与成熟IL-22蛋白N-端融合。(添加的氨基酸标记物示于SEQ ID NO：5，并且具有以下氨基酸序列：MKFLVNVALVFMVVYISYIYAGSHHHHHHGSGDYKDDDDKAPISSHCR)。
这些标记构建体用于产生稳定表达的CHO细胞系和瞬时表达的COS细胞系。所述标记提供了检测IL-22的便利方法(例如抗6x his抗体；抗FLAG抗体)，并且提供了从条件培养基中纯化蛋白的便利方法(使用Ni+2树脂)。通过该标记从IL-22表达COS细胞系中纯化的人IL-22蛋白，可用于在MES-13细胞中诱导Stat-3活化。
对活化Th1和Th2细胞的IL-22mRNA转录物进行比较(参见例如Syrbe等(1999)Springer Seminars in Immunopathology，21：263-85)表明，比起活化Th2细胞来说，在活化Th1细胞中IL-22的表达水平明显高得多。用RNA酶保护测定法，对IL-22mRNA进行分析。因此，IL-22是在适应性免疫应答中由Th1 CD4+T细胞特异性诱导的。
实施例3：IL-22重组腺病毒载体的建立和体内给药
用EcoRI和NotI消化pED6dpc-2mIL-22，然后将1.1kb mIL-22cDNA片段与经EcoRI和NotI消化的腺病毒载体Adori 1-2连接，得到Adori 1-2鼠IL-22(mIL-22)载体。用EcoRI和NotI消化pEGFP-N1(CLONTECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)，然后将EGFP***到Adoril-1的EcoRI和NotI位点中，得到Adori 1-1绿色荧光蛋白(GFP)构建体。对***质粒的cDNA进行限制性消化分析和测序，证实这两个构建体。mIL-22cDNA和EGFP的表达由巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子和增强子驱动。
通过在人胚肾细胞系293中进行同源重组，产生Ad5 Ela缺失型(dl327)重组腺病毒。分离重组腺病毒，然后在293细胞中扩增。通过3次冻-融循环，从感染293细胞中释放病毒。通过两次氯化铯梯度离心和在4℃对磷酸缓冲盐溶液(PBS)pH 7.2透析，进一步纯化病毒。透析后，加入甘油，使其浓度为10％，将病毒贮存于-80℃待用。病毒通过以下方法进行表征：转基因的表达、在293细胞上的噬斑形成单位(颗粒/ml)、内毒素测定和病毒PCR分析以及对病毒中IL-22编码区进行测序分析。
将单剂量的5×1010个编码mIL-22的重组腺病毒颗粒注射到雌性C57BI/6小鼠(7-8周龄)的尾静脉中。对照小鼠接受编码GFP的腺病毒或PBS/10％甘油。在注射后的不同时间点处死各实验组的小鼠。对于血液学分析和血清化学分析来说，通过心脏穿刺采血。通过眶后窦采血，对血涂片进行鉴别计数。收获组织，经甲醛固定，苏木精和伊红染色，供组织病理学研究用。
实施例4：IL-22的免疫学效应
通过将含鼠IL-22cDNA的病毒导入小鼠中，在多细胞动物情况下对IL-22的免疫学效应进行研究。在经静脉内或皮下注射5×1010病毒颗粒的8周龄C57/B6雌性小鼠中，腺病毒载体用于表达鼠IL-22cDNA。注射后7天和14天，处死试验鼠，与仅注射缓冲液或表达绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒的对照鼠进行比较。在第7天和第14天，发现表达病毒鼠IL-22的小鼠胸腺的绝对和相对重量显著减轻。在第14天，脾脏的绝对平均重量减轻；而在第7天，肝脏重量轻微增加。在第7天和第14天，胸腺普遍出现萎缩以及淋巴组织耗尽(经显微镜观察)。也观察到肾脏重量增加和肝脏增大。
另外，在第7天，出现各种血液学效应，包括红细胞类参数、血红细胞计数、血红蛋白和血细胞比容降低。这些效应归纳起来，表明动物贫血。此外，出现血小板增加，以及因嗜中性粒细胞增加而导致的白细胞计数增加。根据这些观察结果，没有证据显示再生反应，这表明所述效应可在骨髓水平上发生。对此，可能的原因是小分子通过肾脏或肠损失。此外，在第7天和第14天，白蛋白水平轻微下降，但血清淀粉状蛋白A和血纤蛋白原水平升高，这表明急性期反应。对肝脏RNA进行分析，表明SAA、GRO1、OPN、LCN2、PRTN3和SOCS3增加(参见下表3)。其它临床观察结果包括体重减轻、轻微脱水症状、尿液比重增加、排尿量下降和肾近端小管嗜碱性粒细胞增多的诱导。观察到的嗜碱性粒细胞增多是因为肾近端小管上皮细胞的细胞***增加和rRNA增加。给予IL-22后，检测到的变化与IL-22诱导急性期反应的能力是一致的(参见例如Gabay，C.(1999)New England Journal of Medicine 340(6)：448-454)。
实施例5：抗IL-22单克隆抗体和多克隆抗体的制备和表征
用本说明书中描述的常规方法，制备单克隆抗体和多克隆抗体。下表1举例说明结合亲和性、CIA功效和单克隆抗体P3/1、P3/2、P3/3和P3/5的中和特异性、以及针对IL-22的鸡多克隆抗体。抗体P3/1、P3/2、P3/3和P3/5在本文中也分别称为Ab-01、Ab-04、Ab-02和Ab-03。
表1：抗体结合特异性、亲和性和中和活性
                              大鼠单克隆Ab   多克隆Ab
 IL-22抗体   P3/1(Ab-01)   P3/2(Ab-04)   P3/3(Ab-02)  P3/5(Ab-03)   鸡多克隆
 结合特异性   小鼠   人   小鼠/人  小鼠   小鼠/人
 中和特异性   小鼠   人   小鼠/人  小鼠   小鼠/人
 经Biacore测定对IL-22(nM)的亲和性(KD)   0.54   1.51   68.1  0.1
 基于ELISA测定的影响   IL-22R ELISA中的增强；部分阻断IL-22R/IL 10R2   阻断两者   IL-22R ELISA中的增强；部分阻断IL-22R/IL 10R2  阻断两者
 CIA功效   好   NA   中等  NA
 表位   与Ab-02不同   本文所述的Ab-04表位   本文所述的Ab-02表位  与Ab-04不同
通过ELISA，用小鼠或人h/f标记的IL-22微量滴定板，测定结合特异性。每种抗体显示出对小鼠IL-22或人IL-22的强烈特异性，见表1。通过评价抗体对由5ng/ml小鼠或人h/f标记IL-22所介导的STAT3磷酸化的抑制能力，确定中和特异性。用结合鼠IL-22，进行酶联免疫吸附测定(ELISA)证明，mAb P3/1的ED50为～5nM，基于对IL-22-Fc为～2nM和对H/F IL-22为～10nM。此外，除了识别重组IL-22之外，P3/1 mAb也结合用IL-22逆转录病毒载体转染的T细胞所分泌的天然IL-2。已发现IL-22抗体P3/1的ID50约为1nM，并且，当细胞因子存在刚好处于饱和状态(1nM)时，能在化学计量水平上阻断IL-22活性。
经Biacore测定，大鼠抗体Ab-02和Ab-04对人IL-22的结合亲和性(KD)分别为68.1nM和1.51nM。在类似条件下，测定的人IL-22对人IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc复合物和IL-22BP-Fc的结合亲和性分别为1.48nM和3.37nM。用于测定这些结合亲和性的实验条件在以下实施例22中有更加详细描述。
实施例6：IL-22mRNA和受体的表达
采用半定量逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)，在各种人和小鼠组织中检测IL-22及其受体的表达。实验表明，IL-22信使RNA(mRNA)以极低水平存在于人睾丸、肺、***和外周血淋巴细胞(PBL)中，当对对照肌动蛋白进行标准化时。此外，半定量RT-PCR显示，IL-22受体在人胰脏中以最高水平检出，而在肝脏、肠、皮肤、甲状腺、肾脏、心脏、胃、睾丸、唾液腺、肾上腺和***中以较低水平检出。或者，在肝脏、小肠、肌肉、皮肤和卵巢中显示鼠IL-22受体的最高表达，而在肾脏和胚胎e8.5和e19中显示较低表达。
实施例7：IL-22蛋白的原位杂交和凋亡染色
对IL-22蛋白与小鼠受体信使RNA(mRNA)进行原位杂交(所述小鼠用表达IL-22的腺病毒(AdIL-22)或脂多糖(LPS)处理)，结果如下：
表2
A.IL-22细胞因子mRNA的检测
  组织  AdIL-22治疗的小鼠  LPS治疗的小鼠
  肝脏  第1天：肝细胞细胞质染色呈弱阳性第3和14天：无特异性染色  6小时：肝细胞细胞质染色呈弱阳性
  脾脏  第1、3和14天：动脉周围区轻微染色  阴性
  心脏  N/A  阴性
  结肠  N/A  阴性
  肾脏  第1天：近端和远端小管上皮细胞细胞质、皮质髓质连接处Henle环、Bowman腔壁细胞和某些上皮细胞细胞质染色呈中度阳性第4天：近端和远端小管上皮细胞细胞质染色，皮质髓质连接处Henle环染色第14天：近端小管上皮细胞细胞质染色  2小时：近端和远端小管上皮细胞细胞质、皮质髓质连接处Henle环染色呈中度阳性6小时：近端和远端小管上皮细胞细胞质和皮质髓质连接处Henle环、肾小球tuft细胞、某些Bowman腔壁细胞和极少数上皮细胞染色呈弱阳性至中度阳性
  胰腺  N/A  2小时和6小时：腺泡细胞细胞质染色呈弱阳性
  肺  N/A  2小时和6小时：II型肺细胞和/或intraaveolar巨噬细胞染色呈弱阳性至中度阳性染色
  胃  N/A  6小时：基底主要细胞细胞质染色呈中度
  十二指肠和空肠  N/A  2小时和6小时：肠细胞刷状缘细胞质染色呈中度至明显，肠神经丛细胞呈弱阳性
B.LPS治疗的小鼠中IL-22受体mRNA的检测
  组织   LPS治疗的小鼠
  肝脏   2小时和6小时：肝细胞细胞质染色呈弱至中度，在肝细胞、胆管上皮细胞和内皮细胞中观察到核染色。
  肾脏   2小时和6小时：在近端和远端小管上皮细胞、皮质髓质连接处Henle环、肾小球tuft细胞、某些Bowman腔壁细胞和少数上皮细胞的细胞质和核染色呈弱至中度。
  胰腺   2小时和6小时：腺泡细胞细胞质染色呈弱阳性
  心脏   6小时：心肌细胞和心内细胞和内皮细胞中核染色呈中度阳性。
在小肠、大肠、胃、***、脾脏和肺，也检测IL-22受体mRNA。IL-22受体的表达也可被先天性免疫应答介导物例如LPS上调。
最后，对静脉内接受mIL-22蛋白的c57BL/6小鼠肾细胞进行TUNEL测定，显示少数凋亡的上皮细胞在一些近端曲小管中。静脉内接受盐水的小鼠(对照组)没有阳性染色。
这些数据证明，细胞因子和受体在先天性免疫应答期间都可被诱导，该诱导可以局限于炎性状态的组织(LPS)中。在适应性免疫应答期间，IL-22也可从Th1 CD4+T细胞中诱导出来。因为循环白细胞看来没有受体，所以这一结果表明，IL-22在适应性免疫应答下游组织内起到效应物的功能，如同受到受体的组织表达的强化一样，组成型上调和进一步被炎症的先天诱导物上调。
实施例8：在基因表达中IL-22介导的变化
在用AdIL-22或Ad-GFP构建体感染的小鼠肝细胞中，对IL-22调节基因表达水平的能力，进行了测定。
将感染后1天和3天的冷冻小鼠肝研碎，用Promega RNAgentsTotal RNA Isolation System(Promega，Madison，WI)纯化RNA。所得RNA用RNeasy minikit进一步纯化。用RNeasy minikit(Qiagen，Hidden，德国)，从人PBMC中分离总RNA。
将10μg总RNA与100pM T7/T24标记的寡聚dT引物(在GeneticsInstitute合成，Cambridge，MA)一起，在70℃变性10分钟，然后在冰中冷却，制备总RNA，供杂交用。在以下缓冲液条件下，合成第一条cDNA链：1X第一链缓冲液(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA.)、10mM DTT(GIBCO/Invitrogen)、500μM各dNTP(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA))、400单位Superscript RTII(Invitrogen Life Technologies)和40单位RNA酶抑制剂(Ambion，Austin，TX.)。反应在47℃进行1小时。添加以下试剂(终浓度如下)，合成第二条cDNA链：1X第二链缓冲液(Invitrogen LifeTechnologies)、另外的200μM各dNTP(Invitrogen Life Technologies)、40单位大肠杆菌DNA聚合酶I(Invitrogen Life Technologies)、2单位大肠杆菌RNA酶H(Invitrogen Life Technologies)和10单位大肠杆菌DNA连接酶。反应在15.80℃进行2小时。在反应的最后5分钟，加入6单位T4 DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA)。
用以下BioMag羧基端颗粒纯化所得双链cDNA：0.2mg BioMag颗粒(Polysciences Inc.，Warrington，PA)用0.5M EDTA洗涤三次来平衡，然后以22.2mg/ml的0.5M EDTA的浓度重悬浮。双链cDNA反应物稀释至10％PEG/1.25M NaCl的终浓度，加入珠子悬浮液，使其达到0.614mg/ml的最终珠子浓度。反应物在室温下温育10分钟。cDNA/珠子复合物用300μl 70％乙醇洗涤，除去乙醇后，让试管风干。加入20μl 10mM Tris-乙酸(pH 7.8)，温育2-5分钟，洗脱cDNA，然后取出含有cDNA的上清液。
10μl纯化的双链cDNA加入到体外转录(IVT)溶液中，所述溶液含有1X IVT缓冲液(Ambion，Austin，TX)、5,000单位T7 RNA聚合酶(Epicentre Technologies，Madison，WI)、3mM GTP、1.5mM ATP、1.2mM CTP和1.2mM UTP(Amersham/Pharmacia)、0.4mM各bio-16UTP和bio-11 CTP(Enzo Diagnostics，Farmingdale，NY)和80单位RNA酶抑制剂(Ambion，Austin，TX)。反应在37℃进行16小时。标记的RNA用RNeasy(Qiagen)来纯化。用260nm的吸光度定量测定RNA的收率。
在94℃，使12μg体外转录物在40mM Tris-乙酸(pH 8.0)、100mM醋酸钾和30mM醋酸镁中断裂35分钟。断裂的标记RNA探针在杂交缓冲液中稀释至最终组成为：1X 2-N-吗啉代乙磺酸(MES缓冲液(pH6.5)、50pM Bio948(对照生物素化寡聚物，其与探针阵列(GeneticsInstitute，Cambridge，MA)上特有的标志杂交)、100μg/ml鲱精DNA(Promega，Madison，WI)、500μg/ml乙酰化BSA(Invitrogen LifeTechnologies)和1μl/μg标准曲线试剂(Gene Logic，Gaithersburg，MD供应的专用试剂)。该杂交液与两种玻璃珠(Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)在45℃预杂交过夜。将杂交液转移到干净试管中，在95℃加热1-2分钟，然后在微量离心机上离心至多2分钟，沉淀为可溶性碎片。寡核苷酸阵列软片(cartridges)(鼠74Kv2，Affymetrix，Santa Clara，CA)预先用非严格性洗涤缓冲液(0.9M NaCl、60mM磷酸钠、6mM EDTA和0.01％吐温20)润湿，然后在45℃旋转温育5-10分钟。从软片中除去缓冲液，将阵列在180μl杂交液中、在45℃以45-60rpm旋转杂交过夜。过夜保温后，除去杂交液，向软片中灌入非严格性洗涤缓冲液。阵列软片用流控技术操作台按照10个循环(2次混合/循环)的非严格性洗涤缓冲液在25℃洗涤，再用4个循环(15次混合/循环)的严格性洗涤缓冲液(100mM MES、0.1M Na+、0.01％吐温20和0.005％消泡剂)洗涤。探针阵列先在SAPE溶液(100mM MES、1MNa+、0.05％吐温20、0.005％消泡剂、2mg/ml乙酰化BSA(Invitrogen LifeTechnologies)和10μg/ml R藻红蛋白链霉抗生物素(Molecular Probes，Eugene，OR))中于25℃染色10分钟。初次染色后，探针阵列在25℃用非严格性洗涤缓冲液洗涤10个循环(4次混合/循环)。然后，将探针阵列在抗体溶液(100mM MES、1M Na+、0.05％吐温20、0.005％消泡剂、2mg/ml乙酰化BSA(Invitrogen Life Technologies)、100μg/ml山羊IgG(SIGMA，St.Louis，MO)和3μg/ml生物素化抗链霉抗生物素抗体(山羊)(Vector Laboratories.)中于25℃染色10分钟。第二次染色后，探针阵列在SAPE溶液中于25℃再染色10分钟。最后，探针阵列在30℃用非严格性洗涤缓冲液洗涤15个循环(4次混合/循环)。
阵列用Affymetrix基因芯片扫描仪(Affymetrix，Santa Clara，CA)进行扫描。扫描仪具有扫描聚焦显微镜并使用氩离子激光作为激发光源，发射光通过光电倍增管在530nm通带滤光片(荧光素0或560通长滤光片(藻红蛋白)进行检测。
mRNA在鼠74k(Mu74K)芯片组上进行分析。数据用GENECHIP4.0软件还原。将每个实验样品在双文件分析(two-file analysis)中与时间匹配对照进行比较。数据用根据在一个组称为“Present(现在)”的基因的标准进行过滤，并且消除所有不称为“Increasing(增加)”或“Decreasing(减少)”的基因。
3种小鼠的数据列举如下(AD-GIL-19小鼠49、51和52)。显示相对于Ad-GFP对照来说表达发生变化的基因，对每种动物来说显示具有指定的平均变化倍数。经Ad-IL-22治疗的动物所观察到的基因表达的变化与IL-22诱导急性期反应是一致的。所观察到的变化也表明经治疗的动物体内的炎症状态。
表3
  第3天肝-U74v2   Ad-GIL-19小鼠  Ad-GIL-19小鼠  Ad-GIL-19小鼠
 小鼠编号   49  51  52
  标识物  基因名称   平均变化倍数  平均变化倍数  平均变化倍数
  1300017C10RIK  RIKEN cDNA1300017C10基因   23.4  17.2  19.3
  SAA-PS  血清淀粉状蛋白A，假基因   24.6  13.9  24.3
  SAA1  血清淀粉状蛋白A1   11.9  9.7  12.3
  SAA2  血清淀粉状蛋白A2   10.0   8.9   10.3
  PRTN3  蛋白酶3   15.2   14.3   17.1
  SPP1  分泌型磷蛋白1   10.2   7.8   10.7
  LCN2  脂笼蛋白2   13.4   10.3   13.3
  SAA3  血清淀粉状蛋白A3   10.5   5.4   8.2
  GRO1  GRO1癌基因   8.2   5.6   7.2
  LY6D  淋巴细胞抗原6复合物，基因座D   6.0   5.5   4.9
  GRO1  GRO1癌基因   7.0   5.6   7.2
  RAD51L1  RAD51样1(酿酒酵母(S.cerevisiae))   4.4   3.7   3.8
  GAS6  生长停滞特异性6   4.1   3.5   4.8
  SP12-2  丝氨酸蛋白酶抑制剂2-2   3.7   2.8   3.8
  GADD45G  生长停滞和DNA损伤诱导型45γ   3.9   2.7   3.4
  CEBPD  CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)，δ   5.3   3.2   3.9
  TNFRSF1A  肿瘤坏死因子受体超家族，成员1a   3.6   2.6   3.0
  CISH3  细胞因子诱导型含SH2蛋白3   4.0   3.8
  IL1R1  白介素1受体I型   5.2   2.6   5.6
  SAP  血清淀粉状蛋白P-组分   3.1   2.5   3.3
  PEX11A  过氧化物酶体生物发生因子11a   4.2   3.2
  2310031 E04RIK  EST   2.9   2.7   3.3
  A880891  EST   2.7   2.4   2.8
  CD14  CD14抗原   3.4   2.3   2.6
  MT1  金属硫蛋白1   2.7   2.4   2.9
  UNK_AW124835  EST   2.2   2.0
  TM4SF7  跨膜4超家族成员7   2.6   2.8   2.4
  DNCLC1  动力蛋白，胞质，轻链1   2.5   2.4   2.6
  SAA4  血清淀粉状蛋白A4   3.2   2.8
  2410006H10RIK  RIKEN cDNA2410006H10基因   2.2   2.1   2.0
  RBM3  RNA结合基序蛋白3   2.7   2.8   2.8
  1300003D03RIK  RIKEN cDNA1300003D03基因   2.2   2.4
  CEBPB  CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)，β   2.0   2.3
 MT2 金属硫蛋白2     2.2     2.1     2.3
 ORM2 血清类黏蛋白2     1.7     1.7     2.0
 VNNl 血管非炎性蛋白1     2.0     2.1
 GTF2A2 通用转录因子IIa，2(12kD亚基)     2.2     2.4
 ITIH4 interα-胰蛋白酶抑制剂，重链4     1.8     1.9
 ITIH3 interα-胰蛋白酶抑制剂，重链3     1.8     1.7     1.9
 NPN3 致瘤性进程3     2.2     2.5
 U62673 EST     -2.4     -3.2
 PAPSS2 3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸酯合酶2     -2.0     -2.3
 TEMT 硫醚S-甲基转移酶     -2.2     -1.7
 TTR 运甲状腺素蛋白     -2.0     -1.8
 CBG 皮质类固醇结合球蛋白     -3.4     -2.8     -2.8
 HSD11B1 羟类固醇11-β脱氢酶1     -2.1     -1.9
 LIFR 白血病抑制因子受体     -2.5     -2.0     -1.7
 LIFR 白血病抑制因子受体     -2.5     -2.0     -1.7
 HPGD 羟***素脱氢酶15(NAD)     -1.9     -2.5
 CBG 皮质类固醇结合球蛋白     -3.5     -2.8     -2.8
 HAL 组氨酸氨裂合酶     -2.2     -2.0     -2.1
 CYP2F2 细胞色素P450，2f2     -2.5     -2.3     -1.7
 KEG1 肾表达基因1     -2.9     -2.2
 A1266885 EST     -4.7     -3.1     -2.4
仅一种动物中存在
PAP 胰腺炎相关蛋白     9.2
1300007C21 RIK RIKEN cDNA1300007C21基因     4.7
REG2 大鼠再生胰岛衍生，小鼠同系物2     9.8
UNK_AE000664 EST     9.6
丝氨酸/苏氨酸蛋白K1... 丝氨酸/苏氨酸蛋白K1     2.1
1300007C21RIK RIKEN cDNA1300007C21基因     3.8
CRAT 肉毒碱乙酰转移酶     2.6
AS2 芳基硫酸酯酶A     3.2
  2310009M24RIK  RIKEN cDNA2310009M24基因   2.0
  2310004B05RIK  RIKEN cDNA2310004B05基因   2.8
  REG1  大鼠再生胰岛衍生，小鼠同系物1   2.3
  AW048468  酯酶31   1.8
  PAP  胰腺炎相关蛋白   7.7
  SULT-X1  磺基转移酶相关蛋白SULT-X1   -2.6
  ES31  酯酶31   -1.8
  AW538652  EST   -1.9
  GAMT  胍基乙酸甲基转移酶   -2.0
  SC5D  甾醇-C5-去饱和酶(真菌ERG3，Δ-5-去饱和酶)同系物(酿酒酵母(S.cerevisae))   -1.9
  GHR  生长激素受体   -3.0
  AI839995  EST   -1.8
  0610025L15RIK  RIKEN cDNA0610025L15基因   -1.9
  AGXT  丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶   -2.5
  PAH  苯丙氨酸羟化酶   -2.0
  IGFBP2  ***结合蛋白2   -2.5
  A1647632  EST   -2.1
  A1647632  EST   -2.1
  G6PC  葡萄糖-6-磷酸酶，催化剂   -2.2
  CYP17  细胞色素P450，17   -3.0
  GSTA2  谷胱甘肽S-转移酶，α2(Yc2)   -2.3
  CYP26  细胞色素P450，26，视黄酸   -9.0
  THRSP  甲状腺激素效应SPOT14同源物(鼠属(Rattus))   -2.7
  FMO3  含黄素单加氧酶3   -2.6
实施例9：抗IL-22抗体在体内关节炎模型中的作用
对于P3/1单克隆抗体在胶原诱发的关节炎(CIA)鼠模型中缓解症状的能力，进行了检验。雄性DBA/1(Jackson Laboratories，BarHarbor，Maine)小鼠用于所有实验。将抗体预防性或治疗性给予DBA小鼠。在治疗方案中，当连续两天在小鼠中观察到疾病时，开始进行治疗。
关节炎是用II型牛胶原(Chondrex，Redmond，WA)诱导的。将II型牛胶原(Chondrex，Redmond，WA)溶于0.1M乙酸中，并且在等体积的含有1mg/ml结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，菌株H37RA)的CFA(Sigma)中乳化。在第0天，在尾端部皮下注射100μg牛胶原。在第21天，给小鼠的尾端部皮下注射用与等体积的不完全弗氏佐剂(Sigma)混合的含有200μg牛胶原的0.1M乙酸溶液。首次用于实验的动物接受相同组的注射，只是没有胶原。给药方案见图1的示意图。
每周监控小鼠至少三次，观察疾病进程。根据以下指数，给四肢临床评分：0＝正常；P＝关节炎前期，特征是趾头局灶性红斑；1＝可见红斑，伴有1-2个肿大趾头；2＝明显红斑，特征是脚爪肿胀和/或多个趾头肿胀；3＝大量肿胀延伸到踝关节或腕关节；4＝四肢使用困难或关节僵硬。因此，任一给定小鼠四肢评分之和，得出的最大总身体评分为16。
在疾病的不同阶段，将动物安乐死，切取组织，将脚爪在10％***中固定(供组织学分析用)，或者在4％低聚甲醛(pH 7.47)固定，用20％EDTA(pH 8.0)脱钙，然后石蜡包埋(供原位杂交用)。用光学显微镜及5级评分方法(0-4)对脚爪进行评分，以表征关节炎的强度和范围。除了其它炎性相关变化用于评分外，炎性浸润也用于评分，所述炎性相关变化例如血管翳形成、滑膜纤维化、关节软骨侵蚀(erosin)和/或软骨下骨破坏。组织学分级用每个脚爪的读数来确定：NAD＝0或未发现异常；1：轻微至中度；2：轻度至中度；3：明显；4：大量。
治疗性给予IL-22抗体的效果见图2。显示身体评分与时间的函数。相对于给予对照人IgG或PBS的小鼠(数据未显示)来说，给予抗IL-22抗体的小鼠表现出显著性减少的症状。
预防性给予中和IL-22抗体的效果见图3-5。在给予抗IL-22或对照抗体后，显示身体评分与时间的函数。相对于给予对照大鼠IgG或PBS的小鼠(数据未显示)来说，给予抗IL-22抗体的小鼠表现出显著性减少的症状。
在接受单独的预防方案的小鼠中，也检查身体评分。结果见图4，为时间的函数。与用抗IL-22治疗的小鼠相比，用对照抗体治疗的小鼠表现出明显更高的平均总身体评分。相对于给予对照大鼠IgG或PBS的小鼠(数据未显示)来说，给予抗IL-22抗体的小鼠表现出显著性减少的症状。
在接受预防方案的小鼠脚爪的疾病进程见图5。在第36天，处死小鼠，检查其脚爪的疾病严重程度。用0-4的组织学分级，对脚爪进行评分，其中0对应于无病，而4代表最严重疾病。对于注射IL-22抗体的大鼠来说，60％以上的组织学分级为“0”，而约20％小鼠的组织学分级为“1”。约15％小鼠的组织学分级为“2”，而约10％小鼠组织学分级为“3”。少量小鼠的组织学分级为“4”。对于注射对照抗体的小鼠来说，约30％的组织学分级为“0”，约5％小鼠的组织学分级为“1”。其余小鼠表现出更严重的病理学分级：约18％的组织学分级为“2”，而20％的组织学分级为“3”，其余小鼠的组织学分级为“4”。相对于给予对照大鼠IgG1或PBS的小鼠(数据未显示)来说，给予抗IL-22抗体的小鼠表现出显著性减少的症状。
这些结果证明，预防性或治疗性给予IL-22抗体，在动物***中，明显缓解了关节炎症状。
实施例10：IL-22转录物的原位杂交
在关节炎小鼠爪垫的各种细胞类型中，检查了IL-22和IL-22受体序列的表达。通过从相应的转录物中产生2个独立的PCR产物，制备反义IL-22和IL-22鼠受体核糖核酸探针。寡核苷酸5′-GACTGATAATACGACTCACTATAGGGCGAACAATTTTGACTCCGATATTGTCCAAG-3′(SEQ ID NO：6)和5′-AGGATGGAGACATCTGACTGCCCTACG-3′(SEQ ID NO：5)，用于产生IL-22受体有义探针，而5′-ACAATTTTGACTCCGATATTGTCCAAG(SEQ ID NO：7)和3′-GACTGATAATACGACTCACTATAGGGCGAAGGATGGAGACATCTGACTGCCCTACG-3′(SEQ ID NO：8)，用于产生IL-22受体反义探针。以下PCR扩增探针是用T7RNA聚合酶和体外转录产生的。
通过将以下序列***质粒并将所述序列置于T7和SP6启动子的控制下，构建IL-22序列的探针，以产生有义转录物或反义转录物：
CAGCCATACATCGTCAACCGCACCTTTATGCTGGCCAAGGAGGCCAGCCTTGCAGATAACAACACAGATGT
CCGGCTCATCGGGGAGAAACTGTTCCGAGGAGTCAGTGCTAAGGATCAGTGCTACCTGATGAAGCAGGTGC
TCAACTTCACCCTGGAAGACGTTCTGCTCCCCCAGTCAGACAGGTTCCA(SEQ ID NO：9)
将T7 RNA聚合酶结合部位掺入到寡核苷酸中，以便在PCR产物的5′端(用于有义核糖核酸探针)或PCR产物的3′端(用于反义核糖核酸探针)***T7结合部位。按照制造商的说明，用DIG RNA标记混合物(Roche Diagnostics，Mannheim，德国)和T7RNA聚合酶(RocheDiagnostics)，制备洋地黄毒苷标记的探针。CIA鼠模型脚爪的IL-22受体mRNA阳性细胞是巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞亚群、活化成骨细胞、滑膜细胞和表皮。在对照脚爪中或用有义探针，没有观察到阳性染色。mIL-22mRNA阳性细胞是：嗜中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和骨细胞。在用有义探针处理的脚爪部分没有看到染色，而对照小鼠脚爪用mIL-22mRNA染色。原位杂交显示，在关节炎小鼠的脚爪中，IL-22受体和细胞因子都存在。
实施例11：实施例12-22的实验方案
重组IL-22、IL-22RECD、IL-10R2ECD和IL-22BP融合蛋白
将哺乳动物表达载体(其编码与人IL-22成熟末端(APISSHCRLD)融合的N端His/Flag标记物(GSGHHHHHHGSGDYKDDDDK(Terpe，K.(2003)Applied Microbiology & Biotechnology 60(5)：523-33))，转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，所述细胞在甲氨蝶呤中进一步进行选择，随后从条件培养基中纯化重组细胞因子，所有这些步骤都通过标准方法(Terpe，K.(2003)，参见上文；Kaufman，R.J.(1990)Methods in Enzymology 185：537-66；Kaufman，R.J.(1990)Methods inEnzymology 185：487-511；Hochuli，E.(1988)Bio/Technology 6：1321-1325)。为了用于ELISA，用EZ-LinkTM Sulfo-NHS-生物素试剂盒，按照制造商(Pierce，Rockford，IL)的推荐方法，将人IL-22生物素化。通过类似方法，用编码N端HIS/FLAG标记物(GSGHHHHHHGDYKDDDDK)与鼠IL-22成熟N端(LPVNTRCKL)之间的融合物的表达载体，制备纯化的重组鼠IL-22。用A280吸光度，用来自氨基酸组成的理论消光系数，定量测定细胞因子。人和鼠IL-22在还原剂存在或不存在的条件下，在SDS-PAGE凝胶上进行分离，结果在～30-40kD之间(数据未显示)。有大量糖基化；当用N-聚糖酶处理时，IL-22迁移到～19kD处，接近或等于其理论分子量(数据未显示)。
IL-22R和IL-10R2的胞外结构域(根据疏水性图所确定)和IL-22-BP，可以通过柔性接头，与人IgG1的Fc结构域符合读框地融合。构建哺乳动物表达载体，所述载体编码人IL-22RECD(TLPDRTWT是C端序列(Xie M.H.等(2000)J Biol Chem 275(40)：31335-9；Kotenko S.V.等(2001)J Biol Chem 276(4)：2725-32))、人IL-10R2ECD(THDETVPS是C端序列(Lutfalla，G.等(1993)Genomics 16(2)：366-73))或人IL-22BP(EERCVEIP是C端序列(Dumoutier，L.等(2001)J Immunol 166(12)：7090-5；Kotenko，S.V.等(2001)J Immunol 166(12)：7096-103；Xu，W.等(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98(17)：9511-6)，所述人IL-22BP与接头(AGSGSGSG)以及人IgG1 Fc(该结构域的N端序列始于EPKSCDKT)依次融合。通过标准方法，从稳定的CHO细胞系中，制备含有各种这些Fc融合同型二聚体的条件培养基(Kaufman，R.J.(1990)Methods in Enzymology 185：537-66；Kaufman，R.J.(1990)Methods in Enzymology 185：487-511)。通过将IL-10R2-Fc融合表达载体瞬时转染到稳定的表达IL-22R-Fc的CHO细胞系中，或者通过这些融合受体的共同扩增，制备表达IL-22R-Fc和IL-10R2-Fc的条件培养基。用条件培养基(CM)作为所有Fc融合受体的来源。
用抗人IgG夹心ELISA，用1μg/ml山羊抗人IgG(Southern BiotechAssociates，Inc.，Birmingham，AL)作为包被抗体，1/10,000稀释的山羊抗人IgG HRP(Southern Biotech Associates，Inc.，Birmingham，AL)作为检测抗体，无关的纯化Fc融合蛋白作为标准品，定量测定CM中的总Fc融合物，按其在A280的吸光度来定量。标准ELISA的详细方案如下。
在β-巯基乙醇存在或不存在的情况下，对Fc融合同型二聚体和异型二聚体的完整性和组成进行评价(图7A)，用标准SDS丙烯酰胺凝胶电泳方法，用或者1∶5000稀释度的山羊抗人IgG-HRP(SouthernBiotech Associates，Inc.，Birminghan，AL)、1μg/ml兔抗IL-22R(ProSci，Poway，CA)或者0.2μg/ml山羊抗hIL-10R2(R & D Systems，Minneapolis，MN)作为检测试剂。注意，IL-22R和IL-10R2抗体都可检出同型二聚体的两条链和异型二聚体的一条链。
为了特异性检测IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc异型二聚体，建立了夹心ELISA，用0.5μg/ml兔抗hIL-22R(ProSci，Poway，CA)作为包被抗体，0.5μg/ml生物素化山羊抗hIL-10R2(R & D Systems，Minneapolis，MN)作为检测试剂。
IL-22抗体
先用鼠细胞因子、再用人细胞因子免疫LOU大鼠(Harlan，Harlan，MA)，产生抗IL-22的单克隆抗体。用标准技术(Goding J.Production of Monoclonal Antibodies.In：Monoclonal Antibodies：Principles and Practices.第3版，San Diego：Academic Press；1996，第141-180页)，使大鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞系P3X63Ag8.653(ATCC，Rockville，MD)融合，产生杂交瘤细胞系。抗hIL-22分泌细胞系最初先用ELISA鉴别，用1μg/ml hIL-22包被平板，1/5000稀释度的HRP缀合的山羊抗大鼠IgG(Pierce，Rockford，IL)作为检测试剂。Ab-02和Ab-04先前已分别描述为IL-22抗体P3/3和P3/2(参见以上实施例5)。通过标准方法，从腹水纯化抗体。为了换算成摩尔浓度，将150ng/ml定义为1nM抗体。
IL-22细胞因子/受体Fc结合ELISA
采用两个标准模式，研究IL-22与受体Fc融合物之间的相互作用。结果见图6A、图8A-8B、图9A-9B、图10B-10C和图11A-11C，是得自ELISA测定，其中来自CHO CM的受体Fc先通过抗hIgG包被而固定化。将平底96孔ELISA板(Costar，Cambridge，MA)用100μl山羊抗人IgG抗体(Southem Biotech Associates，Inc.，Birmingham，AL)，以1μg/ml的0.1M碳酸钠缓冲液(pH 9.6)的浓度，于4℃包被过夜。各板用200μl含0.05％吐温20的磷酸缓冲盐溶液(PBS-T)洗涤两次，用100μl 1％BSA(Sigma，St.Louis，MO)的PBS-T封闭1小时，然后洗涤三次。连续温育1小时(100μl)后，各板分别洗涤三次，然后加入以下化合物：固定浓度或系列稀释的给定的受体融合物、固定浓度或系列稀释的生物素化IL-22(bio-IL-22)，然后1/10,000稀释度的链霉抗生物素-辣根过氧化物酶(HRP)(Southern BiotechAssociates，Inc.，Birmingham，AL)。最后一次洗涤后，加入100μl TMBMicrowell过氧化物酶的底物(BioFX，Owings Mills，MD)，过20分钟，反应用100μl 2N H2SO4终止。在Molecular Devices(Sunnyvale，CA)微量板读板仪上，在450nm对过氧化物酶产物进行比色测定。
对于受体Fc和bio-IL-22都以固定浓度的以上某些ELISA测定来说，在加入bio-IL-22之前或同时(图9A)或在bio-IL-22之后(图9B)，加入不同浓度的IL-10R2-Fc。对于指定受体Fc和bio-IL-22也是以固定浓度的以上其它ELISA测定来说，在与bio-IL-22预温育30分钟后，加入不同浓度的抗体(图10B-10C、图11C)或IL-22BP(图11A-11B)。对于直接测定IL-10R2-Fc向IL-22/IL-22R复合物的募集(数据未显示，图9A的实验设计)的ELISA测定来说，将非生物素化IL-22加入到ELISA中，而多克隆山羊抗hIL-10R2或小鼠单克隆抗hIL-10R2(R & D Systems，Inc.，Minneapolis，MN)用作检测试剂。
图6B表明相反模式的ELISA测定结果，其中将100μl 1μg/ml生物素化IL-22加入到Reacti-Bind链霉抗生物素包被的96孔板(Pierce，Rockford，IL)中，过1小时。洗涤后，将不同浓度的Fc融合受体加入到各板中，过1小时，洗涤，然后用山羊抗人IgG-HRP进行检测。在图6A中，50ng/ml来自表达IL-22R-Fc(■)或IL-10R2-Fc(○)的CHO细胞的总Fc的条件培养基(CM)，被捕获到抗人IgG包被孔上。然后，将不同浓度的生物素化IL-22(bio-IL-22)加入到各孔中。随后用链霉抗生物素-HRP检测结合bio-IL-22。在图6B中，bio-IL-22(1g/ml)被捕获到链霉抗生物素板上。将稀释的CHO.CM中的不同浓度的IL-22R-Fc(■)或IL-10R2-Fc(○)加入到各孔中。随后用山羊抗人IgG-HRP检测结合受体Fc。
用抗IL-22抗体抑制STAT3的磷酸化
HepG2细胞(ATCC，Rockville，MD)在添加了10％胎牛血清的Dulbecco改良必需培养基(DMEM)中，用接种了4×105细胞/孔的6孔组织培养板(Corning，Coming，NY)进行培养。24小时后，加入含或不含50ng/ml人IL-22的新鲜培养基，达25分钟。当抗体用于中和功效测定时，将细胞因子和抗体在室温下预温育30分钟。加入200μl/孔的细胞裂解缓冲液(New England Biolabs，Beverly，MA)，裂解细胞。细胞裂解物中的总蛋白浓度用BCA测定法(Pierce，Rockford，IL)进行测定。10微克蛋白在4-20％SDS聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上进行分离，然后在室温下转印到硝酸纤维素膜(Amersham，Braunschweig，德国)上过夜。磷酸化STAT3用p-stat3Tyr705抗体试剂盒(New England Biolabs，Beverly，MA)进行检测。按照制造商(Pierce，Rockford，IL)推荐的方法，ECL检测***用于化学发光的表达。
实施例12：IL-22结合IL-22R但对IL-10R2没有可检测的亲和性
用两种ELISA模式，对IL-22与IL-22R和IL-10R2的胞外结构域(ECD)的结合，进行评价。在第一个模式中，受体-Fc融合蛋白通过抗人IgG包被板上的Fc结构域而固定化。然后加入生物素化IL-22，用链霉抗生物素．HRP进行检测。图6A是曲线图，显示bio-IL-22与固定化IL-22R-Fc的结合，而没有与IL-10R2-Fc结合。在另一模式中，先将bio-IL-22固定到链霉抗生物素包被的板上。然后，加入受体-Fc，并用HRP-缀合的抗hIgG进行检测。如图6B所示，可溶性IL-22R-Fc，而不是IL-10R2-Fc，与固定化bio-IL-22结合。当以较高浓度(3-10μg/ml；数据未显示)将IL-10R2-Fc加入到该测定模式时，观察到高出背景的微弱信号(非特异性Fc融合物)，表明IL-10R2-Fc对固定化bio-IL-22具有非常低的亲合力。总之，第一组ELISA实验表明，IL-22与IL-22R之间具有相对强的相互作用，而IL-10R2-Fc对IL-22仅有微弱亲合力。
实施例13：IL-22R-Fc和IL-10R2-Fc同型二聚体和异型二聚体的制备和表征
以下实验是用来评价IL-10R2的胞外结构域是否与IL-22结合，当与IL-22R-Fc并列时。因为观察到从扩增的CHO细胞系少量分泌IL-22R-Fc(约50-100ng/ml)，而大量分泌IL-10R2-Fc(约10μg/ml)，据信，IL-10R2-Fc能促进IL-22R-Fc的分泌。表达IL-22R-Fc的CHO细胞系用IL-10R2-Fc表达载体瞬时转染。该质粒的导入，增加IL-22R-Fc表达量达2-4倍。随后确定稳定的细胞系，其共表达Fc融合受体链。
已确定单体IL-22RECD-Fc和IL-10R2ECD-Fc融合物的分子量分别为～60kD和～85kD。来自表达受体Fc融合物之一或两者的CHO细胞的还原和非还原条件培养基(CM)在SDS-PAGE凝胶上进行分离，并转印到膜上，随后用针对的人IgG Fc、IL-22R或IL-10R2的多克隆抗体进行检测。更具体地讲，在图7A中，来自表达IL-22R-Fc、IL-10R2-Fc或两者受体Fc的CHO细胞的条件培养基，在还原(+βME)和非还原(-βME)条件下，在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，然后转移到膜印迹上。用任一抗人IgG1抗体、抗hIL-22R抗体或抗hIL-10R2抗体进行蛋白质印迹。对于抗hIgG的印迹检测来说，将CM中的4ng总Fc融合物上样到每一泳道。对于抗IL-22R和抗IL-10R2抗体检测来说，使用来自共表达CHO的CM中的16ng总Fc融合物。在图7B中，将表达IL-22R-Fc(■)、IL-10R2-Fc(○)或两者(▲)的CHO细胞的条件培养基，加入到用兔抗人IL-22R抗体包被的ELISA板上。也加入1∶1的两种同型二聚体的混合物，作为对照(△)。用生物素化山羊抗人IL-10R2抗体、再用链霉抗生物素-HRP，检测结合受体。
在还原条件(+βME，图7A)下，IL-22R和IL10R2-Fc CHO细胞系分泌具有不同分子量的人Fc融合蛋白。用受体链特异性抗体进行检测，证实～60kD的种类是IL-22R-Fc，而～85kD的种类是IL-10R2-Fc。这两种成熟受体融合蛋白的理论分子量都为～51kD。具有4个潜在N联糖基化位点的IL-22R-Fc，在通过CHO细胞时，预测具有比IL-10R2-Fc更少的糖基化，后者具有5个潜在N联糖基化位点。IL-10R2-Fc看来具有更多的翻译后修饰。在还原条件下进行的该分析也显示，共表达CHO细胞分泌两种Fc融合物。来自抗hIgG测定的数据表明，IL-10R2-Fc表达水平比IL-22R-Fc高。
表达两种受体Fc融合物的CHO细胞主要分泌IL-22R/IL-10R2-Fc异型二聚体和IL-10R2-Fc同型二聚体。因为这些受体Fc融合物具有不同的分子量，所以用非还原SDS-PAGE(-βME，图7A)对CM进行分析，能检测在凝胶上两种同型异构体之间分离的受体Fc融合异型二聚体。在这些条件下，IL-22R/IL-10R2-Fc异型二聚体和IL-10R2-Fc同型二聚体都用来自共表达CHO细胞的CM的抗hIgG进行检测。相比之下，IL-22R-Fc同型二聚体较难检测。在非还原条件下对IL-22R抗体进行检测，证明共表达CHO确实分泌IL-22R-Fc同型二聚体，但明显小于异型二聚体。归纳起来，图7A所示结果表明，IL-22R/IL-10R2-Fc转染CHO分泌共价的IL-22R/IL-10R2-Fc异型二聚体和IL-10R2-Fc同型二聚体和极少量IL-22R-Fc同型二聚体。
通过夹心ELISA，使用对异型二聚体每条链具有特异性的抗体，证实来自CHO细胞的CM中存在异型二聚体。将条件培养基加入到包被IL-22R多克隆抗体的各孔中，结合蛋白用生物素化IL-10R2多克隆抗体进行检测。该ELISA模式将仅检测在IL-22R和IL-10R2表位间具有稳定连接的分子。来自表达IL-22R-Fc或IL-10R2-Fc两者或其一的CHO的CM，或者这些CM混合在一起，在该ELISA模式中没有可检测信号。仅从共表达IL-22R-Fc和IL-10R2-Fc的CHO细胞中获取信号。该观察结果连同图7A的数据证明，表达两种Fc融合受体的CHO细胞分泌异型二聚体，所述二聚体含有IL-22RECD与IL-10R2ECDFc单体链之间的共价连接。
总之，图7A-7B所示结果表明，受体Fc融合物是以同型二聚体和异型二聚体形式由CHO细胞分泌的。IL-22R/IL-10R2-Fc共表达CHO细胞多半分泌异型二聚体和IL-10R2-Fc同型二聚体。
实施例14：IL-22表现出对并列IL-22R/IL-10R2受体Fc链的结合增加
IL-22与IL-22R和IL-10R2的ECD的结合，以Fc异型二聚体形式分泌，对此进行了评价。来自CM的固定浓度的总Fc融合蛋白先通过抗人IgG上的Fc结构域包被板而固定化。用不同浓度的bio-IL-22作为检测试剂，评价细胞因子的结合能力(图8A)。如图6A所示，IL-22R-Fc同型二聚体和IL-10R2-Fc同型二聚体分别给出信号和没有可检测信号。然而，最有效bio-IL-22结合，是用来自共表达CHO细胞的CM的固定化受体Fc而得到的：需要bio-IL-22比用固定化IL-22R-Fc同型二聚体的类似信号低8倍。因为在这些条件下不能检测IL-10R2Fc同型二聚体组分与IL-22的结合(图6A，图8A)，所以来自共表达CHO的CM的Fc蛋白对IL-22结合作用的增强，必定是因为IL-22R/IL-10R2-Fc异型二聚体组分。此外，这些共表达CHO细胞极少分泌IL-22R-Fc同型二聚体(图7A-7B)。以下事实强调了异型二聚体对于结合IL-22的更强效力：相对IL-22R-Fc同型二聚体来说，更少固定化异型二聚体用于图8A的实验设计中。因为将固定量的总Fc加入到各孔中，所以含有异型二聚体的CM(而不是IL-22R-Fc同型二聚体CM)被其它Fc组分稀释。结论是，IL-22R/IL-10R2-Fc异型二聚体给出最佳结合信号，表明IL-22对IL-10R2的ECD的结合作用。因为IL-10R2同型二聚体单独不能结合IL-22，所以这些结果也表明，IL-10R2对结合IL-22的作用需要IL-22R的存在。
随机并列的IL-22R和IL-10R2ECD也可比IL-22R-Fc同型二聚体更有效结合IL-22。对于图3B的实验来说，制备1∶1的CM混合物，其含有等量IL-22R-Fc同型二聚体和或者IL-10R2-Fc同型二聚体或者无关Fc同型二聚体。将Fc融合物以及含有异型二聚体的CM的混合物，进行系列稀释，然后以给定总Fc浓度固定在抗人IgG包被板上。用固定浓度的bio-IL-22作为检测试剂，对细胞因子的结合能力进行评价。图8B的结果表明，比起IL-22R-Fc与无关Fc同型二聚体的混合物来说，IL-22R-Fc和IL-10R2-Fc同型二聚体的混合物与bio-IL-22的结合效率大2-3倍。该观察结果表明，在该基于ELISA的模式中，IL-22R和IL-10R2受体链不必共价连接IL-10R2-Fc，以促进其功能。在两种同型二聚体一起随机包被期间，如果发生合适的物理并列(juxtaposition)，那么相对于IL-22R-Fc和无关Fc同型二聚体混合物来说，会检出生物素化IL-22结合增加。这一增强的信号在更高浓度的总Fc时更明显，其中很可能IL-22R和IL-10R2ECD将会彼此并列毗连。相比之下，异型二聚体的受体Fc之间的共价连接提供这些受体ECD的浓度依赖性并列，因此在任何浓度的总Fc时为最强信号。总之，图8A-8B所示结果表明，IL-10R2在IL-22结合中的检测作用需要IL-22R的ECD。当两种ECD都存在时，检测到增强的IL-22结合作用。
实施例15：IL-10R2胞外结构域(ECD)影响IL-22和IL-22R胞外结构域之间起始相互作用的稳定性
IL-10R2的IL-22结合功能需要IL-22R的存在(图8A-8B)。为了进一步评价IL-10R2在IL-22细胞因子受体复合物发育中的暂时作用，通过在IL-22R-Fc同型二聚体后加入IL-10R2-Fc同型二聚体，修改ELISA模式。在加入bio-IL-22之前、同时或之后，对加入IL-10R2-Fc同型二聚体的作用进行评价。更具体地讲，在图9A中，50ng/ml来自CM的IL-22R-Fc被捕获到抗人IgG包被孔上。然后，用100μg/ml人IgG封闭各孔。再将bio-IL-22(30ng/ml)加入到各孔中。随即，结合bio-IL-22用链霉抗生物素-HRP进行检测(长划虚线)。不同浓度的IL-10R2-Fc和生物素化IL-22(30ng/ml)也一并加入，然后检测结合的bio-IL-22(◆)。也先加入不同浓度的来自CM的IL-10R2-Fc，温育，洗板，随即将30ng/ml bio-IL-22加入到各孔中，然后检测结合的bio-IL-22(◇)。将IL-10R2-Fc系列稀释到100μg/ml hIgG中。在图9B，50ng/ml来自CM的IL-22R-Fc被捕获到抗人IgG包被孔上。再将bio-IL-22(30ng/ml)加入到各孔中。立即用链霉抗生物素-HRP检测结合的bio-IL-22(实线)。也可与PBS-1％BSA(长划虚线)或不同浓度的IL-10R2-Fc(●)一起再温育1小时后，检测结合的bio-IL-22。
对于图9A的实验来说，固定量的IL-22R-Fc融合同型二聚体通过其在抗人IgG包被板上的Fc而固定化。再加入人IgG(100μg/ml)，占据或封闭板上仍然可用的抗人IgG抗体。固定浓度的bio-IL-22给出信号(约1.25)，通过其与IL-22R的ECD的相互作用结合到板上。如果在加入bio-IL-22之前，先加入IL-10R2-Fc同型二聚体(系列稀释到hIgG中)，对随后结合到板上的bio-IL-22的数量没有影响。这些观察结果表明，IL-22R-Fc同型二聚体和IL-10R2-Fc同型二聚体的ECD不能单独影响彼此间稳定的连接，这随后可因IL-22结合的增强而被检出。相反，IL-10R2需要IL-22以及IL-22R的存在，以便达到其细胞因子结合的增强作用。在图9A的实验中，如果IL-10R2-Fc与bio-IL-22一起加入的话，与IL-22R结合的bio-IL-22数量上出现IL-10R2剂量依赖性增加。此外，IL-10R2-Fc的加入不能达到增加的目的，如果在加入bio-IL-22之前与固定化IL-22R-Fc温育的话。
考虑到IL-22(图9A)和IL-22R(图8)对于IL-10R2作用于细胞因子结合的必要性，它直接决定了这些需求是否构成IL-22与IL-22R间的相互作用。对于图9B的实验来说，固定量的IL-22R-Fc融合同型二聚体通过其在抗人IgG包被板上的Fc而固定化。加入固定浓度的bio-IL-22，给出信号(约2.5)，通过其与IL-22R的ECD的相互作用而结合到板上。除了立即检测bio-IL-22信号外，也可以在洗涤和再次温育后再检测。当先bio-IL-22、再1％BSA在各孔中温育时，检出0.6(即1.5/2.5)的原信号，表明在与1％BSA的再次温育期间，一些bio-IL-22从固定化IL-22R-Fc同型二聚体中释放出来。相比之下，当先将bio-IL-22、再将增加浓度的IL-10R2-Fc同型二聚体加入到各孔中时，检出更多bio-IL-22信号，与bio-IL-22温育后立即检测所得到的信号水平接近。这些结果表明，IL-10R2在IL-22结合中的功能需要IL-22与IL-22R之间的相互作用。将IL-10R2加入到各孔中，在IL-22温育后，诱导复合物的形成，比起单用IL-22R，IL-22具有更慢的解离速率(off-rate)。
归纳起来，图6、图8和图9所示结果表明，IL-22R ECD和IL-10R2受体链结合IL-22的暂时模型。IL-22先与IL-22R结合。IL-10R2再与IL-22/IL-22R结合，进一步稳定细胞因子受体复合物内的IL-22(归纳于图12的示意图)。
实施例16：IL-22的两个不同表面对于与IL-22R和IL-10R2ECD的各自相互作用来说是需要的
产生了两个大鼠单克隆抗体Ab-02和Ab-04，表明对人IL-22的结合(实施例5)。检验这些抗体阻断IL-22依赖性信号转导的能力。IL-22导致在表达IL-22R和IL-10R2受体链(例如HEPG2)的细胞系中STAT3转录因子的磷酸化(Dumoutier L.等(2000)Proc Natl Acad SciUSA 97(18)：10144-9)。如果这些抗体中和IL-22，那么在细胞裂解物中应该检出更少的P-STAT3。对于图10A的实验来说，系列稀释的抗体与细胞培养基中的固定浓度的IL-22预温育。该培养基，包括IL-22与抗体的复合物，随后加到HEPG2细胞上。随即制备细胞裂解物，蛋白进行凝胶电泳分离，转移到膜上，在其上与对P-STAT3具有特异性的抗体一起温育。更具体地讲，人IL-22(50ng/ml)与细胞培养基中的不同浓度的Ab-02或Ab-04一起在37℃预温育30分钟，然后将培养基加入到HepG2细胞中，将细胞温育25分钟。用抗phospho-STAT3抗体，细胞裂解物经蛋白质印迹进行分析。细胞与单独的IL-22(+)或不与IL-22(-)温育，分别作为阳性对照和阴性对照。这两种抗体都能阻断细胞上的IL-22的活性：随着抗体浓度上升，对P-STAT3的检出下降。然而，这些抗体效力不同：Ab-02和Ab-04的ND50分别为～33nM和～0.4nM。总之，图10A所示结果表明，这两种抗体与IL-22表面结合，对该细胞因子将信号转给细胞的能力来说是重要的。
如果每种抗体通过抑制其与受体链的相互作用而中和IL-22，那么Ab-02和Ab-04限定细胞因子受体相互作用所需的IL-22表位。在细胞因子-受体结合ELISA中，对抗体进行评价，确定这些抗体如何影响IL-22的结合。对于图10B的实验来说，固定量的IL-22R-Fc同型二聚体通过其在抗人IgG包被板上的Fc而固定化。固定浓度的bio-IL-22给出信号(约2.25)，通过其与IL-22R的ECD的相互作用而结合该板。这两个抗体与IL-22的预保温，对IL-22其后结合IL-22R的能力具有性质不同的影响。Ab-04阻断IL-22与IL-22R的结合(ND50＝0.7nM)，而Ab-02增强IL-22与IL-22R的结合(EC50＝0.1nM)。这些抗体在该ELISA中的不同表现，表明它们限定不同的IL-22表位。Ab-04所限定的表位，对于IL-22R的ECD识别IL-22是必需的，或抗体在空间上干扰IL-22R对邻近IL-22表位的识别。
也评价了这些抗体对IL-22结合的作用，当IL-22R/IL-10R2-Fc异型二聚体(而不是IL-22R同型二聚体)固定在抗人IgG包被孔中时(图10C)。在图10C的实验中，随后添加的固定量的bio-IL-22给出信号(约2.5)，通过其与IL-22R和IL-10R2的相互作用而结合到板上。在这种情况下，两种抗体都抑制IL-22与异型二聚体的Fc融合受体的结合。此外，这些抗体性质不同。Ab-04几乎完全抑制结合，其ND50＝0.2nM。相比之下，Ab-02部分抑制结合，其ND50≥10nM。我们得出结论：在IL-22R(图5B)和异型二聚体(图10C)ELISA中，Ab-04都几乎完全阻断IL-22与IL-22R之间的相互作用。在异型二聚体ELISA中，推测Ab-02相对低的效力反映其对IL-22相对弱的亲和性。因为Ab-02不阻断IL-22与IL-22R之间的相互作用(图10B)，所以图10C所示结果表明，Ab-02限定各自的表位，它是IL-10R2的IL-22结合稳定性所需要的，或者Ab-02结合该表位在空间上干扰IL-10R2对邻近IL-22表位的识别。
也评价了多克隆IL-10R2抗体对IL-22结合IL-22R和受体Fc异型二聚体的抑制能力。在IL-10R2不存在的上述ELISA中，增加量的该抗体与固定量的bio-IL-22一并加入，对IL-22与IL-22R同型二聚体之间的相互作用没有显著影响(图10B)。相比之下，当增加量的IL-10R2抗体与IL-22一并加入到包括固定化IL-22R/IL-10R2-Fc的ELISA时，该抗体阻断IL-22与异型二聚体的结合(ND50＝3nM，图10C)。该效果的完成表明，该多克隆抗体对不同IL-10R2表位的结合也阻止了(推测是空间上干扰)IL-22与IL-22R之间的相互作用。
总之，图10A-10C所示结果表明，Ab-02和Ab-04各自限定IL-22上的不同表位，这对IL-22与其受体链之间的相互作用来说是重要的。Ab-04限定对于IL-22R初次识别IL-22来说是必需的表位(图12)。Ab-02限定对于IL-10R2在细胞因子受体复合物的稳定性中的作用来说是必需的表位(图12)。用大鼠抗鼠IL-22单克隆抗体得到的类似数据限定mIL-22上的类似表位(数据未显示)。IL-10R2多克隆抗体对IL-22结合的抑制进一步具体说明了IL-10R2对细胞因子结合的重要性。
实施例17：IL-22BP阻断IL-22与IL-22R之间的相互作用
IL-22结合蛋白(IL-22BP)是IL-22的可溶性“受体”，其与IL-22R的胞外结构域的同源性低。它中和由IL-22介导的信号转导(Dumoutier，L.等(2001)J Immunol 166(12)：7090-5；Kotenko，S.V.等(2001)J Immunol 166(12)：7096-103；Xu，W.等(2001)Proc Natl Acad SciUSA 98(17)：9511-6；Wei C-C等(2003)Gene & Immunity 4：204-21117)。将分泌IL-22BP-Fc融合物的CHO细胞的条件培养基加入到细胞因子受体结合ELISA中，测定该天然拮抗剂如何阻断IL-22与其受体链的相互作用。对于图11A和图11B的实验，来自分别表达IL-22R-Fc同型二聚体或IL-22R/IL-10R2-Fc异型二聚体的细胞的固定量的总Fc，通过其在抗人IgG包被板上的Fc而固定化。固定浓度的bio-IL-22给出信号，通过其与固定化受体链相互作用结合到板上。当增高浓度的IL-22BP-Fc与固定浓度的IL-22一起加入时，IL-22BP-Fc几乎完全阻断IL-22与IL-22R ND50＝4nM；图11A)和异型二聚体ND50＝2nM；图6B)的结合。这表明IL-22BP通过阻断IL-22R识别所需的IL-22表位来抑制结合。这些观察结果与用Ab-04所观察的结果类似。
为了确定IL-22BP、Ab-04和Ab-02是否结合IL-22上的不同或重叠表位，采用结合ELISA，其中IL-22BP-Fc通过其在抗人IgG包被板上的Fc而固定化(图11C)。固定浓度的bio-IL-22给出信号，通过其与IL-22BP相互作用结合到板上。增加浓度的Ab-04或Ab-02也与固定浓度的IL-22一并加入。Ab-04完全阻断IL-22和IL-22BP之间的相互作用ND50＝0.05nM)，表明这两种抑制剂共享相同或重叠的IL-22表位。相比之下，Ab-02部分和微弱地阻断IL-22对IL-22BP的识别(ND50＝100nM)，表明Ab-02和IL-22BP在IL-22上具有不同但重叠的表位。
总之，图11所示结果表明，IL-22BP和Ab-04在IL-22上共享类似表位，这对与IL-22R的结合来说是重要的。由Ab-02所限定的IL-22表位是不同的。
实施例18：IL-22序贯地与IL-22R的ECD和IL-10R2的ECD相互作用
生物素化N端HIS/FLAG标记的人IL-22细胞因子和IL-22RECD-Fc融合物和IL-10R2ECD-Fc融合物用于基于ELISA的模式，以研究IL-22怎样与其受体链相互作用的。正如图12的示意模型所归纳的，IL-22可以先与IL-22R的ECD结合。然后IL-22/IL-22RECD与IL-10R2的ECD的相互作用，形成对IL-22具有更高亲和性的细胞因子受体复合物。尽管没有直接显示出IL-10R2ECD稳定地募集到该复合物，但是以下观察结果支持该模型。
对IL-22与单个受体亚基的相互作用进行了研究，发现容易检测到IL-22与IL-22R之间的结合(ED50＝20ng/ml IL-22和ED50＝6ng/mlIL-22R-Fc，分别在图6A和图6B中)。相比之下，固定化IL-22和可溶性IL-10R2之间仅检出有微弱亲合力，并且这需要高浓度的IL-10R2-Fc(3-10μg/ml；数据未显示)。这些结果与Logsdon，N.J.等(参见下文)做出的近期研究是一致的，其中检出毫微摩尔级的单体IL-22和IL-22R之间的相互作用(Keq约为15nM)，而IL-22和IL-10R2之间的相互作用则为毫摩尔级(Keq约为1mM)(Logsdon，N.J.等(2002)JInterferon Cytokine Res 22(11)：1099-112)。
不受理论的束缚，申请人认为，IL-10R2的ECD随后与最初的IL-22R/IL-22RECD复合物缔合，是基于其对表位的亲和性，这是由IL-22和IL-22R胞外结构域的相互作用所确定的。对IL-10R2ECD的这种暂时性连接，使受体复合物内的细胞因子更稳定，并导致有效的信号转导(图12)。在固定化IL-22R ELISA中，在之前、同时(图9A)或序贯(图9B)地将可溶性IL-10R2Fc加入到生物素化IL-22中的实验，证明IL-10R2对IL-22结合的作用依赖于先前的IL-22/IL-22R相互作用(图9)。在所用的***中，IL-10R2-Fc既不能先与IL-22缔合(图6)也不能先与IL-22R-Fc缔合(图9A)以增加IL-22的结合。这些观察结果与Logsdon等(2002，参见上文)的亲和性测定结果是一致的，其中固定化IL-22对单独的溶液相IL-10R2的亲和力为约1mM(Keq)，而其对溶液相IL-22R和IL-10R2一起的亲和力要大20倍(约45μM)。
在该ELISA***中，IL-10R2亚基与IL-22/IL-22R复合物的稳定性连接不能直接用多克隆hIL-10R2抗体或单克隆hIL-10R2抗体检出。这两种抗hIL-10R2试剂检测IL-10R2-Fc与ELISA板的明显的非特异性结合，甚至是在100μg/ml人IgG存在下以及独立于IL-22R或IL-22的添加。这种高背景可能会掩蔽这样的较弱信号：来自IL-22/IL-22R依赖性的IL-10R2与ELISA板的结合信号。尽管注意到，当序贯加入细胞因子时，这种IL-10R2-Fc非特异性结合不能增强来自bio-IL-22的信号，推测因为当hIgG加入到测定中时，没有足够的IL-22R-Fc并列在IL-22RECD附近(图9A)。
在异型二聚体的情况下，IL-22R与IL-10R2的共价并列，在本文所用***种提供IL-22结合的最佳检测(图8A)。结果，一旦细胞因子加入到测定中时，这种共价缔合增加了IL-10R2ECD接近IL-22/IL-22R ECD复合物的可能性。
这些异型二聚体可人工模拟细胞膜内的IL-22R与IL-10R2受体亚基间的潜在预先缔合。Krause等(Molecular & Cellular Proteomics1(10)：805-15，2002)开发的单细胞FRET***的研究表明，完整功能性IFN-γRI和IFN-γR2受体链间的预先缔合，可以通过C端GFP和BFP融合物而检出，同时IFN-γ与该***的细胞结合，和推测的细胞因子-受体复合物寡聚化，FRET信号减少，表明胞内结构域作为激酶分开，使受体链磷酸化，并扩增下游信号级联。在一个模型中，在本文所述的ELISA***模型中，暂时性IL-22细胞因子受体相互作用研究了预先缔合的IL-22受体链的寡聚化所需的相互作用，以及细胞膜内的其它II类细胞因子受体。
实施例19：IL-22具有各自的IL-22R和IL-10R2结合表面
现已证明，大鼠IL-22抗体Ab-02和Ab-04对于评价IL-22表位上潜在结合部位来说，是有用的工具，所述部位是所提议的细胞因子-受体复合物的暂时性装配和随后的信号转导所必需的(图12)。对这些抗体作用进行研究，能表征两类IL-22拮抗剂。第一类以Ab-04和hlL-22BP-Fc为例，阻断最初IL-22与IL-22R之间的相互作用(图10B和图12)。第二类抑制剂以Ab-02为例，阻断随后的IL-10R2ECD对IL-22/IL-22RECD的识别(图10C和图12)。这些抗体也阻断IL-22所介导的信号转导(图10A)。
无论IL-22抗体所确定的表位与受体结合部位重叠，还是与抗体结合部位重叠，都会在空间上干扰受体链对细胞因子的识别，这两类抗体证实，IL-22对IL-22和IL-10R2具有不同的受体结合部位。针对本文所报道的抗体特征来说，Ab-04与IL-22表位结合，阻止IL-22R识别IL-22；而Ab-02的情况与此不同。IL-22与IL-22R的缔合不被Ab-02阻断。事实上，Ab-02增强IL-22与固定化IL-22R的结合(图5B)。据信，这是因为Ab-02识别IL-22的构象变化，所述变化是因为该细胞因子与IL-22R ECD的相互作用所致。尽管Ab-02不阻断细胞因子装配的第一步，但是它能阻断第二步(即IL-10R2ECD识别IL-22/IL-22R)。因此，得出结论：Ab-04和Ab-02分别阻断IL-22R和IL-10R2对IL-22上不同结合部位的识别。天然存在的IL-22的拮抗剂和结合蛋白即IL-22BP，与Ab-04具有类似特征，都干扰IL-22R对IL-22的识别(图11A)。Ab-04对IL-22结合固定化IL-22BP-Fc的强烈干扰能力，进一步支持这一结论：Ab-04和IL-22BP共享IL-22上的类似表位，该表位与Ab-04所确定的表位不同。
总之，本文所示结果表明，IL-22以暂时的机制与其受体链相互作用。首先，IL-22与IL-22R ECD缔合，其中以Ab-04和IL-22BP-Fc为例的拮抗剂阻止该相互作用。其次，IL-10R2ECD与先前IL-22与IL-22R间相互作用所确定的不同结合部位结合。这后一种相互作用被以Ab-02为例的拮抗剂阻断(图12)。
实施例20：在用大鼠抗人IL-22抗体的pSTAT萤光素酶测定中，对IL-22活性的抑制
买验方案：
pSTAT-TA-萤光素酶载体构建如下。将5拷贝的STAT效应元件(PN Pearse等(1993)PNAS 90：4314-4318)克隆到市售的pTA-Luc载体(Clontech产品目录号：PT3606-5)。
萤光素酶活性用以下pSTAT萤光素酶测定来检测：第1天，将HepG2细胞用胰蛋白酶完全消化，以5×106细胞/P100的密度分配到P-100平板(Corning)中。第2天，在以下条件下在每P100平板转染细胞：溶液1：20μg pSTAT-TA-Luc DNA+0.5ml无血清培养基(Opti-MEM，来自Gibco)；和溶液2：60μl Lipofectamin2000(来自Gibco)+0.5ml无血清培养基(Opti-MEM，来自Gibco)。将溶液1轻轻地加入到溶液2中，将试管倒转数次，充分混合。让混合物在室温下静置20分钟。将HepG2细胞的培养基除去，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤一次。向P100中加入9ml/p100的无血清培养基(DME+PSG+HEPES)。将DNA/Lipofectamin 2000混合物(溶液1+溶液2)滴加到细胞上。所得混合物轻轻涡旋搅拌，放回培养箱。第3天，将细胞用胰蛋白酶消化，接种到平底96孔细胞培养板中，每个p100接种一个96孔板，100μl/孔。第4天，系列稀释的抗体与30ng/mlhuIL-22的DME+PSG+10％FBS一起于37℃预温育30分钟。除去培养基后，将100μl抗体∶细胞因子混合物加入到细胞培养板中。细胞在37℃温育6小时。除去培养基。将1x RLB缓冲液(Promega E3971)加入到96孔板，50μl/孔，然后混合均匀。将40μl裂解物转移到化学发光96孔测定板(Packard或Wallac不透明96孔板)中，供萤光素酶测定用。加入100μl萤光素酶测定试剂(Promega E1483)。在发光计(Wallax Micro Beta TriLux闪烁计数器)中记录发光。
该实施例描述在pSTAT萤光素酶测定中，用大鼠抗人IL-22抗体Ab-02和Ab-04，对IL-22活性的抑制，与人IL-22结合蛋白和Fc融合物的融合构建体(huIL-22BP-huFc)进行比较。图13是一幅图，表示大鼠抗人IL-22单克隆抗体Ab-02和Ab-04对IL-22活性的抑制。固定浓度的IL-22与不同浓度的Ab-02(●)或Ab-04(▲)或对照抗体(-)在细胞培养基中预温育，再加入到用pSTAT-TA-Luc载体瞬时转染的HepG2细胞中。6小时后，裂解细胞，将相同量的细胞裂解物与萤光素酶底物一并加入其中。信号用发光读出仪进行检测。与IL-22(长划虚线)或不与IL-22(短划虚线)一起温育的细胞分别作为阳性对照和阴性对照。Ab-02的ED50约为10hM。Ab-04的ED50约为0.3nM。
图14是一幅图，表示大鼠抗人IL-22单克隆抗体Ab-04或IL-22BP-Fc对IL-22活性的抑制。固定浓度的IL-22与不同浓度的Ab-04(▲)或IL-22BP-Fc(□)在细胞培养基中预温育，再加入到用pSTAT-TA-Luc载体瞬时转染的HepG2细胞中。6小时后，裂解细胞，将相同量的细胞裂解物加入到具有萤光素酶底物的各样品中。信号用发光读出仪进行检测。与IL-22(长划虚线)或不与IL-22(短划虚线)一起温育的细胞分别作为阳性对照和阴性对照。IL-22BP-Fc的ED50约为0.4nM。
实施例21：在BaF3增殖测定中，大鼠抗人IL-22抗体对IL-22活性的抑制
实验方案：
将编码全长IL-22R和IL-10R2的DNA片段，分别克隆到GFP-RV(携带绿色荧光蛋白报道基因的逆转录病毒载体)和YFP-RV(携带黄色荧光蛋白报道基因的逆转录病毒载体)中。BaF3细胞用IL-10R2-YFP-RV转导，用FACS进行分选。IL-10R2阳性BaF3细胞再用IL-22R-GFP RV转导，用FACS进行分选。IL-10R2/IL-22R双重阳性BaF3细胞用于如下所述的BaF3增殖测定。
洗涤BAF3细胞。制备在RPMI1640+PSG+10％FBS中105/ml的细胞悬液，以50μl/孔的等分试样加入到细胞培养板(VWR#62402-929)中。系列稀释的抗体与1.5ng/ml人IL-22的RPMI1640+PSG+10％FBS一起，于37℃预温育30分钟。所得混合物加入到细胞培养板中，50μl孔。细胞在37℃/5％CO2的恒湿培养箱中培养48-72小时。为了评价增殖，从培养箱中取出培养板，让其冷却至室温。加入约100μl/孔的重建Cell-Tirer Glo试剂。平板在定轨摇床上摇动2分钟，确保细胞完全溶解。用Trilux(Wallax Micro Beta TriLux闪烁计数器)，以1秒/孔记录发光。
该实施例描述了在BaF3增殖测定中，用大鼠抗人IL-22抗体Ab-02和Ab-04对IL-22活性的抑制(图15)。固定浓度的IL-22与不同浓度的Ab-02(●)或Ab-04(▲)或对照抗体(-)在细胞培养基中预温育，再加入到同时表达IL-22R和IL-10R2受体的BaF3细胞中。48-72小时后，细胞增殖用Cell-Tirer Glo试剂进行检测。用发光读出仪检测信号。Ab-02的ED50和Ab-04的ED50分别为约40nM和0.2nM。
实施例22：通过BIAcore，对大鼠Ab-02、Ab-04、IL-22BP-Fc、IL-22R和IL-22R/IL-10R2对IL-22的结合能力进行动力学分析
实验方案：
为了制备生物传感器表面，将山羊抗人IgG亲和力纯化(KPL01-10-20)；蛋白-A(Pierce 21184)；山羊抗大鼠IgG或试验蛋白，用胺偶联，直接固定到研究级的羧甲基葡聚糖芯片(CM5)上。表面用EDC/NHS活化。捕获抗体以50μg/ml的醋酸钠缓冲液(pH 4.5)的浓度进行注射；蛋白-A以50μg/ml的醋酸钠缓冲液(pH 4.0)的浓度进行注射；或者试验蛋白以0.01-1μg/ml的醋酸钠缓冲液(pH 5.0)的浓度直接注射。用快捷工具，对于抗hu或抗大鼠IgG来说使用10,000共振单位(RU)、对于蛋白-A来说使用3000(RU)和对于直接固定化试验蛋白来说使用50-100(RU)，来完成固定化。其余的活化基团用1.0M乙醇胺(pH 8.0)封闭。作为对照，第一流动池用作参考表面，以校正折射指数、矩阵效应和非特异性结合，第二、第三和第四流动池用捕获分子包被。
对于动力学分析来说，将含有IL-22R-Fc、IL-10R2-Fc、IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc受体复合物或IL-22BP-Fc蛋白的条件培养基，捕获到抗人IgG抗体或蛋白A表面上。通过注射60μl 400ng/ml溶液，将大鼠抗体捕获到抗大鼠IgG抗体表面上。当完成Fc融合蛋白注射，显示结合配体量时，基线和点间的净差值(net difference)约为90秒。按一式三份注射浓度为300nM、150nM、100nM、75nM、50nM、25nM、12.5nM、6.5nM和0nM的IL-22溶液，流速为30μl/分，达3分钟，结合材料的量是时间的函数，记录在传感器图(sensorgram)上。解离相在HBS/EP缓冲液中以同样流速监视10分钟，再注射5μl 0.1％TFA和5μl甘氨酸(pH 1.5)，以产生完全有活性的捕获表面。在22.5℃，在HBS/EP缓冲液中进行11个动力学实验。使用双重参比，将空白和缓冲液的影响从每个传感器图上减去。
动力学数据用BIA评价软件3.0.2，以1∶1模型，进行分析。从传感器图合适区，用综合分析，计算表观解离常数(kd)和缔合(ka)速率常数。用以下公式，根据动力学速率常数计算受体、抗体和IL-22间相互作用的亲和常数：KD＝kd/ka。
在BIAcore中用不同的大鼠抗体，测试大鼠抗体结合IL-22的亲和性：在BIAcore芯片上直接包被大鼠抗体或者通过抗大鼠IgG抗体，将大鼠抗体捕获到BIAcore芯片上。然后，将不同浓度的IL-22注入芯片中，再注入缓冲液。用BIA评价软件，对相互作用的亲和常数进行分析。从不同实验得到类似数据。
IL-22R-Fc、IL-10R2-Fc、IL-22R-Fc/IL10R2-Fc受体复合物和IL-22BP-Fc结合IL-22的亲和力，已经在BIAcore中用含有以上受体-Fc融合蛋白的条件培养基进行测试。受体-Fc融合蛋白被抗人IgG抗体捕获到BIAcore芯片上。然后，将不同浓度的IL-22注入芯片中，再注入缓冲液。用BIA评价软件，对相互作用的亲和常数进行分析。从不同实验得到类似数据。
  Ab-02   Ab-04   IL-22R-Fc   IL-22R-Fc/IL-10R2-Fc复合物   IL-22BP-Fc
  KD(nM)   68.1   1.51   41   1.48   3.37
*IL-10R2-Fc和IL-22间相互作用太弱，无法在BIAcore分析中检出。
杂交瘤细胞系的保藏
依据布达佩斯条约，将产生Ab-02和Ab-04的杂交瘤细胞系于2003年6月5日保藏于美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection，10801 University Boulevard，Manassas，Virginia，U.S.A.20110-2209)，作为原始保藏物，并分别给予ATCC保藏号PTA-5254和PTA-5255。对公众能得到该保藏材料的所有限制，将会在该专利授权时被不可撤销地注销，除非在37 C.F.R.§1.808(b)所规定的要求内，而且有关保藏的条款要符合37C.F.R.§1.806。
                        等同实施方案
本领域技术人员将会理解或者只要使用常规实验就能够确定本文所述发明具体实施方案的许多等同实施方案。所附权利要求书中包括所述等同实施方案。
                            序列表
<110>GENETICS INSTITUTE，LLC
     LI，JING
     TAN，XIANG-YANG
     TOMKINSON，KATHLEEN N.
     PITTMAN，DEBRA D.
     VELDMAN，GEERTRUIDA M.
     FOUSER，LYNETTE
<120>抗白介素-22抗体及其应用
<130>AM101524
<150>US 60/480,652
<151>2003-06-23
<160>10
<170>PatentIn Ver.3.1
<210>1
<211>1191
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
gaattcggcc aaagaggcct acaggttctc cttccccagt caccagttgc tcgagttaga 60
attgtctgca atggccgccc tgcagaaatc tgtgagctct ttccttatgg ggaccctggc 120
caccagctgc ctccttctct tggccctctt ggtacaggga ggagcagctg cgcccatcag 180
ctcccactgc aggcttgaca agtccaactt ccagcagccc tatatcacca accgcacctt 240
catgctggct aaggaggcta gcttggctga taacaacaca gacgttcgtc tcattgggga 300
gaaactgttc cacggagtca gtatgagtga gcgctgctat ctgatgaagc aggtgctgaa 360
cttcaccctt gaagaagtgc tgttccctca atctgatagg ttccagcctt atatgcagga 420
ggtggtgccc ttcctggcca ggctcagcaa caggctaagc acatgtcata ttgaaggtga 480
tgacctgcat atccagagga atgtgcaaaa gctgaaggac acagtgaaaa agcttggaga 540
gagtggagag atcaaagcaa ttggagaact ggatttgctg tttatgtctc tgagaaatgc 600
ctgcatttga ccagagcaaa gctgaaaaat gaataactaa ccccctttcc ctgctagaaa 660
taacaattag atgccccaaa gcgatttttt ttaaccaaaa ggaagatggg aagccaaact 720
ccatcatgat gggtggattc caaatgaacc cctgcgttag ttacaaagga aaccaatgcc 780
acttttgttt ataagaccag aaggtagact ttctaagcat agatatttat tgataacatt 840
tcattgtaac tggtgttcta tacacagaaa acaatttatt ttttaaataa ttgtcttttt 900
ccataaaaaa gattactttc cattccttta ggggaaaaaa cccctaaata gcttcatgtt 960
tccataatca gtactttata tttataaatg tatttattat tattataaga ctgcatttta 1020
tttatatcat tttattaata tggatttatt tatagaaaca tcattcgata ttgctacttg 1080
agtgtaaggc taatattgat atttatgaca ataattatag agctataaca tgtttatttg 1140
acctcaataa acacttggat atcctaaaaa aaaaaaaaaa aaagcggccg c          1191
<210)2
<211>179
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ala Ala Leu Gln Lys Ser Val Ser Ser Phe Leu Met Gly Thr Leu
  1               5                  10                  15
Ala Thr Ser Cys Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Val Gln Gly Gly Ala
             20                  25                  30
Ala Ala Pro Ile Ser Ser His Cys Arg Leu Asp Lys Ser Asn Phe Gln
         35                  40                  45
Gln Pro Tyr Ile Thr Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser
     50                  55                  60
Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe
 65                  70                  75                  80
His Gly Val Ser Met Ser Glu Arg Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu
                 85                  90                  95
Asn Phe Thr Leu Glu Glu Val Leu Phe Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln
            100                 105                 110
Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Ala Arg Leu Ser Asn Arg
        115                 120                 125
Leu Ser Thr Cys His Ile Glu Gly Asp Asp Leu His Ile Gln Arg Asn
    130                 135                 140
Val Gln Lys Leu Lys Asp Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu
145                 150                 155                 160
Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn
                165                 170                 175
Ala Cys Ile
<210>3
<211>1166
<212>DNA
<213>小家鼠(Mus musculus)
<400>3
gaattcggcc aaagaggcct acctaaacag gctctcctct cagttatcaa ctgttgacac 60
ttgtgcgatc tctgatggct gtcctgcaga aatctatgag tttttccctt atggggactt 120
tggccgccag ctgcctgctt ctcattgccc tgtgggccca ggaggcaaat gcgctgcccg 180
tcaacacccg gtgcaagctt gaggtgtcca acttccagca gccatacatc gtcaaccgca 240
cctttatgct ggccaaggag gccagccttg cagataacaa cacagatgtc cggctcatcg 300
gggagaaact gttccgagga gtcagtgcta aggatcagtg ctacctgatg aagcaggtgc 360
tcaacttcac cctggaagac gttctgctcc cccagtcaga caggttccag ccctacatgc 420
aggaggtggt gcctttcctg accaaactca gcaatcagct cagctcctgt cacatcagcg 480
gtgacgacca gaacatccag aagaatgtca gaaggctgaa ggagacagtg aaaaagcttg 540
gagagagtgg agagatcaag gcgattgggg aactggacct gctgtttatg tctctgagaa 600
atgcttgcgt ctgagcgaga agaagctaga aaacgaagaa ctgctccttc ctgccttcta 660
aaaagaacaa taagatccct gaatggactt ttttactaaa ggaaagtgag aagctaacgt 720
ccatcattat tagaagattt cacatgaaac ctggctcagt tgaaaaagaa aatagtgtca 780
agttgtccat gagaccagag gtagacttga taaccacaaa gattcattga caatatttta 840
ttgtcactga tgatacaaca gaaaaataat gtactttaaa aaattgtttg aaaggaggtt 900
acctctcatt cctttagaaa aaaagcttat gtaacttcat ttccataacc aatattttat 960
atatgtaagt ttatttatta taagtataca ttttatttat gtcagtttat taatatggat 1020
ttatttatag aaacattatc tgctattgat atttagtata aggcaaataa tatttatgac 1080
aataactatg gaaacaagat atcttaggct ttaataaaca catggatatc ataaaaaaaa 1140
aaaaaaaaaa aaaaaaaagc ggccgc                                      1166
<210>4
<211>180
<212>PRT
<213>小家鼠(Mus musculus)
<220>
<221>其他特征
<222>(180)..(180)
<223>其中Xaa为任何氨基酸
<400>4
Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu
  1               5                  10                  15
Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn
             20                  25                  30
Ala Leu Pro Val Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln
         35                  40                  45
Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser
     50                  55                  60
Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe
 65                  70                  75                  80
Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu
                 85                  90                  95
Asn Phe Thr Leu Glu Asp Val Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Gln
            100                 105                 110
Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln
        115                 120                 125
Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn
    130                 135                 140
Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu
145                 150                 155                 160
Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn
                165                 170                 175
Ala Cys Val Xaa
            180
<210>5
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于产生有义探针的寡核苷酸
<400>5
aggatggaga catctgactg ccctacg                                    27
<210>6
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于产生有义探针的寡核苷酸
<400>6
gactgataat acgactcact atagggcgaa caattttgac tccgatattg tccaag    56
<210>7
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于产生反义探针的寡核苷酸
<400>7
acaattttga ctccgatatt gtccaag                                    27
<210>8
<211>56
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：用于产生反义探针的寡核苷酸
<400>8
gactgataat acgactcact atagggcgaa ggatggagac atctgactgc cctacg    56
<210>9
<211>191
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：针对IL-22序列的探针
<400>9
cagccataca tcgtcaaccg cacctttatg ctggccaagg aggccagcct tgcagataac 60
aacacagatg tccggctcat cggggagaaa ctgttccgag gagtcagtgc taaggatcag 120
tgctacctga tgaagcaggt gctcaacttc accctggaag acgttctgct cccccagtca 180
gacaggttcc a                                                      191
<210>10
<211>49
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：氨基酸标记物
<400>10
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
  1               5                  10                  15
Ser Tyr Ile Tyr Ala Gly Ser Gly His His His His His His Gly Ser
             20                  25                  30
Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Pro Ile Ser Ser His Cys
         35                  40                  45
Arg

Claims (31)

1.一种与白介素-22(IL-22)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段降低IL-22与包含IL-22受体(IL-22R)和白介素-10受体2(IL-10R2)的复合物的结合。
2.一种与白介素-22(IL-22)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段降低IL-22与IL-22受体(IL-22R)的结合。
3.一种与白介素-22(IL-22)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段降低IL-22与白介素-10受体2(IL-10R2)的结合。
4.一种与白介素-22(IL-22)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段降低IL-22和IL-22受体(IL-22R)的复合物与白介素-10受体2(IL-10R2)的结合。
5.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与白介素-22(IL-22)特异性结合并且竞争性抑制第二抗体与所述IL-22的结合，其中所述第二抗体是选自PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生的单克隆抗体。
6.权利要求1-5中任一项的抗体或其片段，其亲和常数Kd为10E-9或更高亲和性。
7.权利要求1-5中任一项的抗体或其片段，所述抗体或其片段中和HEPG2中STAT的磷酸化或BaF3细胞的增殖，其ED50范围为约5nM至200pM或更强。
8.权利要求1-5中任一项的抗体或其片段，所述抗体或其片段与IL-22缔合的动力学范围为约10E4-10E6l/Ms且解离动力学范围为约10E-3-10E-6l/s。
9.权利要求1-5中任一项的抗体或其片段，其中所述IL-22包含与SEQ ID NO：2的氨基酸34-179有至少90％同一性的氨基酸序列，并且能够诱导Stat-3蛋白的磷酸化。
10.权利要求6的抗体或其片段，其中所述IL-22包含SEQ ID NO：2的氨基酸34-179。
11.权利要求1、3或4中任一项的抗体或其片段，其中所述IL-22、IL-22R和IL-10R2都来源于人。
12.权利要求2的抗体或其片段，其中所述IL-22和IL-22R都来源于人。
13.权利要求1-5中任一项的抗体或其片段，所述抗体是人源化抗体、互补决定区(CDR)移植抗体或人抗体。
14.由选自PTA-5254和PTA-5255的杂交瘤所产生的单克隆抗体。
15.一种药物组合物，所述组合物包含权利要求1-5中任一项的抗体或其片段。
16.权利要求15的药物组合物，所述组合物还包含选自以下的其它治疗药：细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂和细胞抑制剂。
17.权利要求16的药物组合物，其中所述治疗药选自肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-21R拮抗剂、T细胞消耗剂、B细胞消耗剂、甲氨蝶呤、来氟米特、西罗莫司即雷帕霉素或其类似物、Cox-2抑制剂、胞质磷脂酶2(cPLA2)抑制剂、非甾体抗炎药(NSAID)和p38抑制剂。
18.一种干扰IL-22和IL-22受体复合物或其亚基间相互作用的方法，所述方法包括在允许IL-22和IL-22受体复合物或其亚基间相互作用的条件下，使IL-22和IL-22受体复合物或其亚基接触，从而形成IL-22/IL-22受体混合物；并且使IL-22/IL-22受体混合物与权利要求1-5中任一项的抗体或其片段接触，从而干扰IL-22和IL-22受体复合物或其亚基之间的相互作用。
19.一种治疗或预防患者的IL-22相关疾病的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求1-5中任一项的抗体或其片段，其用量足以治疗或预防IL-22相关疾病。
20.权利要求19的方法，其中所述IL-22相关疾病选自自身免疫性疾病、呼吸性疾病和炎性疾病。
21.权利要求19的方法，其中所述IL-22相关的疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、多发性硬化、重症肌无力、节段性回肠炎、炎性肠病、狼疮、糖尿病、银屑病、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、心血管炎症、胰腺炎、肝炎和肾炎。
22.权利要求20的方法，其中所述自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。
23.权利要求19的方法，其中所述患者是哺乳动物。
24.权利要求23的方法，其中所述哺乳动物是人。
25.权利要求19的方法，所述方法还包括给予所述患者选自以下的其它治疗药：细胞因子抑制剂、生长因子抑制剂、免疫抑制剂、抗炎药、代谢抑制剂、酶抑制剂、细胞毒剂和细胞抑制剂。
26.权利要求25的方法，其中所述治疗药选自肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂、IL-12拮抗剂、IL-15拮抗剂、IL-17拮抗剂、IL-18拮抗剂、IL-21R拮抗剂、T细胞消耗剂、B细胞消耗剂、甲氨蝶呤、来氟米特、西罗莫司即雷帕霉素或其类似物、Cox-2抑制剂、胞质磷脂酶2(cPLA2)抑制剂、非甾体抗炎药(NSAID)和p38抑制剂。
27.一种降低患者的急性期反应的方法，所述方法包括给予所述患者权利要求1-5中任一项的抗IL-22抗体或其片段，其用量足以降低所述患者的急性期反应。
28.权利要求27的方法，其中所述患者是哺乳动物。
29.权利要求28的方法，其中所述哺乳动物是人。
30.权利要求1-5中任一项的抗体或其片段在制备用于治疗或预防患者的IL-22相关疾病的药物中的用途。
31.权利要求1-5中任一项的抗体或其片段在制备用于治疗或预防患者的急性期反应的药物中的用途。
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