CN1835792A - 含水两相体系的可注射水凝胶微球 - Google Patents

含水两相体系的可注射水凝胶微球 Download PDF

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Abstract

可注射水凝胶微球是通过形成乳液来制备，该乳液中水凝胶前体是粉散水相且聚合水凝胶前体。在一种优选情况中，该水凝胶前体是聚(乙二醇)二丙烯酸酯和N－异丙基丙烯酰胺，并且乳液的连续相是葡聚糖和葡聚糖溶解度降低剂的水溶液。微球应自水溶液装载蛋白质，例如细胞因子。

Description

含水两相体系的可注射水凝胶微球
本发明至少部分是由美国政府所支持的美国商业部最佳颁奖号为99-27-07400、按照与国家纺织品中心的子协议完成的。美国政府拥有本发明的部分权益。
交叉参考的有关文献
本申请请求享受2003年1月17日提交的美国临时专利申请No.60/440,646的优先权。
技术领域
本发明涉及一种可注射水凝胶微球及其形成方法，其可以从含水溶液负载水溶性蛋白质并且用于药物的控释，如水溶性蛋白质药物。
发明背景
给药***的一个最大挑战是蛋白质基药物的控释，因为所述蛋白质基药物在循环体系中半衰期短，渗透性低，蛋白水解作用快(低稳定性)且具有免疫原性。使用多单位剂型例如聚合物微球与单一单位剂型如片剂的给药相比会明显降低在患者中的吸收差异，并且在人体靶部位提供更有效的药物浓集。许多技术已经被建议用于制备给药的聚合物微球。最常用的已知技术包括溶剂蒸发或者多重乳液溶剂蒸发。这些技术依赖于有机溶剂，但有机溶剂可引起蛋白质基药物的生物活性降低并且一般有毒，因此需要全部除去。
患有口腔癌症的患者在最后40年的总存活率保持在约50％。细胞因子免疫疗法在动物模型和早期临床实验中已经被证实具有令人激励的结果。然而，当细胞因子被***性给药时，它们显示出可怕的毒性。虽然通过水凝胶的释放可以将促炎细胞因子局部缓释到肿瘤微观环境中，但带有细胞因子的已知水凝胶的负载必需从细胞因子的有机溶剂中装载，这导致细胞因子生物活性的显著丧失。
所以需要不必使用有机溶剂就可形成且负载水溶性蛋白质药物且不使药物失活的聚合物微球剂型。
发明内容
本发明已经发现了可以由水凝胶前体获得可溶于水并在其制备中不需要使用有机溶剂的可注射水凝胶微球，并且由此得到的水凝胶微球可从含水溶液中装载水溶性蛋白质，同时不使该蛋白质失活。
本发明的方法是用于形成从水溶液中装载蛋白质且不显著损失蛋白质活性的可注射水凝胶微球，得到用于活性蛋白质的缓释载体。
本发明的方法包括的步骤是：
a)形成含有水溶性水凝胶前体作为唯一水凝胶前体的水溶液，称之为第一水溶液，其中至少一种的该水凝胶前体在水凝胶生成中同时发挥交联剂和单体的功能，
b)将第一水溶液和第二水溶液混和，其中该第二水溶液含有溶于水的聚合物，该聚合物是这样的聚合物，该聚合物在第二水溶液中的浓度下与第二水溶液中存在的任意溶解度降低剂(solubilityreducer)一起，通过上述混和操作后生成与上述第一水溶液不混溶的水相，所述第二水溶液与第一水溶液以相对量混和，由此通过混合该第一和第二水溶液形成乳液，它应是一个连续相，
c)形成一种乳液，其中第二水溶液是连续相且第一水溶液是分散相，该分散相是由直径范围为25～60μm的球体组成，该直径通过激光衍射法测定，
d)聚合分散相的水凝胶前体，形成水凝胶微球，
e)收集水凝胶微球。
本发明的另一实施方式涉及可以由水溶液装载细胞因子的可注射水凝胶微球。水凝胶的可注射性的优点在于给药方便。
在此使用的术语″水凝胶″是指在水中具有溶胀能力且在其结构内保留大部分水分而不溶解的聚合物材料。
在此使用的″水凝胶前体″是指在水溶液中可聚合形成水凝胶的水溶性组合物。
在此使用的术语″微球″是指直径范围为1～200或300μm的球形颗粒，除非另外说明。
具体实施方式
在水凝胶形成中同时发挥交联剂和单体作用的水凝胶前体优选是聚(乙二醇二丙烯酸酯)(有时在此称作PEG-DA)，其中聚(乙二醇)的重均分子量为2,000～35,000。该PEG-DA优选由聚(乙二醇)二醇、通过其与丙烯酰氯的反应来制备，生成聚(乙二醇)的丙烯酸二酯，如Cruise，G.M.等在Biomaterials 19，1287-1294(1998)中所述。该聚(乙二醇)二醇起始原料可商购。
第一水溶液中优选包含的其他水凝胶前体为N-异丙基丙烯酰胺(有时称作NIPAAm)。该NIPAAm为所得水凝胶提供温度敏感性，由此所得的水凝胶当超过其最低临界共溶温度时失去水分和任何溶解在其中的蛋白质。术语″最低临界共溶温度″(有时在此称作″LCST″)是通过水凝胶微球的热分析图测定的吸热峰并且当大于该温度时，所述水凝胶被破坏且水凝胶的体积急剧缩小。所述由NIPAAm和PEG-DA得到的水凝胶具有约29℃的LCST。在此使用的术语″温度敏感性″是指引起收缩且失水的温度变化。
对于含有NIPAAm和PEG-DA的第一水溶液来说，NIPAAm在第一水溶液中的浓度为，例如，5～25％(wt/vol％)，并且PEG-DA在第一水溶液中的浓度为，例如，2～50％(wt/vol％)。
第二水溶液中的聚合物是可溶于水的，并且如上所述是一种这样的聚合物，该聚合物在第二水溶液中的浓度下与第二水溶液中存在的任意溶解度降低剂一起，通过混和步骤(b)形成一种与所述第一水溶液不混溶的水相。水溶性多糖优选是该第二水溶液的聚合物。特别优选重均分子量为约40,000-80,000的葡聚糖。其他水溶性多糖，例如壳聚糖、淀粉、墨角藻聚糖(algal fucoidan)、纤维素、果胶、肝素、腰果树胶和糖原可以代替葡聚糖。除了多糖以外，用于第二水溶液的其他聚合物例如是聚电解质(polyelectrolyes)，例如聚乙烯亚胺(polyethyenimine)或聚丙烯酸；聚(乙烯基吡咯烷酮)；环氧乙烷和环氧丙烷的共聚物；和酪蛋白酸钠和藻酸钠的混合物。
当用葡聚糖作为第二水溶液的聚合物时，可以将化合物加入到第二水溶液中降低葡聚糖在水中的溶解度，由此促进在步骤(b)的混和后由于聚合物-聚合物的不溶解性形成两相含水体系，即由葡聚糖″盐析″PEG-DA和NIPAAm，并促进两个水相之间的不混溶性且无需乳化剂或稳定剂。此目的的优选化合物为MgSO4。其他盐例如KCl和磷酸镁可以代替MgSO4。
对于第二水溶液中的葡聚糖和MgSO4，葡聚糖在该溶液中的浓度可以为，例如，10～50％(wt/vol％)并且MgSO4的浓度可以为，例如，10～60％wt/vol％)。
步骤(b)中，所述第一和第二水溶液以相对量混和，从而在步骤(c)中乳液形成时该第二水溶液构成所述连续相且第一水溶液构成分散相。
乳液的形成是步骤(c)，它可以通过剧烈混和例如15分钟～2小时来完成，由此生成一个两相水包水乳液并且在不进行搅拌后10分钟～1小时达到稳定。该分散相是由第一水溶液的微球组成，该微球的直径由激光衍射法测定为25～60μm。如上所述，不一定需要存在乳化剂；优选不存在乳化剂。
步骤(d)的聚合易于通过向生成的乳液加入引发剂来完成。对于PEG-DA和NIPAAm的聚合和交联来说，优选过硫酸铵、N，N，N′，N′-四甲基亚乙基二胺的引发剂体系。其他引发剂体系包括，例如，过二硫酸铵和亚硫酸氢钠(Sodium busulfite)，过硫酸钾和亚硫酸氢钠，过(二)亚硫酸铵和抗坏血酸，过硫酸钾和抗坏血酸以及过氧化氢和Fe2+的体系。聚合和交联反应在15～45℃下进行15分钟～24小时。
步骤(e)的收集可以通过倾析所述连续相来进行，并且通过与蒸馏水多次离心进行纯化。
所收集水凝胶微球的干燥适宜以保持该微球的形状且维持其彼此分开的方式进行。例如，这可以通过将含有水溶胀微球的水溶液置于玻片上来完成，用湿滤纸除去多余的水，并且在空气中干燥例如15～30小时或通过冷冻干燥。
通过扫描电子显微镜测定，冷冻干燥的微球的直径为10～35μm。
水溶性蛋白质如细胞因子如白细胞介素-2的装载是通过例如将干燥的水凝胶微球浸渍在负载有可溶性蛋白质的磷酸盐缓冲溶液内，进行1～4天。
下面说明本发明的可注射微球的实施方式，所述可注射微球可以从水溶液装载细胞因子。所述可注射微球优选是通过聚(乙二醇)二丙烯酸酯(其中聚乙二醇具有2,000～35.000的重均分子量)和N-异丙基丙烯酰胺的聚合而制备且装载上述细胞因子的水凝胶微球。
可注射水凝胶具有一种温度敏感性释放模式，即升高温度导致收缩和失水。
本文的重均分子量是通过凝胶渗透色谱法、相对于加压分散的(manodispersed)聚苯乙烯标准品进行测定。
本发明得到那些上述标题为含水两相体系中合成PNIPAAm/PEG-DA水凝胶微球的实验、结果和结论的支持，其是美国临时专利申请No.60/440,646的一部分，在此引用美国临时专利申请No.60/440,646的全文作为参考。
本发明通过下列工作实施例进行说明。
实施例I
聚(乙二醇)(重均分子量为3600)二丙烯酸酯(PEG-DA)通过Cruise，G.M.等Biomaterials 19，1287-1294(1998)中所述的方法制备。
将PEG-DA(0.35g)和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm，0.75g)溶解在蒸馏水(5.0ml)中形成一种水溶液。此后将葡聚糖(重均分子量为43,000，3.0g)和无水硫酸镁(MgSO4，3.0g)溶解在蒸馏水(10ml)中生成第二水溶液。在800rpm的搅拌速度下剧烈混和上述两种水溶液30分钟。实施相分离并使所得的水包水乳液体系稳定20分钟。随后，加入过硫酸铵(150μl，5.0wt％水溶液)和N，N，N′，N′-四甲基亚乙基二胺(100μl)引发聚合/交联反应。该反应在22℃下无搅拌进行30分钟以聚合NIPAAm和PEG-DA中的丙烯酰基部分。最后，收集得到的水凝胶微球并通过与蒸馏水多次离心进行纯化。通过在空气中按照上述方法进行干燥。
为了测定该水凝胶微球的控释功能，选择牛血清白蛋白(BSA)作为模型高分子量蛋白质药物。
将干燥的水凝胶微球在负载BSA(8.0g BSA和25ml磷酸盐缓冲盐)磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)中于22℃下浸渍2天，由此BSA经平衡分配运载到该水凝胶微球中。溶胀的负载BSA水凝胶微球随后用于后续的BSA释放研究。BSA自该水凝胶微球的释放试验是在pH 7.4磷酸盐缓冲盐(PBS)中于低于(22℃)或高于(37℃)其LCST的温度下进行。释放情况是通过UV光谱在277μm处测定吸光度。22℃下，约60％的BSA在12小时内从水凝胶微球释放出来，而水凝胶微球在37℃下释放40％BSA，证实药物释放是通过改变环境温度来控制的。实验证明了缓释，因为全部的BSA不是在第一个24小时内释放出来。结果的外推表明，BSA的释放是在约1周或更长时间内进行。
实施例II
聚(乙二醇)二丙烯酸酯(PEG-DA)是用重均分子量8,000的聚(乙二醇)二醇、通过Cruise，G.M.等Biomaterials 19，1287-1294(1998)中所述方法制备。简而言之，将25g聚(乙二醇)二醇(8,000)即PEG二醇溶解在50ml的无水苯中，生成一种溶液，即PEG溶液。将三乙胺(基于PEG二醇端基计过量四倍摩尔)室温下加入到PEG溶液内且随后将丙烯酰氯(基于PEG二醇端基计过量四倍摩尔)滴加到所述的PEG溶液内生成PEG的丙烯酸二酯。将该混合物在35℃和干燥N2下搅拌过夜。过滤出反应过程中生成的不溶性三乙胺盐且通过加入1.0L的冷***(4℃)沉淀出PEG二丙烯酸酯(PEG-DA)产物。收集沉淀的PEG-DA且通过在无水苯/冷***中重结晶2次来纯化。收集纯化的PEG-DA且在40℃真空下干燥过夜。
将PEG-DA(8,000，0.35g)和N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm，0.75g)溶解在5.0mL蒸馏水中生成一个水相。由于二丙烯酸酯基的存在，PEG-DA在随后的聚合/交联反应中充当交联剂和前体。随后，葡聚糖(重均分子量66,000，3.0g)和无水MgSO4(3.0g)溶解在10mL蒸馏水中生成另一水相。在此，无水MgSO4用于从葡聚糖盐析出PEG-DA和NIPAAm(即，提高两种水体系之间的不混溶性：葡聚糖和NIPAAm/PEG-DA)，从而便于上述两种不混溶水相的形成。这两个水溶液在800rpm的搅拌速度下剧烈混和60分钟。实施相分离且使所得水包水乳液体系稳定30分钟。此后，加入0.5mL过硫酸铵溶液(50mg/mL)和0.1mL N，N，N′，N′-四亚甲基二胺。
无需搅拌，将该化合物在室温下放置12小时以便NIPAAm和PEG-DA相中丙烯酰基部分聚合/交联。所得交联的PNIPAAm/PEG-DA微球通过多次离心和蒸馏水洗涤步骤进行纯化。溶胀微球在水中的混悬液在10wt％的浓度和室温下时为半透明状。
浓缩平衡的溶胀微球经Vertis Freeze Drier(Gardiner，NY)在真空-42℃下干燥至少3天直至全部水分升华。
得自前体的冻干微球的收率约为54％。
溶胀水凝胶微球的大小通过激光衍射法按照下列方式测定：使冻干的微球悬浮在HPLC级水(5％vol)中，此后进行超声得到均匀混悬液，随后利用粒度分析仪(Particle Size Analyzer 2010，BrinkmanInstruments，Inc.，NY，USA)测定粒度，其功能利用了激光衍射。测定出约60％的溶胀微球的直径达到约50μm。
利用扫描电子显微镜(Hitachi S4500 SEM，Mountain View，CA，USA)测试冻干的水凝胶微球。在SEM观测之前，将该微球固定在铝短柱上并用金涂层。SEM图像显示直径大小约为25μm。
通过粒度分析仪和SEM测量法测定的直径之间的大小偏差值归因于一种情况下测定流体动力学直径而另一情况中测定非流体动力学直径之间的差异。发现不可能利用SEM来观察天然溶胀状态中的水凝胶微球，因为SEM观测法需要高真空。环境扫描电子显微镜(ESEM，Phillips ElectroScan 220)的采用和通过将一滴微球混悬液滴注到显微镜短柱上制备样本用于直接在室温下观测，证实水合的微球直径大小为约25μm，它与通过SEM观测法得到的冻干颗粒的大小一致。
该水凝胶的LCST行为是利用差示扫描量热法(DSC)(TA 2920Modulated DSC，TA Instruments，Inc，DE，USA)测试。各样本被浸渍在室温下的蒸馏水中，在DSC测量之前达到平衡状态。把约10mg平衡溶胀样本置于密封铝盘内侧，随后将其用气密性铝盖紧紧密封。对溶胀微球样本的热分析是在15～55℃下、于3℃/min的加热速度和干燥氮气(40mL/min)下进行。观测到LCST为约29.1℃。LCST的存在证实该水凝胶微球是温度敏感性的，即，升高温度会导致收缩和失水。
室温(22℃)下的平衡溶胀比按照下列方法测定：
将预定量的冻干微球样本置于圆柱形塑料管(45ml)且关闭该管的盖子，测定重量。将水(约30ml)加入到该管内且使该微球在室温下溶胀12小时并连续振摇。将溶胀的水凝胶微球离心并浓缩。用移液管小心除去上层透明液体后，将收集的微球快速称重并置于塑料管内。此后，将相同体积的清水在振摇下加入到浓缩的微球。该管在室温下保温8小时且随后将溶胀的水凝胶微球离心并再次浓缩。重复数次这样的溶胀-离心-称重过程直至微球的重量达到恒定，这意味着水凝胶微球在该溶剂中达到平衡溶胀状态。由各样本的三个平衡溶胀取平均值，并且如下计算溶胀比，
                 溶胀比＝(Ws-Wd)/Wd
其中Ws是溶胀水凝胶微球的重量且Wd是干燥微球的重量。测定的溶胀比是20±4。
引入下面的模型药物。溶胀比涉及浸渍药物的释放速率和量。溶胀比越大，药物释放的速率越快且释放度越高，这是正常状况。在此测定的溶胀比显示出该水凝胶微球的缓释效用。
选择牛血清白蛋白(BSA)作为浸渍到水凝胶微球内的模型蛋白质药物。
一种预载方法用来在配制水凝胶微球之前混合BSA。将固定量的BSA(3.0wt.％的聚合物前体)加入到所述前体溶液(即PNIPAAm/PEG-DA水相)中。这种负载BSA的PNIPAAm/PEG-DA溶液此后被加入到葡聚糖/MgSO4溶液内用于制备水凝胶微球。聚合和交联后，负载BSA的PNIPAAm/PEG-DA水凝胶微球在5小时内快速通过离心和用蒸馏水洗涤来纯化。
随后将负载药物的水凝胶微球(10mg)置于含有1.5mL磷酸盐缓冲溶液(PBS)(0.1M，pH 7.4)的2.0mL瓶子中。将该瓶置于设定在预订温度(室温，即22℃，或37℃)的恒温箱中。在预订浸渍期间，该瓶子在10,000rpm下离心5分钟且除去1.0mL的上清液并用新PBS更换。上清液中的BSA含量是通过Perkin Elmer Lambda2UV/VIS光度计(Norwalk，Connecticut)在277nm下测定，并且释放的BSA的浓度是由BSA标准校准曲线来计算。所以释放研究一式两份进行。结果用累积释放表示，根据下列方程它是时间的函数：
累积释放度(％)＝(Mt/Mo)×100
其中Mt是时间t时自水凝胶微球释放的BSA的量，并且Mo是水凝胶微球中负载的BSA的起始量。
测定22℃(低于LCST)和37℃(高于LCST)下自水凝胶微球释放的BSA随时间的累积释放度。不论温度如何，该水凝胶具有双相调控，特征在于相对较快的起始释放阶段，随后是较慢的释放阶段。BSA在37℃下的释放速度和程度比22℃下的缓慢和低。例如，在第一个8小时内，释放的累积BSA在22℃下约为21％和在37℃下约为13％。22天研究过程中累积BSA释放度在22℃下为60％且在37℃下为52％。不希望受到推理的限制，推定在37℃下释放较少归因于大于LCST时在溶蚀的基质中包埋BSA。
实验证实释放速度存在差异，因为外部温度不同。
变化方案
对于所属领域技术人员来说变化方案是显而易见的。所以，本发明的范围由下列权利要求书限定。

Claims (9)

1.一种由水溶液装载蛋白质形成水凝胶微球的方法，包括步骤：
a)形成水溶性的水凝胶前体的水溶液，称之为第一水溶液，其中至少一种的水凝胶前体在水凝胶生成中同时发挥作为交联剂和单体的功能，
b)将第一水溶液和第二水溶液混和，其中该第二水溶液含有溶解在水中的聚合物，其中该聚合物是这样的聚合物，其在第二水溶液中的浓度下与第二水溶液中存在的任意溶解度降低剂一起，通过上述混和生成与上述第一水溶液不混溶的水相，所述第二水溶液与第一水溶液以相对量混和，由此通过混合第一和第二水溶液形成乳液，成为一个连续相，
c)形成一种乳液，其中第二水溶液是连续相且第一水溶液是分散相，该分散相是由直径范围为25～60μm的球体组成，该直径通过激光衍射法测定，
d)聚合分散相的水凝胶前体，形成水凝胶微球，
e)收集水凝胶微球。
2.权利要求1的方法，其中第一水溶液的第一水凝胶前体在水凝胶形成中同时充当单体和交联剂，它是聚(乙二醇)二丙烯酸酯，其中该聚(乙二醇)具有2,000～35,000的重均分子量。
3.权利要求2的方法，其中第一水溶液的第二水凝胶前体是一种这样的前体，当超过临界共溶温度时其使所得水凝胶失去水分。
4.权利要求3的方法，其中第二水凝胶前体是N-异丙基丙烯酰胺。
5.权利要求4的方法，其中第二水溶液的聚合物是水溶性多糖。
6.权利要求5的方法，其中第二水溶液的聚合物是重均分子量为40,000～80,000的葡聚糖。
7.权利要求6的方法，其中第二水溶液含有降低葡聚糖在水中的溶解度的组分，使在步骤(b)的混和后可以形成两相水体系。
8.一种可以由水溶液装载细胞因子的可注射微球。
9.权利要求8的可注射微球，它是通过聚乙二醇二丙烯酸酯与N-异丙基丙烯酰胺聚合形成的水凝胶，其中该聚乙二醇具有2,000～35,000的重均分子量。
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