CN1804593A - 单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法 - Google Patents

Abstract

一种单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，对手术切除组织的单细胞拉曼光谱检测方法，以光谱手段实现对癌症的医学病理检测的功能。本发明包括：人体病灶部位单细胞样品的制备和生物活性维持；在接近人体生理环境下对单个活细胞拉曼光谱的测量；判断细胞为癌症或正常的单细胞拉曼光谱诊断识别模型；单细胞拉曼光谱诊断识别模型的临床应用程序。本发明具有检测迅速和判断客观的优点，并且实施对象(即上皮细胞)在测量过程中处于存活状态、所处测量环境接近人体自然生理环境，能够正确反映其尚在人体内时的性质，并将检测目标局限于癌变起始部位(即上皮粘膜)。本发明可为医生判断上皮细胞癌变提供诊断依据，可用于多种癌症。

Description

单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法

技术领域

本发明是关于单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，可用于对上皮细胞癌变的诊断，包括结直肠癌、膀胱癌、食道癌、皮肤癌、口腔癌等多种癌症。

背景技术

目前医学病理检测(pathology)是对癌症确诊的标准方法，其操作流程是将手术切除的病灶部位新鲜组织以***固定并用石蜡包埋，制作成切片经染色后，由经过多年培训的病理专家在显微镜下观察，根据经验得出结论。通常，***固定需时3-6小时，切片制作和染色需时24小时，所以在到达病理分析这一阶段所费时间已经就很长。更进一步的是，对切片观测所得病理结论是病理专家基于经验的主观判断，存在一定随意性。对同一切片，不同病理专家可能会得出相反结论。例如文献显示，对同一基底细胞癌病例，单一病理专家得出的结论与大量同行得出的共同结论，两者的吻合几率仅为65％。因此，如果一种新的检测方法能够为医生提供迅速和客观的诊断信息，将大大提高病理诊断的速度和准确性。

拉曼散射是激发光波长与待测分子的振动交换能量产生的效应，带有分子的特征指纹，使得拉曼光谱成为标识分子、探测分子结构的标准技术之一。在人体组织和细胞的病变过程中，生物大分子(如蛋白质)的变化将引起其拉曼光谱的改变，使得运用拉曼光谱探测组织病变成为可能。

拉曼散射虽然在上世纪20年代就已被发现，但只是在最近10年由于实验技术的进步才被广泛应用于对疾病的检测。其中，首先是激光技术的发展解决了拉曼散射激发光源的问题，其次上世纪90年代初冷却CCD技术的完善使得拉曼信号探测***实现了小型化，提高了探测灵敏度。现在，拉曼光谱对癌症的诊断在临床研究中已得到了广泛的应用。

先技术[1]在利用拉曼光谱技术诊断基底细胞癌的研究中(Gniadecka M.et al.Journal of Raman Spectroscopy 28，125-129(1997))，使用了近红外傅立叶变换拉曼光谱技术检测最常见的皮肤癌—基底细胞癌(Basal Cell Carcinoma，BCC)的分子变化。他们的具体实验过程如下：样品包括16个来自经组织病理学确诊的基底细胞癌病人的皮肤切片和16个用于对照的正常皮肤切片。所有样品保存在4℃的潮湿环境里，不经任何预处理，在样品收集后的30分钟内进行拉曼光谱测量。拉曼光谱测量在带有FRA 106拉曼模块的Bruker IFS 66光学***上进行。激发光源是一个Nd:YAG激光器，波长是1064nm，功率是300mW。样品放置在一个不锈钢的杯子里，聚焦到样品上的激光光斑直径大约是100μm。对每个样品须将250次的扫描结果累加起来，整个光谱记录时间是10分钟。测量得到的光谱经强度校正后用人工神经网络分析可以区分正常皮肤和基底细胞癌。

在先技术[2]中，文献Haka AS et al.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America 102，12371-12376(2005)是该课题组运用拉曼光谱技术诊断乳腺癌的系列临床研究的最新结果。在这一工作中，样品来源为58例病人在作活组织切片检查过程中经手术取得的乳腺组织。样品处理是将乳腺组织切除后立刻在液氮中冷冻储存，待进行光谱检测时再将乳腺组织从液氮中取出、置实验台上于室温中自然融化，在组织表面加磷酸盐缓冲生理盐水(Phosphate Buffered Saline，PBS)溶液保持湿润。拉曼探测***由Ti:Sapphire激光光源、共聚焦显微***和CCD光谱仪组成，聚焦后激发光的光斑直径约为100μm，但由于组织对光的散射现象，焦点在组织中扩散，所以实际的激发区域扩大为约1mm³。使用的激光功率为100mw至150mw，文章声明在这样的功率下没有观测到组织的辐射损伤。实验共测得58个病例130条拉曼光谱，在光谱分析中使用了9种物质组份的拉曼光谱的线性叠加来对乳腺组织的拉曼光谱进行拟合，得到各组分的浓度系数。这9种物质分别是二水草酸钙(Calcium Oxalate Dihydrate)、氢氧基磷酸钙(Calcium Hydroxyapatitte)、β-Carotene、脂肪、胶原蛋白(Collagen)、细胞核、细胞质、胆固醇状脂类沉积物(Cholesterol-like lipid deposits)和水分。在诊断算法部分，文章声称仅使用脂肪和胶原蛋白的浓度系数便可诊断区分正常组织、纤维囊性变化(fibrocystic change)、纤维腺瘤(fibroadenoma)和***(invasive carcinoma)，达到94％灵敏度和96％特定度。然而目前这一工作在学术界引起质疑，例如，脂肪和胶原蛋白并不是乳腺癌活组织切片病理检查中的主要检测目标，病理检测更侧重于从组织形态、细胞排列、细胞性状等方面作判断，因此基于细胞核和细胞质浓度系数的光谱诊断算法应是更可信的。

上述已有光谱技术对癌症的诊断方法存在如下缺陷：

(1)样品的处理过程(如液氮冷冻或4℃环境下保存)改变了组织的成分和结构；

(2)组织样品丧失了生物活性，其光谱与组织在人体内部处于存活状态下时有异；

(3)均是组织水平的探测，激发区域体积均在mm³量级，获得的拉曼信号是多细胞和细胞间质的总和，干扰源较多。由于85％癌症起源于上皮细胞变异，因此上皮细胞应是主要检测目标，而皮下组织中血细胞是强烈拉曼信号源，组织水平的探测技术很难避免干扰。

发明内容

本发明的目的是针对目前癌症拉曼光谱诊断中存在的缺点和问题，提供一种单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，它是对手术切除组织作单细胞处理，并以单细胞拉曼光谱检测手段实现对上皮细胞的癌症病理识别。在测量过程中维持上皮细胞处于存活状态、所处测量环境接近人体自然生理环境，能够正确反映其尚在人体内时的性质；利用激光俘获单个细胞而实现的单细胞水平检测又将检测目标局限于癌变起始部位(即上皮粘膜)，克服了组织水平检测所包含的细胞间质、血细胞和深层组织细胞等的干扰，是激发区域在μm³量级的一种定位测量技术，具有干扰小、研究对象孤立、可控性好、目标选择性高等优点。对细胞癌或非癌的拉曼光谱判断识别结论可为医生对病人的诊断提供快速、客观的评价标准。

本发明技术解决方案如下：

一种单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，包括四个内容：

(1)人体病灶部位单细胞样品的制备和生物活性维持将病人病灶部位切除组织和病灶附近正常部位少量切除组织作细胞分离后进行原代培养并制备单细胞样品，获得反常对照组和正常对照组。

(2)在接近人体生理环境下对单个活细胞拉曼光谱的测量利用激光俘获显微拉曼光谱仪挑选和俘获样品培养液中具有生物活性的单个上皮细胞，并利用光势阱的囚禁作用将细胞转移至显微镜视野中一个相对孤立的区域。后者的目的是为了净化上皮细胞的测量环境，防止测量过程中培养液里其它物质(如另一个上皮细胞，或红细胞，或其它组织残留物)对俘获细胞的可能粘接。光势阱的激光能量本身将激发被俘获细胞的拉曼光谱，由拉曼光谱仪记录测量。对正常对照和反常对照各挑选20个细胞进行测量。

(3)区别癌症细胞与正常细胞的单细胞拉曼光谱诊断识别模型对细胞性质进行识别必须由一个模型实现，而这一模型是通过定标过程来建立的。在定标时，考虑到不同病人间存在一些个体差异，为保证统计性，需采集足够确诊病例的拉曼光谱，建立定标光谱数据库。在此基础上，使用主元素分析方法和逻辑回归算法，建立由光谱参数构成的诊断方程，给出对数据库中癌症细胞光谱与正常细胞光谱的最佳模式区分，而其中实现光谱模式识别的阈值条件则称为诊断条件。

(4)诊断识别模型在临床诊断中的应用程序对未确诊病人的手术切除组织按照步骤(1)制备成单细胞样品并按步骤(2)测量光谱，将光谱带入步骤(3)的诊断识别模型，根据诊断条件来对未知细胞进行癌与非癌的模式归类，从而实现对细胞的光谱诊断。

本发明可用于对上皮细胞癌变的诊断，包括结直肠癌、膀胱癌、食道癌、皮肤癌、口腔癌等多种癌症。

附图说明

图1是本发明测得的结直肠上皮细胞的平均光谱<r( v)>。(见方程(3))

图2是本发明方程(5)用于计算参数a₂所需要的第二主元素光谱P₂( v)。

图3是本发明方程(5)用于计算参数a₃所需要的第三主元素光谱P₃( v)。

图4是本发明方程(5)用于计算参数a₄所需要的第四主元素光谱P₄( v)。

图5是本发明对实施例1拉曼光谱诊断的结果。由(a₂，a₃，a₄)给出的点集本是三维图，但平面显示难以展示点集分布特征，所以图中将坐标空间作了旋转，将a₂和a₃组合为横轴，则诊断面投影为一条直线。沿诊断面看去，左上方为p＜0.5区域，是正常细胞区域；直线的右下方为p＞0.5区域，是癌症细胞区域。

图6是本发明对实施例2拉曼光谱诊断的结果。

图7是本发明对实施例3拉曼光谱诊断的结果。

具体实施方式

本发明所使用病例都事先得到了病人的知情同意。本发明的具体技术细节按照对结直肠癌的实施阐述如下：

(一)单细胞样品的制备和生物活性维持

本发明可与医院现行常规医学病理检测共享样品来源。通常，结直肠肿瘤手术除切除肿瘤组织外，还在病灶部位附近切除少量正常粘膜组织，后者用作医学病理检测中的正常对照。

本发明样品处理步骤如下：在结直肠肿瘤患者手术后，无菌条件下立即从手术切除的新鲜肿瘤组织和正常粘膜组织中各切取约0.5cm³，后者取自距肿瘤10cm以上部位的粘膜。将所取组织置于含青霉素300U/ml、链霉素300μg/ml的D-Hanks平衡盐溶液中20分钟，然后将之剪成小于1mm³的碎块放入预热至37℃的0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA)溶液中，由胰蛋白酶对组织碎片作用消化30分钟，其间操作员不时用吸管在溶液中以反复吸挤溶液的机械方式来产生液流冲击吹打组织。消化之后取上清液离心(800转/分)，将沉淀用D-Hanks平衡盐溶液洗涤一遍，然后以8ml含10％小牛血清和青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml的RPMI 1640培养液悬浮沉淀，制成单细胞悬液。所用试剂均购自Invitrogen公司。单细胞样品制备可在1小时内完成。

(二)在接近人体生理环境下对单个活细胞拉曼光谱的测量

光谱测量由我们仿制的激光俘获显微拉曼光谱仪(Xie CG，Dinno MA，Li YQ，Optics Letters 27，249-251(2002))实现。该光谱仪使用恒温恒电流控制下的半导体激光作为光源，中心波长为782nm，光路中使用了780-790nm的窄带滤波器来提高光源的单色性能。该光源同时用作激光光镊控制光源和拉曼光谱激发光源，由光路***输入尼康EclipseTE2000-U微分干涉相衬(DIC)显微镜，经双色镜和100X油浸物镜共轴聚焦于样品溶液中，在焦点附近形成激光光镊(即光势阱)，俘获待测细胞并激发拉曼散射，光镊处激光功率约为11.5mw。而油浸物镜同时又用作收集物镜，收集散射信号沿轴向反向输出显微镜，经Super-NotchFilter(Kaiser，Inc.)滤去激发波长信号，剩余的拉曼信号再经过光路***输入光栅光谱仪(Acton SpectraPro 2300i)和CCD(RoperScientific SPEC-10：100BR/LN)进行光谱测量。与光谱测量***相互独立，显微镜的成像***为物镜视场中激光光镊对细胞的挑选、俘获和操控提供了实时观测功能。

实验过程中，将上述(一)中制备的单细胞培养液移入显微镜载物台上的样品池中。在显微镜成像***的视场内，可以观测到溶液内通常悬浮几类细胞：单一上皮细胞、未分离的上皮细胞团、红细胞和少量细菌。在测量过程中挑选圆润的、微转动的、体型大的、有相衬度的单一上皮细胞作探测对象，这几个要求保证了所选细胞处于存活状态，具有生物活性，而其中最后一个要求使用了DIC显微镜的相衬功能来排除非常透明的细胞。

信号探测分为三步：第一，将待测细胞在光镊焦点处囚禁并抬升至溶液中同一高度(高于焦点20μm)；第二，以11.5mw激发功率和60s积分时间采集细胞的拉曼光谱s( v)， v为波数；第三，将细胞从光镊处释放，再以相同激发功率和积分时间采集背景光谱B( v)。最终细胞实际的拉曼光谱R( v)可以表达为：

R( v)＝[S( v)-B( v)]/Q( v)                            (1)

其中Q( v)为拉曼***响应曲线。

(三)区别癌症细胞与正常细胞的单细胞拉曼光谱诊断识别模型

诊断识别模型是本发明的核心之一，它的建立过程称为定标。下面阐述定标过程的技术细节。

本发明的定标使用了确诊为癌症的病例的拉曼光谱来确立光谱分析所需的基矢光谱和诊断参数方程。这里“确诊病例”定义为通过对新鲜组织作切片进行组织病理分析，由两名或两名以上富有经验的病理分析专家相互独立工作得到共同结论的病例，而得到不同结论的病例则被摒弃。通常定标过程中所使用的光谱数量越多，诊断识别模型统计性越好，判断越准确。本发明使用了8个确诊为癌症的病例，每个病例从反常对照中挑选20个癌症细胞，从正常对照中挑选20个正常细胞(两类拉曼光谱总共各160个)，组成了定标光谱集。

本发明光谱诊断识别模型的建立采用主元素分析法(PrincipalComponent Analysis)和逻辑回归(Logistic regression)分析法。两者都是数据挖掘理论(Data Mining)中的标准方法。

建立诊断模型的第一步是对光谱的归一化。因为光谱中的诊断信息主要是包含在谱线形状即各谱峰的相对强度上，而谱线的绝对强度与激发能量成正比，受激光功率涨落影响。光谱归一方法有几种选择，例如将谱线按积分归一，但更常用的是将谱线作矢量归一，因为这有利于主元素分析的几何解释。具体操作是

$r\left(\stackrel{\&OverBar;}{v}\right)=R\left(\stackrel{\&OverBar;}{v}\right)/\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{R}^2\left({\stackrel{\&OverBar;}{v}}_i\right)---\left(2\right)$

这里，由于测得的光谱R( v)实际上是CCD各像素点的光子计数，由一系列分离值组成，而波数 v也是由像素点换算得到的分离值(N为波数总数目)，因此方程(2)将光谱映射到N维空间中单位球面上的一个点。

这里给出主元素分析在我们光谱分析中的几何解释。任何一条由离散值(如CCD像素点的光子计数)代表的光谱均可一一映射到高维空间中的一个点，空间维数为离散值总数，坐标取每一像素的数值。然而这些维度之间是相关的。例如，设想待测样品中含有一种化学组分，其在v₃₀₀、 v₅₆₀和 v₇₂₀处有拉曼峰，相对强度分别为α、β和γ，那么在高维空间中的第300、560和720维就存在关联，表现为当这种组分含量改变时，光谱对应的高维空间点沿着直线 $\mathrm{\&alpha;}{\hat{x}}_{300}+\mathrm{\&beta;}{\hat{x}}_{560}+\mathrm{\&gamma;}{\hat{x}}_{720}$ 移动，其中

和

分别是这三个维度坐标的单位向量。很明显，点集在这三个维度的变化实际上是一维变化而不是三维变化，适当选择坐标变换便可只用一个变量描述。主元素分析就是对归一后的定标光谱集在N维空间单位球面上的点分布做维度降阶的方法。

建立模型的第二步是计算构成定标集的320条归一光谱的平均光谱，即

$\&lang;r\left(\stackrel{\&OverBar;}{v}\right)\&rang;=\frac{1}{320}\underset{m=1}{\overset{320}{\mathrm{\&Sigma;}}}{r}_m\left(\stackrel{\&OverBar;}{v}\right)---\left(3\right)$

为阐述清晰，我们用下标m标记不同的光谱，而用下标i和j标记波数。

建立模型的第三步是使用主元素分析的标准算法，确立描述定标光谱主要变化特征的主元素光谱(Principal Components)。首先，计算定标光谱归一后(方程(2))各波数间的协方差矩阵，即

${\mathrm{\&sigma;}}_{\mathrm{ij}}=\underset{m=1}{\overset{320}{\mathrm{\&Sigma;}}}\frac{1}{320-1}[r_m\left({\stackrel{\&OverBar;}{v}}_i\right)-\&lang;r\left({\stackrel{\&OverBar;}{v}}_i\right)\&rang;]\&CenterDot;[r_m\left({\stackrel{\&OverBar;}{v}}_j\right)-\&lang;r\left({\stackrel{\&OverBar;}{v}}_j\right)\&rang;],$ 1≤i，j≤N.    (4)

其次，计算矩阵σ_ij的本征值和本征矢量。在将本征值从大到小排序后，即λ₁≥λ₂≥...≥λ_N，与本征值{λ₁，λ₂，...，λ_N}相对应的本征矢量便组成了主元素光谱{P₁( v)，P₂( v)，...，P_N( v)}。可以注意到，本征值和本征矢量的个数均与波数总数N相等，但实际上只有排在前列的少数几个本征值才有高于信号噪音的数值，后面的均弱于信号噪音而可忽略。

由于{P_n( v)，1≤n≤N}的正交归一性，可实现对定标光谱按主元素光谱的线性分解，即

$\left\{\begin{array}{c}{a}_n=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}[r\left({\stackrel{-}{v}}_i\right)-\&lang;r\left({\stackrel{\&OverBar;}{v}}_i\right)\&rang;]\&CenterDot;P_n\left({\stackrel{\&OverBar;}{v}}_i\right),1\&le;n\&le;N;\\ r\left(\stackrel{\&OverBar;}{v}\right)=\&lang;r\left(\stackrel{\&OverBar;}{v}\right)\&rang;+\underset{n=1}{\overset{N}{\mathrm{\&Sigma;}}}{a}_n{P}_n\left(\stackrel{-}{v}\right).\end{array}\right.---\left(5\right)$

其中r( v)是归一后的定标光谱，a_n是展开系数(score)。这里特别需要指出的是，主元素分析过程中对本征值的排序使得P_n( v)在光谱分析中的重要性随下标n增加而降低，而定标光谱集中光谱的主要变化特征可以用{a₁，a₂，...a_N}序列中排在前列的几个参数描述。主元素光谱的另一特性是{P_n( v)}组成了正交归一的基矢集，由此张成了一个空间，称作主元素空间，可由前述N维空间经坐标变换得到，实际上主元素分析便是变换的具体操作过程。经方程(5)每一光谱被映射到主元素空间中的一个点。另一个值得注意的事实是：从光谱测量直到这里，我们对癌症细胞和正常细胞都是等价处理的。

但是癌症细胞光谱对应的点集与正常细胞光谱对应的点集在空间分布上是不同的，分别处于可隔离的区域。寻找这两类点集分布的分界面便是建立诊断模型的第四步一使用模式识别算法从{a_n}中建立区分癌症细胞与正常细胞的参数方程。在这里，我们才引入两类细胞的差异。逻辑回归法(logistic regression)是对二元模式识别的标准算法，具体操作是计算似然估计函数的极大值。这一算法的输入量是

1.两类细胞的模式设置，有且仅有两个值：0或1。第m个细胞的模式取值为(均是已知量，建立定标数据库时己知)

2.从{a_n，1≤n≤N}中挑选处于系列前列的几个主要展开系数。这里需要注意的是，入选系数的数目增多通常会减弱模型的预言能力，通常数目应不超过3。

经过反复调试，本发明确认对结直肠癌，组合{a₂，a₃，a₄}能够给出最佳结果。应用这三个参数，定标光谱集的逻辑回归似然估计函数为

$\underset{m=1}{\overset{320}{\mathrm{\&Pi;}}}\frac{\exp \left[y_m({\mathrm{\&beta;}}_0+{\mathrm{\&beta;}}_1{a}_2^{\left(m\right)}+{\mathrm{\&beta;}}_2{a}_3^{\left(m\right)}+{\mathrm{\&beta;}}_3{a}_4^{\left(m\right)})\right]}{1+\exp [{\mathrm{\&beta;}}_0+{\mathrm{\&beta;}}_1{a}_2^{\left(m\right)}+{\mathrm{\&beta;}}_2{a}_3^{\left(m\right)}+{\mathrm{\&beta;}}_3{a}_4^{\left(m\right)}]},---\left(7\right)$

其中，β_{0，1，2，3}是未知参数，我们在展开系数a_2，3，4上增加上标(m)以标记细胞。β的取值应使定标光谱集的似然估计函数达到最大值，因此通过求解方程(7)的最值点来得到β值。数据处理发现，

β₀＝0.07868，β₁＝24.38，β₂＝-22.35，β₃＝-24.47.    (8)

根据逻辑回归算法，对细胞癌性的预言几率(predicted probability)表示为

$p=\frac{\exp [{\mathrm{\&beta;}}_0+{\mathrm{\&beta;}}_1{a}_2+{\mathrm{\&beta;}}_2{a}_3+{\mathrm{\&beta;}}_3{a}_4]}{1+\exp [{\mathrm{\&beta;}}_0+{\mathrm{\&beta;}}_1{a}_2+{\mathrm{\&beta;}}_2{a}_3+{\mathrm{\&beta;}}_3{a}_4]},---\left(9\right)$

代入β数值后整理为参数方程

$1n\left(\frac{p}{1-p}\right)=0.07868+24.38a_2-22.35a_3-24.47a_4,---\left(10\right)$

这是本发明确定的将两类结直肠粘膜上皮细胞区分诊断的最佳方程：当p＝0时，细胞以0％几率为癌症，即以100％几率为正常，方程(10)左端为-∞；当p＝1时，细胞以100％几率为癌症，方程(10)左端为+∞。当p＝0.5时，细胞以同等几率为正常和癌症，方程(10)左端为0，这时该方程实际上定义了a₂-a₃-a₄空间中的一个平面，该平面将癌症细胞点集分布与正常细胞点集分布有效分隔开来，称为诊断面，这等价于设定一个诊断条件：取阈值0.5，当p＜0.5时判定细胞为正常，而当p＞0.5时判定细胞为癌症。

使用上述标准，本发明对定标光谱集中的细胞识别达到了77.5％的敏感度(即识别了160个癌症细胞中的124个)和81.3％的特定度(即识别了160个正常细胞中的130个)。

(四)诊断识别模型在临床诊断中的应用程序

识别模型临床应用步骤如下：

1.对未经诊断病人的手术切除组织按照步骤(一)培养单细胞样品；

2.按照步骤(二)测量单细胞样品中活的上皮细胞的拉曼光谱；对正常对照组和反常对照组分别测量不低于20个细胞的拉曼光谱；

3.对每一细胞，按照方程(2)对光谱作归一；

4.对每一细胞，利用定标过程中确定的、已知的＜r( v)＞和{P_i( v)}按照方程(5)算得a₂、a₃和a₄数值；

5.对每一细胞，将a₂、a₃和a₄数值代入方程(10)，算得p值。如果p＜0.5即为正常，p＞0.5即为癌症。

6.20个正常细胞的p值分布和20个反常细胞的p值分布既是本发明的测量结果，可为医生诊断提供判断依据。

本发明的所有数据和数值模型均由实际测量给出，对细胞的诊断结论由光谱客观给出，不依赖于观测者的主观判断。单细胞样品制备可在1小时内完成，光谱测量时间可控制在2至4小时，对光谱的识别模型计算可在1秒内得到结果。因此在结直肠癌的快速临床诊断方面有广阔应用前景。

实施例1

朱X X，男，52岁，病理诊断为乙状结肠溃疡型腺癌，高至中度分化，采用本发明方法进行双盲检测。医生提供了病灶部位和非病灶部位单细胞样品，光谱检测正确识别了20个正常细胞中的17个，20个癌症细胞中的17个，结果显示该病人确已患有癌症。图5为实施例1诊断结果。

实施例2

沈X X，男，64岁，病理诊断为直肠浸润溃疡型腺癌，高分化，采用本发明方法进行双盲检测。医生提供了病灶部位和非病灶部位单细胞样品，光谱检测正确识别了全部20个正常细胞，20个癌症细胞中的16个，结果显示该病人确已患有癌症。图6为实施例2诊断结果。

实施例3

张XX，女，64岁，采用本发明方法进行双盲检测。医生提供了病灶部位和非病灶部位单细胞样品，光谱检测判别20个非病灶细胞中10个为正常，20个病灶部位细胞中的11个为癌症，判断该病人处于正常与癌症之间。经病理诊断，其结论是直肠绒毛-管状腺瘤，伴轻中度不典型增生。图7为实施例3诊断结果。

Claims (13)

1.一种单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于该方法由四个步骤组成：

(1)人体病灶部位单细胞样品的制备和生物活性维持；

(2)在维持接近人体生理环境下对具有生物活性的上皮细胞进行的单细胞激光俘获拉曼光谱测量；

(3)判断细胞为癌症或正常的单细胞拉曼光谱诊断识别模型；

(4)细胞诊断识别模型在临床诊断中的应用程序。

2.如权利要求1所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于对病人手术切取的组织进行无菌条件下的细胞离化处理，得到处于生理存活状态下的单细胞生理溶液。

3.如权利要求2所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于在单细胞生理溶液中添加抗生素抑制细菌生长。

4.如权利要求2所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于在单细胞生理溶液中添加细胞培养液维持细胞的生物活性状态。

5.如权利要求1所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于将上皮细胞悬液注入近红外激光俘获显微拉曼探测***的样品池，在细胞培养液的液态环境中进行上皮细胞的拉曼光谱测量。

6.如权利要求5所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于使用激光光镊技术对单个活上皮细胞实现俘获和孤立，简化光谱测量环境。

7.如权利要求6所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于得到俘获状态下单个上皮细胞的拉曼光谱，重点检测500-1900cm^-1。

8.如权利要求1所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于对拉曼光谱进行强度归一以去除激发光功率涨落的影响；

9.如权利要求1所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于鉴别上皮细胞为癌或正常的拉曼光谱识别模型由确诊病例组成的定标光谱数据库建立。

10.如权利要求2或9所述的在单细胞水平进行癌症诊断的拉曼光谱方法，其特征在于组成定标光谱数据库的每一病例为手术切取的癌症确诊病人的恶性肿瘤组织和距肿瘤10cm以上部位的正常上皮组织。

11.如权利要求9所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于定标光谱数据库包含5个以上病例，且每个病例包含20个正常细胞和20个癌症细胞的拉曼光谱，以获得充足的统计性。

12.如权利要求9所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于鉴别上皮细胞为癌或正常的拉曼光谱识别模型包括：a)定标光谱数据库中所有上皮细胞的平均光谱；b)定标光谱数据库经主元素分析确定的主元素光谱基矢集和定标光谱在此基矢集上的展开系数；c)对定标光谱展开系数经逻辑回归分析确立的判断细胞为正常或癌症的的诊断方程：该方程以光谱的主要展开系数为变量，功能是计算细胞为癌症的语言几率p，几率阈值条件设定为p＜0.5则细胞为正常细胞，p＞0.5则细胞为癌细胞。

13.如权利要求1所述的单细胞拉曼光谱判别上皮细胞癌症性质的方法，其特征在于对未诊断病人的实施程序为a)对病灶的切除组织作单细胞处理；b)测量单细胞拉曼光谱；c)对单细胞拉曼光谱作强度归一；d)计算光谱在诊断方程中所使用的展开系数系列；e)将展开系数代入权利要求12所述诊断方程，得到p值，由阈值条件确定是否为癌症细胞。

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