CN1793336A - 表达绿色荧光蛋白的乳酸杆菌基因工程体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)的乳酸杆菌基因工程体，包括将gfp基因***质粒pLEM415，构建成gfp表达质粒，电转化从鸡小肠分离到的乳酸杆菌，即成本发明的基因工程体－lactobacillus－pLEM415－gfp。在转化子中有绿色荧光蛋白的表达，且在30℃下荧光强度最大。本发明所提供的基因工程体可用于大量扩增培养，用于研究乳酸杆菌在体内的运动情况及与肠道的相互作用机理，提取该乳酸杆菌的质粒后，可***各种抗原、活性肽和药物等，广泛的用于科研，生产等各种领域。乳酸杆菌很有望成为口服基因工程苗的表达载体。

Description

表达绿色荧光蛋白的乳酸杆菌基因工程体

一、技术领域

本发明涉及表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的乳酸杆菌基因工程体，为构建用于研究乳酸杆菌和动物机体间互作的乳酸杆菌基因工程体，属基础生命科学领域的前沿科学。

二、背景技术

几个世纪以来，乳酸杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品及饮料加工业，以乳酸杆菌作为发酵菌的食品工业所创造出的经济价值占全球总的发酵类食品的20％。数千年，乳酸杆菌被人类大量食用，没有引起任何已知的健康问题，但是其对机体的免疫机理及与动物肠道是如何相互作用等一系列问题尚不清楚，同时乳酸杆菌可以作为抗原递送载体诱导粘膜免疫应答和全身免疫应答，这引起了研究者们很大的兴趣。为了观测到机体内乳酸杆菌的运动情况及免疫机理，首先需要对其进行标记。

1乳酸杆菌对黏膜免疫的影响

乳酸杆菌是人体和动物肠道中一种正常的益生菌，具有多种生理功能，如控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能，在科学界越来越显示出强大的生命力。作为一种重要的益生菌，多年来乳酸杆菌被大量用于食品的制造中，如干酪、酸乳酪和干腊肠。数千年来人们大量的消费这些食品，从未引起任何的健康问题。作为口服疫苗，乳酸杆菌还具有很好的安全性。因此，乳酸杆菌非常适宜作为安全的口服疫苗和其他病原体的抗原载体。

进入胃肠道中的乳酸杆菌具备抗胆汁酸和在胃肠道中持续存在的能力。与一般微生物抗原一样，乳酸杆菌在诱导黏膜免疫应答时或是经过小肠上皮之间的微皱褶细胞(microfold cell，M细胞)，或者通过上皮下的树突状细胞(dendritic cell，DC)进入固有层，激活Th2淋巴细胞，产生大量的白介素(IL)-5，后者是有效的IgA刺激因子，可激活B细胞，分泌IgA，IgA与肠黏膜上皮产生的分泌片段结合，形成黏膜表面抗体sIgA(分泌型IgA)，阻止致病菌的吸附和入侵。许多乳酸杆菌由于抗酸、抗胆汁盐，能够顺利通过胃和回肠，大量存在于小肠和大肠的上游处。乳酸杆菌进入胃肠道后可持续诱导局部细胞免疫和体液免疫，并具有减少***反应、增强肠道屏障功能和治疗自身免疫病等功能。

乳酸杆菌能显著增加肠道中非特异性和特异性抗体水平。对0-6个月健康新生儿的研究发现，肠道内的乳酸杆菌和双歧杆菌定植的时间越早，外周血中IgA定向细胞出现得就越早；随着肠内乳酸杆菌和双歧杆菌数目的增加，外周血中的IgA定向细胞的数量也增加；在轮状病毒导致的腹泻婴儿中，喂食乳酸杆菌株后可使病程减短，病情减轻；减毒的Salmonella typhi感染小鼠后，如果口服含有L.acidophilus Lal发酵乳，小鼠体内针对S.typhi的血清总IgA水平均升高。乳酸杆菌还可明显促进小肠中细胞免疫反应，如乳酸杆菌能增强肠上皮淋巴细胞细胞毒活性，诱导产生多种淋巴因子；激发固有层CD4+细胞产生干扰素；增强单核—吞噬细胞的吞噬作用，从而杀灭肠道病毒和肠道内的其他细菌，小鼠口服含有大量乳酸杆菌的Kefir奶可以协助特异性抗原提高小肠特异性黏膜免疫反应。乳酸杆菌中含有大量未甲基化的CpG DNA，脂磷壁酸(lipoteichoic acids，LTA)和肽聚糖，通常这些物质可与Toll样受体(Toll like receptors，TLRs)结合，刺激先天免疫***产生应激反应。所以口服乳酸杆菌对增强小肠特异和非特异性免疫应答均具有重要作用。

2口服黏膜免疫研究进展

口服黏膜免疫方法简便、安全，不仅在黏膜局部和其他黏膜组织产生免疫应答，还可引起全身性体液免疫应答，多年来受到国内外免疫学家的密切关注。目前儿童广泛口服的脊髓灰质炎糖丸就是一个消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰质炎口服疫苗的应用，使全球小儿麻痹发病得到有效控制，为口服疫苗的研制与应用起到了指导作用。但是在实践中，口服疫苗经过消化道时常受到消化液的降解，疫苗很容易被破坏，影响免疫力的效果，使消化道黏膜免疫方法的应用和推广受到限制。近年来疫苗投递***成为研究传染病防御领域新技术的热点之一。尤其是细菌活载体疫苗因具有培养方便，外源基因容量大，刺激细胞免疫力强等优点具有巨大的应用潜力。细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向，所谓细菌载体疫苗是将所需的编码病原菌特异性抗原的DNA片段***减毒的病原菌或者共生菌中，提呈表达所编码的抗原，以期达到预防一种或多种疾病的目的。通过活菌载体递送疫苗抗原不仅可刺激肠道局部免疫应答，又可针对特异性抗原产生特异性免疫应答，使机体可以获得全面的保护力。

以前的研究表明一些减毒细菌可作为疫苗抗原的载体，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等。国外学者以减毒沙门氏菌为载体在真核细胞中成功表达了lacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、HIV-gp140基因、李斯特菌溶血素基因等。但沙门氏菌为载体传递DNA疫苗也存在潜在危险性。首先，减毒细菌可能存在毒力返强的危险；其次，质粒DNA可能会整合到宿主细胞基因组，从而引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。此外，减毒细菌对一些老弱病残个体可能有潜在致病性。因此，选择理想的疫苗抗原载体是建立生物学新技术的关键。理想的输送抗原的载体应该是能够在体内较长时间存在，本身对机体既安全又能产生持续免疫力的一些微生物。

乳酸杆菌是安全的益生菌，利用一些乳酸杆菌在胃肠道、泌尿、生殖***中或黏膜部位黏附存活且无病原性等特点，开展活菌口服疫苗和黏膜疫苗载体的研究，日益受到了广泛的重视。理想的疫苗载体***能够把表达的外源性蛋白抗原分泌到细胞外。外源蛋白在细菌中的表达在生物技术上一直是一个挑战。乳酸杆菌的一些菌株具有S层(S-layer)，由单一的蛋白亚单位组成规则排列的类晶格结构。与大肠杆菌相比，乳酸杆菌仅有一层细胞膜，目的蛋白可在S层蛋白信号肽的引导下直接分泌到细胞外，从而容易获得目的蛋白。将目的抗原与乳酸杆菌S层蛋白信号肽序列融合，将其克隆于乳酸杆菌表达质粒启动子下游，通过电转化可以获得稳定表达抗原的乳酸杆菌。虽然一些革兰氏阴性菌也具有S层，但革兰氏阴性菌存在一定缺点，如在大肠杆菌中，重组蛋白易被内毒素污染并易以不溶的包涵体形式在细胞质中堆积；而乳酸杆菌则能稳定的将异源性重组蛋白表达于细胞外。但是前几年乳酸杆菌的遗传和分子生物学研究进展较为缓慢，主要是由于乳酸杆菌的转化***研究的不够深入。

3乳酸杆菌的标记

在研究乳酸杆菌启动小肠免疫应答的机制时，需要对乳酸杆菌进行标记以便于观察。对乳酸杆菌的分子生物学研究已经有了很大的发展，许多工具已开发并运用于乳酸杆菌上了。如DNA探针已作为一种特异性方法用来在复杂的环境中确认一些微生物。食物中的细菌可以通过PCR扩增特异性片断来确认。这些技术具有种属特异性以及很好的敏感性，但是不能观测到单个细菌的情况。另外，由于要从复杂的环境中提取核酸以及PCR效率问题，这些都会限制这些标记技术的运用。近年来构建了一系列外源蛋白表达***，使乳酸杆菌成为表达外源基因的良好工程菌株。许多的报告基因，如大肠埃希菌(Escherichiacoli)β-葡苷酸酶(β-glucoronidase)基因、肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)基因、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶(α-amylase)基因、弧菌属细菌(Vibrio fischeri)荧光素酶(luciferase)基因和金黄色葡萄球菌(S.aureus)核酸酶(nuclease)基因已经用于乳酸杆菌的功能表达和细菌的定位。为了检测到这些表达报告基因的重组乳酸杆菌，通常需要依赖于外源性底物，因此它们很难运用于体内试验。从jellyfish Aequorea Victoria分离到的绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)报告***可以很好的解决这个问题，GFP是一种完美的荧光标记分子，与其他生物发光或荧光指示分子不同，该蛋白能够自身催化形成发光结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光。作为荧光标记分子，GFP具有很多优点，如检测方便，荧光稳定，易于构建载体且对活细胞无毒害，对目的基因的功能没有影响，转化后细胞可以继续传代。因此，GFP是稳定的非种属限制的标记分子，能够检测活体细胞的运动。

许多学者在不同的细菌中表达GFP，观察表达GFP的这些重组菌与宿主间的相互联系。Dhandayuthapani等在牛的结核分支杆菌成功地表达了GFP，并研究了该分支杆菌与巨噬细胞的相互作用。Stephan Khler等在布鲁氏菌中成功的表达了GFP，该布鲁氏菌感染巨噬细胞，在24h和48h后成功地在巨噬细胞中观察到了布鲁氏菌的增殖情况，这将有利于我们更好的了解布鲁氏菌是如何消除巨噬细胞的杀菌机制的。鼠伤寒沙门氏菌能够穿过很多动物(包括人)胃肠道的上皮屏障，在粘膜下层和***附近增殖。海鱼分枝杆菌可以引起冷血动物的慢性***感染，同时也会引起人体肢端的感染。Valdivia RH等在鼠伤寒沙门氏菌和海鱼分枝杆菌中表达了GFP，且鼠伤寒沙门氏菌和海鱼分枝杆菌对宿主细胞的侵入和增殖能力并不会随着GFP的表达而改变。表达GFP的海鱼分枝杆菌感染青蛙五周后，可在青蛙的脾和肺观察到该细菌。

总之，乳酸杆菌最令人感兴趣的新领域之一是利用乳酸杆菌作为口服疫苗的载体。TTFC在乳酸杆菌中的成功表达证明将乳酸杆菌应用于黏膜免疫是完全可行的。在许多动物模型中进行的黏膜疫苗的研究，都取得了较好的免疫效果，但这些结果和结论能否适用于人类，仍存在一定距离。现在构建乳酸杆菌口服基因工程苗的表达载体的条件都已逐渐完善，只是乳酸杆菌如何诱导小肠产生局部免疫反应的机制尚不清楚。我们所面对的巨大挑战是如何使机体对表达任何抗原的乳酸杆菌都能产生需要的免疫应答。有了乳酸杆菌的标记***，弄清乳酸杆菌如何诱导黏膜免疫反应的机制只是时间上的问题。乳酸杆菌很有希望成为口服基因工程苗的表达载体。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供表达绿色荧光蛋白(GFP)的乳酸杆菌工程体，将绿色荧光蛋白转化从鸡分离的乳酸杆菌，作为一种标记分子，有利于以后观察乳酸杆菌在肠道内的运动分布情况。更为将来乳酸杆菌作为抗原递送载体提供基础技术。

技术方案

本发明的基因工程体的特征在于：将gfp基因***质粒pLEM415，构建成gfp表达质粒，电转化从鸡小肠分离到的乳酸杆菌，即成本发明的基因工程体-lactobacillus-pLEM415-gfp。

菌种分类：德氏乳杆菌乳亚种

命名：-lactobacillus-pLEM415-gfp

其主要基因为gfp基因

本发明乳酸杆菌的基因工程体，其特征在于：用以下方法构建而成：

1)pldhL-gfp片段的获取

根据质粒pRV85的基因序列，设计1对包含启动子pldhL的gfp基因的引物L₁和L₂

L₁ 5’TTA  GGGCCC ACTGAGAAGTTGCTCTC3’

             Apa I

L2  5’TTA  ATCGAT TTATTTGTAGAGCTCATCC3’

             Cla I

以pRV85质粒为摸板，用PCR扩增出片断pldhL-gfp；

2)gfg::pLEM415质粒的构建

将上述提取的pldhL-gfp基因***pLEM415质粒，构建gfp::pLEM415重组质粒，转化感受态大肠杆菌，进行酶切鉴定和PCR鉴定，用Kpn I和EcoRI双酶切重组质粒为三条带，大小分别为6288bp、727bp和279bp，PCR扩增得到为1006bp的pldhL-gfp基因片段，表明构建成功；

3)电转化乳酸杆菌

将新构建的gfg::pLEM415重组质粒电转化从鸡胃肠道分离的乳酸杆菌，转化后选择抗性菌落鉴定即可得到转化子，从乳酸杆菌转化子中提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，用Kpn I和EcoRI双酶切重组质粒为三条带，大小分别为6288bp、727bp和279bp，PCR扩增得到为1006bp的pldhL-gfp基因片段表明乳酸杆菌的电转化成功；

4)绿色荧光蛋白表达的观察

液体培养基中的乳酸杆菌离心后收集沉淀，用盐溶液润洗，涂抹在载玻片上，Leica荧光显微镜下观察，同时以未转化任何质粒的乳酸杆菌作为对照，结果观察到绿色荧光，证明绿色荧光蛋白的表达，证明本发明的基因工程体-lactobacillus(德氏乳杆菌乳亚种)-pLEM415-gfp的构建成功。

有益效果  本发明提供的表达绿色荧光蛋白(GFP)的乳酸杆菌工程体，将绿色荧光蛋白转化从鸡分离的乳酸杆菌，作为一种标记分子，有利于以后观察乳酸杆菌在肠道内的运动分布情况。

本发明基因工程体有绿色荧光蛋白的表达，且在30C下荧光强度最大。

本发明所提供的基因工程体可用大量扩增培养，用于研究乳酸杆菌在体内的运动情况及与肠道的相互作用机理。提取该乳酸杆菌的质粒后，可***各种抗原、活性肽和药物等，广泛的用于科研，生产等各种领域。为将来乳酸杆菌作为抗原递送载体提供基础技术。

本发明构建了乳酸杆菌的标记***，有利于弄清乳酸杆菌如何诱导黏膜免疫反应的机制。乳酸杆菌很有望成为非常具有吸引力的口服基因工程苗的表达载体。

四、附图说明

图1 pLEM415::gfp的PCR产物及限制性内切酶酶切鉴定电泳图谱

A  1 Marker DL2000      2 PCR产物

B  1 Marker DL2000      2 pLEM415::gfp  3 pLEM415::gfp Kpn I和EcoRI双酶切

4 Marker λ-HindIII

图2荧光显微镜下的观察10×40

A表达绿色荧光蛋白的德氏乳杆菌乳亚种R4

B未转化任何质粒的德氏乳杆菌乳亚种R4(阴性对照)

图3 Kpn I和EcoRI双酶切重组质粒

五、具体实施方式

1 pldhL-gfp片段的获取

根据pRV85(公知公用载体，Gory L，Montel MC，Zagorec M.Use of green fluorescentprotein to monitor Lactobacillus sakei in fermented meat products.FEMS Microbiol Lett2001；194：127-133)和pLEM415(公知公用载体，Serror，P.，T.sasaki，S.D.Ehrlich，and E.Maguin.Electrotransformation of Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus and L.delbrueckii subsp.lactis with various plasmids.Appl.Environ.Microbiol 2002；68：46-52.)两个质粒的基因序列设计了一对引物L1、L2，引物及其包含的酶切位点如下：

L1 5’TTA GGGCCCACTGAGAAGTTGCTCTC   3’(Apa I)，

L2 5’TTA ATCGATTTATTTGTAGAGCTCATCC 3’(Cla I)，

PCR扩增出pldhL-gfp片断，共1006bp.

PCR反应体系(50μL)：10×buffer5μL；Mg²⁺4μL，dNTP(2.5mmpl/L)1μL；引物F(20pmol/L)0.25μL，R0.25μL；Taq酶(1U/μL)0.5μL；模板DNA为质粒pRV85(50ng/μL)1uL；ddH₂O38μL。引物由三博远志生物有限公司合成，PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30sec，50℃30sec，72℃1min，32个循环后72℃延伸5min。

2 gfg基因的酶切

将pldhL-gfp片断用限制性内切酶Apa I和Cla I消化(37℃，6h))，经琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中pldhL-gfp基因片断，将切下的DNA片段用DNA回收试剂盒回收，得到的带粘性末端的gfp基因(GenBank accession no.U62636)，即可用于连接反应。

3 pLEM415质粒的酶切回收

质粒pLEM415是乳酸杆菌和大肠杆菌的穿梭质粒，有一多克隆位点，具有氨苄青霉素抗性和红霉素抗性。载体质粒pLEM415用限制性内切酶Apa I和Cla I消化(37℃，6h))，取10μl酶切产物进行1％琼脂糖电泳，切下凝胶中线性化的pLEM415。将切下的DNA片段用DNA回收试剂盒回收，置-20℃冻存备用。

4 连接

回收的线性化质粒pLEM415与pldhL-gfp基因片断以1∶3(物质的量比)混合，加入T4DNA连接酶，按DNA连接药盒说明书进行，其反应体系如下：

pLEM415质粒双酶切回收产物     5μl

gfg基因双酶切回收产物         9μl

T4连接酶                      3μl

T4连接酶缓冲液                2μl

ddH₂O                        1μl

混匀后，置16℃过夜反应，即为重组表达质粒pLEM415::gfp，立即可用于转化。

5 大肠杆菌感受态细胞的制备

参照《分子克隆实验指南》(第三版)(2002，96-98，科学出版社)介绍的方法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。

6 转化

取10μl连接产物转化DH5α感受态细胞，具体操作参照《分子克隆实验指南》(第三版)(2002，99-102，科学出版社)介绍的方法进行。取200μl转化大肠杆菌，涂布含Amp 50mg/ml的LB琼脂平板，同时设未转化的感受态大肠杆菌作对照(阴性对照)，接种后置37℃培养过夜培养18h，观察对照板(感受态DH5α菌)上无细菌，而转化后的DH5α板上有细菌。

7 重组表达质粒pLEM415::gfp克隆株的筛选

挑选上述培养平板中的单个菌落，在含有氨苄青霉素(50ug/ml)的LB培养基中，37℃振荡培养12h。碱裂解法提取大肠杆菌中的质粒，进一步做PCR鉴定和酶切鉴定(图1)。

8 重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定

质粒pLEM415有1个多克隆位点，用Apa I和Cla I消化后，将回收的gfp基因定向地***载体，转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒pLEM415::gfp.以该重组质粒为模板，用引物经PCR扩增得到约为1006bp的片段表明gfp基因已被克隆入载体质粒中，结果见图1(图1A)。用Kpn I和EcoRI双酶切消化pLEM415::gfp，电泳结果显示：重组质粒(图3)被切为三条带，大小分别为6288bp、727bp和279bp。验证结果与酶切图谱(图1B)相吻合，表明质粒构建成功。

9 重组质粒的提取

质粒的提取按《分子克隆实验指南》(第三版)(2002，27-29，科学出版社)介绍的方法进行。

10 乳酸杆菌感受态细胞的制备

挑取乳酸杆菌德氏乳杆菌乳亚种R4(公知公用菌种，于卓腾毛胜勇朱伟云，鸡肠黏膜乳酸菌的抗菌能力及其对抗菌素的药敏特性，华中农业大学学报，24(4)，2005：376-379)菌落在MRS中培养过夜，将过夜培养物以1∶50稀释，37℃培育3.5-4h(OD600值约为0.5)。冰浴使细菌停止生长，4℃，4000g离心10min。无菌条件下弃上清，用冰预冷的10％甘油溶液冲洗三遍，充分洗尽离心管中的杂质和离子。最后加入1ml的10％甘油重新悬浮，获得乳酸菌感受态细胞。

11 乳酸杆菌的电转化

取2μL水溶的质粒和40μL待转化的乳酸菌感受态细胞混合，然后移入供转化用的电极杯中(间距0.2cm)，冰上放置5min。移入BioRad基因脉冲仪进行电击转化，本试验固定电阻为200Ω，电容为25μF，改变电场强度进行电击转化。在电压为1.5kV时获得最大转化效率，之后随电压增加转化效率下降。这与Charlene等转化乳酸杆菌时的电击参数一致。电脉冲转化后，在电击杯中加入400μLMRS培养基，混匀后转移入1.5mLEP管中于37℃静止培养2h，取100μL转化后的菌液涂布在含氨苄青霉素(50μg/mL)MRS平板上，培养36h，选择抗性菌落鉴定即可得到转化子。按照Anderson和McKay的方法从乳酸杆菌转化子中提取质粒进行酶切鉴定，用Kpn I和EcoRI双酶切重组质粒(图3)为三条带，大小分别为6288bp、727bp和279bp(图1B)，PCR扩增得到约为1006bp的pldhL-gfp基因片段表明乳酸杆菌的电转化成功(图1A)。

12 绿色荧光蛋白表达的观察

液体培养基中的乳酸杆菌离心后收集沉淀，用盐溶液(NaCl 8.5g/L)润洗，然后涂抹在载波片上，于Leica荧光显微镜下观察，同时以未转化任何质粒的乳酸杆菌作为对照，结果发现转化子中有绿色荧光蛋白的表达(图2)，且在30℃下荧光强度最大，在其它的温度条件下，荧光的亮度有所降低。

以上实验重复两次，所得结果一致。

应用

本发明所提供的基因工程体可用大量扩增培养，用于研究乳酸杆菌在体内的运动情况及与肠道的相互作用机理。提取该乳酸杆菌的质粒后，可***各种抗原、活性肽和药物等，广泛的用于科研，生产等各种领域。

Claims (2)

1、表达绿色荧光蛋白(GFP)的乳酸杆菌工程体，其特征在于：将gfp基因***大肠杆菌-乳酸杆菌的穿梭质粒pLEM415中，构建成gfp::pLEM415质粒，转化大肠杆菌，然后提取该质粒，电转化从鸡胃肠道分离的乳酸杆菌，即成本发明的乳酸杆菌工程体-lactobacillus(德氏乳杆菌乳亚种)-pLEM415-gfp。

2、根据权利要求1所述的基因工程体，其特征在于，由以下方法构建而成：

1)pldhL-gfp片段的获取

根据质粒pRV85的基因序列，设计1对包含启动子pldhL的gfp基因的引物L₁和L₂

L₁  5’TTA  GGGCCC ACTGAGAAGTTGCTCTC 3’

             Apa I

L2   5’TTA  ATCGAT TTATTTGTAGAGCTCATCC 3’

             Cla I

以pRV85质粒为摸板，用PCR扩增出片断pldhL-gfp；

2)gfp::pLEM415质粒的构建

将上述提取的pldhL-gfp基因***pLEM415质粒，构建gfp::pLEM415重组质粒，转化感受态大肠杆菌，进行酶切鉴定和PCR鉴定，用Kpn I和EcoR I双酶切重组质粒为三条带，大小分别为6288bp、727bp和279bp，PCR扩增得到为1006bp的pldhL-gfp基因片段，表明构建成功；

3)电转化乳酸杆菌

将新构建的gfp::pLEM415重组质粒电转化从鸡胃肠道分离的乳酸杆菌，转化后选择抗性菌落鉴定即可得到转化子，从乳酸杆菌转化子中提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，用Kpn I和EcoR I双酶切重组质粒为三条带，大小分别为6288bp、727bp和279bp，PCR扩增得到为1006bp的pldhL-gfp基因片段表明乳酸杆菌的电转化成功；

4)绿色荧光蛋白表达的观察

液体培养基中的乳酸杆菌离心后收集沉淀，用盐溶液润洗，涂抹在载玻片上，Leica荧光显微镜下观察，同时以未转化任何质粒的乳酸杆菌作为对照，结果观察到绿色荧光，证明绿色荧光蛋白的表达，证明本发明的基因工程体-lactobacillus(德氏乳杆菌乳亚种)-pLEM415-gfp的构建成功。