CN1793330A - 一种新型高活性乳酸菌制品的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及新型高活性乳酸菌制品的制备方法，该方法利用发明人筛选并保藏的具有转化亚油酸生成共轭亚油酸能力的乳酸菌(Lactobacillus plantarum)HSC235 CCTCC No.M204051，在优化条件下发酵培养该新菌株，包括：发酵培养基配方筛选、酶诱导物的提供方式，发酵工艺条件选定等制得高活性乳酸菌制品，冻干制品活菌粉中活菌数可达10¹⁰个/g。本发明所得活性乳酸菌制品对亚油酸的转化率高达42.7％。以此高转化活性的新型乳酸菌微生态活菌制剂再与其它成分复配后，可制得复合高效的微生态制剂，作为益生菌在食品、医药及微生态饲料工业将有十分广泛应用前景。

Description

一种新型高活性乳酸菌制品的制备方法

(一)技术领域  本发明涉及一种新的用于微生物转化亚油酸生成共轭亚油酸的乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum HSC 235)，以及利用该乳酸菌发酵生产高活性乳酸菌制品的方法。

(二)背景技术目前，利用微生态理论研制的益生素应用较广的是乳酸菌类益生素，产品剂型有口服糊状剂、水溶性粉剂、液剂等。微生态制剂的功效己被公认，它通过抑制肠道内有害菌群，促进有益菌群的增殖，消除肠内毒素和增强免疫***来预防肠道疾病，从而改善肠道内微生态的平衡。它既无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不会污染环境，在食品、医药、饲料添加剂等领域具有广阔的应用前景。

周德庆(我国微生态制剂的现状和发展设想.工业微生物，1999，1：34～43)当今以肠道微生态制剂为代表的益生菌制品，主要选用以下3类细菌。

(1)严格厌氧的双歧杆菌属：据最新报道，该属现有32个种，其中已被应用于制造肠道微生态制剂者主要有5种，即长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、青春双歧杆菌、两叉双歧杆菌和短双歧杆菌。(2)一般厌氧即耐氧的乳杆菌属：至今已报道的有56种。常用于肠道微生态制剂中的约有10种，如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌、短乳杆菌(L.brevis)、干酪乳杆菌(L.casei)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.delbrueckii subsp.bulgaricus，旧称“保加利亚乳杆菌”)等。(3)若干兼性厌氧球菌：如属于肠球菌属(Enterococcus)中的粪肠球菌和屎肠球菌(E.faecium，旧称“屎链球菌”)等；属于乳球菌属(Lactococcus)的乳酸乳球菌乳亚种(L.lactis subsp.lactis，旧称“乳链球菌”)和乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris，旧称“酪链球菌”)等；以及属于链球菌属(S.treptococcus)的唾液链球菌嗜热亚种(S.salivarius subsp.thermophilus，旧称“嗜热链球菌”)和中间链球菌(S.intermedius)等。

日本及欧美用于酸奶及益生菌剂的乳酸菌种主要是一些来自人体的乳酸菌种和双歧杆菌如：嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗氏乳杆菌、植物乳杆菌、酪乳杆菌、詹氏乳酸杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆菌及双歧双歧杆菌及乳酸肠球菌等。还有酵母菌也是一颇爱注目的益生菌，酵母菌因不受一般抗生素的影响帮可与抗生素同时使用，其它优点是耐酸、耐热性较强，也学被胆汁杀死，在厌氧好氧环境均可生存，对于制造和贮存有利。日体还使用酪酸梭状芽孢杆菌(Cl.butyricum)作为益生菌药剂以治疗肠道感染和肠功能异常。其芽孢耐热耐酸性强，摄入后在肠道发芽增殖，1-2天后粪便中可检出该菌，经3-5天后完全消失。日本现有224种特定保健食品中有150种是整肠类保健品。主要是乳酸菌中的双歧杆菌及相关因子(如低聚糖、菇类提取物、乳酮糖等)的复合。(胡学智，国外微生态制剂的研究与市场概况。工业微生物，2002，3：56-61)

药用乳酸菌活菌制剂在临床上的应用，目前主要用于防治腹泻、肠炎、痢疾、肝炎、肝硬化、***炎、便秘、消化道功能紊乱、降血脂、皮肤病和泌尿***疾病等。能作为药用的双歧杆菌主要有：短双歧杆菌、长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和青春双歧杆菌等。可入药的乳酸杆菌主要有：嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、短乳杆菌、植物乳杆菌等。可作药用的肠球菌主要有：粪肠球菌、屎肠球菌。

彭开松等报道(水产有益微生物的研究与应用。世界农业，2004，11：51-53)认为国内独立开发的主要是一些单一菌株：如光合细菌，芽孢杆菌，蛭弧菌等；复合制剂主要是仿制或引进国外的商品。

杨汝德等(用微型包囊法研制新型高效微生态活菌制剂，广东药学院学报2003，2：87-90)采用流化床技术与喷嘴结合的微型包囊法，将3种双歧杆菌、高效活菌保护剂和双歧促生因子一起作为核心物质，包封于无毒囊材中制成耐酸肠溶微囊(或微球)。微囊在人工模拟胃液(pH 1.5～2.0)中处理4h，其中的双歧杆菌活菌数仍保持在44％以上；在人工肠液中处理12min，微囊全部崩解释放出活性菌，在37℃下保存3个月(相当于常温下1年以上)，其中的活菌数仍大于10⁹个/g。有效地解决了胃酸、消化酶和抗生素等对活性双歧杆菌的灭活和产品常温保存期短的问题。

刘景圣等(嗜酸乳杆菌和双歧杆菌肠溶活菌制剂的研究，中国乳品工业，2003，1：14-16)对双歧杆菌和嗜酸乳杆菌进行最适pH值流加中和培养，真空冷冻干燥处理后，利用相应的机械设备及特殊的工艺处理，研制出双歧杆菌和嗜酸乳杆菌的肠溶软胶囊、肠溶硬胶囊和普通硬胶囊等系列活菌制剂。并且对这些制剂进行了物理性状、胃肠崩解、模拟胃肠综合试验，以及常温保存试验等分析检测，对上述各种制剂的特性及性能指标作出了客观评价。

陈铁涛等[两歧双歧杆菌与嗜酸乳杆菌微生态制剂的工业化生产工艺研究，中国乳品工业，2002，30(5)]研究了两歧双歧杆菌与嗜酸乳杆菌微生态制剂的工业化生产工艺。对发酵培养基及发酵条件进行了研究与优化，并确定了发酵奶冷冻干燥工艺条件。产品中两歧双歧杆菌与嗜的活菌数达到10⁹-10¹⁰/g。

微生态制剂不仅在在食品保健品中具有广阔的使用，作为一种饲料添加剂有养殖行业也有相当广泛的应用价值。近年来的研究发现，长期使用抗生素作饲料添加剂，给畜牧业生产、人类健康和环境等都带来许多严重的问题：①破坏畜禽肠道的微生态平衡；②导致某些细菌产生抗药性，危害人畜；③抗生素的化学残留，威胁着人类健康。利用微生态理论研制的益生素，即畜禽用微生态制剂，是一种含活性微生物的饲料添加剂。它既无毒、无副作用、无残留、无抗药性，同时也不会污染环境，具有广阔的应用前景。目前，研究较多，应用较广的是乳酸菌类益生素，产品剂型有口服糊状剂、水溶性粉剂、液剂等。畜禽用微生态制剂的功效己被公认，它通过抑制畜禽肠道内有害菌群，促进有益菌群的增殖，消除肠内毒素和增强免疫***来预防肠道疾病，从而改善肠道内微生态的平衡，达到提高畜禽生产性能的目的。

共轭亚油酸具有可促进人体内脂肪细胞蓄积的脂肪和蛋白质，碳水化合物等输送到肌肉、缔合组织、内脏等运动组织细胞内，保持能量，调整新陈代谢功能等。具有抗氧化，抑制产生***素E2，阻碍蛋白激酶C活化等功能(粮食与油脂，1999，1：53-54)。吴冀华，裘爱泳(共轭亚油酸的生理功能，中国油脂，2001，6：45-47)，动物实验表明，共轭亚油酸是一种很强的抗癌物质，具有抗动脉粥样化形成、抗糖尿病、抗过敏、调节免疫、促进生长、降低身体脂肪并增加瘦肉量及影响骨骼形成等生理功能。

林淑英等(中国油脂，2003，11：55-57共轭亚油酸在食品工业中的应用前景)认为作为抗癌保健食品，CLA是一种有潜力的抗癌药。一个70kg的人每天可能需要摄入约115～310g CLA才能降低肿瘤的发病率；作为减肥食品添加剂，人体不能合成CLA，必须从食物中获得，反刍动物产品如牛奶、奶酪及肉是CLA的主要来源。在欧美国家，特别是美国已将CLA作为运动食品和营养辅助保健食品原料，面向锻炼身体和吸氧健身运动的人员销售。若食品中添加约0.1％～0.5％的CLA，因其可进入细胞的磷脂黏膜，使营养从脂肪细胞反复运输到运动组织细胞内，这样使希望减少体内脂肪的人在进行步行等运动时，不仅能减少体内脂肪，促进代谢，同时提高肌肉张力，使肌肉更加发达；CLA为新型的食品防腐剂。有研究认为CLA的钠盐、钾盐可以抑制霉菌的生长，且无毒副作用，性质相对比较稳定，无使用上的限制，可用于食品、化妆品等行业，可作为苯甲酸的替代品。既可达到防腐抑菌的作用，又可起到良好的保健作用，这正可迎合消费者对于无毒无害的天然防腐剂的需求。

沈继红等(微囊化共轭亚油酸的研究，高技术通讯，2002，4：97-99)利用喷雾干燥技术，使共轭亚油酸微囊化。对于不同的包埋剂和共轭亚油酸配比对微囊化产品质量的影响，以及产品的热稳定性和溶出度进行了研究。结果表明，合适的共轭亚油酸和包埋剂配比，能降低产品的表面油；在最佳酸方共轭亚油酸∶包埋剂I∶包埋剂II＝6∶7∶4时，产品的抗氧化性优于原料共轭亚油酸，溶出度也符合药典要求。

吕桂善等研究了共轭亚油酸在液态乳制品中的应用研究(广州食品工业科技，Vol.20No.3：15-17)。在液态乳制品中添加不同含量的共轭亚油酸(Conjugated linoleic Acid，CLA)及不同的CLA产品形式(CLA，CLA乙酯，CLA甘油三酯)后对产品感官品质(可接受度)的影响，并对CLA的贮藏稳定性进行了研究。研究结果表明，当CLA的添加量超过1‰时，产品即有一种CLA特有的涩味，比较难以让人接受；当使用CLA甘油三酯时，对产品的感官品质没有影响，反而使得产品更加滑爽，脂肪香味更浓；CLA甘油三酯在贮藏过程中具有良好的稳定性。

由上述文献资料可见，具有较高转化亚油酸生成共轭亚油酸活性的乳酸菌粉作为一种新型微生态活菌制剂的研究开发与制备尚未见有报道。以此高转化活性的新型乳酸菌微生态活菌制剂再与其它成分复配后，可制得复合高效的微生态制剂，在食品、医药及微生态饲料工业将有十分广泛应用前景。

(三)发明内容本发明的任务是提供一种能有效转化亚油酸为共轭亚油酸的微生物菌株，以及提供一种利用该新的微生物发酵生产高活性乳酸菌制品的方法。

本发明的能有效转化亚油酸为共轭亚油酸的新的微生物菌株，是乳杆菌属(Lactobacillus)的植物乳杆菌一个种：HSC235(Lactobacillusplantarum HSC 235)，此菌株是从天然发酵的蔬菜中采用MRS乳酸菌培养分离筛选得到。

此菌株己于2004年7月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保存号CCTCC No.M204051。

此菌株的细菌学特征如下：

(1)形态：

  1)细杆状，直径0.5微米～0.8微米，长1微米～5微米；

  2)在培养初始阶段，细胞呈长杆状；

  3)运动性：不运动；

  4)孢子形成：不形成孢子；

  5)革兰氏染色：阳性；

  6)耐酸性：阳性。

(2)在各种培养基上生长状态(30℃)：

  1)MRS琼脂平板培养基：生长不良，菌落呈圆形，不规则，

    表面光滑，乳白色；

  2)MRS琼脂斜面培养基：生长不良，无光泽，乳白色；

  3)MRS液体培养基：生长良好，液体混浊，有沉淀。

(3)生理特征：

  1)木糖：+

  2)海藻糖：+

  3)蔗糖：+

  4)山梨醇：+

  5)水杨苷：+

  6)核糖：+

  7)鼠李糖：-

  8)棉子糖：+

  9)密二糖：+

  10)甘露糖：+

  11)甘露醇：+

  12)麦芽糖：+

  13)乳糖：+

  14)葡萄糖酸盐：+

  15)半乳糖：+

  16)果糖：+

  17)七叶灵：+

  18)纤维二糖：+

  19)***糖：+

  20)苦杏仁苷：+

  21)乳酸旋光性：DL

  22)接触酶：-

  23)产吲哚能力：-

  24)分解酪素：-

根据以上细菌学特征，以及此菌株HSC235培养物基于其对底物的利用情况可确定为植物乳杆菌Lactobacillus plantarum。

该菌种在MRS培养基上保藏，通常所用的培养基含有：碳源(例如葡萄糖、乳糖、乳清)，氮源(如)，有机营养物质(如酵母抽提物，蛋白胨，胰白胨，植物蛋白胨，牛肉膏，玉米浆)，无机营养成分(如磷酸盐、镁、钾、锌、铁、钴和锰)，及作为诱导物质的亚油酸，或者含亚油酸的其它物质，或者亚油酸结构类似物等。在20℃～40℃培养温度下均能生长，最适的生长温度为28℃～37℃。培养条件：pH值4.0～7.0，最适的生长pH值为6.0～6.6。该菌种在含明亚油酸的MRS培养基上厌氧条件下培养1天～3天，所得细胞具有转化亚油酸及亚油酸类物质为共扼亚油酸的能力。

本发明制备高活性乳酸菌制品的方法，包括：

(1)将菌株CCTCC No.M204051进行常规斜面培养活化和种子培养；

(2)配制发酵培养基，并经灭菌后接菌种，发酵培养基配方，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：

酵母提取物：5.0-15.0

蛋白胨：10.0-30.0

氯化钠：8.5

葡萄糖：20.0-30.0

亚油酸：8-30

微量元素：适量

吐温80：1ml/L～5ml/L

其余为水；

(3)发酵工艺

a.接种子液，接种量为发酵培养基溶液的5％～15％(v/v，等单位体积之比)，种子液的光密度(OD值)为1～3；

b.发酵过程中，长菌温度为28℃～30℃，时间为60h～66h；

c.采取慢速加糖方式，加糖量为100g-350g(发总发酵液体积10升计)，且在接种后6h开始，在48h内加完；

d.上述发酵培养基中亚油酸一般不能直接加入，而经与其它分散剂混合后才能加入，且控制发酵液中亚油酸的浓度，采用缓慢加入的方式；

e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间；

(4)菌泥收集和干燥：发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次(7000转/分，20min，4℃)，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得活菌粉。

本发明发酵培养基中微量元素为无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，CoCl₂ 0.002g。

本发明设计了酶诱导物的提供方式，一定浓度的亚油酸对于细菌的生长具有抑制作用，而且亚油酸在发酵培养基的溶解性较小，因此将亚油酸溶解或包埋在环糊精、淀粉、牛血清蛋白-卵磷脂、牛血清蛋白、卵磷脂、甘油、单甘脂物质之一中，再行添加。其添加方式为：发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度控制在0.4g/L以内，在接种培养12h后再间歇补加，48h内加完。

发酵结束，经分离、收集、干燥，制得的冻干制品即活菌粉中活菌数可达10¹⁰个/g。菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达42.7％。乳酸菌活菌计数按GB/T 4789.35-2003规定测定，共轭亚油酸采用气相色谱法(GC)和紫外分光光度法测定(吴冀华，裘爱泳，气相色谱法分析共轭亚油酸异构体，中国油脂，2002，27：65-67；Shigenobu Kishino，Jun Ogawa.Conjugated Linoleic Acid Production from Linoleic Acid by Lactic AcidBacteria.Journal of American Oil Chemistry Society.2002，79：159-163；JohnAG，Roach M，Mossoba M.Chromatographic separation and identification ofconjugated linoleic acid isomers.Analytica Chimica Acia，2002，465：207-226；张亚刚，樊莉等，紫外可见分光光度法在共轭亚油酸定量分析中的应用，新疆石油学院学报，2002，14：59-64)。

本发明具有如下特点：

采用本发明的菌株HSC235，菌体得率高，菌体OD值在2～6.3，所得菌粉活菌数可达10¹⁰个/g；所得菌体具有转化亚油酸生成共轭亚油酸的能力；亚油酸采用促溶剂进行保护溶解，降低其对细胞生长的抑制作用，另一方面增强了其诱导作用，提高了转化率，其对亚油酸的转化率可达17％～42.7％(底物质量转化率)；且发酵温度低，降低了能耗，节省成本。采用本发明所得乳酸菌粉可作为益生菌在食品、生物饲料等方面使用，以提高突宿主体内共轭亚油酸的含量。

(四)具体实施方案下面实施例旨在举例说明而不是限制本发明的范围。

实施例1：

菌种保藏培养基：

MRS培养基成分(以制备1L为计量)：胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸出物5g，葡萄糖20g，吐温80 1ml，K₂HPO₄2g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g。(pH＝6.0～6.2)，用蒸馏水配制，121℃湿热灭菌20分钟；

种子培养基：同菌种保藏培养基；

种子液的制备：经上述斜面培养基活化的菌种CCTCC No.M204051，接入种子培养基中培养，培养温度37℃，摇床转速120rpm，培养时间1天，获得种子培养液，种子培养液中菌体密度OD值控制在1～3之间。

发酵培养基(以制备1L为计量，若制备10L发酵培养基，则相应的组分量也增加10倍，在以下实施例中也以此类推)：酵母提取物5g，蛋白胨10g，氯化钠8.5g，葡萄糖20g，亚油酸8g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，CoCl₂ 0.002g，吐温-80 1ml，其余为水，pH6.5，灭菌备用。

酶诱导物(亚油酸)的提供方式：

将发酵培养基中的亚油酸溶解或包埋在环糊精中添加入发酵液中，发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度控制在0.2g/L；其余在发酵过程中添加入发酵液中，即在接种子液培养发酵12h后，剩余的溶解或包埋在环糊精中的亚油酸量，分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液中亚油酸的总加入量为8g/L。

发酵工艺：

按上述配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子培养液，菌种的接种量为培养基溶液的5％，即500mL，光密度(OD值)为1；

将10L发酵培养基所需的亚油酸溶解或包埋在环糊精中，添加入发酵液中，控制发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度为0.2g/L；剩余的亚油酸在发酵过程中再添加入发酵液中；

用氢氧化钠来调节pH6.0，开始培养发酵；

在开始培养发酵6h后把葡萄糖100g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，在48h内加完；

在接种子液培养发酵12h后，将剩余的溶解或包埋在环糊精中的亚油酸量，分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液中亚油酸的总加入量为8g/L；

继续发酵，总时间为60h，整个发酵过程中长菌培养及诱导温度控制在30℃左右；发酵过程中采用氢氧化钠和盐酸调节pH，使发酵过程中的pH值维持在6.0～6.6之间。

菌泥收集和干燥：发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次(7000转/分，20min，4℃)，离心收集细胞，加保护剂(选择甘油，脱脂奶粉，海藻糖，甘露醇中的任意一种物质作为保护剂)，真空冷冻干燥，即得冻干制品——活菌粉。冻干制品中活菌数所得菌粉活菌数可达2.1*10¹⁰个/g，菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达17％。

实施例2：

斜面培养基：同实施例1；

种子培养基和种子液的制备：同实施例1；

发酵培养基：酵母提取物10g，蛋白胨20g，氯化钠8.5g，葡萄糖25g，亚油酸12g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，CoCl₂ 0.002g，吐温-803ml，其余为水，pH值6.0，灭菌备用。

诱导物的提供方式：

将发酵培养基中的亚油酸先溶解或包埋在单甘酯中，再添加入发酵液中，发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度控制在0.3g/L；接种子液培养12h后，将剩余的溶解或包埋在单甘酯中的亚油酸，分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液中亚油酸的总加入量为12g/L。

发酵工艺(在下面的发酵工艺中不再重复亚油酸的加入方式)：

按上述配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子培养液，菌种的接种量为培养基溶液的10％，即1L，光密度(OD值)为2；用氢氧化钠来调节pH6.0，开始培养发酵；在培养6h后开始把葡萄糖200g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，在48h内加完；发酵时间72h，发酵过程中长菌及诱导温度为28℃；发酵过程中采用氢氧化钠和盐酸调节pH，使发酵过程中的pH值始终维持在6.0～6.6之间。

菌泥收集和干燥：过程同实施例1，冻干制品中活菌数所得菌粉活菌数可达5.7*10¹⁰个/g。菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达24.1％。

实施例3：

斜面培养基：同实施例1；

种子培养基和种子液的制备：同实施例1；

发酵培养基：酵母提取物15g，蛋白胨30g，氯化钠8.5g，葡萄糖30g，亚油酸20g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，CoCl₂ 0.002g，吐温-80 5ml，其余为水，pH值6.6，灭菌备用。

酶诱导物的提供方式：

将发酵培养基中的亚油酸溶解或包埋在牛血清蛋白-卵磷脂中，再添加入发酵液中，发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度控制在0.4g/L(即每升发酵液中含4g亚油酸)；其余在发酵过程中添加入发酵液中，即在接种子液发酵培养12h后，将剩余的溶解或包埋在牛血清蛋白-卵磷脂中的亚油酸再分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液亚油酸的总加入量为20g/L。

发酵工艺(在下面的发酵工艺中不再重复亚油酸的加入方式)：

按上述配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子培养液，菌种的接种量为培养基溶液的15％，即1.5L，光密度(OD值)为2.5；用氢氧化钠来调节pH6.0，开始培养发酵；在开始培养6h后把葡萄糖350g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，在48h内加完；发酵过程中长菌及诱导温度30℃，发酵总时间66h；发酵过程中采用氢氧化钠和盐酸调节pH，使发酵过程中的pH值始终维持在6.0～6.6之间。

菌泥收集和干燥：过程同实施例1，冻干制品中活菌数所得菌粉活菌数可达9.7*10¹⁰个/g。菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达42.7％。

实施例4：

斜面培养基：同实施例1；

种子培养基和种子液的制备：同实施例1；

发酵培养基：酵母提取物15g，蛋白胨30g，氯化钠8.5g，葡萄糖30g，亚油酸30g，无水醋酸钠5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·H₂O 0.05g，柠檬酸二铵2g，CoCl₂：0.002g，吐温-80 4ml，其余为水，pH值6.0，灭菌备用。

酶诱导物的提供方式：

将发酵培养基中的亚油酸溶解或包埋在淀粉，或卵磷脂，或甘油，或牛血清蛋白的一种物质中，再添加入发酵液中，发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度控制在0.4g/L；接种子液培养12h后，将剩余的溶解或包埋在淀粉、卵磷脂中亚油酸分三次间歇补加入发酵液中，48h内加完，发酵液亚油酸的总加入量为30g/L。

发酵工艺(在下面的发酵工艺中不再重复亚油酸的加入方式)：

按上述配方配制10L发酵液于发酵罐中，经灭菌后接种子培养液，菌种的接种量为培养基溶液的15％，即1.5L，光密度(OD值)为3；用氢氧化钠来调节pH6.0，开始培养；在开始培养6h后把葡萄糖350g(首先配制成30％的溶液消毒)慢速加入发酵罐，用时20h；发酵过程中长菌及诱导温度30℃，发酵为时间66h；发酵过程中采用氢氧化钠和盐酸调节pH，使发酵过程中的pH值维持在6.0～6.6之间。

菌泥收集和干燥：过程同实施例1，冻干制品中活菌数所得菌粉活菌数可达9.3*10¹⁰个/g。菌体转化亚油酸生成共轭亚油酸的转化率可达32.7％。

Claims (5)

1.一种能有效转化亚油酸为共扼亚油酸的微生物菌株，是植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum HSC 235)CCTCC No.M204051，利用该菌株制备高活性乳酸菌制品的方法，包括：

(1)配制发酵培养基，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/L：酵母提取物：5.0-15.0，蛋白胨：10.0-30.0，氯化钠：8.5，葡萄糖：20.0-30.0，亚油酸：8-30，无水醋酸钠：5，MgSO₄·7H₂O：0.2，MnSO₄·H₂O：0.05，柠檬酸二铵：2，CoCl₂0.002，吐温80：1ml/L-5ml/L，其余为水，pH值为6.0～6.6；

(2)将菌株CCTCC No.M204051，HSC235进行常规斜面活化、种子培养，种子液接入上述发酵培养基中进行培养、发酵，发酵工艺：

a.种子液接种量为发酵培养基溶液的5％～15％，种子液的光密度OD值为1～3；

b.发酵过程中培养条件：长菌温度为28℃～30℃，发酵时间为60h～72h；

c.采取慢速补加糖方式，加糖量为每10升发酵液100g-350g，且在接种后6h开始，48h内加完；

d.采用缓慢加亚油酸的方式；

e.发酵过程中采用添加氢氧化钠和盐酸自动平衡调节pH值，使pH值维持在6.0～6.6之间；

(3)发酵结束，发酵液经离心脱水，收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，得活菌粉。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是发酵培养基中的亚油酸溶解或包埋在环糊精、单甘脂、牛血清蛋白-卵磷脂、淀粉、牛血清蛋白、卵磷脂、甘油物质中的一种中，再行添加。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征是溶解或包埋后的亚油酸添加方式为：发酵液中亚油酸初始浓度诱导浓度控制在0.4g/L以内，接种培养12h后再间歇补加，48h内加完。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是发酵结束，发酵液通过高速冷冻离心机用去离子无菌水洗涤三次(7000转/分，20min，4℃)，离心收集细胞，加保护剂，真空冷冻干燥，即得活菌粉。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征是所述的保护剂为甘油、脱脂奶粉、海藻糖、甘露醇中的一种。