CN1789974A - 鱼类分子生物学快速鉴别方法 - Google Patents

Abstract

一种鱼类分子生物学快速鉴别方法，其特征是按以下步骤进行：(1)设计“目”的所有鱼类通用引物对；(2)采用通用引物对，对该“目”中的各种鱼的DNA样本进行扩增；(3)选出每一种鱼的与其它鱼种有差异的DNA片段；(4)为每一种鱼分别设计并筛选出一条特异引物；(5)用通用引物对中的一条引物分别与每一种鱼的特异引物配对，构成每一种鱼的“引物对”；(6)分别对每一种鱼的DNA样本进行PCR扩增；将所得到的扩增产物相混合，作为分型标准物；(7)将通用引物对和每一种鱼的一条特异引物相混合，构成混合引物；(8)采用混合引物，对需要鉴别的鱼类DNA样本进行扩增；(9)根据扩增产物的电泳条带的对比，得到鉴别结果。

Description

鱼类分子生物学快速鉴别方法

技术领域

本发明涉及一种鱼类分子生物学鉴别方法。

背景技术

保护生物多样性，就是保护人类自己。由于水体生态环境的特殊性和大多数水产动物一直是人们捕捉的对象，鱼类生物多样性比陆生动物多样性显得更为脆弱，承受的压力更大。保护好鱼类种质资源，就是保护人类生存所必须的水产动物蛋白的生产源泉。鱼类资源是一种可更新的资源，只要利用得当，就可取之不尽，经久不衰，但如果酷捕滥捕，也可发生资源枯竭或个体变小、质量降低。捕捞并不是一个消极因素，只要捕捞合理，它可使鱼类种群产生最大的生产量，人们可获得最大持续量。据Nelson(1994)报道，全世界共有鱼类24618种，占脊椎动物种数的一半以上，在动物界中仅次于昆虫。在全世界，水面占地球表面的71％，其中，海洋占地面总水面的97％，而淡水仅占地面总水面的1％，但41％的硬骨鱼类正是生活在面积极其有限的淡水水体里(Cohen，1970)。全世界约有10亿人以鱼类为主要的蛋白质来源，但同农作物及畜禽类不同的是，目前，人类所消费的鱼类数量的80％以上依然来自天然捕捞产品。在全世界水产动物，如鱼类中，只有少数种类已用于养殖，极大多数种类的养殖潜力尚待评估。据初步统计，仅中国，由于工农业生产的迅猛发展以及生活水平提高后对水产品需求的剧增，水域生态***处于持续增长的压力之下，处于濒危状态和受到严重威胁的鱼类有97种(9目，24科，80属)(陈灵芝，1993)。

由于鱼类分布范围广泛，地理差异，生态环境的不同，使得各个地区的种类不同。由于人们的生活水平的提高，对鱼产品的需求猛增，于是产生了对鱼类的过渡捕捞，乱捕乱捞时有发生，再加上人们为了满足各种需要而对鱼类生态环境造成的破坏；使许多鱼种濒临灭绝。虽然我们采取了一些措施，例如每年设立禁鱼期，发布鱼类保护***，但由于没有强有力的执法队伍，主要是缺乏快速、准确、经济、易于操作的鱼类鉴别方法(FAO 2000；Hoelzel2001；Pank etal.2001；Smith and Benson 2001；Shivji etal.2002)，所以远远达不到预期目的。国内外过去常采用核DNA和线粒体DNA限制性长度多态性、同工酶电泳、RAPD技术进行鱼类鉴别(Martin 1993；Malik et al.1997；Baker et al.1998；Palumbi and Cipviano 1998；Heist and Gold1999；Diozon et al.2000)，上述现有方法具有繁琐费时、费力、费钱，不利于操作，可重复性差，误差大等弊端(Callejas et al.2001；Chapman etal.2003)。

发明内容

本发明的目的是提供一种耗费时间少、易于实验室操作、方便直观的鱼类分子生物学快速鉴别方法。

本发明方法的基本思路是：设计并筛选出一对对鱼类某一个目rDNA特异的引物作为这个目的通用引物，利用该通用引物扩增出该目下的各种鱼的DNA片段并测序，然后通过对比设计出各种鱼的特异引物，通过PCR实验筛选出对各种鱼扩增效果好的特异引物，同时把各种鱼的特异引物扩增出的DNA片段作为分型标准物，然后把该目下各种鱼的特异引物和通用引物进行混合，利用所得混合引物对需鉴别的鱼类DNA样本进行PCR扩增，并对得到的PCR产物进行琼脂糖电泳，即可根据电泳条带对同一目中的鱼进行鉴别分类。

具体来说，本发明的鱼类分子生物学快速鉴别方法是按以下步骤进行：

(1)、设计并筛选出一对特异针对鱼类某一个“目”的核糖体DNA的引物，作为这个“目”的所有鱼类通用引物对；

(2)、采用步骤(1)中的通用引物对，对该“目”中的各种鱼的DNA样本分别进行PCR扩增，得出该“目”的各种鱼的PCR扩增产物；

(3)、分别对上一步骤所得到的各种鱼的PCR扩增产物测序，根据测序结果选出每一种鱼的一个与其它鱼种有差异的DNA片段；

(4)、在上一步骤所选出的DNA片段的区域内，为该“目”中的每一种鱼分别设计并筛选出一条特异引物；

(5)、用步骤(1)所得到的同一“目”鱼类通用引物对中的一条引物分别与该“目”中的每一种鱼的特异引物配对，构成该“目”中的每一种鱼的“引物对”；

(6)、使用上一步骤所得到的每一种鱼的“引物对”，分别对该“目”中的每一种鱼的DNA样本进行PCR扩增；将所得到的该“目”中的各种鱼的PCR扩增产物相混合，作为分型标准物；

(7)、将步骤(1)中所得的通用引物对和步骤(4)中得到的每一种鱼的一条特异引物相混合，构成混合引物；

(8)、采用上一步骤所得到的混合引物，在PCR反应体系中对需要鉴别的鱼类DNA样本进行扩增；

(9)、让上一步骤所得到的扩增产物和所述分型标准物在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据需要鉴别的鱼类DNA扩增产物的电泳条带与分型标准物的电泳条带的对比，得到鉴别结果。

在本发明的步骤(3)中，要求在对由通用引物扩增出的每种鱼的DNA片段测序时，要特别准确，否则根据测序结果设计出来的特异引物与目标DNA序列不吻合，无法进行特异扩增，导致扩增失败。

在本发明的步骤(4)中，各种鱼特异引物的设计需要考虑以下几个方面的要素：①、它必须是每种类鱼类基因组的特异序列，即它的序列不会与非特异种鱼类基因组序列相同或互补。②、选取适当的引物长度。大量实验结果表明，在设计引物时，引物长度是一个非常关键的参数，18～24个碱基构成的寡核苷酸链是比较优化的引物长度；引物过短，将会导致特异性的降低；引物过长，扩增退火时被引发的模板太少，在指数扩增期，甚至每一步退火步骤的小失误都将扩大，以致引起扩增产物的明显减少。③、选取引物中碱基GC的含量和引物的退火温度Tm。较低的Tm值会导致特异性的丧失，若采用太高的退火温度，扩增的效率将会非常低同时也会产生非特异扩增；如果退火温度太低，引物将产生非特异性退火，从而导致非特异性DNA片段的扩增。本发明推荐在设计引物的Tm值时选择61℃，因为在该温度下，复合扩增中绝大多数的PCR反应都能进行。

本发明中，每种鱼特异引物扩增出来的DNA片段的大小一定要能在琼脂糖凝胶电泳时能肉眼识别片段大小的差异，所以在设计引物时一定要考虑PCR扩增产物的长度。

在本发明的步骤(5)中，采用了步骤(1)所得到的“目”的鱼类通用引物对中的一条引物分别与该“目”中的各种鱼的特异引物配对，进而构成该“目”中的各种鱼的“引物对”。在实际操作时，可以在通用引物对中任选一条引物与该“目”中的各种鱼的特异引物配对。

在本发明中，特别地采用步骤(6)得到分型标准物，这一点极其重要，这也是本发明有别于现有技术的重要区别特征。这是因为，该分型标准物来自于每种鱼的特异引物的扩增产物，它具有唯一性，即与每一种鱼的特定DNA内部结构一一对应，从而为鱼种的最后鉴别提供了基础。

在本发明的步骤(7)中，在将通用引物对和各种鱼的一条特异引物相混合而构成混合引物时，可以根据实际需要而采用不同的混合比例。本发明推荐采用大致为1比1的混合比例，即采用通用引物对中的每条引物与各种鱼的一条特异引物等量的混合比例。

在本发明的上述步骤中，所涉及的PCR扩增、PCR扩增产物测序、特异引物的设计和筛选、琼脂糖凝胶电泳等具体操作均可以沿用现有技术得以实现。例如，在步骤(8)中，当在PCR反应体系中对需要鉴别的鱼类DNA样本进行扩增时，除了使用步骤(7)所得到的混合引物之外，PCR反应体系中还应当使用其它试剂，如DNA聚合酶、MgCl₂、脱氧核苷三磷酸dNTP、BSA(小牛血清蛋白)、缓冲液和双蒸水DDH₂O等，由于PCR反应体系的构成属于现有技术，故不再赘述。

在本发明中，所说的鱼的DNA样本可以按以下常规方法进行提取：a、取鱼类新鲜组织，如鱼的肌肉、鱼鳞、鱼鳍、鱼卵、鱼血、鱼类粘液等，置于1.5ml的离心管消化过夜，用酚----氯法提取DNA；b、鱼类烘干或晒干制品，鱼类罐头制品，可以直接取样，同新鲜组织一样提取DNA；c、对于用95％酒精保存的鱼类组织样本，需用双蒸水浸泡过夜，再用酚----氯法提取DNA。

与前述现有鱼类鉴别方法相比较，本发明的鱼类鉴别方法利用鱼类编码鱼类RNA的核DNA序列的保守性和它的转录间隔子种间的变异，设计出通用引物和种属特异性引物，从而建立了一种快速、准确、经济、直观、易于操作的鉴别珍稀鱼类的方法。对于鱼类形态学等其它方法无法鉴别的鱼类卵子，鱼类粘液，鱼类的分割样本，特别是鱼类的混合样本来说，本鉴别方法均能够有效并快速地加以鉴别。同时，本方法的样本需要量小，通过一片鱼鳞、一个鱼卵、一滴粘液或者是粘液斑痕就能确定鱼类种属。本方法的最大优点是能够对混合样本进行检测，这种检测能够帮助实现对珍稀鱼类产卵场准确定位，迅速统计珍稀鱼类(特别是濒危鱼类)种群的大小，通过对各种珍稀鱼类生物学特性分子水平的了解，了解它们繁殖所需的生态环境，准确地掌握它们的繁殖行为和繁殖时的生理生化变化，为我国的珍稀鱼类的人工繁殖提供可靠的科学依据。同时，本方法还为打击非法捕捞、非法经营、非法走私提供了有力的技术保障。另外，对那些鱼类分类不是很擅长的非鱼类专业人员来说，本方法也极具实用价值。

本发明的内容结合以下实施例作更进一步的说明，但本发明的内容不仅限于实施例中所涉及的内容。

附图说明

图1和图2是采用通用引物对对鱼类DNA样本进行PCR扩增的扩增结果图。

图3是采用混合引物同时对四川白甲DNA样本、华鲮DNA样本、胭脂鱼DNA样本、岩元鲤DNA样本和重口裂腹鱼DNA样本进行PCR扩增的扩增产物电泳结果图。

图4是采用混合引物对四川白甲的DNA样本进行PCR扩增的扩增产物电泳结果图。

图5是采用混合引物对华鲮的DNA样本进行PCR扩增的扩增产物电泳结果图。

图6是采用混合引物对重口裂腹鱼的DNA样本进行PCR扩增的扩增产物电泳结果图。

图7是采用混合引物对胭脂鱼的DNA样本进行PCR扩增的扩增产物电泳结果图。

图8是采用混合引物对岩元鲤的DNA样本进行PCR扩增的扩增产物电泳结果图。

具体实施方式

本实施例以鲤形目的鉴定为例，先设计出鲤形目的通用引物，分别对要鉴定的鱼的DNA样本进行扩增，对每种鱼DNA样本的扩增产物测序，设计筛选出每种鱼的特异引物，用特异引物对每种鱼的DNA样本进行扩增，扩增产物作为分型标准物(即分子马克)，再把通用引物和特异引物进行混合，对要鉴定的鱼类DNA样本进行PCR扩增，对扩增产物和分型标准物(即分子马克)进行电泳，即可通过产物在凝胶中的位置与分型标准物中各种鱼PCR扩增产物的位置的比较，清楚地区分出要鉴定鱼的种类。具体步骤如下：

(1)、设计并筛选出一对特异针对鱼类鲤形目的核糖体DNA的引物，作为鲤形目的所有鱼类通用引物对；

(2)、采用步骤(1)中的通用引物对，对鲤形目中的各种鱼的DNA样本分别进行PCR扩增，得出鲤形目的各种鱼的PCR扩增产物；

(3)、分别对上一步骤所得到的各种鱼的PCR扩增产物测序，根据测序结果选出每一种鱼的一个与鲤形目下的其它鱼种有差异的DNA片段；

(4)、在上一步骤所选出的DNA片段的区域内，为鲤形目中的每一种鱼分别设计并筛选出一条特异引物；

(5)、用步骤(1)所得到的鲤形目鱼类通用引物对中的一条引物分别与鲤形目中的每一种鱼的特异引物配对，构成鲤形目中的每一种鱼的“引物对”；

(6)、使用上一步骤所得到的每一种鱼的“引物对”，分别对鲤形目中的每一种鱼的DNA样本进行PCR扩增；将所得到的鲤形目中的各种鱼的PCR扩增产物相混合，作为鲤形目鱼类的分型标准物；

(7)、将步骤(1)中所得的通用引物对和步骤(4)中得到的每一种鱼的一条特异引物相混合，构成混合引物；

(8)、采用上一步骤所得到的混合引物，在PCR反应体系中对需要鉴别的鱼类DNA样本进行扩增；

(9)、让上一步骤所得到的扩增产物和所述分型标准物在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据需要鉴别的鱼类DNA扩增产物的电泳条带与分型标准物的电泳条带的对比，得到鉴别结果。

在本实施例的步骤(1)中，先设计并筛选出了一对对鱼类的鲤形目的核糖体DNA特异的引物，作为鲤形目的鱼类通用引物对，该鲤形目通用引物对为：

左引物：5′-cggtggatcactcggctcgt-3′

右引物：5′-cgtaaccggatggggtcgtg-3′

在本实施例的步骤(2)中，先提取了鲤形目中的四川白甲、华鲮、重口裂腹鱼、三角鲤、鲫鱼、草鱼、岩原鲤、鲢鱼、鳙鱼、建鲤、丰鲤和胭脂鱼的DNA样本，同时，为了进行验证，还提取了非鲤形目的杂交大口鲶、班点叉尾鮰、黄颡鱼、大口黑鲈的DNA样本。

在提取上述鱼类的DNA时，取每种鱼的尾柄肌肉20mg，消化过夜，用酚----氯法提取，酒精沉淀，自然风干，双蒸水溶解保存在-20℃备用。

在常规的PCR扩增体系中，采用通用引物对对鱼类DNA样本进行PCR扩增。

PCR反应体系中的各成份的浓度如下表：

试剂	单管式计量
			DDH2O	22.0μl
dNTP	6.0μl(200μM)
			10×buffer	3.6μl
引物	通用引物	通用引物
			左引物  0.3μl(40nM)	右引物  0.3μl(40nM)
	Taq酶	1μl(3u)
Mgcl2				1.3μl(2.25mM)
	Sample	3μl

扩增过程如下：

(1)预变性：加热至94℃。

(2)变性：加热至94℃秒，使双链DNA解开；

(3)退火：降温至60℃，在此温度下，长引物与模板DNA相结合；

(4)延伸：升温至72℃，此温度是DNA聚合酶反应的最适合温度，聚合酶在Mgcl₂等作用下，在长引物的5′端延着模板的5′→3′方向加入dNTP。

整个复合扩增共循环34轮，循环参数如下：

预变性：           94℃       6分钟

变性：             94℃       30秒

复性：             55℃       60秒

延伸：             72℃       60秒

循环次数：34

延伸：             72℃       10分钟

在上述PCR扩增时，DNA耐热聚合酶、MgCL₂和10×Buffer(缓冲液)直接由市售的PCR试剂盒(生产厂家为TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名为TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。

所得扩增结果如图1、2所示。

从图1、2可以看出，用通用引物可以扩增出全部鲤形目的鱼类，而其它非鲤形目的鱼类不能扩增。

在本实施例的步骤(3)中，分别对上一步骤所得到的各种鱼的PCR扩增产物进行了测序，对于鲤形目中的各种鱼，根据测序结果而各选出一个与鲤形目下的其它鱼种有差异的DNA片段中的区域。

在本实施例的步骤(4)中，根据对扩增产物的测序结果设计出特异引物，再用特异引物扩增所对应的鱼类DNA样本，筛选出好的特异引物。以鲤形目中的胭脂鱼、岩元鲤、四川白甲、华鲮、重口裂腹鱼为例，筛选结果为：

胭脂鱼的特异引物：           5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′

华鲮的特异引物：             5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′

岩元鲤的特异引物：           5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′

重口裂腹鱼的特异引物：       5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′

四川白甲的特异引物：         5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′

在本实施例的步骤(5)中，用步骤(1)所得到的鲤形目的鱼类通用引物对中的一条引物

5′-cggtggatcactcggctcgt-3′

分别与该鲤形目中的上述鱼的特异引物配对，进而构成鲤形目中的各种鱼的“引物对”：

胭脂鱼：     左引物：5′-cggtggatcactcggctcgt-3′

             右引物：5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′

华鲮：       左引物：5′-cggtggatcactcggctcgt-3′

             右引物：5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′

岩元鲤：     左引物：5′-cggtggatcactcggctcgt-3′

             右引物：5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′

重口裂腹鱼： 左引物：5′-cggtggatcactcggctcgt-3′

             右引物：5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′

四川白甲：   左引物：5′-cggtggatcactcggctcgt-3′

             右引物：5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′

在本实施例的步骤(6)中，使用上述各种鱼的“引物对”，分别对鲤形目中的各种鱼的DNA样本进行PCR扩增；将所得到的鲤形目中的各种鱼的PCR扩增产物相混合，作为分型标准物。

PCR反应体系中的各成份的浓度如下表：

试剂	单管式计量
			DDH2O	22.0μl
dNTP	6.0μl(200μM)
			10×buffer	3.6μl
引物	通用引物	特异引物
			左引物0.3μl(40nM)	0.3l(40nM)(每种鉴定鱼)
	Taq酶	1μl((3u)
Mgcl2				1.3μl(2.25mM)
	Sample	3μl

扩增过程如下：

(1)预变性：加热至94℃。

(2)变性：加热至94℃秒，使双链DNA解开；

(3)退火：降温至60℃，在此温度下，长引物与模板DNA相结合；

(4)延伸：升温至72℃，此温度是DNA聚合酶反应的最适合温度，聚合酶在Mgcl₂等作用下，在长引物的5′端延着模板的5′-3′方向加入dNTP。

整个复合扩增共循环34轮，循环参数如下：

预变性：  94℃       6分钟

变性：    94℃       30秒

复性：    55℃       60秒

延伸：    72℃       60秒

循环次数：34

延伸：    72℃       10分钟

在上述PCR扩增时，DNA耐热聚合酶、MgCL₂和10×Buffer(缓冲液)直接由市售的PCR试剂盒(生产厂家为TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名为TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。

在本实施例的步骤(7)中，将步骤(1)中所得的该鲤形目通用引物对

左引物：5′-cggtggatcactcggctcgt-3′

右引物：5′-cgtaaccggatggggtcgtg-3′

和步骤(4)中得到的各种鱼的一条特异引物

胭脂鱼的特异引物：    5′-GGGCAACAGGAGGGCGTACC-3′

华鲮的特异引物：      5′-GCACACAACGTCCCCGAACC-3′

岩元鲤的特异引物：    5′-GGCCTTAAGCGAGCGGGTTC-3′

重口裂腹鱼的特异引物：5′-AGCCGCGGAGGGGAGGAC-3′

四川白甲的特异引物：  5′-GACGAGGCGCCGGGAGGAAG-3′相混合而构成混合引物。在本实施例中，通用引物对中的每条引物与各种鱼的特异引物以1比1的比例等量混合。

在本实施例的步骤(8)中，采用上一步骤所得到的混合引物，在PCR反应体系中对需要鉴别的鱼类DNA样本进行扩增。本实施例在进行PCR扩增反应时，按照PCR扩增的方法加入各种试剂、引物和需鉴别鱼类的样本。PCR反应体系中的成份主要有：模板DNA(待鉴别的鱼类DNA样本)、所述混合引物、高GC耐热DNA聚合酶、MgCl₂、脱氧核苷三磷酸dNTP、1×Buffer(缓冲液)和双蒸水DDH₂O。其中，DNA耐热聚合酶、MgCL₂和10×Buffer(缓冲液)直接由市售的PCR试剂盒(生产厂家为TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.，Ltd.品名为TakaRa LA TaqDNA聚合酶)提供。

PCR反应体系中的各成份的浓度如下表：

试剂	单管式计量
			DDH2O	22.0μl
dNTP	6.0μl(200μM)
			10×buffer	3.6μl
引物	通用引物	特异引物
			左引物0.2μl(40nM)
	右引物0.2μl(40nM)	0.2μl(40nM)(每种鉴定鱼)
			Taq酶	1μl(3u)
Mgcl2	1.3μl(2.25mM)
			Sample	3μl

扩增过程如下：

(1)预变性：加热至94℃。

(2)变性：加热至94℃秒，使双链DNA解开；

(3)退火：降温至60℃，在此温度下，长引物与模板DNA相结合；

(4)延伸：升温至72℃，此温度是DNA聚合酶反应的最适合温度，聚合酶在Mgcl₂等作用下，在长引物的5′端延着模板的5′→3′方向加入dNTP。

整个复合扩增共循环34轮，循环参数如下：

预变性：  94℃    6分钟

变性：    94℃    30秒

复性：55℃        60秒

延伸：72℃        60秒

循环次数：34

延伸：72℃        10分钟

在本实施例的步骤(9)中，鉴于扩增产物的分子量大小、片段长短不同，特别地利用电泳检测法对其进行分离检测，以便检验扩增结果。进行分离检测时，先将上一步骤所得到的扩增产物与上样缓冲液以一定的比例混匀，加入电泳槽中的琼脂糖凝胶(凝胶中已加入溴乙淀)孔中，在其两端加以电压进行电泳。由于各扩增产物的分子大小不同，在相同电场力的作用下，其在单位时间内在相同的介质中所运行的距离也不等。因此，在电泳仪中处理一段时间之后，各扩增产物的差距逐渐拉开，此后取出凝胶，在紫外线灯下观察，根据电泳条带的位置，与分型标准物进行比较，最后即能直观地看到鉴别结果。

所采用的电泳检测原料、设备及条件如下：

琼脂糖凝胶成份：

1、1.5％琼脂糖凝胶溶液            10ml

2、每100ml琼脂糖凝胶溶液中加入10ul1‰的溴乙淀

电泳仪：pharmacia1000型多功能电泳仪

电泳条件：

1、上样量：样本3μl  凝胶载样缓冲液：2μl

   电极缓冲液：0.5×TBE溶液

2、采用恒流方式电泳电流：40mA    时间：30～40分钟

另外，由步骤(6)得到的分型标准物也上样2.0ul，电泳30～40分钟。

就步骤(8)和步骤(9)来说，在采用混合引物同时对四川白甲DNA样本、华鲮DNA样本、胭脂鱼DNA样本、岩元鲤DNA样本和重口裂腹鱼DNA样本进行PCR复合扩增之后，在紫外线灯下所观察到的扩增结果如图3所示。

在采用混合引物对四川白甲的DNA样本进行PCR扩增之后，在紫外线灯下所观察到的扩增结果如图4所示。

在采用混合引物对华鲮的DNA样本进行PCR扩增之后，在紫外线灯下所观察到的扩增结果如图5所示。

在采用混合引物对重口裂腹鱼的DNA样本进行PCR扩增之后，在紫外线灯下所观察到的扩增结果如图6所示。

在采用混合引物对胭脂鱼的DNA样本进行PCR扩增之后，在紫外线灯下所观察到的扩增结果如图7所示。

在采用混合引物对岩元鲤的DNA样本进行PCR扩增之后，在紫外线灯下所观察到的扩增结果如图8所示。

在图1～8中，所标注的第一原始分型标准物M1、第二原始分型标准物M2是指市售的用于测量DNA片段大小的基准标准物。

从图3、4、5、6、7、8我们可以看出，每种鱼的特异引物只对该种鱼的特异位点进行扩增，该种鱼的扩增产物电泳后有两条带；其它鱼的样本，不是同一目的样本不能进行扩增，因此无扩增产物，电泳时无条带；同一目的只有通用引物扩增的产物，电泳只产生一条带，通过与分型标准物的电泳条带相对比，就可以鉴别各种鱼。

需要说明的是：在本实施例的上述步骤(8)和步骤(9)中，是在已知的鱼类DNA样本下进行扩增和观测、验证的(即已经事先知道所扩增和观测的鱼类DNA样本属于哪一种鱼)，这主要是为了测定本发明方法用于鉴别鱼类时的可行性及可靠性。而在实际操作中使用本方法时，事先并不知道需要鉴别的鱼的种类，因此步骤(9)的实际做法是：依据观察到的扩增结果并与分型标准物的电泳条带相对比，推知步骤(8)所扩增的鱼类DNA样本属于哪一种鱼，进而判别待鉴别鱼的种类。

当然，就本发明的方法来说，除能够对鲤形目中的上述胭脂鱼、岩元鲤、四川白甲、华鲮、重口裂腹鱼进行鉴别外，还可以对鲤形目中的其它鱼类进行鉴别。同时，本发明的方法还可以对除鲤形目之外的其它目的鱼类进行鉴别。在对其它目的鱼类进行鉴别时，除设计并筛选出的通用引物及各种鱼的特异引物有所不同之外，其鉴别步骤及原理均与本实施例相同，故不再赘述。

Claims (1)

1、一种鱼类分子生物学快速鉴别方法，其特征是按以下步骤进行：

(1)、设计并筛选出一对特异针对鱼类某一个“目”的核糖体DNA的引物，作为这个“目”的所有鱼类通用引物对；

(2)、采用步骤(1)中的通用引物对，对该“目”中的各种鱼的DNA样本分别进行PCR扩增，得出该“目”的各种鱼的PCR扩增产物；

(3)、分别对上一步骤所得到的各种鱼的PCR扩增产物测序，根据测序结果选出每一种鱼的一个与其它鱼种有差异的DNA片段；

(4)、在上一步骤所选出的DNA片段的区域内，为该“目”中的每一种鱼分别设计并筛选出一条特异引物；

(5)、用步骤(1)所得到的同一“目”鱼类通用引物对中的一条引物分别与该“目”中的每一种鱼的特异引物配对，构成该“目”中的每一种鱼的“引物对”；

(6)、使用上一步骤所得到的每一种鱼的“引物对”，分别对该“目”中的每一种鱼的DNA样本进行PCR扩增；将所得到的该“目”中的各种鱼的PCR扩增产物相混合，作为分型标准物；

(7)、将步骤(1)中所得的通用引物对和步骤(4)中得到的每一种鱼的一条特异引物相混合，构成混合引物；

(8)、采用上一步骤所得到的混合引物，在PCR反应体系中对需要鉴别的鱼类DNA样本进行扩增；

(9)、让上一步骤所得到的扩增产物和所述分型标准物在琼脂糖凝胶上进行电泳，根据需要鉴别的鱼类DNA扩增产物的电泳条带与分型标准物的电泳条带的对比，得到鉴别结果。

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