CN1788077A - 用于制备免疫保护性组合物的载体和来源于转基因植物的细胞 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于制备基因转化的植物细胞的载体和方法，所述细胞表达来自病原性生物体的免疫原，用来生产用在疫苗制剂中的免疫保护性颗粒。本发明包括编码新城疫病毒HN蛋白的植物优化的基因。本发明还涉及在转基因植物中生产抗原的方法。

Description

用于制备免疫保护性组合物的载体和来源于转基因植物的细胞

本申请要求享有2003年5月5日递交的美国临时申请No.60/467,998的优先权。上述申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明大体涉及植物分子生物学领域，因为它应用于重组生产植物制造的疫苗。

背景技术

重组DNA技术已经在包括疫苗的药物和兽药的安全性、质量、功效和成本方面取得实质性进展。Curtiss和Cardineau发明了植物生产的粘膜疫苗。见美国专利No.5,654,184；5,679,880和5,686,079，它们通过引用并入本文。有人已经描述表达免疫保护性抗原的转基因植物及其生产方法，其中包括Arntzen、Mason和Lam。见美国专利No.5,484,717；5,914,123；6,034,298；6,136,320；6,194,560和6,395,964，它们通过引用并入本文。

在植物***中生产的疫苗有很多超过常规生产***的优点。常规生产的疫苗株(活疫苗和带载体的疫苗)可能恢复毒力或携带生产过程中的生物污染物。亚单位疫苗难以生产和纯化，这是由于在原核生物中生产时的蛋白质不稳定问题和不能被糖基化。

植物细胞生产不需要在生长培养基中加入动物来源的成分，基本消除了传播来自生产过程的病原体污染的危险。植物细胞可以进行翻译后糖基化，与疫苗制备中目前使用的常规生长培养基相比，植物细胞生长培养基通常更便宜且容易操作和制备。

针对特定病原体的***免疫起因于免疫***的活化，这种活化是针对由特定病原性生物呈递的或由设计用于保护免受特定病原体成分攻击的疫苗而得的抗原的应答。暴露于病原体经常通过总是暴露于病原性生物并受其激发的粘膜表面发生。

粘膜和口腔免疫由覆盖呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道的黏膜表面的分泌物以及来自所有分泌腺的分泌物中分泌型IgA(sIgA)抗体的生成引起。McGhee，J.R.et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.409，(1983)。这些分泌型IgA抗体可阻止病原体在黏膜表面的定植(Williams，R.C.et al.，Science 177，697(1972)；McNabb，P.C.et al.，Ann.Rev.Microbiol.35，477(1981))，因而是阻止病原体通过黏膜入侵或定植的第一道黏膜保护屏障。可通过对分泌腺或组织的局部免疫或将抗原呈递给肠道相关淋巴组织(GALT或集合***)或支气管相关淋巴组织等方法来刺激sIgA的产生。Cebra，J.J.et al.，Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.41，210(1976)；Bienenstock，J.M.，Adv.Exp.Med.Biol.107，53(1978)；Weisz-Carrington，P.Et al.，J.Inmunol 123，1705(1979)；McCaughan，G.et al.，Internal Rev.Physiol 28，131(1983).膜性微皱褶细胞，也叫做M细胞，覆盖了GALT和BALT的表面，并且可能和其它的分泌性黏膜表面有关。M细胞可从邻近黏膜表面的体腔内提取抗原并将其转移到抗原呈递细胞(树突状细胞和巨噬细胞)，后者又将抗原呈递至T淋巴细胞(当抗原是T细胞依赖性时)，T淋巴细胞将抗原处理后呈送给待命的B细胞。然后B细胞被刺激而增殖，迁移并最终被转化成抗体分泌型浆细胞而产生针对所递呈抗原的IgA。当该抗原被覆盖GALT和BALT的M细胞所俘获时，体内所有分泌组织产生针对抗原的sIgA，导致全身黏膜免疫性。Cebra等，同上；Bienenstock等，同上；Weinz-Carrington等，同上；McCaμghan等，同上。因此经口免疫是刺激全身免疫应答并引起口腔和胃肠道的局部刺激分泌免疫应答的最重要途径。

粘膜免疫还具有可传递给后代的优势。新生儿免疫可通过初乳和/或母乳被动获得。这称为乳源免疫，是在生命早期保护动物的有效方式。sIgA是乳汁中的主要免疫球蛋白，并可最有效的通过粘膜免疫诱导。

覆盖肠相关淋巴组织的集合***的M细胞可以获取多种抗原性物质和颗粒(Sneller，M.C.and Strober，W.，J.Inf.Dis.154，737(1986))。因为它们可以吸收乳胶和聚苯乙烯微球、木炭、微胶囊和其它可溶性和颗粒性物质，可以不依赖于待递送物质的任何特异性粘附型性质而递送多种物质给GALT。

用于生产转基因植物来源的免疫保护性抗原的载体和细胞以及改进的抗原生产方法将大大有助于开发、制造植物产生的疫苗，并提高其功效。

发明内容

本发明基于编码目标免疫保护性抗原的植物优化的序列。具体而言，本发明基于编码新城疫病毒的HN抗原的植物优化的DNA序列或编码禽流感病毒的HA抗原的DNA序列。本发明还包括实现免疫保护性抗原基因在植物细胞中表达的重组表达载体，以及含有所述表达载体的植物细胞和转基因植物，以及含有所述表达载体的蛋白质产物的疫苗。本发明还涉及用本发明的疫苗保护免受病原体影响的方法。本发明另外还涉及在转基因植物中生产抗原的方法。

本发明提供编码新城疫病毒的HN抗原的、分离的、植物优化的核苷酸序列，其含有SEQ ID NO：1的序列，还提供了含有SEQ ID NO：1的重组表达载体。

在一个实施方案中，所述载体选自pCHN、pGHN、pGHN151、pGHN153、pMHN、pUHN。

在另一个实施方案中，所述载体含有可操作性连接到SEQ ID NO：1的植物功能性的启动子。

本发明还提供在植物细胞中表达免疫保护性抗原的重组表达载体，其含有编码禽流感病毒的HA抗原的DNA序列，其中所述载体是pCHA。

本发明进一步提供含有本发明载体的用于表达免疫保护性抗原的转基因植物细胞。所述植物细胞包括番茄植物细胞或烟草植物细胞，以及下述任意一种植物物种来源的细胞。

本发明进一步提供含有本发明载体的转基因植物。

本发明还提供含有重组病毒抗原性蛋白质和药学上可接受递体(carrier)的疫苗，其中所述病毒抗原性蛋白质是由本发明载体产生的新城疫病毒的HN抗原，其中所述疫苗施用于动物时可引起免疫应答。

在一个实施方案中，所述疫苗的HN蛋白含SEQ ID NO：2。可在植物细胞中生产所述疫苗的HN蛋白。

本发明还提供含重组病毒抗原性蛋白质和药学上可接受递体的疫苗，其中所述病毒抗原性蛋白质是由本发明载体产生的禽流感病毒的HA抗原，其中所述疫苗施用于动物时可引起免疫应答。在一个实施方案中，在植物细胞中生产所述疫苗的HA蛋确定合适剂量。通常将0.1、1.0、1.5、2.0、5、10或100mg/kg的抗原施用于大型哺乳动物，如狒狒、黑猩猩或人。如果需要，也可在所述抗原性组合物之前、之后或同时提供辅刺激分子或佐剂。优选的是，施用抗原的剂量范围是1ng到0.5mg/kg体重；更优选的是1mg到50mg/kg体重。

通过证明施用所述疫苗预防或改善待治疗的或由感兴趣病原体引起的疾病的症状至少5％、优选10-20％和更优选25-100％，可以测定根据本发明的可食用疫苗的功效。

“鸟”在本文中定义为鸟类的温血脊椎动物成员，所述鸟类具有变成翼的前肢、带鳞片的腿、喙且将后代产在硬壳卵内。对于本说明书目的，优选的鸟是家鸡、火鸡、鸵鸟、鸭、鹅和康尼希雏鸡(cornish game hen)。更优选的是家鸡和火鸡。对于本发明目的，最优选的鸟是家鸡，包括肉鸡(broiler)和产蛋鸡(layer)。

本发明的方法和组合物的目的是免疫和保护人和动物，优选家养动物如鸟(家禽)、牛、绵羊、山羊、猪、马、猫、狗和羊驼(llamas)，最优选是鸟。这些动物物种的某些有多个胃和对植物物质分解特异的消化酶，易于灭活其它类型的口服疫苗。不能理解为对本发明的限制，转基因植物细胞以及由这些细胞来源的组合物的摄入能导致在包括扁桃腺在内的口腔粘膜部位对所述动物的免疫。

本文所用的“果实”指被子植物花的子房及其相连结构(例如，花托或花管部分)，这些结构膨大并发育形成一团围绕种子的组织。根据本发明，参与果实发育的具体组织随物种变化，但根据本发明参与果实发育的组织总是来源于后代种子的母体。

本文所用的“成熟”指特征在于色素改变、酸和淀粉转化成游离糖和细胞壁分解导致果实软化的果实发育阶段。

本文所用的“果实成熟条件”指可以发生果实成熟中涉及的发育过程的条件，包括子房受精后发生的细胞***和母体组织扩张。例如，如此处所用，乙烯的产生是刺激呼吸跃变型果实如番茄的成熟发生程序的化学信号。

本文所用的“果实成熟发生之前”指少于10％(例如9.9、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％)的果实已经发生色素改变的果实发育阶段。“果实成熟发生之前”白。

本发明还提供保护动物抵抗新城疫病毒或禽流感病毒的方法，包括向动物施用有效量的适当的本发明的疫苗。根据所述方法的一个实施方案，其中所述疫苗通过口腔、鼻内、腹腔内、肌内、静脉内或皮下施用。在所述方法的一个实施方案中，所述疫苗的有效量是1μg-50μg/克体重。

本发明还提供在转基因植物中生产抗原的方法，包括以下步骤：a)生产含编码所述抗原的载体的转基因植物；b)在所述植物表达所述抗原的条件下培育植物；其中在开始成熟之前培育所述植物。

在一个实施方案中，所述植物含有成熟果实。

在另一个实施方案中，所述植物是番茄植物。

在另一个实施方案中，所述植物的果实在开始成熟之前收获。根据此方法的一个实施方案，所述抗原分离自所述收获的果实。

在另一个实施方案中，所述抗原选自新城疫病毒的HN抗原、禽流感病毒的HA抗原、LTB、NVCP、透明带糖蛋白和HBsAg。

附图说明

图1a和1b.NDV株“Lasota”的HN基因的植物优化的编码序列(SEQ ID NO：1)和蛋白质序列(SEQ ID NO：2)。

图2.包含植物选择性标记PAT(草铵膦乙酰转移酶)的pBBV-PHAS-iaaH图谱，包括组成型CsVMV(木薯脉花叶病毒cassava vein mosaic virus)启动子并以MAS 3’(甘露碱合成酶)元件终止。来自农杆菌Agrobacterium的LB和RB(左和右T-DNA边界)元件标记出整合入所述植物基因组的DNA的边界。

图3.pCP！H的图谱，它是“模板载体”，用作表达免疫保护性抗原的多种植物表达载体的起始质粒。

图4.用于NDVHN蛋白的pCHN表达载体的图谱。该载体含HN表达表达盒，包括组成型CsVMV启动子且以大豆vspB 3’元件终止。

图5.用于NDV HN蛋白的pgHN表达载体的图谱。该表达载体含HN表达表达盒，包括带TEV 5’UTR的块茎特异性GBSS启动子且以大豆vspB 3’元件终止。

图6.用于NDV HN蛋白的pgHN151表达载体的图谱。所述HN表达载体或表达盒包括带其天然5’UTR和内含子的块茎特异性GBSS启动子，且以大豆vspB 3’元件终止。所述载体衍生自包含植物选择性标记PAT的pBBV-PHAS-iaaH，包括CsVMV启动子并以MAS 3’元件终止。LB和RB(左和右T-DNA边界)元件标记出整合入所述植物基因组的DNA的边界。

图7.用于NDV HN蛋白的pgHN153表达载体的图谱。所述HN表达载体包括带其天然5’UTR和内含子的块茎特异性GBSS启动子且以菜豆球蛋白phaseolin 3’元件终止。所述载体衍生自包含植物选择性标记PAT的pBBV-PHAS-iaaH，包括CsVMV启动子并以MAS 3’元件终止。LB和RB(左和右T-DNA边界)元件标记出整合入所述植物基因组的DNA的边界。

图8.用于NDV HN蛋白的pMHN表达载体的图谱。所述HN表达载体包括组成型4OCSΔMAS启动子(P2方向)且以大豆vspB 3’元件终止。所述载体衍生自包含植物选择性标记PAT的pBBV-PHAS-iaaH，包括CsVMV启动子并以MAS 3’元件终止。LB和RB(左和右T-DNA边界)元件标记出整合入所述植物基因组的DNA的边界。

图9.用于AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)基因的pCHA表达载体的图谱。

图10.AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因的DNA(SEQ ID NO：3)和蛋白质(SEQ IDNO：4)序列。

图11.pGLTB中间载体的图谱。

图12.pCLT105中间载体的图谱。

图13.用pGPTV-HAO或pCHA在转基因NT1细胞系中的HA表达。

图14.pCHA转化的NT1细胞系的重复测试。

图15.pCHA转化的NT1细胞系中AIV HA表达的Western印迹。

图16.pCHA转化的马铃薯小植株的微块茎中的HA表达。

图17.pCHA转化的马铃薯植株的叶中的HA表达。

图18.土壤生长的pCHA转化的马铃薯植株的块茎中的HA表达。

图19.pCHN转化的NT1细胞中的NDV-HN表达。

图20.pCHN转化的NT1细胞系中单位细胞量的HN表达。

图21.pCHN转化的NT1细胞系中HN表达的稳定性。

图22.用HN特异性抗体进行pCHN转化的NT1细胞的Western印迹。

图23.HN抗原保持于冻干的pCHN转化的NT1细胞中和提取物于4℃保存。

图24.蔗糖梯度分析HN抗原显示颗粒特性。

图25.pMHN和pCHN转化的NT1细胞系中的HN表达。

图26.pCHN转化的马铃薯中的HN表达。

图27.从pCHN转化的马铃薯块茎中提取的HN抗原的颗粒行为。

图28.pGHN转化的马铃薯植株的微块茎中HN表达。

图29.pGHN和pGHN151转化的马铃薯植株的块茎中的HN表达。

图30.pCHN结构中的T-DNA区。

图31.成熟对野生型TA234番茄果实pH的影响。

图32.成熟对野生型TA234番茄果实总可溶性蛋白的影响。

图33.T₀ CHN番茄株系的Southern分析。

图34.野生型和转基因番茄果实的总RNA。

图35.成熟CHN番茄果实中HN浓度的ELISA分析。

图36.野生型和转基因番茄果实和叶与NT1细胞提取物中蛋白粗提取物的Western分析。

图37.CHN番茄果实和叶中的凝血活性。

图38.成熟番茄果实直径的变化。“周”表示授粉后的时间量。点表示三次测量的平均值，而条线表示平均值的标准误差。

图39.成熟番茄果实质量的变化。“周”表示授粉后的时间量。每个点表示三次测量的平均值，而条线表示平均值的标准误差。

图40.冻干过程中成熟番茄果实的水分丧失。“周”表示授粉后的时间量。点表示三次测量的平均值，而条线表示平均值的标准误差。

图41.每克新鲜番茄果实中的HN浓度。“周”表示授粉后的时间量。柱表示三个样品的平均值。用相同字母标记的柱之间没有显著差异(α＝0.05)。误差条线表示平均值的标准误差。

图42.成熟番茄果实中的HN量。“周”表示授粉后的时间量。柱代表三次重复HN含量乘以质量的平均值。用相同字母标记的柱之间没有显著差异(α＝0.05)。误差条线表示平均值的标准误差。

图43.CHN-18母种(master seed)中的受调节生物成分(pCHN)***物。

图44.CHN-18母种中的全基因***物的DNA序列(SEQ ID NO：12)。

图45.pCHA载体序列(SEQ ID NO：24)。

图46.pMHN载体序列(SEQ ID NO：25)。

图47.pCHN载体序列(SEQ ID NO：26)。

图48.构建pUHN。

序列说明

SEQ ID NOs：1和2，示于图1，是NDV株“Lasota”的HN基因的植物优化的编码序列和蛋白质序列。

SEQ ID NOs：3和4，示于图10，是AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)的HA基因的DNA和蛋白质序列。

SEQ ID NO：5是用于末端修正pCP！H上CsVMV启动子的PCR引物。

SEQ ID NO：6是用于末端修正pCP！H上CsVMV启动子的PCR引物。

SEQ ID NO：7是用于产生Nco I位点的诱变引物。

SEQ ID NO：8是与所述5’区域互补的正向引物。

SEQ ID NO：9是用于产生Xho I位点的诱变引物。

SEQ ID NO：10是通过使用引物HNa制备的PCR标记探针。

SEQ ID NO：11是通过使用引物HNb制备的PCR标记探针。

SEQ ID NO：12是CHN-18母种中的全基因***物的DNA序列。

SEQ ID NO：13是编码乙肝病毒株Gly D表面抗原的DNA序列，完整编码序列。(GenBank accession AF134148)。

SEQ ID NO：14是乙肝病毒株Gly D表面抗原的蛋白质序列。(GenBank accessionAAD31865)。

SEQ ID NO：15是编码人透明带糖蛋白3(***受体)(ZP3)的DNA序列，mRNA。(GenBank accession NM_007155)。

SEQ ID NO：16是人透明带糖蛋白3前体蛋白(***受体)(ZP3)的蛋白质序列。(GenBank accession NP_009086)。

SEQ ID NO：17是编码禽流感病毒血凝素(HA)的DNA序列，mRNA，完整编码序列。(GenBank accession U67783)。

SEQ ID NO：18是禽流感病毒血凝素(HA)的蛋白质序列。(GenBank accessionAAC58999)。

SEQ ID NO：19是编码新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN)的DNA序列，mRNA，完整编码序列。(GenBank accession AY510092)。

SEQ ID NO：20是新城疫病毒血凝素-神经氨酸酶(HN)的蛋白质序列。(GenBankaccession AAS10195)。

SEQID NO：21是编码原鸡透明带糖蛋白3(***受体)(ZP3)的DNA序列，mRNA。(GenBank accession NM_204389)。

SEQ ID NO：22是原鸡透明带糖蛋白3(***受体)(ZP3)的蛋白质序列。(GenBankaccession NP_989720)。

SEQ ID NO：23是鸭乙型肝炎病毒的DNA序列。(GenBank accession X58569)。

SEQ ID NO：24是载体pCHA的DNA序列。

SEQ ID NO：25是载体pMHN的DNA序列。

SEQ ID NO：26是载体pCHN的DNA序列。

定义

本文所用的“免疫原或免疫保护性抗原”是非自身物质，该物质引起健康动物中的体液和/或细胞免疫应答，保护动物抵抗以后将遇到的携带所述免疫原的病原体。病原体典型的是物质如病毒、细菌、真菌和原生动物。免疫原也可以是病原体的抗原性部分，包括细胞壁成分和病毒衣壳蛋白。

本文所用的“免疫保护性颗粒”是来源于表达免疫原的转基因植物细胞的颗粒或小泡，当适当施用于动物时，针对将来会遇到的携带所述免疫原的病原体提供保护。

本文所用的“接种疫苗(vaccination或vaccinating)”定义为针对病原体提供保护的方法，它是通过用病原性物质的免疫原性制剂或其非毒性形式或其部分给宿主接种，刺激宿主免疫***并防止或减弱随后宿主对以后遇到的病原体的反应。“提供保护”指刺激如下所述的免疫应答。

本文所用的“疫苗”是用于给动物接种疫苗的组合物，其包含至少一种免疫保护性抗原性物质。

本文所用的“病原性生物”是引起受感染动物的疾病或医学状况的细菌、病毒、真菌或原生动物。

本文所用的“佐剂”是强化、增加或增强对免疫原或抗原的免疫应答的物质。如此处所用，增加或强化或增强指例如与不存在佐剂相比，对存在佐剂的条件下所施用抗原应答所产生的抗体量增加2倍或更多、例如2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或1000倍或更多倍。增加或强化或增强还指至少5％或更多的抗体产生，例如5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％或更多，例如对存在佐剂的条件下所使用抗原的应答与不存在佐剂的条件下所施用抗原的应答相比。佐剂通常增强体液免疫应答和细胞免疫应答，但在缺乏另一种的情况下、对其中一种的应答增加符合对佐剂的定义。此外，佐剂及其用途对免疫学家已公知，当免疫原剂量有限或当免疫原的免疫原性很低或当施用途径不是最佳时，通常使用佐剂以增强免疫应答。因而术语“佐剂量”是指能增强针对给定免疫原或抗原的免疫应答的佐剂的量。与佐剂量相等的量是变化的且依赖于多种因素，包括但不限于免疫原特性、施用免疫原的量、宿主物种、施用途径和施用免疫原的方案。给定一组具体条件，通过常规实验很容易定量佐剂量。这对于本领域普通技术人员是公知的，通常将常规剂量应答测定的使用应用于施用量变化的免疫原和佐剂。通过用酶联免疫吸附分析、放射免疫分析、凝血分析等测定由对所述免疫原的应答产生的血清抗体效价来测量应答。

本文所用的“转基因植物细胞”是指稳定表达外源基因的植物细胞，其中所述外源基因整合到所述植物细胞染色体中，并且不随之携带病毒特有的病毒载体序列，在此外源基因传代给下一代细胞并可以从宿主植物细胞染色体上表达。此外“转基因植物材料”指含有通过公知的细胞培养技术(Street，HE.1973，Plant tissue and cellculture：botanical monographs.Vol II，University of California，Berkeley)获得的一个或多个“转基因植物细胞”的“转基因细胞悬液”。

本文所用的“转基因植物”是指一种植物，它的细胞稳定表达“异种的”外源基因，其中外源基因整合到植物细胞染色体中，并且不随之携带病毒特有的病毒载体序列，在此外源基因传代给下一代植物并可以从宿主植物细胞染色体上表达。“转基因植物”含有“多个转基因植物细胞”。“转基因植物”指整个植株或其一部分，包括但不限于根、茎、叶、柄、种子、果实、块茎、花、花粉等。异种的外源基因的实例包括但不限于诺沃克病毒衣壳蛋白(NVCP)、禽流感血凝抗原(AIV-HA)、新城疫病毒神经氨酸酶(NDV-HN)、透明带糖蛋白3(ZP3)和乙肝表面抗原(HBsAg)。

转基因植物此处定义为来源于转化的植物细胞或原生质体的植物细胞培养物、植物细胞系、植株或其后代，其中所述转化的植物的基因组包含由实验方法导入的、原本不存在于相同物种的天然非转基因植物细胞中的外源DNA。术语“转基因植物”和“转化的植物”有时候在本领域用作同义词来定义DNA中包含外源DNA分子的植物。

本文所用的“可食用植物”是指可以被动物食用的、具有营养价值且无毒的植物。“可食用植物”可以是“食物”，所述食物是可以被人或其它动物摄入的植物或由植物获得的材料。术语“食物”包括可供人和其它动物食用的植物材料或可供人和其它动物食用的加工过的植物材料。由植物获得的材料包括最终被人或其它动物摄入的植物成分。“可食用植物”的实例包括但不限于番茄植物、水稻植物、小麦植物、玉米植物、胡萝卜植物、马铃薯植物、苹果植物、大豆植物、紫花苜蓿植物、苜蓿植物、蔬菜植物和果实植物或本文所述的任何可食用植物。

有时候“可食用植物”“因其营养价值可被摄入”，这是指经动物摄入后植物或其部分提供代谢能量来源、辅助或必需维生素或辅因子、粗纤维或其它有益作用。因而，当有待用本发明方法处理的动物是可由细菌辅助消化纤维素的食草动物时，这种食物的代表是转基因草植物。其它可食用植物包括蔬菜和果实。类似的，例如，尽管转基因莴苣植物基本上不提供能量来源、结构大分子如蛋白质、糖或脂肪，也没有其它必需或辅助的维生素或辅因子，如果摄入莴苣提供对动物有益的粗纤维，即使动物不能消化莴苣中的纤维素成分，转有本文所述核酸分子的、用作动物食物的莴苣植物将落入本文所用的食物的定义。因而“可食用植物”不包括烟草。

本文所用的“免疫应答”是指生物体的免疫***对包括但不限于外源性或自身蛋白质等物质引起的应答。存在有三种常见类型的“免疫应答”，包括但不限于黏膜、体液和细胞“免疫应答”。“黏膜免疫应答”由覆盖呼吸道、胃肠道和泌尿生殖道的黏膜表面的分泌物以及来自所有分泌腺的分泌物中分泌型IgA(sIgA)抗体的生成引起(McGhee，J.R.et al.，1983，Annals NY Acad.Sci.409)。这些分泌型IgA抗体可阻止病原体在黏膜表面的定植(Williams，R.C.et al.，Science 177，697(1972)；McNabb，P.C.et al.，Ann.Rev.Microbiol.35，477(1981))，因而是阻止病原体通过黏膜入侵或定植的第一道黏膜保护屏障。可通过对分泌腺或组织的局部免疫或将抗原呈递给肠道相关淋巴组织(GALT或集合***)或支气管相关淋巴组织等方法来刺激sIgA的产生(BALT；Cebra，J.J.et al.，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.41，210(1976)；Bienenstock，J.M.，Adv.Exp.Med.Biol.107，53(1978)；Weisz-Carrington，P.et al.，J.Immunol 123，1705(1979)；McCaughan，G.et al.，Internal Rev.Physiol 28，131(1983))。膜性微皱褶细胞，也叫做M细胞，覆盖了GALT和BALT的表面，并且可能和其它的分泌性黏膜表面有关。M细胞可从邻近黏膜表面的体腔内提取抗原并将其转移到抗原呈递细胞(树突状细胞和巨噬细胞)，后者又将抗原呈递至T淋巴细胞(当抗原是T细胞依赖性时)，T淋巴细胞将抗原处理后呈送给待命的B细胞。然后B细胞被刺激而增殖，迁移并最终被转化成抗体分泌型浆细胞而产生针对所递呈抗原的IgA。当该抗原被覆盖GALT和BALT的M细胞所俘获时，体内所有分泌组织产生针对抗原的sIgA，导致全身黏膜免疫性。(Cebra等，同上；Bienenstock等，同上；Weinz-Carrington等，同上；McCaμghan等，同上)。因此经口免疫是刺激全身免疫应答并引起口腔和胃肠道的局部刺激分泌免疫应答的重要途径。

“免疫应答”可用本领域技术人员公知的技术测定。例如，可从怀疑发生免疫应答的生物体中获得血清、血液或其它的分泌物，用酶联免疫吸附分析来检测上述免疫球蛋白的存在(ELISA；美国专利No.5,951,988；Ausubel et al.， Short Protocols in Molecular Biology 3^rd Ed.John Wiley&Sons，Inc.1995)。根据本发明，如果通过ELISA检测，经感兴趣蛋白质处理的动物中免疫球蛋白的定量测量值与未经赶兴趣蛋白质处理的动物中检测到的免疫球蛋白的测量值相比有统计学上的差异(例如，抗体产生量增加或降低2倍或更多倍，例如2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或1000倍或更多倍的增加或降低。增加或降低也表示至少5％或更多的抗体产生，例如5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％或更多，或至少5％或更多的抗体产生的降低。)，则可以说本发明的蛋白质刺激了“免疫应答”，其中所述免疫球蛋白是对所述感兴趣蛋白质特异的。本领域已知的、用于确定免疫球蛋白水平测量值差异的统计学检验包括但不限于ANOVA、学生T-检验等，其中P值至少＜0.1、＜0.05、＜0.01、＜0.005、＜0.001，甚至＜0.0001。

可用对“免疫应答”过程中产生的部分免疫球蛋白特异的标记抗体通过其它的技术如免疫组化来检测“免疫应答”。从根据本发明施用感兴趣蛋白质的动物获得组织(如卵巢组织)，使用本领域中公知的技术处理以进行免疫组化检测(Ausubel et al.，Short Protocols in Molecular Biology 3^rd Ed.John Wiley&Sons，Inc.1995)。通过扫描免疫组化染色的组织样品并用本领域技术人员公知的计算机软件程序对染色水平进行定量，从而对通过免疫组化获得的显微镜数据进行定量，所述的计算机软件程序包括但不限于NIH Image(美国国立卫生院，Bethesda，MD)。根据本发明，如果经感兴趣蛋白质处理的动物中免疫组化染色定量测量值与未经感兴趣蛋白质处理的动物中免疫组化染色定量测量值在统计学上有差异，则可以说本发明中的蛋白质刺激了“免疫应答”，其中所述的组织化学染色需要对该蛋白质有结合特异性。本领域中公知的、统计学检验来确定测定的免疫组化染色方面的差异，所述的统计学检验包括但不限于ANOVA、学生T-检验等，其中P值至少＜0.1、＜0.05、＜0.01、＜0.005、＜0.001，甚至＜0.0001。

可用上述的任意技术“检测”“黏膜免疫应答”。例如使用抗-IgA抗体的ELISA分析法可用来检测和测定黏膜特异性免疫球蛋白(Dickinson，B.L.& Clements，J.D.Dissociation of Escherichia coli heat-labile enterotoxin adjuvanticity fromADP-ribosyltransferase activity.Infect Immun 63，1617-1623(1995))。

“体液免疫应答”包括对一种或多种抗原应答产生抗体。细胞免疫应答包括诸如辅助性T细胞(CD4⁺)应答和细胞毒性T淋巴细胞(CD8⁺)应答的应答。粘膜免疫应答(或分泌型免疫应答)包括产生分泌型抗体(sIgA)。免疫应答可以包括一种或一组这些免疫应答。

本文所用的“动物”是指归类于***发生的动物界的生物。本文所用的“动物”也表示哺乳动物。用于本发明的动物包括但不限于哺乳动物、有袋动物、小鼠、狗、猫、牛、人、鹿、马、绵羊、家畜、家禽、鸡、火鸡、鸵鸟、鱼、鳍鱼(fin fish)和贝壳鱼(shell fish)等。

本文所用的“单子叶植物的”表示其胚有一片子叶或种叶的一类植物。“单子叶植物”的实例包括但不限于百合；草；玉米；谷物，包括燕麦、小麦和大麦；兰；鸢尾；洋葱和棕榈。

本文所用的“双子叶植物的”表示其胚有两片种叶或子叶的一类植物。“双子叶植物”的实例包括但不限于烟草；番茄；豆类包括苜蓿；橡树；枫树；蔷薇；薄荷；南瓜；雏菊；胡桃；仙人掌；紫罗兰和毛莨。

本文所用的“载体”表示可以转运与之连接的另一种核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它表示另外的核酸片段可以***其中的环状双链核酸环。某些载体可以在导入的宿主细胞中自主复制(例如有细菌复制起始的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如非附加型哺乳动物载体)在导入宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，并随宿主基因组一起复制。另外，某些载体可指导与之可操作连接的基因的表达。这些载体此处称作“表达载体”。一般来说，重组核酸技术中使用的表达载体经常是以质粒的形式。本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。

本文所用的“启动子”表示通常位于结构基因编码区上游(5’)  的一段DNA序列，通过提供转录起始所需的RNA聚合酶和其它因子的识别和结合位点而控制编码区的表达。启动子的选择依赖于感兴趣的核酸序列。“植物功能性启动子”表示可支持植物细胞中转录起始的“启动子”。本发明使用的“植物功能性启动子”包括但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S启动子；种子贮藏蛋白基因如Zma10Kz或Zmag12、光诱导基因如核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)、应激诱导基因如乙醇脱氢酶(Adh1)或所有细胞中都表达的“管家基因”(如Zmact，玉米肌动蛋白基因)的启动子；番茄E8启动子；泛素；甘露碱合成酶(mas)；水稻actin l；大豆种子蛋白大豆球蛋白(Gyl)；大豆营养贮藏蛋白(vsp)；和颗粒结合的淀粉合酶(gbss)。其它“植物功能性启动子”包括已知在可食用植物部分产生高表达的基因的启动子，如马铃薯的patatin基因启动子。

本文所用的“可操作连接”表示所述成分的关系允许它们以期望的方式发挥功能的邻接关系(juxtaposition)。“可操作连接”到编码序列的调控序列的连接方式应使所述编码序列在与所述调控序列相容的条件下得到表达。当足够临近基因的转录起始位点并调节该基因转录时，启动子序列“可操作的连接”到所述基因。

本文所用的“施用”表示向动物递送本发明的转基因植物材料、细胞、组合物和药物配方，所用的递送方式保证“递送”材料接触所述被施用动物的粘膜表面。本发明使用的“递送途径包括但不限于口腔递送、鼻内递送、腹膜下递送、肌内、静脉内或皮下递送、直肠或***递送(例如通过栓剂或局部给药)、或递送材料直接接触粘膜表面的递送途径(即“粘膜递送”)。本文所用的“药学上可接受的”表示不干扰活性成分生物活性的效应的无毒性物质。递体的特性依赖于给药途径。

本文所用的“粘膜表面”、“粘膜膜”或“粘膜”表示这些结构的公知医学定义，它是一种结构的表面或内层，包括上皮、固有层(lamina propria)和在消化道中时的平滑肌层。“粘膜表面”的实例包括但不限于支气管的内表面、鼓室的粘液层、结肠的内粘液表面、输精管内层、食管内表面、小肠的粘液表面、喉的粘液表面、舌粘膜、垂体膜、口腔粘膜、咽粘膜、气管内粘膜层、咽鼓管内层、输卵管粘液层、输尿管内层、尿道内层、子宫内膜、***粘膜、胃粘液层、膀胱内表面和精囊粘膜。

本文所用的“递体”表示适于完成或增强本发明的疫苗向动物递送的惰性和无毒物质。递体的实例包括但不限于水、磷酸盐缓冲液或盐水，还可以包括佐剂。佐剂如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾是本领域公知的物质。

本发明还提供药物和兽药组合物，其含有本发明的免疫保护性颗粒，还一并含有一种或多种药学上可接受的佐剂、递体、稀释剂和赋形剂。这些药物组合物也可以是疫苗并以药物疫苗领域公知的方式制备。

“施用(administering或administer)”定义为物质向动物体内的导入，包括口腔、鼻、直肠、***和消化道外途径。要求保护的组合物可以任何给药途径单独施用或与其它治疗药合并施用，这些给药途径包括但不限于皮下(SQ)、肌内(IM)、静脉内(IV)、粘膜、鼻或口腔。所述组合物可通过SQ或IM途径施用。特别优选的是粘膜途径，最优选的是口腔途径。

本文所用的“有效量或有效剂量的疫苗”是在人或动物体内刺激本文所定义的且可由本文所述测试法检测到的足够的先天性免疫应答、以使人或动物有效抵抗病原体的攻击所必需的量。例如，在一个实施方案中，“有效量或有效剂量的疫苗”引起结合到所述疫苗的免疫保护性抗原的抗体量增加。如此处所用，增加表示：与未接种疫苗的个体比较，接种疫苗的个体产生的抗体量增加2倍或更多倍，例如2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或1000倍或更多倍。增加还表示：与未接种疫苗的个体比较，接种疫苗的个体产生的抗体量增加至少5％或更多，例如5、6、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％或更多。施用人或动物的剂量将由医生或兽医考虑相关条件下确定，所述条件包括具体的免疫保护性颗粒或颗粒组合、人或动物的状态和选择的给药途径。此处所给的剂量范围决非要限制本发明的范围，而是作为一般性原则提供给熟练的专业人员。可在细胞培养测试或动物模型通常是小鼠、兔、狗或猪中初步估计有效剂量。动物模型也用于获得期望的浓度范围和给药途径。而后可用这些信息确定对人的有用的剂量和给药途径。

精确剂量可由各医生根据待治疗患者来选择。调整剂量和施用以提供足够水平的活性成分或维持期望效应。可考虑的其它因素包括疾病状态的严重程度；患者的年龄、体重和性别；饮食、给药时间和频率、药物组合、反应灵敏度和对治疗的耐受/应答。根据具体配方的半寿期和清除速率，长效药物组合物可以每3到4天、每周或每两周给药。

本发明的抗原性组合物的具体剂量依赖于很多因素，这些因素包括但不限于准备施用所述组合物的人或动物的物种、年龄和一般状态以及所述组合物的给药方式。本发明组合物的有效量仅用常规实验即可确定。体外和体内模型(例如家禽)可用于还指果实料少于10％(例如9．9、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％)的酸和淀粉已经转化成糖的果实发育阶段。“果实成熟发生之前”还表示果实中少于10％(例如9．9、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5％)的细胞壁物质被降解的果实发育阶段。

本文所用的“培育”包括使植物在田间或在受控或非受控的实验室或室内设施中生长。在本发明的一个实施方案中，如本文定义，通过在果实成熟发生之前在植物表达抗原的条件下“培育”所述植物，在所述植物中生产所述抗原。

具体实施方式

本发明涉及编码感兴趣抗原的序列，例如编码新城疫病毒HN抗原和禽流感病毒HA抗原的植物优化的序列。本发明还涉及含有本发明中植物优化的序列的载体、植物细胞、转基因植物和疫苗。本发明还涉及预防病毒感染如新城疫病毒或禽流感病毒感染的方法。本发明也涉及在转基因植物中生产抗原的方法。

根据本发明有用的免疫保护性抗原

本发明提供表达异种的外源基因的植物细胞和转基因植物。本发明的异种的外源基因可以是任何感兴趣的基因，包括但不限于诺沃克病毒衣壳蛋白(NVCP)(Genbank Accession Number：M87661，GenBank#AF093797，Genome for NorwalkVirus.Genbank Accession Number AAB50466，for NV capsid protein)、禽流感血凝抗原(AIV-HA)(Genbank Accession Number U67783和AAC58999)、新城疫病毒神经氨酸酶(NDV-HN)(Genbank Accession Numbers NM-204389，NP-989720，NP-009086和NM-007155)(Genbank Accession Number：AY510092和AASl0195)、透明带糖蛋白3(ZP3)和乙肝表面抗原(HBsAg)(Genbank Accession Numbers AFl34148，AAD31865，X58569，GenBank#AF090842)、shigatoxin B(StxB)(Genbank#AJl32761)、葡萄球菌肠毒素B(SEB)(GenBank#M11118)、大肠杆菌不稳定毒素B(LT-B)(GenBank#AB011677)和大肠杆菌不稳定毒素A亚基(LT-A)(GenBank#AB011677)。

新城疫病毒(NDV)是副粘病毒科(paramyxoviridae)的副粘病毒属(paramyxovirus)的成员。该属的病毒是带包膜的负链RNA病毒，包括副流感病毒如仙台病毒、呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒和麻疹病毒(Kingsbury et al.，1978，Intervirology，10：137-152)。病粒的特征是存在两个表面糖蛋白，包括血凝素-神经氨酸酶(HN)，一种74kDa蛋白；和较小的融合蛋白(F)。HN参与两种重要的功能，包括通过识别含唾液酸的细胞受体而实现的细胞附着，和从子代病毒颗粒上切除唾液酸以防止自聚集的神经氨酸酶活性。F蛋白介导病毒-细胞和细胞-细胞融合和溶血。参见Scheid，A.，and Choppin，P.W.(1973)J.Virology.11，263-271；Scheid，A，andChoppin，P.W.(1974)Virology 57，470-490；Lamb，R.A.，and Kolakofsky，D.(1996).Paramyxoviridae：the viruses and their replication，p.577-604.In B.N.Fields，D.M.Knipe，and P.M.Howley(ed.)，Fields virology，3^rd ed.Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，Pa。制备的抗任一种蛋白的多价血清可以中和所述病毒的感染性。参见Mertz，D.C.，Scheid，A.，and Choppin，P.W.(1980)J.Exp.Med.151，275-288。

禽流感病毒描述于Suarez et al.，Virus Res.1997，51：115和Sockett，Can.Med.Assoc.J.，1998，158：369，其全部内容通过引用并入本文。禽流感病毒的血凝素基因描述于Barun et al.，1998，Nuc.Acids.Res.，16：4181，其全部内容通过引用并入本文。

制备本发明的构建体

根据本发明的表达盒含有编码至少一种免疫保护性抗原的、与植物细胞中发挥功能的转录和翻译调控区可操作连接的DNA序列。优选的，本发明提供用于在植物中表达免疫保护性抗原转基因的植物表达盒。这些盒含有从5’到3’可操作连接的以下元件：

A)在植物中天然表达的植物基因启动子序列；

B)编码感兴趣的免疫保护性抗原的核酸序列；和

C)3’UTR。

用于本实施方案的启动子是在植物中发挥功能的任何已知的启动子。很多这种启动子是本领域的普通技术人员公知的。这些启动子包括与其它基因正常连接的启动子，和/或由任何细菌、病毒、真核或植物细胞中分离的启动子。使用有效指导外源编码序列在选用于表达的细胞或组织类型中表达的启动子是有优势的。用于蛋白质表达的启动子和细胞类型组合的使用对于分子生物学领域的技术人员来说通常已知，例如参见Sambrook et al.，In：Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y，1989。所用启动子可以是组成型或诱导型，且可用于在合适条件下指导所导入DNA片段的高水平表达，例如这对大规模生产重组蛋白或肽是有利的。在启动子范畴中使用的术语“组成型”表示所述启动子能在缺乏刺激(例如热激、化学物质等)的条件下指导可操作连接的核酸序列转录。相比较而言，“诱导型”启动子能在存在刺激(例如热激、化学物质等)的条件下指导可操作连接的核酸序列的一定水平的转录，其中转录水平不同于缺乏刺激时的水平。本文所用的“诱导型”还表示存在外源或内源化学物质(例如醇、激素或生长因子)、存在光和/或对发育变化的应答条件下的表达。本文所用的“诱导型”也表示在化学诱导剂的存在下在任何组织中的表达。如此处所用，根据本发明的“化学诱导”表示将具有使植物细胞或植物器官中的靶启动子增加转录速率的作用的外源或内源物质(包括大分子如蛋白质或核酸)物理施用于植物或植物器官(例如通过喷含化学诱导剂的溶液到叶上，将溶液施用于根或将植物或植物器官暴露于气体或蒸气)。

可用于表达本发明中结构基因的一些植物功能性启动子的实例如下：CaMV 35S和19S启动子(US 5,352,605和US 5,530,196)；patatin启动子(US 5,436,393)；来源于Solanum tuberosum的patatin基因的B33启动子序列，它可以导致融合到B33启动子的序列的块茎特异性表达(US 5,436,393)；番茄E8启动子(WO 94/24298)；番茄果实启动子(US 5,556,653)；植物泛素启动子***(US 5,614,399和5,510,474)；脱落酸应答性基因表达的5′顺式调控元件(US 5,824,865)；一种杆状DNA病毒，即水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)的启动子(US 5,824,857)；与烟草PR-1a基因编码区临近的5’旁侧区的可化学诱导的启动子片段(US 5,789,214)；悬钩子drul启动子(US5,783,394)；草莓启动子和基因(WO 98/31812)；启动子是napin启动子、菜豆球蛋白启动子和DC3启动子(US 5,773,697)；LEA启动子(US 5,723,765)；库器官特异性表达的5′转录调控区(US 5,723,757)；G-盒相关序列基序，特别是Iwt和PA基序，作为启动子的顺式元件调控异源基因在转基因植物中的表达(US 5,723,751)；P119启动子及其用途(US 5,633,440)；Group 2(Gp2)植物启动子序列(US 5,608,144)；来源于玉米、矮牵牛和烟草的几个基因的核酸启动子片段(US 5,608，143)；从豌豆属植物豌豆Pisum sativum的叶绿体GS2谷氨酰胺合成酶的核基因和胞浆GS3谷氨酰胺合成酶中分离的启动子序列(US 5,391,725)；玄参花叶病毒(FMV)的全长转录本启动子(US 5,378,619)；异柠檬酸裂合酶启动子(US 5,689,040)；小孢子特异性调控元件(US5,633,438)；用植物天冬酰胺合成酶启动子在转基因植物和植物细胞中表达异源基因(US 5,595,896)；驱动1450碱基TR转录本在章鱼碱型冠瘿瘤中表达的启动子区(US4,771,002)；核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子序列(US 4,962,028)；拟南荠组蛋白H4启动子(US 5,491,288)；种子特异性植物启动子(US 5,767,363)；可赋予正常条件下是绿色组织特异性启动子的rbcS-3A启动子根部表达能力的21bp启动子元件(US 5,023,179)；相关DNA序列在植物中尤其在根中组织优先转录的启动子(US5,792,925)；芸苔属物种多聚半乳糖醛酸酶启动子(US 5,689,053)；种皮特异性隐蔽启动子区(US 5,824,863)；从烟草PR-1a基因中分离的可化学诱导的启动子片段，可通过施用苯并-1，2，3-噻二唑、异烟酸化合物或水杨酸化合物而诱导(US 5,689,044)；从黄瓜几丁质酶/溶菌酶基因中分离的启动子片段，可通过施用苯并-1，2，3-噻二唑而诱导(US 5,654,414)；来自烟草的组成型启动子，至少可指导在子房、花、未成熟胚、成熟胚、种子、茎、叶和根组织中的表达(US 5,824,872)；改变植物中的基因表达(US5,223,419)；用于单子叶植物中基因表达的重组启动子(US 5,290,924)；用TMV过度生产肽和蛋白质的方法(WO 95/21248)；含芽***组织特异性启动子和调控序列的核酸(WO 98/05199)；菜豆球蛋白启动子和结构基因(EP-B-0122791)；植物启动子[CaMV35S的亚结构域](US 5,097,025)；番茄E8来源的启动子在成熟果实中表达异源基因如5-腺苷甲硫氨酸水解酶的用途(WO 94/24294)；用反式活化蛋白在转基因植物中调控基因表达的方法(US 5,801,027)；编码诱导型植物启动子和番茄Adh2酶的DNA分子(US 5,821,398)；合成的植物核心启动子和上游调控元件(WO 97/47756)；具有双子叶植物创伤诱导型启动子的单子叶植物(US 5,684,239)；植物中的选择性基因表达(US5,110,732)；CaMV 35S增强的甘露碱合成酶启动子及其使用方法(US 5,106,739)；种子特异性转录调控(US 5,420,034)；种子特异性启动子区(US 5,623,067)；来自小麦的DNA启动子片段(US 5,139,954)；用于植物的嵌合调控区和基因盒(WO95/14098)；高水平生产基因产物(WO 90/13658)；HMG启动子表达***和收获后植物和植物细胞培养物中基因产物的生成(US 5,670,349)；含植物中α-淀粉酶基因的启动子区的基因表达***(US 5,712,112)。

优选的启动子是美国专利申请系列号09/202,838中描述的木薯脉花叶病毒启动子，其全部内容通过引用并入本文；US专利号5,591,605中描述的菜豆球蛋白启动子，其全部内容通过引用并入本文；US专利号5,641,876中描述的水稻肌动蛋白启动子，其全部内容通过引用并入本文；WO98/56921中描述的per5启动子，其全部内容通过引用并入本文；和WO 00/12681中描述的γ-玉米蛋白启动子。

如果以下二者的位置关系使启动子DNA序列影响编码DNA序列的转录，则说启动子DNA序列“可操作连接”到编码DNA序列上。例如，如果编码DNA序列编码蛋白质产物，且如果启动子DNA序列影响来自所述编码DNA序列的蛋白质产物的表达，则所述启动子DNA序列是可操作地连接到所述编码DNA序列。

用公知的方法即可完成基因盒的构建，这些方法有些公开于如Sambrook et al.(1989)和Ausubel et al.(1987) Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley andSons，New York，N.Y。本发明也包括与此处公开的编码免疫保护性抗原的序列具有相当大的序列同源性、从而对表达具有所公开的作用的DNA序列。如本申请使用，术语“相当大的序列同源性”用于表示核苷酸序列(在是DNA或RNA的情况下)或氨基酸序列(在是蛋白质或多肽的情况下)与另一个核苷酸或氨基酸序列相比表现出相当大的功能或结构等价性。具有相当大序列同源性的序列之间任何功能或结构差异将是最低的；也就是说，它们将不影响所述序列发挥如本申请中表明的功能的能力。与本文所公开序列具有相当大同源性的序列通常是所公开序列的变体、如突变体，但也可以是合成序列。

大多数情况下，与本文所公开序列有95％同源性的序列将发挥等价的功能。并且在很多情况下较低的同源性，例如75％或80％也是可以接受的。定位这些序列的一些非关键部分可能是耗时的，但是常规的且为本领域技术人员所公知。修饰寡核苷酸序列的技术实例包括用多核苷酸介导的定点诱变。参见Zoller et al.(1984)；Higuchiet al.(1988)；Ho et al.(1989)；Horton et al.(1989)；和 PCR Technology：Principles and Applications for DNA Amplification，(ed.)Erlich(1989)。

本发明提供编码感兴趣免疫保护性抗原的植物优化序列。植物优化的编码序列的设计优先使用反映番茄和马铃薯密码子偏向性的杂合密码子(Ausubel F.，et al.，eds.(1994)Current Protocols in Molecular Biology，vol.3，p.A.1C.3 Haq TA，Mason HS，Clements J D，Arntzen C J(1995))。

本发明的植物优化的序列可以按US 5,380,831中描述的方法制备，此专利的全部内容通过引用并入本文。一般来说，使用感兴趣目标植物的密码子使用频率来调整感兴趣目标基因如NDV HN的密码子使用频率。

扫描天然序列中可能导致干扰在所述目标植物中表达的序列基序，如poly-A添加位点、Shaw/Kamen降解位点、剪接接头位点和涉及RNA终止或潜在发夹形成的任何序列等。经常要避免连续的A/T序列。在一个实施方案中，优选尽可能保持连续的A/T串到4个或更少，因为大多数调控位点倾向于包含连续的A和T(例如AATAAA共有poly-A或ATTTA Shaw/Kamen)。根据文献中发现的植物中的已鉴定位点，一般可以扫描到约16个假想的poly-A添加序列。在某些实施方案中，寻找连续的C/G是有用的，因为它们可以稳定发夹-茎结构。因为与双子叶植物相比，单子叶植物有点更倾向于使用第三位的C和G，鉴定连续C/G的必要性取决于用于表达的目标宿主植物。

在基因在双子叶植物和单子叶植物中都表达的一个实施方案中，使用总体的植物密码子使用频率作为序列优化的基础。

对于本发明的目的，术语膜锚定序列含有本领域普通技术人员理解的关于该术语的意思。膜锚定序列包括跨膜蛋白序列，在很多天然存在的蛋白中可发现。这些膜锚定序列大小有变化，但总是由偏好膜内疏水环境的一系列带亲脂侧链或脂肪族侧链的氨基酸组成。在RNA翻译和翻译后加工期间，所述锚定序列整合并嵌入细胞膜而起锚定功能，或松散的将蛋白质附着到细胞膜成分上，使蛋白质的亲水部分暴露于细胞内部或外部的水性环境、并与之相互作用。

制备本发明的构建体时，可以操作多种DNA片段，以使DNA序列正确地定向，并适当地位于正确的读码框。可使用接头或衔接物连接DNA片段，或采用其它操作以提供方便的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。

实施这些多种步骤时要使用克隆技术，以扩增含随后要导入期望宿主细胞中的启动子/目的基因的载体。可以使用各种克隆载体，其中克隆载体包括在大肠杆菌中有功能的复制***和允许选择转化细胞的标记。示例性的载体包括pBR322、pUC系列、pACYC184、Bluescript系列(Stratagene)等。因而，所述序列可以在适当的限制性位点***所述载体，得到的质粒用于转化大肠杆菌宿主(如大肠杆菌株HB101、JM101和DH5α)，大肠杆菌生长于适当的营养培养基上并收获和裂解细胞从而回收质粒。分析可以包括序列分析、限制性分析、电泳等。每个操作后，待用于最终构建体中的DNA序列可以被限制酶切割并与下一序列连接，其中部分构建体中的每一个可以被克隆在相同或不同的质粒中。

载体是可获得的或可易于制备的，以便转化植物细胞。通常，质粒或病毒载体应包含在给定宿主中维持和表达异源DNA必需的所有DNA调控序列。这些调控序列一般包括前导序列和编码翻译起始信号密码子、翻译终止密码子的DNA序列，和编码调控信使RNA加工的3’UTR信号的DNA序列。使用本公开的内容，选择适当的元件以优化在任何具体物种中的表达是本领域普通技术人员可胜任的工作。最后，所述载体应该含有可以提供表型特征的标记基因，以便鉴定含所述载体的宿主细胞。

***植物细胞中的外源编码序列的活性依赖于临近该***物的内源植物DNA的影响。一般来说，使用任何转化技术***异源基因是随机的；然而当前存在通过DNA向植物细胞中位点特异性重组产生植物的技术(见WO91/09957)。可以接受在所述启动子控制下导致期望序列表达的任何方法或方法组合。

本发明不限于任何特定的转化植物细胞的方法。将DNA导入植物细胞中的技术对本领域技术人员是公知的。已经描述了四种递送外源DNA到植物细胞中的基本方法。化学方法(Graham and van der Eb，Virology，54(02)：536-539，1973；Zatloukal，Wagner，Cotten，Phillips，Plank，Steinlein，Curiel，Bimstiel，Ann.N.Y. Acad.Sci.，660：136-153，1992)；物理方法，包括微注射(Capecchi，Cell，22(2)：479-488，1980)；电穿孔(Wongand Neumann，Biochim.Biophys.Res.Commun.107(2)：584-587，1982；Fromm，Taylor，Walbot，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82(17)：5824-5828，1985；U.S.Pat.No.5,384,253)和基因枪(Johnston and Tang，Methods Cell.Biol.，43(A)：353-365，1994；Fynan，Webster，Fuller，Haynes，Santoro，Robinson，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(24)：11478-11482，1993)；病毒方法(Clapp，Clin.Perinatol.，20(1)：155-168，1993；Lu，Xiao，Clapp，Li，Broxmeyer，J.Exp.Med.178(6)：2089-2096，1993；Eglitis and Anderson，Biotechniques，6(7)：608-614，1988；Eglitis，Kantoff，Kohn，Karson，Moen，Lothrop，Blaese，Anderson，Avd．Exp.Med.Biol.，241：19-27，1988)；和受体介导的方法(Curiel，Agarwal，Wagner，Cotten，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88(19)：8850-8854，1991；Curiel，Wagner，Cotten，Bimstiel，Agarwal，Li，Loechel，Hu，Hum.Gen.Ther.，3(2)：147-154，1992；Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(13)：6099-6103，1992)。

通过电穿孔方式将DNA导入植物细胞对本领域技术人员是公知的。使用降解植物细胞壁的酶如降解果胶的酶使接受细胞比未处理细胞更容易接受电穿孔转化。为通过电穿孔进行转化，可以直接使用脆弱的组织如悬浮培养细胞、或胚发生愈伤组织、或未成熟胚或其它机体化的组织。通常有必要用降解果胶的酶或机械致伤以受控制的方式部分降解目标植物材料的细胞壁。这样处理的植物材料容易通过电穿孔接受外源DNA。

另一种将外源转化DNA递送入植物细胞的方法是通过微粒轰击。在此方法中，微粒用外源DNA包被并通过推动力递送到细胞中。这些微粒通常由钨、金、铂等金属制造。微粒轰击的优点是既不需分离原生质体(Cristou et al.，1988，Plant Physiol.，87：671-674)，也不要求对农杆菌感染的敏感性。通过加速将DNA递送到玉米细胞中方法的一个示例性实施方案的是Biolistics Particle Delivery System，它可用于推动包被DNA或细胞的颗粒穿过筛网到覆盖有玉米细胞培养悬液的滤膜表面。筛网使颗粒分散以便它们不以大聚集体的形式递送到接受细胞。对轰击来说，悬浮细胞优选浓缩到滤膜或固体培养基上。另外，可以将未成熟胚或其它靶细胞排列在固体培养基上。待轰击细胞在微粒停止板(macroprojectile stopping plate)下方以适当间隔定位。轰击转化中，可以优化轰击前培养条件和轰击参数以获得最大数目的稳定转化体。在此技术中物理和生物学参数都很重要。物理因素是与操作DNA/微粒沉淀有关的因素或影响微粒飞行和速度的因素。生物因素包括与轰击之前或刚轰击后的细胞操作有关的所有步骤、帮助减轻与轰击相关的创伤的靶细胞渗透调节，以及转化DNA的性质，如线性化DNA或完整的超螺旋质粒。

农杆菌介导的转移是广泛应用于将外源DNA导入植物细胞的***，因为可以将DNA导入整个植物组织，避免了从原生质体再生完整植株的需要。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA导入植物细胞是本领域公知的。例如，参见Fraley et al.，1985，Biotechnology，3：629；Rogers et al.，1987，Meth.in Enzymol.，153：253-277中描述的方法。另外，Ti-DNA整合是较精确的过程，很少导致重排。待转移的DNA区由边界序列限定，且***DNA通常如Spielmann et al.，1986，Mol.Gen.Genet.，205：34；Jorgensen etal.，1987，Mol.Gen.Genet.，207：471中描述***植物基因组中。

现代农杆菌转化载体能在农杆菌和大肠杆菌中复制，便于操作。此外，用于农杆菌介导之基因转移的载体的最近技术进展已经改进了载体中基因和限制性位点的排列，以便于构建可表达多种蛋白或多肽的载体。为直接表达***的编码多肽的基因，两侧是启动子和多聚腺苷酸化位点的方便的多连接子区适于本发明的目的。此外，含有带臂(armed)和不带臂(disarmed)的Ti基因的农杆菌可用于转化。

用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法可以实现植物原生质体的转化。(例如见Potrykus et al.，1985，Mol.Gen.Genet.，199：183；Marcotte et al.，Nature，335：454，1988)。这些***在不同植物物种中的应用依赖于从原生质体再生特定物种的能力。

所述植物细胞转化、选择并检测抗原表达以后，有时可以再生有繁殖能力的完整植株。这将很大程度上依赖于所选择植物物种。文献中已经报道了很多种植物物种的再生方法并且本领域技术人员是公知的。对于本发明的实施，优选转化可以培养并迅速放大的植物细胞系，避免一般时间很长的再生步骤。此外，植物细胞培养的使用避免开放的大田生产并大大减少基因逃逸和食品污染的机会。烟草悬浮细胞培养物如NT-1和BY-2(An，G，1985 Plant Physiol.79，568-570)是优选的，因为这些细胞系特别容易在培养中操作、容易转化、发生稳定整合的事件并可冷冻保存。

烟草悬浮细胞系NT-1适用于本发明实施。NT-1细胞来源于Nicotiana tabacumL.cv.bright yellow 2。NT-1细胞系广泛使用并容易获得；尽管任何烟草悬浮细胞系都符合本发明的要求。值得注意的是NT-1细胞系的起源不清楚。此外，所述细胞系表现为可变异，且易受培养条件影响而改变。适用于下面实施例的NT-1细胞可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得，其保藏号是ATCCNo.74840。也见美国专利No.6,140,075，该专利通过引用并入本文。

从实验室规模的摇瓶到几千升生物反应容器，已经描述了很多植物细胞培养技术和***，并且这些对植物细胞培养领域的技术人员是公知的。例如见Fischer，R.et al，1999 Biotechnol.Appl.Biochem.30，109-112和Doran，P.，2000 Current Opinions inBiotechnology 11，199-204。培养到期望量之后，收获转化的植物细胞，轻轻漂洗并置于合适的缓冲液中进行超声。很多不同的缓冲液可用于本发明。一般所述缓冲液是中性pH值或接近中性pH的水性等渗缓冲盐溶液，其中不含任何去污剂。优选的缓冲液包括Dulbecco’s磷酸盐缓冲液和含1mM EDTA的PBS。

为了超声，将漂洗后的细胞置于约0.01gm/ml-约5.0gm/ml、优选约0.1gm/ml-约0.5gm/ml(漂洗后细胞湿重/缓冲液体积)的缓冲液中。很多商业供应的超声仪器符合本发明要求，超声时间是约5-约20秒，优选约15-约20秒。所得颗粒是膜性囊泡，大小可在几微米到几百微米并暴露所述重组的、免疫保护性的、锚定的蛋白质。

根据本领域公知的并在以下实施例中描述的方法表达并分离感兴趣的免疫保护剂或抗原。

在一个实施方案中，生产感兴趣抗原的方法包括制备含编码所述抗原的载体的转基因植物。在植物成熟发生之前在所述植物表达所述抗原的条件下培育所述植物。根据本实施方案，所述植物有成熟果实(包括但不限于番茄、香蕉、柑桔、瓜、草莓、菠萝、核果、芒果、pumpkin、squash等)。在施用之前，可从所述植物或从所述植物的果实中分离根据该方法产生的抗原。作为替代方案，不从所述植物中分离所述抗原，而以粗的、加工后食品或未加工的形式施用。这种方法的细节在下面实施例中描述。

根据本发明有用的植物

本发明也提供用本发明构建体转化的转基因植物。可用于本发明实施的植物包括任何双子叶和单子叶植物。这些包括但不限于烟草、番茄、马铃薯、茄子、pepino、薯蓣、大豆、豌豆、甜菜、莴苣、柿子椒、芹菜、胡萝卜、芦笋、洋葱、葡萄、香瓜、草莓、水稻、向日葵、油菜籽/canola、小麦、燕麦、玉米、棉花、胡桃、云杉/针叶树、白杨和苹果，浆果如草莓、悬钩子、苜蓿和香蕉。因为被人用作食物或作为动物饲料成分的很多可食用植物是双子叶植物，因此通常使用双子叶植物，尽管单子叶植物转化也是可行的，尤其是在生产用作动物饲料的某些谷物时。以容易施用人的果汁形式、如番茄汁、大豆汁和胡萝卜汁或乳汁来生产疫苗，对于人类婴儿预防某些疾病特别有利。根据本发明来源于这些植物疫苗的细胞和种子也是有用的。

已经用此***转化的代表性植物和代表性参考文献列举于表A。有可食用部分的、或者可以被加工来提供分离蛋白的其它植物可以用相同方法或其常规修改方法来转化。

                                       表A

植物	参考文献
		烟草番茄马铃薯茄子Pepino薯蓣大豆豌豆甜菜莴苣柿子椒芹菜胡萝卜芦笋洋葱葡萄香瓜草莓	Barton，K.et al.，(1983)Cell 32，1033Fillatti，J.et al.，(1987)Bio/Technology 5，726-730Hoekema，A.et al.，(1989)Bio/Technology 7：273-278Filipponee，E.et al.，(1989)Plant Cell Rep.8：370-373Atkinson，R.et al.，(1991)Plant Cell Rep.10：208-212Shafer，W.et al.，(1987)Nature.327：529-532Delzer，B.，et al.，(1990)Crop Sci.30：320-322Hobbs，S.et al.，(1989)Plant Cell Rep.8：274-277Kallerhoff，J.et al.，(1990)Plant Cell Rep.9：224-228Michelmore，R.，et al.，(1987)Plant Cell Rep.6：439-442Liu，W.et al.，(1990)Plant Cell Rep.9：360-364Liu，C-N.et al.，(1992)Plant Mol.Biol.1071-1087Liu，C-N.et al，(1992)Plant Mol Biol.1071-1087Delbriel，B.et al.，(1993)Plant Cell Rep.12：129-132Dommisse，E.et al.，(1990)Plant Sci.69：249-257Baribault，T.，et al.，(1989)Plant Cell Rep.8：137-140Fang，G，et al.，(1990)Plant Cell Rep.9：160-164Nehra，N.et al.，(1990)Plant Cell Rep.9：10-13

水稻向日葵油菜籽/Canola小麦燕麦玉米苜蓿棉花胡桃云杉/针叶树白杨苹果

Raineri，D.et al.，(1990)Bio/Technology.8：33-38Schrammeijer，B.et al.，(1990)Plant Cell Rep.9：55-60Pua，E.et al.，(1987)Bio/Technology 5.815Mooney ，P.et al.，(1991)Plant Cell Tiss.Organ Cult.25：209-218Donson，J.et al.，(1988)Virology.162：248-250Gould，J.et al.，(1991)Plant Physiol.95：426-434Chabaud，M.et al.，(1988)Plant Cell Rep.7：512-516Umbeck，P.et al.，(1987)Bio/Technology.5：263-266McGranahan，G.et al.，(1990)Plant Cell Rep.8：512-516Ellis，D.et al.，(1989)Plant Cell Rep.8：16-20Python，F.et al.，(1987)Bio/Technology 5：1323James，P.et al.，(1989)Plant Cell Rep.7：658-661

用上述载体转化的转基因植物是本发明的另一个方面。

马铃薯变种FL 1607(“Frito Lay 1607”)和Desiree与番茄变种TanksleyTA234TM2R是特别优选的变种，它们已经用此处描述的方法转化二元载体。这些转化的变种中，Desiree是仅有的商业变种；另外的变种可以从Frito-Lay(Rhinelander，Wis.)和Steve Tanksley(Dept.of Plant Breeding，Cornell Univ.)获得。马铃薯变种FL 1607允许快速转化但不是良好的农业变种，因为它有空心。

优选番茄作为表达外源蛋白的模式***，因为它容易基因转化，还因为有果实特异性的、成熟依赖的启动子进行受调控表达(Giovannoni et al.，1989)。

本发明包括整个植株、植物细胞、植物器官、植物组织、植物种子、原生质体、愈伤组织、细胞培养物和组构成可表达至少本发明多聚核苷酸的结构和/或功能单元的任何植物细胞的群体。优选的是，整个植株、植物细胞、植物器官、植物组织、植物种子、原生质体、愈伤组织、细胞培养物和任何植物细胞的群体产生0.001、0.01、1、5、10、25、50、100、500或1000μg本发明多肽/克总可溶性植物材料。

根据本发明的疫苗的用途、剂量和给药

食用植物产生的抗原提供用于制备疫苗的较低成本的抗原来源，不需要动物来源的成分。

根据本发明的疫苗可用于抵抗感兴趣的病原体并抵抗病毒感染。

1.给药

本发明提供向哺乳动物施用根据本发明的疫苗以预防病毒感染的方法。

在一个实施方案中，经口腔(通过饲喂或口腔管饲(oral gavage))施用疫苗以确保诱导粘膜免疫应答同时利用其成本和方便性。方便的是，口服给药步骤使得消耗根据本发明的转基因植物或植物的一部分。根据本发明的可食用的疫苗的形式可以是植物的一部分、提取物、汁、液体、粉或片剂。

也可以喷鼻剂形式通过鼻内途径施用根据本发明的疫苗。作为替代方案，可通过口腔、腹膜内、肌内、静脉内或皮下途径施用根据本发明的疫苗。

本发明提供含有与生理相容性递体混合的可食用疫苗的组合物。本文所用的“生理相容性递体”表示生理学上可接受的稀释剂，如水、磷酸盐缓冲液或盐水，还可以包括佐剂。佐剂如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾是本领域公知的材料。

本发明还提供药物组合物。除了活性成分以外，这些药物组合物可包含可药用的药学上可接受的递体制剂。

可以适于口服的剂量、用本领域公知的药学上可接受的递体配制口服药物组合物。这些递体能使所述药物组合物配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、悬浆、悬液等剂型，供患者摄入。

口服使用的药物制剂可以通过下列方法获得：组合活性化合物与固体赋形剂，如果加入合适助剂，然后可选的研磨所得混合物，并加工混合物颗粒，以获得片剂或糖衣丸芯。合适的赋形剂是碳水化合物或蛋白质填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；来自玉米、小麦、米、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶，包括***胶和黄芪胶；和蛋白质，如明胶和胶原。如果需要可以加入崩解剂或助溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，如海藻酸钠。

糖衣丸芯可与合适的包衣剂一起提供，这些包衣剂如浓缩糖溶液，其中也可含有***胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。染料或色素可以加入所述片剂或糖衣丸包衣剂以用于产品鉴别或用于表征活性成分的量，即剂量。

可用于口服的药物制剂包括由明胶制造的推入-契合型胶囊，以及由明胶和包衣如甘油或山梨醇制造的软密封胶囊。推入契合型胶囊可包含活性成分与填充剂或粘合剂，如乳糖或淀粉；润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁；和可选的稳定剂。软胶囊中，所述活性成分可溶解或悬浮于含或不含稳定剂的合适液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。

经肠道外给药的药物制剂包括活性化合物的水溶液。用于注射时，本发明的药物组合物可配制成水性溶液，优选生理相容性缓冲液如Hank’s液、Ringer’s液或生理缓冲盐溶液。水性注射悬液可包含增加悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。此外，所述活性溶剂或赋形剂的悬液包括脂肪油如芝麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或三甘油酯；或脂质体。可选的，所述悬液也可包含合适的稳定剂或增加所述化合物溶解度以制备高度浓缩溶液的成分。

用于经鼻给药时，适用于待透过的特定屏障的渗透剂用于所述配方。这种渗透剂通常在本领域已知。

2.制造和保存

本发明的药物组合物可以本领域已知的方法制造，例如，通过常规的混合、溶解、造粒、造糖衣丸、悬浮、乳化、胶囊化、捕获或冻干工艺。

所述药物组合物可以盐形式提供并可以与多种酸形成，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等。与游离碱形式相比，盐更容易溶于水性或其它质子溶剂。另外，优选制剂可以是1mM-50mM组氨酸、0.1％-2％蔗糖、2％-7％甘露醇、pH 4.5-5.5中的冻干粉，使用前与缓冲液混合。

含有配制在可接受递体中的本发明化合物的药物组合物制备后，可以放置于适当的容器中，并标记治疗适应症的信息，包括给药量、频率和方法。

3.治疗有效剂量

适用于本发明的药物组合物包括所含活性成分量可以有效获得预期目的的组合物。有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。

对于任何化合物，可在细胞培养物测试或动物模型通常是鸟、小鼠、兔、狗或猪中初步估计治疗有效剂量。所述动物模型也用于获得需要的给药浓度范围和途径。这些信息然后可用于确定人中的有用剂量和给药途径。

治疗有效剂量指可以预防或改善例如由病毒感染所致症状或疾病的蛋白质或其抗体、拮抗剂或抑制剂的量。这些化合物的治疗功效和毒性可通过标准制药方法在细胞培养物或实验动物中测定，例如ED50(群体中50％有效的治疗剂量)和LD50(群体中50％致死的剂量)。治疗作用和毒性作用的剂量比是治疗指数，它可以表达为LD50/ED50比。优选表现大治疗指数的药物组合物。由细胞培养物和动物研究中获得的数据用于配制供人使用的剂量范围。这些化合物的剂量优选位于包括ED50的很少或没有毒性的循环浓度范围内。在此范围内的剂量变化依赖于所用剂型、患者敏感度和给药途径。

由各医生或兽医根据待治疗患者选择确切剂量。调整剂量和给药法以提供足够水平的活性成分或维持期望作用。可考虑的其它因素包括疾病状态的严重程度；患者的年龄、体重和性别；饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感度和对治疗的耐受/应答。取决于具体配方的半寿期和清除速率，长期作用药物组合物可以每3到4天、每周或每两周一次施用。

一般来说，取决于待使用组合物的期望剂量和类型，组合物包含总共约0.5％-约50％的所述化合物。然而，所述化合物的量最佳限定为有效量，即给需要这种治疗的患者提供期望剂量的每种化合物量。附加组合的活性不依赖于所述组合物的性质，因此仅依据方便性和经济性来选择并配制所述组合物。任何所述所组合可以配制成任何期望的组合物形式。

取决于给药途径，剂量变化范围可以是0.1-100,000微克重组蛋白；转化的植物细胞或转化的转基因植物/人/天，例如1μg、10μg、100μg、500μg、lmg、10mg、甚至总剂量最高约1g/人/天。在一个实施方案中，剂量范围是1ng-0.5mg/千克体重。在另一个实施方案中，剂量范围是1μg-50μg/千克体重。在另一个实施方案中，剂量范围是1μg-25μg/千克体重。在另一个实施方案中，剂量范围是2μg-25μg/千克体重。在另一个实施方案中，剂量范围是2μg-15μg/千克体重。例如，在一个实施方案中，HN抗原皮下施用2.5-5μg，IN/经眼施用0.5-12μg；HA抗原皮下施用1-5mg，IN/经眼施用24-26μg；VP2抗原皮下施用8-17μg，LT抗原口服施用50-100ng，皮下施用2-10μg，IN/经眼施用2-10μg；文献中提供关于特定剂量和递送方法的指导。见美国专利No.4,657,760、5,206,344或5,225,212，通过引用并入本文。本领域技术人员将使用不同于蛋白质或其抑制剂的核苷酸配方。同样，多聚核苷酸或多肽的递送对特定细胞、疾病状况、位置等也将是特异的。

测试本发明疫苗的功效

通过证明施用所述疫苗预防或改善待处理或预防的病毒感染的症状或由感兴趣病原体诱导的症状至少5％、优选10-20％、更优选25-100％，来测试根据本发明疫苗的功效。

通过下述方法测定根据本发明的疫苗的功效：测量对植物来源的感兴趣蛋白质接种应答而产生的抗体，检测针对植物来源的感兴趣蛋白质接种应答的抗体生成，其中所述抗体抑制血细胞凝集，并评价已接种并用含本发明保护性抗原的疫苗激发的受试对象死亡率(所有这些在下文描述)。

已经大体描述本发明，通过参考以下实施例，可以更容易理解本发明，这些实施例以举例方式提供，除非明确提出、并不限制本发明。

                        实施例1：载体

基因构建：分析NDV株“Lasota”的HN基因的编码序列(GenBank accessionAF077761)的密码子偏好和不期望序列基序的存在，这些基序可以介导错误的mRNA加工和不稳定性或基因组DNA的甲基化。见Adang M J，Brody MS，Cardineau G，EaganN，Roush RT，Shewmaker CK，Jones A，Oakes JV，McBride KE(1993)The constructionand expression of Bacillus thuringiensis cryIIIA gene in protoplasts and potato plants.Plant Mol Biol 21：1131-1145。根据反映番茄和马铃薯密码子使用偏好的杂合密码子偏向性设计植物优化的编码序列(Ausubel F.，et al.，eds.(1994)Current Protocols inMolecular Biology，vol.3，p.A.1C.3 Haq T A，Mason HS，Clements JD，Arntzen CJ(1995)Oral immunization with a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants.Science 268：714-716)。所设计的序列示于图1。由商业供应者(Retrogen)合成HN基因并以两个独立的质粒提供，质粒中分别包含克隆到pCR-Blunt中的所述基因的5’(p4187-4203-1)或3’(p42111-4235-1c-1)部分。

质粒构建：基于图2中所示的载体pBBV-PHAS-iaaH构建用于农杆菌介导的植物转化的二元载体，所述载体使用通过引用并入本文的美国专利No.5,879,903；5,637,489、5,276,268和5,273,894中所述的植物选择标记草铵膦乙酰转移酶(PAT)，并由WO97/48819描述的组成型木薯脉花叶病毒启动子(CsVMV)驱动。通过用PacI消化pBBV-PHAS-iaaH而删除iaaH基因和菜豆球蛋白启动子序列，并重连接形成pCVMV-PAT；然后通过用Klenow酶补平而删除单个HindIII位点并重连接形成pCP！H。用引物CVM-Asc(5′-ATGGCGCGCCAGAAGGTAATTATCCAAG SEQ IDNO：5)和CVM-Xho(5′-ATCTCGAGCCATGGTTTGGATCCA SEQ ID NO：6)对模板pCP！H进行PCR，末端修正CsVMV启动子，并将产物克隆到EcoRV消化的、加T尾的pBluescriptKS上，得到pKS-CVM7。pCP！H的图谱示于图3。通过连接载体pKS-CVM7/NcoI-EcoRI与3个***片段：NcoI/PstI双切的HN 5’部分、PstI/KpnI双切的HN 3’部分和KpnI-EcoRI双切的大豆vspB 3’元件(Haq 1995)，构建HN表达盒pKS-CHN。然后通过将载体pCP！H/AscI-EcoRI和pKS-CHN的AscI-EcoRI片段连接，组装二元T-DNA载体pCHN。pCHN的图谱示于图4。

描述于美国专利No.5,824,798中的结合颗粒的淀粉合酶(GBSS)启动子被用于构建其它载体，该专利通过引用并入本文。使用从Solanum tuberosum L.cv.的基因组DNA扩增的启动子片段构建这些构建体。“Desiree”使用由中国马铃薯栽培种“Dongnong”的GenBank accession X83220的序列设计的引物。用诱变引物“GSS-Nco，，(5′-tgccatggtgatgtgtggtctacaa SEQ ID NO：7)和与-1800bp位5’区域互补的正向引物“GSS-1.8F”(5′-gatctgacaagtcaagaaaattg SEQ ID NO：8)来创建与翻译起始密码子重叠的一个NcoI位点；将1825 bp PCR产物克隆到带T尾的pBluescriptKS中，得到pKS-GBN并测序。用诱变引物“GSS-Xho”(5′-agctcGAGCTGTGTGAGTGAGTG SEQID NO：9)与引物“GSS-1.8F”创建位于转录起始位点即3’端的一个XhoI位点；将1550 bp PCR产物克隆到带T尾的pBluescriptKS中，得到pKS-GBX并测序。

通过将HindIII/XhoI消化的载体pTH210和pKS-GBX的HindIII/XhoI片段连接，使811bp GBSS启动子取代CaMC 35S启动子，来组装通过引用并入本文的美国专利5,891,665中所述的、包含TEV 5’UTR(非翻译区)的GBSS启动子表达盒，从而得到pTH252A。见Haq TA，Mason HS，Clements JD，Arntzen CJ(1995)Oral immunizationwith a recombinant bacterial antigen produced in transgenic plants.Science 268：714-716。通过将NcoI/PstI双切的HN 5’部分和PstI/KpnI双切的HN 3’部分连接将HN基因***pTH252A/NcoI-KpnI，从而得到pHN252A。通过将NsiI和EcoRI消化的载体pGLTB(示于图11)与片段pHN252A/NsiI-KpnI和pTH210/KpnI-EcoRI连接而得到二元T-DNA载体pgHN。pgHN的图谱示于图5。

通过将HindIII/NcoI消化的载体pTH210(Haq 1995)与pKS-GBN的HindIII/NcoI片段连接，使1084bp GBSS启动子/5’UTR取代(花椰菜花叶病毒)CaMV 35S启动子/TEV 5’UTR，来组装含GBSS 5’UTR的GBSS启动子表达盒(描述于美国专利No.5,824,798，通过引用并入本文)与其内含子，从而得到pTH251A。通过将载体pCLT105(示于图12)与片段pTH251A/HindIII-NcoI和pHN252A/NcoI-KpnI连接，得到二元T-DNA载体pgHN151。pgHN151的图谱示于图6。

构建含带内含子的GBSS 5’UTR和菜豆球蛋白3’元件的GBSS启动子表达盒(描述于美国专利No.5,270,200、6,184,437、6,320,101，通过引用并入本文)。首先，在唯一KpnI位点消化pCP！H，用T4 DNA聚合酶钝化，并重新连接得到pCP！HK，其中的KpnI位点已经去除。用NsiI消化pCP！HK，随后用T4 DNA聚合酶钝化，然后用PacI消化。所得载体与SacI消化的pgHN151的2848bp片段连接，随后用T4 DNA聚合酶钝化，然后用PacI消化，得到pgHN153。pgHN153的图谱示于图7。

使用嵌合型组成型启动子(4OCSΔMAS美国专利No.5,001,060、5,573,932和5,290,924，通过引用并入本文)构建另一个HN表达载体。用EcoRV消化质粒pAGM149，并用BamHI部分消化。该片段与PmeI/PstI消化的pCHN和由用BamHI/PstI消化pKS-CHN获得的合成HN基因的5’部分连接。所得pMHN示于图8。

从David Suarez(SEPRL，Athen，GA)获得含AIV A/turkey/Wisconsin/68(H5N9)HA基因的质粒。通过PCR进行末端修正，在5’端加上限制性位点NcoI和在3’端加上KpnI位点，并***包含35S启动子、TEV 5’-UTR和vspB 3’端的载体pIBT210.1(Haq et al.，1995)中。通过用HindIII和EcoRI消化(部分)将所述表达盒转移到二元载体pGPTV-Kan(Becker et al.，Plant Mol Biol 1992；20：1195-7)，从而得到pIBT-HAO。通过用NcoI和EcoRI消化(部分)而获得来自pIBT-HAO的HA基因/vspB 3’端片段，并***pKS-CVM7而得到pKS-CHA。通过用AscI和EcoRI消化(部分)而从pKS-CHA获得含CsVMV启动子、HA基因和vspB 3’端的表达盒，将之与pCP！H连接从而得到pCHA，示于图9。

构建含NDV-HN的植物优化的核苷酸序列的双子叶植物表达载体。在一个二元表达载体中，完整的构建体包含所述基因表达盒；拟南荠(At)泛素3(Ubi3)启动子v2/新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(NDV-HN)/vspb 3’UTR∷木薯脉花叶病毒(CsVMV)启动子/PAT选择标记/拟南荠(At)ORF25 3’UTR。

通过完成3向连接组装所述表达盒(图48)。通过去除CsVMV启动子和GUS基因修饰二元载体pCGUS。酶HindIII和KpnI(New England Biolabs)的限制酶消化释放8310bp DNA片段。NDV-HN基因作为1731bp的NcoI/KpnI(New EnglandBiolabs)限制酶消化的DNA片段从质粒pCHN中分离。最后AtUbi3启动子v2作为NcoI/HindIII(New England Biolabs)限制酶消化物从pDAB7121中分离。所得反应产生1732 bp的DNA片段。通过“Qiaex Gel Extraction Kit”(Qiagen)从琼脂糖凝胶中切出所有三种酶消化物的DNA。使用等摩尔浓度的所有三种DNA片段完成3向连接。连接由“T4 DNA连接酶”(New England Biolabs)催化。所得连接产物用于转化“OneShot Top10 Chemically Competent E.coli.”(Invitrogen)。从这次转化中分离两个菌落。经限制酶消化初步筛选，表明两个克隆都产生期望的DNA分带模式。用以下酶完成限制酶反应：EcoRV、FspI、HinDIII、NcoI、SacI、ScaI(New England Biolabs)。正确构建体的进一步确认涉及跨AtUbi 3’启动子v2/NDV-HN边界的测序反应。使用“Beckman CEQ Quick Start Kit”(Beckman Coulter)用引物pUHN2(tgg ttg gag cct agggta ct)完成测序反应。测序反应的结果显示AtUbi3启动子v2 DNA片段确实与NDV-HN DNA片段在预期NcoI限制位点处连接。跨NDV-HN/pCGUS边界和pCGUS/AtUbi3’启动子v2边界的测序要求另外的步骤。完成两个边界的PCR反应。用“FailSafe PCR Kit”(Epicenter)PCR扩增NDV-HN/pCGUS边界和pCGUS/AtUbi3’启动子v2边界。用FailSafe缓冲液B和C与PCR引物KpnI 5’(act aat act taa tga taaca)和KpnI 3’(ata cac tac ctc cac atg tt)完成NDV-HN/pCGUS边界的两个反应。用FailSafe缓冲液B和C与PCR引物HinDIII 5’(tgccggttttcaggtaac ata)和HinDIII 3’(agt tag gcc cga ata gtt tga a)完成pCGUS/AtUbi3’启动子v2边界的两个反应。所有PCR反应产生预期长度的DNA片段(～600bp)。将所述边界区的PCR扩增产物克隆入“TOPO TA cloning kit with pCR2.1-TOPO”(Invitrogen)。通过EcoRI限制酶消化(New England Biolabs)鉴定含所述扩增边界区的克隆。为确认确实在这些边界临界发生了期望连接，用“Beckman CEQ Quick Start Kit”’(Beckman Coulter)用M13反向测序引物(aac agc tat gac cat g)完成测序反应。这些测序反应的结果表明在pCGUS/NDV-HN和pCGUS/AtUbi3’启动子v2边界处确实发生了正确的连接反应。

                    实施例2：制备转基因烟草

转化前3到4天，通过将2ml NT-1培养物加入到40ml NT-1培养基中，将1周龄NT-1培养物亚培养到新鲜培养基上。亚培养物25±1℃下摇床上100rpm避光培养。

              NT-1培养基

试剂	/升
		MS盐	4.3g
MES贮液(20X)	50ml
		B1肌醇贮液(100X)	10ml
Miller’s I贮液	3ml
		2，4-D(1mg/ml)	2.21ml
蔗糖	30g
		PH调至5.7±0.03

               B1肌醇贮液(100X)(1升)

              盐酸硫胺素(Vit B1)-0.1g

               MES(20X)(1升)

              MES(2-N-吗啉代乙基磺酸)-10g

              肌醇-10g

               Miller’s I(1升)

              KH₂PO₄-60g

从甘油保存物中取包含感兴趣表达载体的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)划线到含50mg/l壮观霉素的LB培养基平板上。细菌培养物在暗处30℃培养24-48小时。选取一个外形良好的菌落并转移到3ml含50mg/l壮观霉素的YM培养基中。在培养摇床中250rpm下暗处30℃培养液体培养物直到OD₆₀₀是0.5-0.6。这大概需要24小时。

         LB培养基

试剂	/升
		Bacto-胰蛋白胨	10g
酵母提取物	5g
		NaCl	10g
Difco Bacto Agar	15g

        YM培养基

试剂	/升
		酵母提取物	400mg
甘露醇	10g
		NaCl	100mg
MgSO4·7H2O	200mg
		KH2PO4	500mg

(作为替代方案，购买粉状YM(Gibco BRL；catalog #10090-011)。加11.1g到1升水中制备液体培养基。)

转化当日，向每ml NT-1培养物中加入1μl 20mM乙酰丁香酮。转化当日制备乙酰丁香酮的乙醇贮液。创伤处理NT-1细胞以增加转化效率。为进行创伤处理，用10ml宽口无菌吸管上下重复吹打悬浮培养物(20次)。向10个60×15mm Petri板的每个中转移4毫升所述悬浮物。保留一个平板用作非转化对照。向剩下的9个平板的每个中加入大约50-100μl农杆菌悬浮物。用parafilm膜封板，然后在暗处25±1℃摇床上100rpm培养3天。

转移细胞到无菌50ml锥形离心管，并用NTC培养基补充到45ml体积(含高压灭菌后加入的500mg/ml羧苄青霉素的NT-1培养基)。混合，然后在配备吊桶转头的离心机中1000rpm离心10min。弃上清液，所得沉淀重悬于45ml NTC。重复洗涤。离心悬浮液并弃上清，沉淀重悬于40ml NTC。取5ml部分样品铺到含NTCB10培养基(NTC培养基用8g/l Agar/Agar固化；补充10mg/l双丙氨膦，高压灭菌后加入)的每个Petri板(150×15mm)上。用parafilm膜封板并在暗处25±1℃培养。转移到培养室之前在层流罩中打开平板以使过量液体蒸发。6到8周后，出现假想的转化体。从中选取并转移到新鲜NTCB5(NTC培养基用8g/l Agar/Agar固化；补充10mg/l双丙氨膦，高压灭菌后加入)。用parafilm膜封板并在暗处25±1℃培养。

假想转化体表现为在死的非转化细胞背景下的小愈伤组织簇。转移这些愈伤组织到NTCB5并使之生长几周。选取每个假想转化体的一部分供ELISA分析。至少2系列ELISA分析之后，选择具有最高抗原水平的株系。在平板培养上，有时也在液体培养中扩增每个优良系的愈伤组织材料量。所得转化的NT-1细胞系表达并积累新城疫病毒(Lasota株)的HN蛋白，或转化的细胞系CHA表达禽流感病毒的HA蛋白。这些细胞系包含未鉴定数拷贝的稳定整合到核染色体DNA上质粒的T-DNA区。通过HN特异性ELISA测定，转基因CHNNT-1细胞积累HN水平最高占总可溶性蛋白的1％。

扩增并选择具有Bialaphos^_抗性的转基因NT-1细胞和马铃薯株系，并用ELISA评价HN表达。在液体悬浮培养中建立高表达的NT1细胞系。筛选在叶组织中表达的含组成型启动子构建体(pCHN，pMHN)的马铃薯株系，并将选择的株系转移到土壤中，在温室中培育以获得供评价的块茎。用体外形成的微块茎筛选含块茎特异性GBSS启动子构建体(pGHN，pGHN151，pGHN153)的马铃薯株系中的表达。

用CsVMV启动子的pCHN转化NT-1细胞系中的HN表达.对生长于固体培养基上的愈伤组织测试的NT-1细胞系中HN表达示于图19。最高表达系是CHN-5(8.5ng/μg TSP)和CHN-18(6.2ng/μg TSP)。在液体悬浮培养中建立CHN-1和CHN-5系。在这些培养物中每单位细胞量的HN表达示于图20。CHN-5系表现为6.7μg/g细胞量的HN表达。图20中所示的相同细胞系进行多次评价，在最后时间点测试一些新的细胞系，在NT1细胞系中HN表达的稳定性(图21)。使用单克隆抗体检测，CHN-5和CHN-7系提取物的Western印迹显示与参照标准共迁移的单一反应性条带，使用多克隆抗血清检测时还显示一个附加的较小条带(图22)。

新鲜细胞的冻干和提取物4℃保存的影响.为了检测干燥对抗原稳定性的影响，提取冻干NT1细胞并用ELISA测试。冻干细胞提取物显示单位新鲜细胞量的HN含量没有丧失或明显增加(图23)。另外，ELISA测试显示保存于4℃一周的新鲜细胞提取物中HN含量增加(图23)。用另一个膜结合病毒蛋白-乙肝表面抗原，我们观察到了相似的作用。这可以归因于半胱氨酸残基氧化形成正确的二硫键，导致展现适当的抗原表位。

植物表达HN抗原的颗粒行为.为了评价NT1细胞表达的抗原组装形成颗粒结构的情况，对细胞粗提物进行蔗糖梯度沉降。表示于图24的谱型显示NT1细胞来源的HN表现出两个ELISA反应性物质的峰。一个峰与无活性病毒颗粒共沉降，而另一个峰沉降较慢但仍表现出颗粒特性。这些数据提供HN蛋白正确***ER膜的证据。

pMHN转化的NT1细胞系中使用(4ocs)ΔMAS启动子的HN表达.与pCHN转化的NT1细胞系相比较，几个转化了pMHN的细胞系中HN表达示于图25。pMHN转化的细胞系中表达至少与pCHN转化的细胞系一样高，观察到的最高HN积累约30μg/g细胞量。pCHN转化的NT1细胞中最大HN表达小于20μg/g细胞量。也产生了Bialaphos^_抗性的NT1细胞系并用上述ELISA测试HA表达。第一组测试中，只有一个pCHA转化的细胞系积累HA的程度与之前产生的12号pGPTV-HAO系的相似(图13)。在该实验中，表达范围最高为2.5ng/μg TSP。在使用这些和新pCHA转化的细胞系的重复实验中，HA积累范围在CHA-13系中最高为18ng/μg TSP(图14)。用Western印迹分析选自该组的细胞系。在所有测试的pCHA系中，都观察到预期大小约68kDa的活性带(图15)。这些数据显示HA蛋白被正确加工而除去信号肽，并以稳定形式积累。以前通过非变性Western印迹对pGPTV-HAO转化的NT1细胞进行的研究(未公开研究)显示HA装配成寡聚体结构，可能是在AIV毒粒表面出现的天然三聚体。

                         实施例3：冻存

细胞培养：NT-1烟草悬浮培养物(非转基因和转基因系)培养在250ml烧瓶中。首先，细胞培养于改进的液体Linsmaier and Skoog培养基(LS)(1965)。该培养基称为LSg，包含LS盐和维生素、30g/l葡萄糖和0.05mg/l 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。该培养基的pH调到5.8。通过转移6ml 7天培养物到50ml LSg培养基中，每周转移培养物到新鲜培养基中。

基于LSg培养基中细胞的不良生长，研究了称作KCMS和NT-1的另外两种培养基。KCMS包含Murashige and Skoog(MS)(1962)盐、1.3mg/l硫胺素、200mg/lKH₂PO₄、30g/l蔗糖、0.2mg/l和0.1mg/l激动素。NT-1培养基包含MS盐、180mg/lKH₂PO₄、0.5mg/l 2-N-吗啉代乙基磺酸、1mg/l硫胺素、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖和2.21mg/l 2，4-D。两种培养基的pH都调到5.7。为了转移到新鲜培养基中，转移2ml 7天培养物到48ml KCMS或NT-1培养基中。所有悬浮培养物在有轨摇床上100rpm下培养于暗处25℃。

预培养：亚培养后3天(晚指数生长期)，用1M甘露醇更换三分之一的培养基(最终浓度0.3M)，细胞于各自培养基(LSg、KCMS或NT-1)中预培养24-72小时。

热激处理：预培养后，培养物置于有轨摇床上100rpm在37℃培养2小时。然后在透明化之前转移回25℃摇床培养4小时。

透明化：称为PVS2/100％的透明化溶液含有存在于0.4M蔗糖溶液中的30％甘油、15％乙二醇和15％DMSO。通过稀释PVS2/100％得到PVS2/20％溶液。两种溶液pH都调到5.8，高压灭菌，然后4℃保存。

为开始透明化过程，将4ml冰冷PVS2/20％加入到1ml沉积细胞体积的细胞中。制备物在冰上孵育5分钟，然后以一分钟间隔加入1ml冷PVS2/100％直到总体积达到9ml。制备物于7500-8000rpm离心1分钟。弃上清液，细胞保持在冰上，然后以1分钟间隔加入0.5ml PVS2/100％ 2次。再以1分钟间隔加入1ml PVS2/100％ 3次。接着向6个冻存管(Continental Plastic Corporation，Delavan，WI)中的每个中转移入半毫升该混合物。用热钳热封管子的两端，并立即浸入液氮中。剩余的2ml不冷冻保存，作为对照。

恢复：液氮中1小时后，在40℃水浴中融化透明化细胞3-5秒，然后立即用7ml冷1.2M蔗糖稀释。细胞保持于湿冰上20分钟，然后于7500-8000rpm离心3分钟。转移细胞到2层滤纸(42.5mm Whatman)上，滤纸放置于60×15mm组织培养板中含0.75％琼脂糖(Invitrogen Life Technogies，Carlsbad，CA)的LSg或NT-1固体培养基上。培养物在暗处25℃下培养。铺板两天后，细胞转移到新鲜NT-1固体培养基上。转基因系首先铺在不含选择试剂的培养基上，直至细胞生长已良好建立并覆盖小板，然后将它们转移到含适当选择试剂的培养基上。

随后，大约每2周将细胞转移到新鲜培养基中。当细胞生长几乎覆盖了平板中培养基的表面时，从滤纸上取下细胞并转移到更大平板(100×15mm)。当愈伤组织再次覆盖平板时，将细胞转移到用8g/l Agar(Sigma，St.Louis，MO)固化的NT-1培养基中培养。

                        实施例4：抗原制备

直接从细胞培养物收获表达HN、HA或空对照的全部湿NT-1细胞，并过滤去除过量培养基，过滤是通过在布氏漏斗中放置Spectramesh 30滤纸并用低真空使细胞和培养基通过滤纸而实现。将0.5克细胞放入2ml缓冲液(Dulbeccos Phosphate BufferedSaline和1mM EDTA)中，然后在冰上超声15、20秒。超声使用带可更换微探头的Branson 450超声仪进行不同时间，输出控制为8，工作循环60。然后放置超声物于冰上直至使用。

                         实施例5：抗原提取

为验证不经去污剂处理是否能从转化的NT-1细胞中释放ELISA信号并保留生物活性，进行一系列处理，其中涉及比较没有去污剂的处理和多种水平的超声。结果是引人注目的，超声时间大于20秒的提取缓冲液中完全破坏了来自携带pCHN的NT-1细胞系的HN凝血活性，但不破坏ELISA信号。相反，仅超声20秒的DPBS中不仅释放可被ELISA信号检测的抗原，而且可溶性蛋白提取物表现出优异的凝血活性(见表1)。

                                      表1

                     提取方法对植物来源HN凝血活性的影响的比较

样品	DPBSsonic.1.5min	提取缓冲液sonic.1.5min	DPBSsonic.15秒	提取缓冲液F/Tsonic.15秒	DPBSF/Tsonic.15秒
						pCHN-18-NT-1	≤2	256	4096	1024	1024
pCHA-47-NT-1	≤2	-	64	16	16
						NT-1	≤2	≤2	≤2	≤2	≤2
天然NDV1	256	512	128	nd	nd

¹天然NDV超声2分钟。提取缓冲液-50mM抗坏血酸钠、1mM EDTA、1mM PMSF和0.1％Triton X-100 pH7.2；DPBS-Dulbeccos磷酸盐缓冲液；sonic.-超声；F/T-冻-融；nd-本实验未做。

不用去污剂提取的植物来源的HN用作凝血抑制实验的抗原，以确定针对天然病毒产生的多克隆抗体是否可以通过所述植物来源的HN识别并抑制RBC聚集。结果表明天然抗体可以与天然病毒相似的方式识别所述植物来源的HN的凝血表位(表2)。表2的数据还证明对照NT-1细胞或表达非凝血蛋白的NT-1细胞不使红细胞凝集也不受NDV特异性血清影响。在此实验中，植物来源的提取物稀释到4个HA单位，然后用NDV特异性多克隆抗血清处理。4个HA单位是用于测定血清效价的标准病毒量。

                                  表2

               植物来源的HN和天然病毒凝血抑制活性(HAI)的比较

样品	HN浓度ELISA	凝血效价	凝血抑制作用效价(鸡抗NDV多克隆抗体)
				NDV尿囊液(天然)	20μg/ml	4*	4096
NT对照细胞	无	≤2	≤8
				pCHN-7-NT-1	1.5μg/g鲜重	＞64	512
CHN-18-NT-1	12μg/g鲜重	≥4096	1024
				CLT-101-14-NT-1	无	≤2	≤8

^*病毒原液稀释到4HA单位，原液的1∶4稀释产生阳性HA但1∶8稀释不凝血。这是用于测定抗体效价的病毒浓度，干扰4个HA单位病毒的抗体终点稀释度认为是抗体制剂的HAI效价。

以上数据表明，对于表达HN或HA的转化NT-1细胞，使用不用去污剂并减小细胞破碎量的提取方法产生保留凝血活性的细胞外成分。为确定来自非去污剂提取的NT-1细胞的HN蛋白是否有与疫苗功效相关的其他生物活性，验证HN提取物结合鸡细胞受体的能力。免疫荧光染色表明天然病毒或pCHN-18提取物处理的CEF细胞无法区分。因而，植物来源的HN保留结合靶细胞表面受体的类似病毒的能力。

表1和2以及上述讨论的凝血和免疫荧光测试的组合数据提示，如果正确加工和配制，来自转基因NT-1细胞的HN蛋白保留免疫学和生物学特性。以上提供数据的最显著之处是：HAI测试中天然病毒的抗血清识别植物来源的HN。含超过背景至少4倍以上效价HAI活性的鸡几乎总是有某种抵抗有毒力病毒攻击的能力。为测试如上所述的无去污剂的植物来源的蛋白提取物是否在目标动物物种中产生抗体，制备了HA和HN蛋白并接种到鸡和兔中。

                     实施例6：定量ELISA

HN

在进行HN定量ELISA测试前一天包被板子。50μl/孔捕获抗体(50％甘油中的兔抗HN，在0.01M硼酸缓冲液中稀释(1∶500))加入到各平底96孔微滴定板的每个孔中。盖上板子并2℃-7℃孵育过夜(12-18小时)。使包被的ELISA板平衡到室温(约20-30分钟)，然后用200-300μl PBS-T/孔/次洗涤三次。加入200μl/孔3％脱脂奶封闭溶液封闭整板以防止非特异性反应。然后在37℃±2℃孵育板子2小时(+10分钟)(用板盖或等价物盖上板子)。加入1％脱脂奶封闭液中的HN参照抗原(Ag)至浓度达250ng HN/ml；实验抗原用1％封闭液稀释。用PBS-T洗涤HN ELISA板一次，然后100μl/孔稀释的HN参照抗原和HN测试样品加入B行。50μl/孔1％封闭液加入所有剩余孔中。沿着板子从B行到G行依次转移50μ1/孔，每次转移前用吸管混合4-5次，使样品系列稀释。盖上板子并在37℃±2℃孵育板子1小时(+10分钟)；用PBS-T洗涤ELISA板3次。将用3％封闭液1∶2000稀释的50％甘油中的50μl NDVHN 4A腹水加入每个孔中，然后盖上板子并在37℃±2℃孵育板子1小时(+10分钟)。用PBS-T洗涤ELISA板3次，将用3％封闭液1∶3000稀释的50％甘油中的50μl兔抗小鼠IgG加入每个孔中。盖上板子并在37℃±2℃孵育板子1小时(+10分钟)。用PBS-T洗涤ELISA板3次，将50μl ABTS过氧化物酶底物溶液(室温平衡至少30分钟)加入每个孔中。盖上板子并在室温避光孵育板子15-20分钟。在波长405nm处(使用492nm参照滤光片)读孔中的光密度(OD)。HN参照抗原的起始稀释度应该为0.7-1.0OD，这用作ELISA的阳性对照。

HA

对于HA的定量ELISA，在进行测试前一天包被板子。将50μl/孔捕获抗体(50％甘油中的山羊抗Hav5，在0.01M硼酸缓冲液中稀释(1∶1000))加入到各平底96孔微滴定板的每个孔中。盖上板子并2℃-7℃孵育过夜(12-18小时)。使包被的ELISA板平衡到室温(约20-30分钟)，然后用200-300μl PBS-T/孔/次洗涤三次。加入200μl/孔3％脱脂奶封闭溶液封闭整板以防止非特异性反应。然后在37℃±2℃孵育板子2小时(+10分钟)(用板盖或等价物盖上板子)。加入1％脱脂奶封闭液中的AIV-HA(尿囊液)参照抗原至浓度达1000ng HA/ml；实验抗原用1％封闭液稀释。用PBS-T洗涤HA ELISA板一次，然后将100μ1/孔稀释的HA参照抗原和HA测试样品加入B行。50μl/孔l％封闭液加入所有剩余孔中。沿着板子从B行到G行依次转移50μl/孔，每次转移前用吸管混合4-5次，使样品系列稀释。盖上板子并在37℃±2℃孵育板子1小时(+10分钟)；用PBS-T洗涤ELISA板3次。将用3％封闭液l∶2000稀释的50％甘油中的50μl鸡抗AIV多克隆抗血清加入每个孔中，然后盖上板子并在37℃±2℃孵育板子1小时(+10分钟)。用PBS-T洗涤ELISA板3次，将用3％封闭液1∶3000稀释的50％甘油中的50μl山羊抗鸡IgG加入每个孔中。盖上板子并在37℃±2℃孵育板子1小时(+10分钟)。用PBS-T洗涤ELISA板3次，将50μl ABTS过氧化物酶底物溶液(室温平衡至少30分钟)加入每个孔中。盖上板子并在室温孵育板子15-20分钟。在波长405nm处(使用492nm参照滤光片)读孔中的光密度(OD)。HA参照抗原的起始稀释度应该为0.7-1.0OD，这用作ELISA的阳性对照。

                          实施例7：血清ELISA

NDV-HN

板子用稀释(1∶2000)于0.01M硼酸缓冲液中的兔抗NDV合并抗血清(1∶2混合50％甘油水溶液)包被(100μl/孔)。板子在2-7℃孵育过夜，盖上板子，然后在室温平衡约20-30分钟。使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T(1×PBS+0.05％Tween-20)按300μl/孔洗涤板子三次。用PBS-T稀释的5％脱脂奶(封闭液)封闭板子(200μl/孔)，并在37℃孵育2小时。使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T按300μl/孔洗涤板子一次。NDV尿囊液1∶200稀释于封闭液中。将100μl/孔稀释抗原加入板子中，并在37℃孵育板子1小时。使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T按300μl/孔洗涤板子三次。稀释待测鸡血清样品(1∶50)。稀释阴性对照血清(1∶50)(阴性对照27NOV00)。稀释阳性对照血清(1∶10,000或1∶20,000)(SPAFAS鸡抗NDV血清)。所有血清样品用封闭液稀释。将100μl/孔阴性对照血清加入第1列第B-G行；200μl/孔阳性对照血清加入第2-3列第A行；200μl/孔待测血清样品加入第A行适当列中。这使得每个板上有4个样品，每个样品有8个稀释度。将100μl/孔封闭液加入所有剩余的孔中。阳性对照血清和待测血清样品沿板子两倍系列稀释。沿板子从A行到H行稀释样品，丢弃剩余的100μl/孔。在37℃孵育板子1小时，然后使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T按300μl/孔洗涤板子三次。山羊抗鸡IgG(H&L)-HRP稀释于(1∶3000)封闭液中。向每块板中加入100μl/孔稀释的偶联物。偶联物加入后立即在室温暗处平衡ABTS底物。在37℃孵育板子1小时，然后使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T按300μl/孔洗涤板子三次。向每块板中加入100μl/孔预温的ABTS底物，板与板之间等待2-3分钟。当阳性对照的第一稀释度的吸光度为0.7-1.0时，在Tecan Sunrise酶标仪或等价物上按双波长405/490nm读板。

AIV-HA

板子用稀释(1∶1000)于0.01M硼酸缓冲液的兔抗HA合并抗血清(1∶2混合50％甘油水溶液)包被(100μl/孔)，并在2-7℃孵育过夜，盖上板子。在室温平衡板子约20-30分钟，然后使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T(1×PBS+0.05％Tween-20)按300μl/孔洗涤板子三次。用PBS-T稀释的5％脱脂奶(封闭液)(200μl/孔)封闭板子并在37℃孵育1小时。使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T按300μl/孔洗涤板子一次。灭活的T/W/68AIV尿囊液1∶100稀释于封闭液中并将100μl/孔稀释抗原加入板子中，在37℃孵育板子1小时。使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T按300μl/孔洗涤板子三次。稀释待测鸡血清样品(1∶50)。稀释阴性对照血清(1∶50)。稀释阳性对照血清(1∶25600)(USDA/SEPRL鸡抗AIV(T/W/68)抗血清)。所有血清样品用封闭液稀释。将100μl/孔阴性对照血清加入第1列第B-G行；200μl/孔阳性对照血清加入第2-3列第A行；200μl/孔待测血清样品加入第A行适当列中。将100μl/孔封闭液加入所有剩余的孔中。这使得每个板上有4个样品，每个样品有8个稀释度。阳性对照血清和待测血清样品沿板子两倍系列稀释，丢弃剩余的100μl/孔。在37℃孵育板子1小时，然后使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T按300μl/孔洗涤板子三次。山羊抗鸡IgG(H&L)-HRP稀释于(1∶3000)封闭液中。向每块板中加入100μl/孔稀释的偶联物。偶联物加入后立即在室温暗处平衡ABTS底物。在37℃孵育板子1小时，然后使用Titertek M96洗板机或等价物用PBS-T按300μl/孔洗涤板子三次。向每块板中加入100μl/孔预温的ABTS底物，板与板之间等待2-3分钟。当阳性对照的第一稀释度的吸光度为0.7-1.0时，在Tecan Sunrise酶标仪或等价物上按双波长405/490nm读板。

                      实施例8：兔中的抗原性

为测试上述无去污剂提取的植物来源的蛋白质是否在目标动物物种中产生抗体，同时制备HA和HN蛋白并接种到兔子中。根据表3提供的剂量方案用HA-AIV或HN-NDV接种3月龄新西兰白兔。对于初次接种，将抗原与完全弗氏佐剂(CFA)混合，所有加强接种使用不完全弗氏佐剂。由两种蛋白诱导的抗体效价提供在表4中。结果表明经两次接种后两种蛋白都诱导出HAI抗体效价。然而，接种AIV-HA的兔子效价高于由NDV-HN蛋白诱导的效价。这是明显的，因为与NDV-HN相比，AIV/HA蛋白有更低的整体生物活性(凝血)/单位AIV-HA蛋白(表3第4列)。这表明，考虑到两种蛋白的定量方法都是准确的，与NDV-HN蛋白相比，单位蛋白质中来自植物的AIV-HA蛋白更强。也提示以此方式配制的AIV-HA蛋白在鸡中是有免疫原性的。

                                表3

                         接种到兔子中的剂量水平

样品	凝血终点滴度	ELISA结果(ug蛋白/ml)	BCATSP1结果(mg/ml)	凝血单位/mg蛋白
					NT对照	≤2	0.00	1.44	0
CHN-7	2048	13.53	2.48	3027
					CHN-18	1024	9.21	4.10	2223
CHA-13	32	3.80	6.15	168
					CHA-47	16	2.88	5.25	111

¹所有NT-1样品由非冻干材料提供，BCA-二金鸡纳酸，Pierce Chemical BCA蛋白质测试盒中的主要成分；TSP-总可溶性蛋白。

                                            表4

                      来自NT-1来源的AIV-HA和NDV-HN接种的兔子中的血清学结果

用NDV-HN处理	样品编号	NDV HAI效价				NDV ELISA效价
												取血前	6周	8周	10周	取血前	6周	8周		10周
		NT对照细胞的上清HN-18细胞的上清HN-18细胞的上清HN-7细胞的上清HN-7细胞的上清	27232724272527262727	≤8≤8≤8≤8≤8	≤823114545	≤823232345	≤823232345	00000	081506071396	05545854612008												088859101270
用AIV-HA处理	样品编号											AIV HAI效价				AIV ELISA效价
		取血前	6周	8周	10周	取血前	6周		8周		10周
												NT对照细胞的上清HA-13细胞的上清HA-13细胞的上清HA-47细胞的上清HA-47细胞的上清	27232728272927302731	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8362181181≤8	≤8362181362362	≤836211724362	＜25＜5＜25＜25＜25	＜252560032001280050		＜252560032002560012800		＜2525600＜2525002500

为验证植物来源抗原对鸡的功效，接种HN蛋白到2日龄和10日龄的鸡中。这些研究中使用的剂量浓度提供在表5中。所有疫苗接种物用在摇床烧瓶中25℃生长15-20天的NT-1细胞的可溶性组分配制。用于两组试验的佐剂是Corixa，Inc.提供的MPL-TDM。鼻内组单独给予作为佐剂的MPL。

                       实施例9：家禽中的激发

用来自NT-1的生物活性(凝血阳性)NDV-HN蛋白通过多种途径接种2日龄SPF鸡，每次接种的HN蛋白量示于表5。本试验的血清学和激发结果提供在表6中。所有对照组的应答结果与预期一致，即未接受NDV-HN抗原接种的鸟100％死亡率，而通过SQ接受20μg天然NDV的对照鸟有100％生存率。在实验处理组中，第3组(SQ接种没有佐剂)有75％保护作用，第4组(SQ接种有佐剂)有80％保护作用。剩余的治疗组通过IN和口服接种，有100死亡率。然而，第6组中两只鸟死亡延迟，表示这些鸟可能已经对疫苗接种敏化(见表9)。

                              表5

                   家禽试验每次接种使用的剂量水平

组	mg HN/鸟
				0天	14天	21天
	NT对照(SQ)NDV尿囊液(SQ)HN烟草(SQ)HN烟草(IN)HN烟草(OG+OF)平均凝血单位/mg HN	0201506114114og+700of*3590	02023014282282og/1400of*5810				02018014136136+2366*6025

^*剂量：基于湿重表达/与饲料混合的细胞量；IN-鼻内；SQ-皮下；OG-口腔管饲；OF-混饲                                                               表6

                                                    家禽试验中的血清学和激发结果

		NDV HAI效价					NDV ELISA效价
											处理	样品数目	14天	21天	28天	激发前	激发后	28天	激发前	激发后	幸存激发
1.对照尿囊液	9241061107310771081	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	nanananana	00000	00000	00000	否否否否否
											2.NDV HN尿囊液SQ	10631068107210831089	1111452345	1448144814487241024	2896102414487241448	724724724181362	72436236291181	11956921611592569715181	92457639750049197449	72946122593730116085	是是是是是
3.NDV HN烟草SQ	797106610851059	23≤8≤8≤8	4516≤823	45452345	≤8≤8≤8≤8	2896724na724	04500436	0000	1903615087na10043	是是否是
											4.NDV HN烟草MPL/TDM佐剂SQ	1067108010931094109	11≤81111≤8	45181459123	45181459145	≤845≤811≤8	181181≤811na	592191107470	087101990	4912504800na	是是是是否
5.NDV HN烟草IN	796925106510841092	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	nanananana	00000	00000	nanananana	否否否否否
											6.NDV HN烟草+MPL佐剂IN	921923106910741088	≤8≤8≤8≤8≤8	≤811≤81111	≤8≤8≤8≤88	≤8≤8≤8≤8≤8	nanananana	00000	00000	nanananana	否否否否否
7.NDV HN烟草口腔管饲	7231062107510791086	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤888≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	nanananana	00000	00000	nanananana	否否否否否
											8.NDV HN烟草+MPL/TDM佐剂口腔管饲+混饲	10701082109110971100	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	nanananana	00000	00000	nanananana	否否否否否

所有鸟接受10² EID₅₀的NDV Texas GB株。最后接种后24天激发鸟。黑体表示的鸟数目死亡发生时间延迟，见表9。

在随后的试验中，根据表7描述的方案和剂量接种18只10日龄SPF鸟。这次试验的结果示于图8。一个对照组(第3组)，未接种未激发处理用来表示鸟舍和设施对鸡的一般健***利影响。这次试验的所有对照组的应答结果与预期一致。因为两次试验的鸟都在同一设施中接受激发，2号处理组用作两次禽试验的阳性对照。

剩余的组中，所有都SQ接种来源于NT-1细胞的HN，第7组有100％生存率，第5和6组的每组有80％生存率，第4组有60％生存率(见图8)。

                    表7

         每次接种使用抗原的剂量水平

组	ug HN/鸟(皮下)
				0天	14天	21天
	NT对照NDV尿囊液HN烟草(低剂量)HN烟草(高剂量)平均凝血单位/ug HN	020201503590	020201002625				020201002625

结论：使用可提供获得HA和HN蛋白凝血活性的程序，通过皮下(SQ)途径将这些植物来源蛋白的制剂接种到两个独立的动物物种，从而确定是否可诱导能抑制凝血的抗体(HAI抗体)。在一个试验中，HN蛋白配制成具有高凝血活性/总可溶性蛋白比率。然后通过SQ、鼻内(IN)和通过口服途径接种这些物质。结果表明，以这种方式配制时，来源于NT-1细胞的HA-AIV和HN-NDV都能在兔子中诱导凝血抑制(HAI)抗体。此外，通过SQ途径向鸡接种NT-1来源的HN-NDV可诱导(HAI)抗体，并抵抗有毒力NDV的激发。

这些试验的结果显示，NT-1来源的HN-NDV当以SQ途径接种给鸟时具有免疫原性。大多数情况下，抵抗激发的鸟在激发后具有可检测的HAI效价，然而这种观察有例外。两只鸟(分别是1093号和1047号)在激发后没有可检测的HAI或ELISA效价，但激发后存活(表6和8)。

                                                                    表8

                                                             血清学和激发结果

		NDV HAI效价				NDV ELISA效价
											处理	样品数目	21天	28天	激发前	激发后	21天	28天	激发前	激发后	激发幸存
1.对照尿囊液	10261027102810291030	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	nanananana	00000	00000	00000	nanananana	否否否否否
											2.NDV HN尿囊液20ug/剂量	10311032103310341035	362362724362724	91724362181724	181181181181181	9191181181181	917712393862278759681	693716533152911007116133	55337909676664877537	35516080636258226539	是是是是是
3.对照烟草	10361037103810391040	≤8≤8≤8≤8≤8	23 11≤8≤823	≤8≤8≤8≤8≤8	≤8≤8≤8≤8≤8	00000	00000	00000	00000	n/cn/cn/cn/cn/c
											4.NDV HN烟草20ug/剂量	10411042104310441045	11 2332≤823	＜811111111	≤8≤8≤8≤8≤8	14482896nana1024	00000	00000	00000	1404219263nana11770	是是否否是
5.NDV HN烟草20ug/剂量+MPL/TDM乳液佐剂	10461047104810491050	2323234511	2323232311	≤8≤8≤8≤8≤8	1448≤8na3621448	0039600	674963757804398	00000	112430na623915948	是是否是是
											6.NDV HN烟草250ug/剂量	10511052105310541055	9145232345	4545232345	23≤8≤8≤823	1811812896na91	109611660646705	11379980838563	565000448	4547737616712na4902	是是是否是
7.NDV HN烟草250ug/剂量+MPL/TDM乳液佐剂	10561057105810591060	4545459145	4523236445	1111232311	2372472491181	74655678020004916	948892158830901522	17406301016448	92611542991546906620	是是是是是

除了第1组接受10⁴ EID₅₀的NDV Texas GB株、第3组是为激发对照外，所有鸟接受10² EID50的NDV Texas GB株。最后接种后31天激发鸟。黑体表示的鸟数目死亡发生时间延迟，见表9。n/c-未激发。

通常，激发后高效价应答是良好敏化免疫接种的指征，然而，对于天然或重组来源的NDV抗原，没有可检测的HAI或ELISA抗体效价而受保护的鸟并非没有先例(Winterfield，R.W.，Dhillon，A.S.，and L.J.Alby，1979.Vaccination of Chickensagainst Newcastle Disease with Live and Inactivated Newcastle Disease Virus.Poultry.Sci.59：240-246)。由此假设在检测不到体液抗体应答时，细胞免疫应答或局部免疫应答参与提供疫苗接种的鸟中的免疫保护(Agrawal，P.K.and D.L.Reynolds.1991.Evaluation of the cell mediated immune response of chickens vaccinated with Newcastledisease virus as determined by the under-agarose leukocyte-migration inhibition technique.Avian Dis.35：360-364)。

有时尽管在疫苗接种方案结束的第28天可以检测到效价，但对激发却没有保护作用。然而发生这种情况何时，在激发前(激发当日)或后均没有可检测的抗体效价，表明这些鸟没有被有效敏化(比较表4和6)。观察到的两组家禽试验之间的差异可以归因于这种事实：用于第一次试验的抗原具有高得多的生物活性/μg HN。与后一个试验相比，用于这次试验的抗原有至少2倍以上的凝血活性水平/μg蛋白(比较表5和7)。这可能是第28天用无佐剂抗原处理的鸟(第3组，表6)产生可检测的ELISA和HAI效价、而第28天用无佐剂抗原处理的鸟(第4组，表8)没显示出ELISA效价的一个原因。导致该结果的另一个差别是鸟的年龄。第一次试验中的鸟在2日龄接种疫苗，而第二次试验中的鸟在10日龄接种疫苗。

                                                                    表9

                                                               激发后死亡天数

组编号	处理	途径	激发	D1	D2	D3	D4	D5	D6	D7	D8	D9	D10	D11-14	幸存率％
																1-018	对照尿囊液	SQ	104EID50	0	0	3	2	-	-	-	-	-	-	-	0
2-018	NDV HN尿囊液-20ug/剂量	SQ	102EID50	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100
																3-018	对照烟草	SQ	None	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100
4-018	NDV HN烟草来源-20ug/剂量	SQ	102EID50	0	0	0	0	1	0	0	0	1	-	-	60
																5-018	NDV HN烟草来源-20ug/剂量+MPL/TDM乳液佐剂	SQ	102EID50	0	0	0	0	0	1	0	0	0	0	0	80
6-018	NDV HN烟草来源-250ug/剂量	SQ	102EID50	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	0	80
																7-018	NDV HN烟草来源-250ug/剂量+MPL/TDM乳液佐剂	SQ	102EID50	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100
1-016	对照烟草	SQ	102EID50	0	0	0	4	1	-	-	-	-	-	-	0
																2-016	NDV HN尿囊液	SQ	102EID50	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	100
3-016	NDV HN烟草来源	SQ	102EID50	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	80
																4-016	NDV HN烟草来源+MPL//TDM乳液佐剂	SQ	102EID50	0	0	0	0	0	0	1	0	0	0	0	80
5-016	NDV HN烟草来源	IN	102EID50	0	0	0	2	3	-	-	-	-	-	-	0
																6-016	NDV HN烟草来源+MPL乳液佐剂	IN	102EID50	0	0	0	3	0	0	0	2	-	-	-	0
7-016	NDV HN烟草来源	口腔管饲	102EID50	0	0	0	3	2	-	-	-	-	-	-	0
																8-016	NDV HN烟草来源+MPL/TDM乳液佐剂	口服	102EID50	0	0	0	2	3	-	-	-	-	-	-	0

这些试验中，佐剂在抗原的配制中似乎也是一个重要特性。尽管在使用较高剂量NT-1来源的NDV-HN时佐剂的作用不明显(比较表6第3和4组与表8第6和7组)，当使用低剂量NDV-HN时具有明显的佐剂作用(比较表8第4和5组)。另外，尽管通过鼻内途径接种的组有100％死亡率，接受佐剂的组有两只鸟(923号和1088号)直到第8天仍未死，而所有阴性对照鸟3天后都死于激发(表9)。然而，接受佐剂化抗原的鼻内组的死亡延迟显著性不太显著，有趣的是923号和1088号鸟是两只在试验第21天具有可检测的HAI抗体效价的鸟，并且用比其它处理组更少的抗原/剂量处理(见表5)。

从此处提供的数据清楚可见，来源于转化的NT-1细胞的HN-NDV可以有效抵抗有毒力的NDV激发。对所述植物来源的抗原的免疫应答与对天然抗原的免疫应答相比有几点相似性。1)尽管激发前对天然抗原的抗体效价更高，20ug SQ接种剂量对天然和植物来源抗原的激发都提供保护性。2)抗体效价必须有相似应答时间，即在两个研究中，激发在接种疫苗后24天和31天进行。3)在疫苗接种方案结束时及激发后产生阳性HAI抗体应答(相对于背景)的所有鸟都抵抗NDV相关病原体。

通过口服或经鼻内接种时没有鸟免受激发。在口服给予鸟的情况下，接种100-300μg来源于NT-1细胞的HN-NDV可溶性蛋白，并伴随每次接种喂饲作为整个湿细胞的700-2400μg HN-NDV，在三个剂量后不诱发可检测的抗体效价，鸟也不能避免受激发。因为来自NT-1的HN-NDV有明确的结合血红细胞和鸡胚成纤维细胞(CEF)的能力，在此研究中结合天然受体的能力不增强与鸟粘膜表面上抗原采样位点的结合或递送。

此处提供的数据显示，当SQ施用时，来自转基因NT-1细胞培养物的HN-NDV抗原可以保护免受有毒力病毒的激发。进而还观察到，尽管在口服组喂饲几毫克抗原，在***性结构中不诱导HAI抗体且不能保护免受激发。因而，正如以前的数据所显示，对于粘膜表面的抗原提呈位点没有天然亲合性或侵入能力的抗原需要在可敏化粘膜表面的蛋白辅助下被靶向到这些位点。

              实施例10：转基因马铃薯的制备和分析

使用二元载体pCHN、pgHN、pMHN和pCHA转化马铃薯(cv.Desiree)，分析转基因块茎中来自NDV的重组HN抗原或来自禽流感病毒的重组HA抗原的表达。

植物材料.马铃薯Desiree品系(Solanum tuberrosum cv Desiree)的体外植株由康奈尔大学植物病理学系司帝文·斯莱克博士(Dr.Steven Slack，Department of PlantPathology，Cornell University)提供。为了扩增，将结节段(nodal segment)转移到被称作CM的芽繁殖培养基，其中包含MS盐(Murashige and Skoog，1962)、100mg/l肌醇、0.4mg/l硫胺素、20g/l蔗糖和8g/l Agar/Agar(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO.；catalog#A-1296)。加入Agar/Agar之前调节培养基pH到pH5.7。每个试管中放置一个结节外植体并在24±1℃、光周期16h(亮)/8h(暗)和74μE m^-2s^-1条件下培养。这些培养物和本报告中描述的那些使用的光源是冷暖荧光灯泡(F40CW和F40WW)(Philips Lighting Co.，www.lighting.philips.com/index.htm)的混合。每6周收获结节外植体并转移到新鲜培养基。

农杆菌制备.从-80℃保存的甘油保存物中划线培养含感兴趣基因构建体的根癌农杆菌于LB培养基的Petri平板上，其中LB培养基含10g/l bacto胰蛋白胨、5g/l酵母提取物、10g/l NaCl、50mg/l壮观霉素和15g/l Difco Bacto琼脂(Difco Laboratories，Detroit，Mich.；catalog#DF 0140-01)。用无菌吸头挑取四个形态良好的菌落，然后加入到50ml含50mg/l壮观霉素的YM培养基(Gibco BRL cat.#10090-011)中。培养物于28℃摇床100rpm生长24小时，或直至培养物OD₆₀₀达到0.5-0.7。约需24小时达到此OD。达到预期OD时，20℃下8000rpm离心细胞10分钟。沉淀重悬于MS液体培养基(MS盐、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l吡哆醇、0.4mg/l硫胺素、0.25mg/l叶酸、0.05mg/l d-生物素、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖、pH 5.6)，培养基体积与YM选择培养基原始体积相同。

感染.从六周龄体外植株上截取长0.5-1cm的结节间茎并在当日接种。每50ml接种物中培养约100个结节间外植体10分钟，并间或振荡。培养后将它们印迹到无菌滤纸上、然后转移到被称为CIM的培养基中，其中含MS盐、2mg/l甘氨酸、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l吡哆醇、0.4mg/l硫胺素、0.25mg/l叶酸、0.05mg/l D-生物素、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖(grade II；PhytoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，Kans.)、1mg/l苄基腺嘌呤(BA)、2mg/l萘乙酸(NAA)(高压灭菌后加入)和6g/l Agar/Agar(PhytoTechnology Laboratories，Shawnee Mission，KS.)。加入Agar/Agar之前调节pH到5.6。每100×20mm Petri平板培养100株外植体。所有培养物在24±1℃、光周期16h(亮)/8h(暗)和74μE m^-2s^-1条件下培养。

植株再生.共培养48小时后，将外植体转移到3C5ZR bialaphos选择培养基上，其中含MS盐、0.1mg/l硫胺素、0.5mg/l烟酸、0.5mg/l吡哆醇、100mg/l肌醇、30g/l蔗糖、0.5mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)(高压灭菌后加入)、3mg/l玉米素核苷(高压灭菌后加入)、500mg/l羧苄青霉素(高压灭菌后加入)(Agri-Bio，Miami，FL.)、5mg/lbialaphos(高压灭菌后加入)(Duchefa，http：//www.duchefa.com/)和8g/l Agar/Agar。加入Agar/Agar之前调节pH到5.9。每100×20mm Petri平板培养25株结节间外植体，平板用Nesco膜(Karlan Research Products，Santa Rosa，CA)密封。连续一个月每周转移外植体，然后每10-14天。所有培养物在24±1℃、光周期16h(亮)/8h(暗)和74μE m^-2s^-1条件下培养。

当再生体约0.5-1.0cm长时，切下并转移到bialaphos选择性生根培养基，其中含与CM相同的成分，同时另外添加500mg/l羧苄青霉素(高压灭菌后加入)和5mg/lbialaphos(高压灭菌后加入)。每GA7 Magenta箱培养5株再生体。一旦芽生根，立即转移每个植株的芽尖到CM试管进行培养。

微块茎.在植物材料上诱导微块茎作为块茎表达的早期指标。这特别可用于含由块茎特异性启动子GBSS调控的基因的转基因株系。将结节短放置在微块茎培养基上，其中含1/2强度的MS盐、5mg/l激动素、80g/l蔗糖、0.25mM嘧啶醇(高压灭菌后加入)、9g/l Agar/Agar。加入Agar/Agar之前调节培养基pH到5.85。培养物在暗处18℃培养。通过ELISA分析微块茎的抗原表达水平。

PCR分析.从3-4周龄假想转化体叶分离基因组DNA。在500μl提取缓冲液中室温匀浆叶样品，其中缓冲液中含200mM Tris HCl(pH 7.5)、250mM NaCl、25mMEDTA和0.5％ SDS。在室温保持1小时，然后12,000rpm离心5分钟。转移上清到新管中，加入500μl异丙醇，然后将样品保持在室温5-10分钟，或放置于-20℃过夜。接着在13,000rpm离心5分钟，并丢弃上清。所得沉淀用70％乙醇洗涤、干燥，然后重悬于100μl TE缓冲液。

设计引物组合使正向引物在CVMV启动子中而反向引物(PATR2)在PAT基因中，由此导致约500bp的产物大小。在1％琼脂糖凝胶上跑扩增的DNA片段，溴化乙锭染色并在UV光下显示。

叶的ELISA分析.收获叶材料到管中然后放置于冰上。选择具有最高抗原水平的株系进行繁殖，然后转移到温室。

温室适应.具有良好形态根***的植株转移到Jiffy 7盆(pot)中。将盆放置于托盘中并用盖上塑料顶。约2周后，移除顶罩。当根系已经生长出Jiffy 7盆上的网时，转移植株到含Cornell土壤混合物的3加仑盆中。

pCHN转化的马铃薯植株中HN表达.用pCHN转化马铃薯(Solanum tuberosumL.cv.Desiree)植株，并用ELISA筛选再生的Bialaphos^_抗性植株的叶中HN表达。基于叶表达选择几个株系(图26)、繁殖并转植于土壤中进行温室培育。成熟时收获并提取块茎，用ELISA测试HN含量(图26)。在同一株系的不同块茎之间HN积累有变化，但一般表达与每个株系内的叶中HN含量相关(图26)。在株系6、21、27和34的块茎中观察到最佳表达，观察到的最高积累达～11μg HN/g新鲜块茎量。

马铃薯块茎表达的HN抗原的颗粒行为.为了评价NT1细胞表达的抗原组装形成颗粒结构的情况，对pCHN转化的马铃薯块茎提取物进行蔗糖梯度沉降。示于图27的谱型显示块茎来源的HN表现出两个ELISA活性物质的峰，这与图24中NT-1细胞来源的HN相似。

pGHN和pGHN151转化的马铃薯植株中HN表达.用pGHN或pGHN151转化马铃薯(Solanum tuberosum L.cv.Desiree)植株，并用ELISA筛选再生的Bialaphos^_抗性植株的微块茎中HN表达。基于微块茎表达选择几个pGHN转化的株系(图28)、繁殖并转植于土壤中进行温室培育。pGHN151转化相对不足，导致只有一个株系表现出在微块茎中有表达(GHN1516)，将它转植于土壤中进行温室培育。成熟时收获并提取块茎，用ELISA测试HN含量(图28)。在同一株系的不同块茎之间HN积累有变化，但一般表达与每个株系内的微块茎中HN含量相关(图29)。在株系GHN-1、30、47和54的块茎中观察到最佳表达，观察到的最高积累达～40μg HN/g新鲜块茎量。株系GHN151-6中的块茎表达在6和12μg HN/g新鲜块茎量之间变化。可能是含内含子的GBSS启动子构建体pGHN151在转基因植株或农杆菌中不稳定，导致该构建体的表达不好。

块茎的ELISA分析.植株转移到土壤中后约3-4个月，分类收获组织供分析。图16表示pCHA转化的微块茎中HA表达，其最高为700ng/g鲜重。这与pGPTV-HAO转化的块茎(HA基因由CaMV 35S启动子驱动)中观察到最大值为1μg/g鲜重的积累相似。选择的株系转植于土壤中并于温室中生长。取样土壤生长植株的叶并用ELISA测试(图17)。叶中HA表达非常低(＜0.025ng/μg TSP)，这与组织培养植株的叶的更早期测试相一致。收获、提取成熟植株的块茎，并用ELISA评价HA表达。块茎中HA积累最大为500ng/g鲜重(图18)。体外生长的微块茎中观察到的表达与土壤生长的块茎中表达一致性很好(图16和18)，因而微块茎是pCHA表达HA的良好模型。

              实施例11：转基因番茄的制备和分析

使用二元载体pCHN、pMHN和pUHN转化番茄(TA234变种)，分析转基因果实和叶中来自新城疫病毒的重组HN蛋白的表达。

植物材料.使用称作TA234的番茄株系的种子进行转化。TA234原称为Monor，是来自Moneymaker变种的黄萎病和烟草花叶病毒抗性的株系。种子在20％ Clorox中表面消毒20分钟，用无菌蒸馏水漂洗3次，然后培养于Magenta箱中的1/2 MSO培养基(见下文)上。它们在24±1℃、光周期16h(亮)/8h(暗)和74μE m^-2s^-1条件下培养。这些培养物和本报告中描述的那些使用的光源是冷暖荧光灯泡(F40CW和F40WW)(Philips Lighting Co.，www.lighting.philips.com/index.htm)的混合。种子培养物培养6-8天，取决于子叶生长阶段。在第一片真叶出现之前切除子叶。如果子叶切面超过1cm长则切成0.5cm段。子叶切块放置于转化前一天准备的饲养层平板上。饲养层由铺于KCMS培养基(见下文)的NT1悬浮培养细胞组成，这些细胞在铺板之前7天已经亚培养(2ml细胞∶48ml液体KCMS)。铺板的悬浮培养物用无菌7cm Whatman滤纸覆盖。子叶切块放置于该滤纸上面。

农杆菌制备.从-80℃保存的甘油保存物中划线培养含感兴趣基因构建体的根癌农杆菌于LB培养基(见附录)的Petri平板上。对于DAS构建体，将50mg/l壮观霉素加入LB培养基中。培养物于28℃培养24-48小时。培养时间依赖于菌落大小。如果24小时后出现针点大小菌落，培养物再继续培养一天。

当菌落是良好形态的大小时，制备液体培养物。用无菌吸头挑取四个菌落，然后对于DNA构建体加入50ml含50mg/l壮观霉素的YM培养基中(见下文)。培养物于28℃摇床100rpm生长24小时，或直至培养物OD₆₀₀达到0.5-0.6。约需24小时达到此OD。达到预期OD时，20℃下8000rpm离心细胞10分钟。沉淀重悬于MS液体培养基，培养基体积与YM选择培养基原始体积相同。

感染.用农杆菌感染之前一天将子叶外植体培养于饲养层平板上。为了感染，将它们在农杆菌悬浮物中孵育10分钟，然后去除悬浮物。将外植体印迹到无菌纸垫上，然后近轴面向下放置于原始饲养平板培养物上。继续在19℃暗处共培养48小时。

植株再生.共培养后，近轴面向上在含3mg/l bialaphos的选择性2Z培养基上培养子叶外植体。在24±2℃、16h光周期的冷白荧光条件下维持培养物。三周后，培养物转移到含3mg/l bialaphos的1Z培养基(见下文)上，然后每三周更换新鲜培养基。当芽体开始再生时，转移培养物到Magenta箱中的含bialaphos的相同1Z培养基中。芽体2cm高时，转移到Magenta箱中的含2mg/l bialaphos的选择性生根培养基(见下文)上。植株在24±1℃、16h光周期的冷白荧光条件下培养。约3周后，这些植株的切块再次转移到含bialaphos但不包括timentin的选择性生根培养基上，以确定是否存在农杆菌污染。

分析.选择在选择性生根培养基上生根的植株供ELISA分析。收获叶材料，转移到2ml锥形螺帽管并放于冰上。选择含最高抗原水平的株系前至少进行两次ELISA。繁殖优秀株系并转移到温室。

温室适应.将具有良好形态根***的植株转移到温室中。转移到含Cornell混合物的6-英寸盆之前洗去根部的琼脂培养基。盖上塑料顶罩。接下来的一周中，逐渐提高顶罩以使植株适应。约5周后，转移植株到含Cornell混合物的3加仑盆中。

               培养基成分

                 1/2MSO

                              /升

MS盐	2.15g
		肌醇	100mg
盐酸硫胺素贮液(0.4mg/ml)	5ml
		盐酸吡哆醇贮液(0.5mg/ml)	1ml
烟酸贮液(0.5mg/ml)	1ml
		蔗糖	10g
调pH到5.8±0.03
		Agar/Agar	8g

            KCMS

                            /升

MS盐	4.3g
		盐酸硫胺素贮液(1mg/ml)	1.3ml
肌醇	100mg
		2，4-D贮液(1mg/ml)	200μl
KH2PO4	200mg
		激动素贮液(1mg/ml)	100μl
蔗糖	30g
		调pH到5.5±0.03
琼脂胶	5.2g

        LB培养基

                      /升

Bacto-胰蛋白胨	10g
		酵母提取物	5g
NaCl	10g
		Difco Bacto Agar	15g

      YM培养基

                /升

酵母提取物	400mg
		甘露醇	10g
NaCl	100mg
		MgSO4·7H2O	200mg
KH2PO4	500mg

作为替代方案，可以购买粉状YM(Gibco BRL；catalog #10090-011)。加11.1g到1升水中制备液体培养基。

   MS液体培养基

              /升

MS盐	4.3g
		肌醇	100mg
甘氨酸	2mg
		烟酸	0.5mg
盐酸吡哆醇	0.5mg
		盐酸硫胺素	0.4mg
叶酸	0.25mg
		D-生物素	0.05mg
蔗糖	30g
		pH5.6

               2Z

                            /升

MS盐	4.3g
		肌醇	100mg
Nitsch维生素贮液(1000×)	1ml
		蔗糖	20g
调pH到6.0±0.3
		琼脂胶	5.2g

      选择性生根培养基

                            /升

MS盐	4.3g
		Nitsch维生素贮液(1000×)	1ml
蔗糖	30g
		调pH到6.0+0.03
Difco Bacto琼脂	8g

高压灭菌后每升加入以下过滤除菌的成分：

Bialaphos：2ml 1mg/ml贮液

Timentin：3ml 100mg/ml贮液

Nitsch维生素贮液(1000×)

              /50ml

甘氨酸	0.1g
		烟酸	0.5g
盐酸吡哆醇	0.025g
		盐酸硫胺素	0.025g
叶酸	0.025g
		d-生物素	0.002g

调节pH到7.0得到清澈溶液。

             实施例12：番茄用作可食用疫苗生产***

合成HN基因的组装.组装包括木薯脉花叶病毒(CsVMV)启动子并以大豆植物贮藏蛋白(VSP)的3’元件终止的HN表达盒，并***由Mason实验室(The BoyceThompson Institute for Plant Research(BTI))提供的二元载体，用于农杆菌介导的植物转化。该载体携带编码植物选择标记草铵膦乙酰转移酶(PAT，描述于美国专利No.5,879,903；5,637,489；5,276,268和5,273,894)的基因(图30)。

番茄转化和再生.由Van Eck实验室(BTI)根据Frary和Earle[12]进行对番茄子叶的农杆菌介导的转化。每3周转移再生外植体到新鲜培养基。当绿色芽高约1cm时，将它们转移到含生根培养基(MS盐4.3g、1ml/l Nitsch维生素1000×、30g/l蔗糖、8g/l difco bacto琼脂、pH6.0，补充50mg/l卡那霉素、300mg/l timentin和4mg/lIBA)的GA-7箱(Magenta Corporation，Chicago，Ill.)中。生根的小植株转移到土壤中并在28℃、12小时光周期的条件下培养。

蛋白质提取和ELISA分析.通过在QBiogene(Carlsbad，Calif.，USA)Fast Prep机器中匀浆1mg新鲜叶、果实或NT1细胞材料/5μl PBS或1mg干叶、果实或NT1细胞材料/10μl PBS制备蛋白质粗提取物。通过在Eppendorf 5415C离心机中4℃、14,000rpm离心5分钟除去不溶性物质。所得样品上清在分析期间保存于冰上并随后保存于-80℃。

96孔微滴定板(Costar 3590，Fisher Scientific，Pa.，USA check)包被100μl/孔的1∶1000稀释于0.01M硼酸缓冲液中的SPAFAS鸡抗NDV多克隆抗体(BenchmarkBiolabs，NE)。盖上板子并4℃孵育过夜。室温平衡板子30分钟，然后用300μl/孔含0.05％ Tween 20的磷酸盐缓冲液(PBST)洗涤三次。使用200μl/孔含3％脱脂奶的PBST在37℃封闭板子2小时，然后用PBST洗三次，加入50μl/孔蛋白质提取物。对一系列用5％脱脂奶+PBS+0.05％Tween-20两倍稀释的粗提取物进行两次重复的ELISA分析。板子在37℃孵育1小时，然后PBST洗三次。将100μl一抗HN Mab 4A(Benchmark Biolabs)(1∶250稀释于1％脱脂奶的PBST中)加入每个孔中，并在37℃孵育1小时。然后用PBST洗板子三次，加入100μl/孔山羊抗小鼠IgG辣根过氧化物酶(HRP)偶联物(Sigma，St Louis，Mo.，USA)(1∶3000稀释于1％脱脂奶的PBST中)，并继续在37℃孵育1小时。然后用PBST洗板子四次，加入50μl/孔TMB过氧化物酶EIA底物试剂盒(BioRad)，并在室温孵育5分钟。在ThermoMax Micropla酶标仪上测量450nm处的吸光度。参考使用纯化HN(Benchmark Biolabs)绘制的标准曲线将由抗HN ELISA获得的ELISA数据转换成微克/克鲜重。

使用基于叶中HN表达最高的四个株系进行果实分析。

核酸提取.10ml提取缓冲液(4％对氨基水杨酸、1％1，5-萘二磺酸二钠盐水合物)、3ml CTAB缓冲液和10ml缓冲液饱和的苯酚(pH4.3)加入50ml Falcon管中并在70℃水浴加热10分钟。约3.5g独立的番茄果实在液氮中研碎然后加入加热的管中并剧烈振荡30秒。加入10ml氯仿∶异戊醇(24∶1)。所得浆状物剧烈振荡30秒，然后在4℃、10,000rpm离心20分钟。水相转移到50ml Falcon管，与2体积乙醇混合，并在室温沉淀15分钟。然后提取物在4℃、10,000rpm离心15分钟，并丢弃上清。所得核酸沉淀重悬于2ml DEPC处理的水中，与等体积4M LiCl混合，并在-20℃沉淀过夜。提取物在4℃、10,000rpm离心20分钟。取出含基因组DNA的上清到另一管中，用2倍体积的乙醇沉淀并保存于-20℃过夜。同时，RNA沉淀重悬于DEPC处理的水中并保存于-20℃。第二天，DNA沉淀在4℃、10,000rpm离心20分钟被离心下来，然后重悬于含1μg/ml Rnase A的水中。

Southern分析.用5单位限制酶EcoRI/μg DNA在37℃消化15微克番茄基因组DNA或330ng pCHN质粒DNA20-24小时。未切和消化后样品在1.0％TAE琼脂糖凝胶中跑过夜。通过一次20分钟脱嘌呤洗涤(0.25M HCl)、两次30分钟变性洗涤(1.5M NaCl，0.5M NaOH)和两次30分钟中和洗涤(0.5M TrisHCl，pH7，3M NaCl)而制备用于转移的凝胶。然后经毛细作用转移将DNA转移到尼龙膜(Zeta-Probe印迹膜，Bio-Rad，Hercules，Calif.，USA)，并使用Bio-Rad GS Gene Linker经紫外交联而固定。通过使用pCHN模板上的引物组HNa(CCG AGC AGT TTC ACA AGT GG，SEQID NO：10)和HNb(CCT GAT CTT GCT TCA CGT ACA，SEQ ID NO：11)制备PCR标记探针。根据制造商说明，使用Roche Molecular Biochemical DIG PCR ProbeSynthesis试剂盒将DIG标记的dCTP引入1734bp的扩增子。使用iCycler GradientThermo Cycler(BioRad，Hercules，Calif.，USA)经37个循环进行扩增。模板预先在94℃熔链5分钟，随后是35个循环的94℃30秒、56℃30秒和72℃90秒。最后延伸步骤在72℃进行5分钟，然后浸于4℃。在杂交炉中预温杂交瓶和10ml DiG Easy Hyb(Roche Scientific，Mannheim，Germany)/膜到45℃。在45℃预杂交膜60分钟，然后用探针浓度为5μl/ml的DiG Easy Hyb在45℃杂交过夜。

按照各自制造商的要求进行杂交后洗涤和检测(Roche--DIG洗涤和封闭缓冲液套装和DIG Luminescent Detection Kit)。对胶片曝光显示标记膜。

Northern分析.用甲醛/甲酰胺变性来自番茄转化体和野生型植株的30微克总RNA和1.25μg梯级标准(high range RNA ladder，MBI Fermentas，Hanover，Md.)并在1％琼脂糖3-(N-***啉)丙磺酸(MOPS)甲醛凝胶中在80V跑2小时。RNA通过向上毛细作用转移到Zeta Probe膜(BioRad，Hercules，Calif.，USA)上，并经紫外交联固定。用0.5M乙酸钠中的0.04％亚甲基蓝对膜进行染色，以确定RNA是否成功转移并确认所有样品中的RNA浓度相似。使用pCHN模板上的引物组HNa和HNb制备PCR标记的DNA探针。根据制造商说明(PCR DIG Probe Synthesis kit，RocheScientific，Mannheim，Germany)将DIG标记的dCTP引入1734bp的扩增子。如Southern分析中描述的方法进行扩增。在杂交炉中预温杂交瓶和10ml DiG Easy Hyb(Roche)/膜到45℃。在45℃预杂交膜至少90分钟，然后用探针浓度为7.5μl/ml的DiG Easy Hyb在45℃杂交过夜。按照制造商的要求进行杂交后洗涤和检测(Roche--DIG洗涤和封闭缓冲液套装和DIG Luminescent Detection Kit)。对胶片曝光显示标记膜。

Western分析.使用Benchmark Biolabs提供的纯化HN和pCHN转化的NT1细胞系119(BTI提供)作为阳性对照。将20μl蛋白质提取物加入4μl 6×SDS凝胶上样缓冲液(300mM Tris-HCl，pH 6.8，600mM DTT 12％SDS，0.6％溴酚蓝，60％甘油)中，煮沸10分钟并加到15％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中。在Tris-甘氨酸缓冲液(25mM Tris，250mM甘氨酸，pH 8.3，0.1％SDS)中以30毫安/胶跑胶，直至染料前沿距凝胶底部约5mm。使用BioRad Trans Blot Cell将分离开的蛋白从凝胶转移到PVDF膜上(50V 2小时或7V过夜)。除非另外说明，所有膜洗涤在PBST(PBS+0.1％Tween-20)中室温进行。在杂交孵育箱(Fisher Scientific，Tustin，Calif.，USA)中使用缓慢转动用5％脱脂奶+PBS+0.1％Tween-20在4℃封闭膜过夜或在室温封闭2小时。简单洗膜两次，然后用1∶50,000稀释于1％脱脂奶+PBS+0.1％Tween-20中的小鼠抗HN Mab14F抗血清(Benchmark Biolabs)在37℃孵育1小时。在PBST中简单漂洗膜，然后15分钟洗涤和3次5分钟洗涤，接着在1∶30,000稀释的抗兔IgG(Sigma)辣根过氧化物酶偶联物中缓慢旋转下37℃孵育1小时。漂洗膜，然后15分钟洗涤和3次5分钟洗涤。根据制造商说明使用Amersham ECL+试剂盒进行检测。

凝血活性.为制备1％鸡红细胞(cRBC)标准溶液，Alsevers溶液中的cRBC(Colorado Serum，Co)转移到15ml锥形管中并在250g离心10分钟。吸弃上清，沉淀重悬于10ml不含钙和镁的Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(DPBS)(Cellgro，Mediatech，Inc，Kansas City，MO.)。悬液在250g离心10分钟。重复洗涤和重悬直至上清清亮。一旦达此目标，则沉淀细胞并吸弃上清而留下压积的RBC沉淀。然后将沉淀稀释于1％DPBS(体积比体积)。400μl 1％ RBC溶液转移到小管中，加入1.6ml去离子水然后高速振荡20秒以裂解细胞。除非裂解后细胞的540nm吸光度是0.4-0.5，否则不要使用cRBC溶液。用抗静电喷剂喷96孔U形底的板子(Falcon)，然后加入50μl/孔DPBS。50微升的这些样品加入第一行，其中包括NDV HN阳性对照和DPBS阴性对照，经重复吹吸来混合，然后经转移50μl到下一行进行系列稀释。50μl标准化的cRBC加入每孔中，接着稀释液在摇板机上以600rpm孵育20-30秒。然后板子在5℃孵育1小时，检测对照NDV HN孔的凝血情况。一旦达此目标则进行最后读数。凝血阳性的最高稀释度的倒数作为HA效价。

分析.果实成熟是发育和遗传调节的过程，其特征是发生很多生化和生理变化，其中包括乙烯生物合成和呼吸的速率增加、叶绿素降解、色素积累、诸如果实软化的结构修饰、糖和有机酸水平的改变和挥发性芳香化合物的产生(Brady C J.Annu Rev.Plant Physiol.1987；38：155-178)。果实pH和固含量间有明显的关系(主要是糖，BentonJones J.Tomato plant culture：in the field，greenhouse，and home garden.New York：CRCPress，1999)。成熟度也是影响pH的因素。野生型TA234的成熟引起果实pH显著降低(α＝0.05)(图31)，同时总可溶性蛋白一般也降低(图32)。这也已在其它研究中发现，虽然降低程度不同(Benton Jones J.Tomato plant culture：in the field，greenhouse，and home garden.New York：CRC Press，1999)。

叶组织中表达最高水平HN的四个株系有不同的表型。株系CHN-1、CHN-12和CHN-32的表型与对照植株无法区分，而CHN-10株系表现出多倍体性状，如厚、皱叶和推迟花期和果实发育。Southern分析中比较质粒对照和基因组样品之间的信号强度，所述株系有1到4拷贝所述转基因(图33)，其中CHN-1有两拷贝，CHN-10有四拷贝，CHN-12有一拷贝，CHN-32有2拷贝。因为CHN-10可能是多倍体株系，它将不被用于进一步研究中或用于批量生产疫苗。

在预杂交和杂交步骤前，用亚甲基蓝染色Northern膜显示RNA从凝胶向膜的转移是成功的，而且每个样品中RNA浓度相似(图34a)。对HN基因特异性的总RNANorthern分析表明，在野生型阴性对照中没有条带，而在转基因番茄株系中可看到约5000个核苷酸的条带(图34b)。因为带启动子和终止子的HN基因表达盒是2,832bp，而内部组合有T-DNA的表达盒是4323bp，此转录本比预期更大，被认为是由于在转录HN基因时通读过VSP 3’终止信号。同一株系内部和不同株系之间在果实成熟的不同阶段转录本丰度有变化。当果实成熟后，CHN-10株系显示HN特异性mRNA含量明显降低(图34b)。然而因为只取样了一个果实供Northern分析，其它CHN番茄株系中RNA丰度和成熟阶段之间的模式无法深入观察。

转基因株系的抗HAELISA显示随果实成熟而浓度降低的趋势(图35)。与株系CHN-1(图35a)和CHN-10(图35b)的阶段1果实及CHN-32的阶段2果实(图35c)相比，阶段4和5有显著更少的HN/克鲜重(α＝0.05)。不同变种之间在不同阶段HN浓度没有显著差异(α＝0.05)。HN浓度在71.1和3.5μg/g鲜重之间变化，其中每个株系中最高的浓度如下：CHN-1的阶段1果实为67.2μg/g鲜重；CHN-10的阶段1果实为63.3μg/g鲜重；CHN-12的阶段1果实为65.4μg/g鲜重；CHN-32的阶段2果实为71.1μg/g鲜重。因此收获HN番茄作物的最佳阶段是在青果期或碎红(breaker)早期。

超量加样时Lasota NDV HN阳性对照的Western分析显示约49、74、78、90、120、200、250和大于250kDa的条带(图36)。78kDa带称为HN单体，较小带为降解产物。90kDa带被认为是不同的糖基化形式，而120kDa和更大的带是HN多聚体。因为HN表达低，Western分析不同阶段的转基因果实是困难的，然而两条带约78和70kDa是可见的。这些带也存在于转基因番茄植株的叶和NT1细胞系119中，但不存在于番茄或NT1细胞系阴性对照中。78和70kDa认为代表不同糖基化形式的HN抗原或70kDa是截短形式的HN单体。被认为是降解产物的其它带在转基因番茄的叶样品中可见的是约20和48kDa，在NT1细胞系119中为48kDa蛋白。

NF代表番茄果实阴性对照-野生型果实；NL表示番茄叶阴性对照-野生型叶；NNT NT1细胞阴性对照-未转化的细胞系；119，转基因NT1细胞系119；L10，转基因番茄株系10的叶；L32，番茄株系32的叶；HN，动物来源的Lasota NDV病毒；M，Bio-Rad’s precision plus protein all blue standard。1-1，CHN-1株系成熟第1阶段的果实；1-3，CHN-1株系成熟第3阶段的果实；1-6，CHN-1株系成熟第6阶段的果实；32-1，CHN-32株系成熟第1阶段的果实；32-3，CHN-32株系成熟第3阶段的果实；32-6，CHN-32株系成熟第6阶段的果实；10-1，CHN-10株系成熟第1阶段的果实。蛋白质大小以kDa表示。

冻干青果和转基因马铃薯叶的凝血测试显示所有株系中的凝血活性(图37)。株系CHN-1、CHN-12和CHN-32的叶中活性最高，而CHN-10是唯一的在果实中活性较高的株系。CHN-32株系显示在果实和叶中最高凝血活性分别是512和2048(图37a)，同时最高凝血活性10,928单位/μg HN(图37b)。CHN-1有第二最高凝血活性在果实和叶中分别是128和256，同时第二最高活性是3,994单位/μg HN(图37a和b)。尽管在转录中间被错误加工，合成的HN基因被翻译成功能性蛋白质。

尽管CHN-10在动物试验和疫苗递送的目标器官果实中有较高HN活性，该株系可能的多倍体状态以及开花和结果缓慢使它不可能作为将来研究的候选对象。考虑到这四个株系中的HN表达水平和HN活性，选择CHN-1和CHN-32供进一步分析。

Western分析、ELISA和凝血活性测试表明，番茄可以表达在ELISA中具有抗原性、并保留凝血活性的正确大小(78kDa)的HN蛋白。在CsVMV启动子控制下表达HN的番茄果实的最佳收获时间是果实成熟的早期阶段。这可使收获时间提前2周并增加约15倍HN表达。尽管蛋白被正确加工，但Northern分析显示其基因在DNA水平不被正确加工。5,000核苷酸转录本可能是由于通读过HN基因终止子。株系CHN-1和CHN-32被认为是供进一步研究的最佳株系。

                   实施例13：番茄果实成熟期间的HN表达

成熟番茄果实中的HN水平以确定是否未成熟果实能比第一阶段番茄表达更高水平HN。

当生长已经完成但仍然完全绿色时，即可以说红肉番茄变种的果实是成熟的。这个成熟阶段称为“绿色期”或“第一阶段”。番茄通常在此阶段采摘然后用乙烯熟化。接下来的阶段包括“碎红期(breaker)”或“第二阶段”，该阶段中绿到浅棕黄色或粉红色有明确变化的迹象(枝蔓成熟的番茄在此阶段采摘)；“转色期(turning)”或“第三阶段”，该阶段中超过10％但少于30％(例如11、12、13、14、15、20、25、29％)的番茄表面显示颜色从绿到浅棕黄色、粉红或红色的明确改变；“粉红期”或“第四阶段”，该阶段中超过30％但少于60％(例如31、32、33、34、35、40、45、50、55、59％)的果实表面颜色是粉红或红色；“浅红期”或“第五阶段”，该阶段中超过60％但少于90％(例如61、62、63、64、65、70、75、80、85、89％)的果实表面颜色是带粉红的红色或红色；“红色期”或“第六阶段”，该阶段中超过90％(例如91、92、93、94、95、99、100％)的果实表面颜色是红色。

由木薯脉花叶病毒启动子(CsVMV)调控的、合成的、植物优化的新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白的基因表达在番茄果实成熟时降低。已经确定第一阶段绿色番茄果实中HN表达约是12μg/g鲜重(FW)，且随着番茄成熟到第六阶段红色番茄果实逐渐降低到约2.5μg/g FW。

使来自T₀CHN代每个原种株系(CHN-1、CHN-32)的一个T1植株发芽并生长。开始开花时，通过手工对每朵花进行自花授粉并用纸巾套住防止交叉授粉。记录每朵花的日期并使之结果。在授粉后一周、授粉后两周、授粉后四周、授粉后六周从每个植物株系收获三个果实，最后在第一阶段收获绿色果实(授粉后约八周)。记录果实直径(mm)和鲜重(g)，然后ELISA分析HN含量并冻干。为测量番茄果实直径，用游标卡尺放在垂直于茎的番茄果实的最宽部分并以毫米为单位记录测量结果。用克天平测量质量。

HN ELISA.使用1∶1500稀释于0.01M硼酸缓冲液中的SPAFAS鸡抗NDV多克隆抗体包被96孔ELISA板。吸取100μl稀释液到每孔并盖上板子放置4℃过夜。第二天上午将板子在24℃平衡30分钟，再用PBST(0.05％Tween)洗涤三次。准备3％脱脂奶溶液并加200μl到每孔中。板子放置于37℃封闭2小时。

为收集样品，沿水平轴将打孔器推入番茄中心。从样品中去除任何凝胶状物质或种子。用解剖刀收集约1cm的番茄并放入样品管中，然后放置于冰上。从总质量中减去每个管重计算出实际样品重量，然后向管中加入20×番茄提取缓冲液(4M NaCl(终浓度100mM)、0.5M EDTA(终浓度1mM)、20％Triton-X 100(终浓度10％)、亮抑酶肽(终浓度10μg/ml)、0.5M NaPi，pH 7.0(终浓度50mM)，用MilliQ水补足体积)(质量/体积)。向样品管中加入陶瓷珠，然后用快速Prep机器以速度4.0匀浆样品30秒。离心匀浆后样品并放置于冰上，此时制作标准曲线。

板子封闭两小时后，用PBST(PBS加0.05％ Tween)洗三次。为制作NDV HN标准曲线，向第二行第二个孔中加入100μl 232ng/ml NDV纯化贮液(1∶80)。将50微升1％脱脂奶加入第二行剩余的孔中和微滴定板上第3-8行的每个孔中。然后将50微升的每种植株样品加入第二行孔3-11中的1％脱脂奶中。通过沿板子从第二行吸取50μl转移到第三行，依次类推，沿板子系列稀释纯化的NDV以及植株样品。每个稀释步骤后上下吹吸来混合样品。样品的起始浓度是40倍稀释。板子放回37℃培养箱孵余1小时。

孵育1小时后，用PBST洗涤板子三次并加入一抗。一抗NDVHN Mab 4A在1％脱脂奶中稀释到1∶250浓度并每孔加入100μL。继续在37℃孵育1小时。然后用PBST洗涤板子三次并将二抗山羊抗小鼠IgG以在1％脱脂奶中1∶3000的浓度加入每个孔中。继续在37℃孵育1小时。

用PBST洗涤板子四次并向每个孔中加入50μL TMB底物。5分钟后用1N H₂SO₄中和TMB。然后在光度计上于450nm波长处读板。

从每个番茄果实中去除种子，测量质量，冷冻于-20℃，冻干，然后重新称重番茄果实，从而测定水分丧失百分比。

为了考虑除HN含量之外的果实大小增加，通过将果实HN浓度乘以果实质量计算所选择每个成熟阶段的番茄果实的HN含量。另外，由此研究产生的数据用于计算如果在第一阶段或授粉后四周收获果实从CHN原种株系产生的可能剂量数。在此模型中，假设在第三阶段和在授粉后四周收获果实时植株产生同样数目的果实并且一个剂量是50μg抗原。

结果

                           果实生理学

正如预期，果实大小、质量和水分丧失百分比随时间增加(图38、39和40)。在相同植物株系相同成熟阶段的重复测量中只观察到一些小变化。在株系1和32的相同成熟阶段之间未见显著差异(α＝0.05)。

成熟中果实的HN含量

成熟果实中HN浓度在授粉后两周达到峰值，然后随果实成熟而降低(图41)。在所述两个番茄株系的相同成熟阶段之间没有显著差异，授粉后前四周的HN含量也没有显著差异(α＝0.05)。

为了考虑除了HN含量之外的果实大小增加，计算所选择每个成熟阶段的番茄果实的HN量。果实中HN含量在授粉后四周达到峰值(CHN-1株系为723μg，CHN-32株系为630.9μg)，并随进一步果实成熟而降低(图42)。在相同成熟阶段的株系之间没有显著差异(α＝0.05)。

计算如果在第一阶段或授粉后四周收获果实由HN原种株系产生的剂量数(表10)。假设每次收获产生同样数目的果实并且一个剂量是50μg抗原。这些数据表明如果在第一阶段收获33个果实将产生126个剂量；而如果在授粉后四周收获果实将产生486个剂量。因而收获时间提前四周，所得剂量有286％的增加。

表10.收获时间对产生HN剂量数的影响

特性	第一阶段	授粉后四周
			抗原浓度(μg/g)	2.5	18.4
平均重量(g/果实)	76.2	40
			收获果实数	33	33
产生果实的总质量(g)	2514.6	1320
			抗原总质量(mg)	6.3	24.3
50μg剂量数	126	486

尽管HN浓度峰值在授粉后两周的番茄果实中为38.8-42μg/g鲜重，在授粉后前四周HN浓度没发现显著区别(α＝0.05)。然而当考虑质量时，授粉后四周的番茄果实平均在631-723μg HN，与其它测试的成熟阶段相比这是显著更高的HN量(α＝0.05)。因为在第一成熟阶段和授粉后2和4周的果实中水分丧失变化不大(总差异2.6％)，授粉后四周显著更高的抗原含量不是改变水分含量或稀释抗原的因素。这些数据提示在CsVMV启动子控制下表达HN的番茄果实的最佳收获时间是授粉后四周。

为便于鉴定何时果实是授粉后四周，在整个成熟过程中记录果实质量和直径。授粉后四周果实平均质量为40g，直径在42到45mm之间。果实大小受遗传、温度、日长和植株年龄的影响。我们平均值的小标准误差表明遗传不是植株-植株间果实大小差异的问题。然而胁迫(由于温度、日长和植株年龄的变化)的影响意味着果实大小可能不总是能作为判断授粉后时间的准确指标。因此当使用果实大小估计授粉时间时，大的温度波动、日长和植株年龄也应该考虑在内。

为计算在番茄果实成熟的更早时间收获的益处，我们建立了一个保守模型，假设在平均生产周期中从一个植株收获33个果实，同时一个剂量HN是50μg。该模型认为是保守的，因为一个剂量可能小于50μg，并且授粉后四周收获果实的植株与更晚阶段收获的植株相比有更小代谢负担，将可能产生更多的果实。这些数据提示通过在授粉后四周收获果实，可以使待收获果实需要的时间缩短四周，增加286％的收获剂量。

因此当在果实成熟的最佳时间收获时，番茄能表达大量HN。

                        实施例14CHN-18母种的制备

母种传代：母种子代2用于DNA提取。

DNA提取和PCR扩增：按本文所述进行DNA提取。分别对HN和PAT基因表达盒进行PCR扩增。在HN和PAT表达盒的PCR产物之间有24bp重叠。

对于HN基因盒扩增，50μl PCR反应体系包含2.5单位Takara Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co，Shiga，Japan，catalog #RR001A)、0.2μM每种引物(CHN01/CHN03)、5μl 10×含MgCl₂的反应缓冲液、0.2mM每种dNTP和200ng基因组DNA。使用由Applied Biosystem(Foster City，CA)制造的Gen Amp PCR 9700***按如下条件进行PCR反应：94℃5分钟1个循环，94℃30秒、60℃30秒和72℃3分30秒共40个循环，72℃7分钟。

对于PAT基因盒扩增，50μl PCR反应体系包含2.5单位Takara Ex Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co，Shiga，Japan，catalog #RR001A)、0.2μM每种引物(CHN02/CHN04)、5μl 10×含MgCl2的反应缓冲液、0.2mM每种dNTP和200ng基因组DNA。使用由Applied Biosystem(Foster City，CA)制造的Gen Amp PCR 9700***按如下条件进行PCR反应：94℃5分钟1个循环，94℃30秒、56℃30秒和72℃2分30秒共40个循环，72℃7分钟。

克隆PCR产物：琼脂糖凝胶电泳和肉眼观察后，用MiniElute PCR Purification Kit(Qiagen，Valencia，CA.Catalog #28004)根据制造商方法纯化PCR产物。使用TOPO TACloning^_试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，Calif.，Catalog #051302)根据制造商方法将纯化的PCR产物克隆到pCR^_II-TOPO载体中。

质粒DNA提取  使用Qiaprep Spin Minprep kit(Qiagen，Valencia，Calif.，catalog#27106)根据制造商方法提取质粒DNA。

DNA测序和分析：包含克隆PCR产物的质粒DNA送到Lark Technologies Inc(Houston，TX)使用ABI PRISM^_BigDye^TM Primer Cycle Sequencing Kits(Applied Biosystem，Foster City，CA)测序，用Vector NTI程序(InforMax，Frederick，MD)分析DNA序列。

结果

组装HN和PAT盒的DNA序列并与pCHN虚拟质粒图谱的序列比较。包括CsVMV启动子、HN和PAT编码序列、vspB 3’UTR和MAS 3’UTR的所有遗传元件的DNA序列与pCHN虚拟质粒图谱的序列是等同的。基于虚拟质粒图谱pCHN，使用引物CHN01/CHN02的包括CHN-18母种中全基因***物的PCR产物是4757bp。然而，实际克隆并测序的包括CHN-18母种中全基因***物的PCR产物是4768bp。经序列比较，7个额外的DNA碱基位于PAT编码序列和MAS 3’UTR之间连接区(多克隆位点)，另外4个DNA碱基位于MAS 3’UTR的3’端以外(图43)。虚拟质粒图谱和实际测序数据之间不一致的DNA碱基数最可能出现在虚拟创建pCHN质粒图谱期间。全部***序列的开放阅读框分析表明只有预期的HN和PAT开放阅读框，没有创建任何新的开放阅读框。

结论

通过与pCHN质粒图谱的虚拟序列比较，除了基因***物中所有遗传元件以外的11个额外DNA碱基，CHN-18母种中的全基因***物的实际DNA序列与预期序列是等同的。这11个DNA碱基对存在的HN和PAT开放阅读框没有任何影响。

本发明的原理、优选实施方案和操作方法已经在前面的说明书和实施例中描述。然而本文要求保护的本发明不受具体公开的特定形式的限制，因为它们应被认为是说明性的，而非限制性的。在不背离本发明的实质和范围的情况下，本领域的技术人员可以进行变化和改变。

除非另外指出，本发明的实施将使用分子生物学、细胞生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术，它们都在本领域技术的范围内。这些技术可以在文献中作有全面解释。例如见Sambrook，Fritsch & Maniatis，1989， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition； Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harnes & S.J.Higgins，eds.，1984)； A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；(Harlow，E.and Lane，D.)Using Antibodies：ALaboratory Manual(1999)Cold Spring Harbor Laboratory Press；and a series， Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)； Short Protocols In Molecular Biology，(Ausubel et al.，ed.，1995)。

此处引用的所有专利、专利申请和公开文献的全部内容都通过引用并入本文。尽管本发明已经参考优选实施方案进行了具体说明和描述，本领域技术人员将理解，在不背离权利要求书所包括的发明范围的情况下，可以进行多种形式和内容的改变。

                                序列表

<110>波依斯汤普森植物研究所

     道农业科学公司

<120>用于制备免疫保护性组合物的载体和来源于基因植物的细胞

<130>3121/2028

<150>US 60/467,998

<151>2003-05-05

<160>26

<170>PatentIn version 3．2

<210>1

<211>1760

<212>DNA

<213>新城疫病毒

<400>1

ccatggaccg agcagtttca caagtggctc ttgagaatga tgagagggaa gccaagaaca      60

cttggaggct tatctttcgg atagccattc tctttcttac tgttgtcacc ctagcaatct     120

ctgttgcatc attactctat tctatgggag caagcacccc ctcagactta gttggcatac     180

ccacacgaat ctctagggct gaagagaaga ttaccagtac cctaggctcc aaccaggatg     240

ttgtggaccg aatctacaaa caagttgcac ttgaaagtca acttgcatta ctcaacacag     300

aaactaccat catgaatgca atcaccagcc tatcctatca gatcaatggg gctgccaaca     360

attcaggttg gggagcccca attcatgatc cagactacat tggaggtatt ggcaaagaac     420

tcattgtaga tgatgcttca gatgttacat ctttctatcc ttcagctttc caggaacatc     480

tgaacttcat tcctgcaccc acaactggga gtgggtgcac tcggataccc tcatttgaca     540

tgagtgctac acactattgc tatacacaca atgtcattct atctggctgt cgtgaccatt     600

ctcactctta tcagtactta gcacttggag ttcttcgtac atctgctact ggtagagtgt     660

tcttctcaac tcttcgcagt atcaatcttg atgatacaca gaatcgcaaa agttgctctg     720

tatctgctac acctttgggc tgtgatatgc tatgcagtaa agtaacagaa actgaagaag     780

aggactacaa ttctgcagtc cctacaagga tggtgcatgg cagattgggt tttgatggtc     840

aataccatga gaaagatttg gatgtcacta cattgtttgg ggattgggta gctaactatc     900

caggagttgg aggtggtagc ttcattgact ccagagtctg gttctctgtc tatggtggtt     960

tgaaacctaa cagtcctagt gatactgtgc aagagggaaa gtatgttatc tacaagaggt    1020

acaatgatac ttgtcctgat gagcaagact atcagattcg aatggctaag tcatcataca    1080

aaccaggaag atttggaggt aagaggatac aacaagctat tctcagtatc aaggttagca    1140

catcattggg agaagatcca gtccttactgttccaccaaa cactgtaaca ttgatgggag     1200

ctgagggaag gattcttact gttggtacta gccactttct ctatcaacgt ggaagttcct    1260

actttagccc agcgttactg tatccaatga ctgtgagcaa caagacagct acattacatt    1320

caccatatac tttcaatgcc tttacaagac ctggatcgat tccttgccaa gcttcagcta    1380

gatgtccgaa ttcgtgtgtg actggagttt acactgatcc ttaccctttg atcttctacc   1440

gtaatcatac cttgagaggg gtgtttggaa caatgttaga tggtgttcaa gctaggttga   1500

atcctgcctc tgctgtgttt gattctacat ccagatcaag gataaccaga gtttcctcta   1560

gttctactaa ggcagcatac actacctcca catgtttcaa agttgtaaag acgaacaaga   1620

cctattgtct gagcatagct gagatttcta acactctctt tggggaattc agaattgttc   1680

cacttttggt ggagattctg aaagatgatg gtgtacgtga agcaagatca ggttaagtct   1740

tcggatccgg taccgagctc                                               1760

<210>2

<211>577

<212>PRT

<213>新城疫病毒

<400>2

Met Asp Arg Ala Val Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu

1               5                   10                  15

Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Ile Phe Arg Ile Ala Ile Leu Phe Leu

            20                  25                  30

Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Set Leu Leu Tyr Set Met

        35                  40                  45

Gly Ala Set Thr Pro Set Asp Leu Val Gly Ile Pro Thr Arg Ile Set

    50                  55                  60

Arg Ala Glu Glu Lys Ile Thr Set Thr Leu Gly Set Asn Gln Asp Va1

65                  70                  75                  80

Val Asn Arg Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Asn Thr Glu Thr Thr Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr

            100                 105                 110

Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His

        115                 120                 125

Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys GIu Leu Ile Val Asp Asp

    130                 135                 140

Ala Set Asp Val Thr Set Phe Tyr Pro Set Ala Phe Gln Glu His Leu

145                 150                 155                 160

Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Set Gly Cys Thr Arg Ile Pro

                165                 170                 175

Set Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

            180                 185                 190

Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala Leu

        195                 200                 205

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr Leu

    210                 215                 220

Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

225                 230                 235                 240

Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu

                245                 250                 255

Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val His

            260                 265                 270

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val

        275                 280                 285

Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly Gly

    290                 295                 300

Gly Ser Phe Ile Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu

305                 310                 315                 320

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile

                325                 330                 335

Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile

            340                 345                 350

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu

    370                 375                 380

Asn Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala

385                 390                 395                 400

Glu Gly Ara Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg

                405                 410                 415

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser

            420                 425                 430

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr

        435                 440                 445

Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro ASn Ser

    450                 455                 460

Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Tyr Arg

465                 470                 475                 480

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asn Gly Val Gln

                485                 490                 495

Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asn Ser Thr Ser Arg Ser

            500                 505                 510

Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr

        515                 520                 525

Ser Thr Cys Phe Lys VaL Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser

    530                 535                 540

Ile Ala Glu Ile Set Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro

545                 550                 555                 560

Leu Leu Val Glu Ile Ile Lys Asn Asn Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser

                565                 570                 575

Gly

<210>3

<211>1647

<212>DNA

<213>禽流感病毒

<400>3

gaccaaatct gcatcggtta tcatgcaaac aattcaacaa aacaagttga cacaatcatg     60

gagaagaatg tgacggtcac acatgctcaa gatatactgg aaaaagagca caacgggaaa    120

ctctgcagtc tcaaaggagt gaggcccctc attctgaagg attgcagtgt ggctggatgg    180

cttcttggga acccaatgtg tgatgagttc ctaaatgtac cggaatggtc atatattgta    240

gagaaggaca atccaaccaa tggcttatgt tatccgggag acttcaatga ttatgaagaa    300

ctgaagtatt taatgagcaa cacaaaccat tttgagaaaa ttcaaataat ccctaggaac    360

tcttggtcca atcatgatgc ctcatcagga gtgagctcag catgcccata caatggtagg    420

tcttcctttt tcaggagtgt ggtgtggttg atcaagaaga gtaatgtata cccaacaata    480

aagaggacct acaataacac caatgtagag gaccttctga tattgtgggg aatccatcac    540

cctaatgatg cagcggaaca aacggaactc tatcagaact cgaacactta tgtgtctgta    600

ggaacatcaa cactaaatca gaggtcaatt ccagaaatag ctaccaggcc caaagtgaat    660

ggacaaagtg gaagaataga atttttctgg acaatactaa ggccgaacga tgcaatcagc    720

tttgaaagta atgggaactt tatagctcct gaatatgcat acaagatagt taaaaaggga    780

gattcagcaa tcatgagaag cgaactggag tatggcaact gtgataccaa atgtcagacc    840

ccagtgggtg ctataaattc cagtatgcct tttcacaatg ttcatcccct taccattgga    900

gagtgtccca aatatgtcaa atcagataaa ctggtccttg caacaggact gaggaacgtg    960

cctcagagag aaacaagagg tctgtttgga gcaatagcag gattcataga aggggggtgg   1020

caaggaatgg tagatggatg gtatggttac catcatagca acgagcaggg aagtggatat  1080

gctgcagaca aagagtccac tcagaaagca atcgacggga tcaccaataa agtcaactca  1140

atcattgaca aaatgaacac tcaattcgaa gccgttggga aagaattcaa caacttagaa  1200

aggagaatag aaaatttgaa taagaaaatg gaagatggat ttctagatgt atggacttac  1260

aatgcagaac ttctggtgct catggaaaat gaaagaactc tggatttcca tgattcatat  1320

gtcaagaacc tatacgataa ggtccgactc cagctgagag ataatgcaaa agaattgggc  1380

aatgggtgtt tggagttctc ccacaaatgt gacaatgaat gcatggaaag tgtgagaaac  1440

ggaacgtatg actatccaca atactcagaa gaatcaaggc tgaacagaga ggaaatagat  1500

ggagtcaaat tggagtcaat gggcacctat cagatactat caatttactc aacagtggcg  1560

agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctgtctt tttggatgtg ctccaatgga  1620

tcattgcaat gcagaatttg catctag                                      1647

<210>4

<211>548

<212>PRT

<213>禽流感病毒

<400>4

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Lys Gln Val

1               5                   10                  l5

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

            20                  25                  30

Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg

        35                  40                  45

Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

    50                  55                  60

Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

65                  70                  75                  80

Glu Lys Asp Asn Pro Thr Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn

                85                  90                  95

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys Tyr Leu Met Ser Asn Thr Asn His Phe Glu

            100                 105                 110

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Asn His Asp Ala Ser

        115                 120                 125

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe

    130                 135                 140

Arg Ser Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Ser Asn Val Tyr Pro Thr Ile

145                 150                 155                 160

Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp

                165                 170                 175

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Glu Leu Tyr Gln

            180                 185                 190

Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

        195                 200                 205

Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

    210                 215                 220

Arg Ile Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Arg Pro Asn Asp Ala Ile Ser

225                 230                 235                 240

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

                245                 250                 255

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Arg Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

            260                 265                 270

Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser

        275                 280                 285

Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

    290                 295                 300

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val

305                 310                 315                 320

Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile

                325                 330                 335

Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His

            340                 345                 350

Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln

        355                 360                 365

Lys Ala Ile Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys

    370                 375                 380

Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu

385                 390                 395                 400

Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp

                405                 410                 415

Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg

            420                 425                 430

Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Tyr Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val

        435                 440                 445

Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Leu

    450                 455                 460

Glu Phe Ser His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn

465                 470                 475                 480

Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg

                485                 490                 495

Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile

            500                 505                 510

Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met

        515                 520                 525

Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys

    530                 535                 540

Arg Ile Cys Ile

545

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物CVM-Asc

<400>5

atggcgcgcc agaaggtaat tatccaag                                       28

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>PCR引物CVM-Xho

<400>6

atctcgagcc atggtttgga tcca                                           24

<210>7

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物GSS-Nco

<400>7

tgccatggtg atgtgtggtc tacaa                                          25

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>正向引物GSS-1.8F

<400>8

gatotgacaa gtcaagaaaa ttg                                             23

<2l0>9

<Z1b>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>诱变引物GSS-Xho

<400>9

agctcgagct gtgtgagtga gtg                                             23

<210>10

<Z11>20

<212>DNA

<z13>人工序列

<220>

<223>引物HNa

<400>10

ccgagcagtt tcacaagtgg                                             20

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物HNb

<400>11

cctgatcttg cttcacgtac a                                             21

<210>12

<211>4767

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>CHN-18母种中的全基因***物的DNA序列

<400>12

gaggtctaca ggccaaattc gctcttagcc gtacaatatt actcaccgga tcggccgctt    60

aattaagttt aaaccctgca ggaaagcccg ggcaaaggcg cgccagaagg taattatcca    120

gatgtagcat caagaatcca atgtttacgg gaaaaactat ggaagtatta tgtgagctca    180

gcaagaagca gatcaatatg cggcacatat gcaacctatg ttcaaaaatg aagaatgtac    240

agatacaaga tcctatactg ccagaatacg aagaagaata cgtagaaatt gaaaaagaag    300

aaccaggcga agaaaagaat cttgaagacg taagcactga cgacaacaat gaaaagaaga    360

agataaggtc ggtgattgtg aaagagacat agaggacaca tgtaaggtgg aaaatgtaag    420

ggcggaaagt aaccttatca caaaggaatc ttatccccca ctacttatcc ttttatattt    480

ttccgtgtca tttttgccct tgagttttcc tatataagga accaagttcg gcatttgtga    540

aaacaagaaa aaatttggtg taagctattt tctttgaagt actgaggata caacttcaga   600

gaaatttgta agtttgtgga tccaaaccat ggaccgagca gtttcacaag tggctcttga   660

gaatgatgag agggaagcca agaacacttg gaggcttatc tttcggatag ccattctctt   720

tcttactgtt gtcaccctag caatctctgt tgcatcatta ctctattcta tgggagcaag   780

caccccctca gacttagttg gcatacccac acgaatctct agggctgaag agaagattac   840

cagtacccta ggctccaacc aggatgttgt ggaccgaatc tacaaacaag ttgcacttga   900

aagtccactt gcattactca acacagaaac taccatcatg aatgcaatca ccagcctatc   960

ctatcagatc aatggggctg ccaacaattc aggttgggga gccccaattc atgatccaga  1020

ctacattgga ggtattggca aagaactcat tgtagatgat gcttcagatg ttacatcttt  1080

ctatccttca gctttccagg aacatctgaa cttcattcct gcacccacaa ctgggagtgg  1140

gtgcactcgg ataccctcat ttgacatgag tgctacacac tattgctata cacacaatgt  1200

cattctatct ggctgtcgtg accattctca ctcttatcag tacttagcac ttggagttct  1260

tcgtacatct gctactggta gagtgttctt ctcaactctt cgcagtatca atcttgatga  1320

tacacagaat cgcaaaagtt gctctgtatc tgctacacct ttgggctgtg atatgctatg  1380

cagtaaagta acagaaactg aagaagagga ctacaattct gcagtcccta caaggatggt  1440

gcatggcaga ttgggttttg atggtcaata ccatgagaaa gatttggatg tcactacatt  1500

gtttggggat tgggtagcta actatccagg agttggaggt ggtagcttca ttgactccag  1560

agtctggttc tctgtctatg gtggtttgaa acctaacagt cctagtgata ctgtgcaaga  1620

gggaaagtat gttatctaca agaggtacaa tgatacttgt cctgatgagc aagactatca  1680

gattcgaatg gctaagtcat catacaaacc aggaagattt ggaggtaaga ggatacaaca  1740

agctattctc agtatcaagg ttagcacatc attgggagaa gatccagtcc ttactgttcc  1800

accaaacact gtaacattga tgggagctga gggaaggatt cttactgttg gtactagcca  1860

ctttctctat caacgtggaa gttcctactt tagcccagcg ttactgtatc caatgactgt  1920

gagcaacaag acagctacat tacattcacc atatactttc aatgccttta caagacctgg  1980

atcgattcct tgccaagctt cagctagatg tccgaattcg tgtgtgactg gagtttacac  2040

tgatccttac cctttgatct tctaccgtaa tcataccttg agaggggtgt ttggaacaat  2100

gttagatggt gttcaagcta ggttgaatcc tgcctctgct gtgtttgatt ctacatccag  2160

atcaaggata accagagttt cctctagttc tactaaggca gcatacacta cctccacatg  2220

tttcaaagtt gtaaagacga acaagaccta ttgtctgagc atagctgaga tttctaacac  2280

tctctttggg gaattcagaa ttgttccact tttggtggag attctgaaag atgatggtgt  2340

acgtgaagca agatcaggtt aagtcttcgg atccggtacc gagctctctc aacaatctag  2400

ctagagtttg ctcctatcta tatgtaataa ggtatgctga tatgcactat tcaaatagga  2460

gcattagcta tgtttgttaa tgtcacttta tgttatgtgg gtaagtcacc taagacactc  2520

cacgtaccta cttgttgtct cttacgcggc tttaataaat cttctgccct tgttccatat  2580

ttactaatta tccctttctt cactaaaaga aaattgttat cattaagtat tagtctttag  2640

aacatatgag gtctttaatt gggtaggtzt tacaaattaa ctaatataaa atgtcataaa  2700

atccacgtgg ttaaacaaat gcagaaaatc gacgtcgtct attggaccga cagttgctat  2760

taatataatg ggccaccata gtagactgac aaataaatta cctgacaaca tcgtttcaca  2820

aaaaaacaaa cacaaaaagg gagtgcattt tccagggcat ttttgtaata aaaaacagat  2880

aaaagggagt gcaatagaaa tataggggtg tggaaatagt gatttgagca cgtcttgaag  2940

cgaattcgcg gccggccaga aggtaattat ccaagatgta gcatcaagaa tccaatgttt  3000

acgggaaaaa ctatggaagt attatgtgag ctcagcaaga agcagatcaa tatgcggcac  3060

atatgcaacc tatgttcaaa aatgaagaat gtacagatac aagatcctat actgccagaa  3120

tacgaagaag aatacgtaga aattgaaaaa gaagaaccag gcgaagaaaa gaatcttgaa  3180

gacgtaagca ctgacgacaa caatgaaaag aagaagataa ggtcggtgat tgtgaaagag  3240

acatagagga cacatgtaat gtggaaaatg taagggcgga aagtaacctt atcacaaagg  3300

aatcttatcc cccactactt atccttttat atttttccgt gtcatttttg cccttgagtt  3360

ttcctatata aggaaccaag ttcggcattt gtgaaaacaa gaaaaaattt ggtgtaagct  3420

attttctttg aagtactgag gatacaactt cagagaaatt tgtaagtttg tggatccaaa  3480

ccatggcttc tccggagagg agaccagttg agattaggcc agctacagca gctgatatgg  3540

ccgcggtttg tgatatcgtt aaccattaca ttgagacgtc tacagtgaac tttaggacag  3600

agccacaaac accacaagag tggattgatg atctagagag gttgcaagat agataccctt  3660

ggttggttgc tgaggttgag ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctggg ccctggaagg  3720

ctaggaacgc ttacgattgg acagttgaga gtactgttta cgtgtcacat aggcatcaaa  3780

ggttgggcct aggatccaca ttgtacacac atttgcttaa gtctatggag gcgcaaggtt  3840

ttaagtctgt ggttgctgtt ataggccttc caaacgatcc atctgttagg ttgcatgagg  3900

ctttgggata cacagcccgg ggtacattgc gcgcagctgg atacaagcat ggtggatggc  3960

atgatgttgg tttttggcaa agggattttg agttgccagc tcctccaagg ccagctaggc  4020

cagttaccca gatctgaggt accctgagct cggtcacctg tccaacagtc tcagggttaa  4080

tgtctatgta tcttaaataa tgttgtcggt attttgtaat ctcatataga ttttcactgt  4140

gcgacgcaaa aatattaaat aaatattatt attatctacg ttttgattga gatatcatca  4200

atattataat aaaaatatcc attaaacacg atttgataca aatgacagtc aataatctga  4260

tttgaatatt tattaattgt aacgaattac ataaagatcg aatagaaaat actgcactgc  4320

aaatgaaaat taacacatac taataaatgc gtcaaatatc tttgccaaga tcaagcggag  4380

tgagggcctc atatccggtc tcagttacaa gcacggtatc cccgaagcgc gctccaccaa  4440

tgccctcgac atagatgccg ggctcgacgc tgaggacatt gcctacctgg agcatggtct  4500

cagcgccggc tttaagctca atcccatccc aatctgaata tcctatcccg cgcccagtcc  4560

ggtgtaagaa cgggtctgtc catccacctc tgttgcggcc aattctgatc tggcccccat  4620

ttggacgtga atgtagacac gtcgatataa agatttccga attagaataa tttgtttatt  4680

gctttcgcct ataaatacga cggatcgtaa tttgtcgttt tatcaaaatg tactttcatt  4740

ttataataac gctgcggaca tctacat                                       4767

<210>13

<211>681

<212>DNA

<213>乙肝病毒

<400>13

atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc ggggtttttc    60

ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac ttctctcaat   120

tttctagggg gatcacccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac ctccaatcac   180

tcaccaacct cctgtcctcc aatctgtcct ggttatcgct ggatgtgtct gcggcgtttt   240

atcatattcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tattggttct tctggattat   300

caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcaa caacaaccag tacgggacca   360

tgcaaaacct gcacgactcc tgctcaaggg aactctatgt ttccctcatg ttgctgtaca   420

aaacctacgg atgggaattg cacctgtatt cccatcccat cgtcctgggc tttcgcaaaa   480

tacctatggg agtgggcctc agtccgtttc tcttggctca gtttactagt gccatttgtt   540

cagtggttcg tagggctttc ccccactgtt tggctttcag ctatatggat gatgtggtat   600

tgggggccaa gtctgtacag catcgtgagt ccctttatac cgctgttacc aattttcttt   660

tgtctctggg tatacattta a                                             681

<210>14

<211>226

<212>PRT

<213>乙肝病毒

<400>14

Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln

1               5                   10                  15

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu

            20                  25                  30

Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys

        35                  40                  45

Leu Gly Gln Ash Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser

    50                  55                  60

Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe

65                  70                  75                  80

Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val

                85                  90                  95

Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly

            100                 105                 110

Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala

        115                 120                 125

Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp

    130                 135                 140

Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys

145                 150                 155                 160

Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu

                165                 170                 175

Val Pro Phe Val Gln Tro Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu

            180                 185                 190

Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile

        195                 200                 205

Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val

    210                 215                 220

Tyr Ile

225

<210>15

<211>1467

<212>DNA

<213>人

<400>15

cgcagttgtg cacaccccag cccaggctct ggcaggctgc caggcggggc tcgccgcctt     60

cgcagtgcac gttgtccagc aggatgtgtc cggtgccata gccgaagaag gcgttggtgg    120

tggcggccat ggccgccccg cagcccagct gacgacagac cacagcggca tccggcagcc    180

cccagtcgtc gtcacacacg gtgccccaca ggccactgtg caggatctcc actcggccct    240

gacacagggt ggagccagcc atcctgagac gtccgtacag cccgtactgg tggagtgtca    300

ggaggccact ctgatggtca tggtcagcaa agaccttttt ggcaccggga agctcatcag    360

ggctgctgac ctcaccttgg gcccagaggc ctgtgagcct ctggtctcca tggacacaga    420

agatgtggtc aggtttgagg ttggactcca cgagtgtggc aacagcatgc aggtaactga    480

cgatgccctg gtgtacagca ccttcctgct ccatgacccc cgccccgtgg gaaacctgtc    540

catcgtgagg actaaccgcg cagagattcc catcgagtgc cgctacccca ggcagggcaa    600

tgtgagcagc caggccatcc tgcccacctg gttgcccttc aggaccacgg tgttctcaga    660

ggagaagctg actttctctc tgcgtctgat ggaggagaac tggaacgctg agaagaggtc    720

ccccaccttc cacctgggag atgcagccca cctccaggca gaaatccaca ctggcagcca    780

cgtgccactg cggttgtttg tggaccactg cgtggccaca ccgacaccag accagaatgc    840

ctccccttat cacaccatcg tggacttcca tggctgtctt gtcgacggtc tcactgatgc    900

ctcttctgca ttcaaagttc ctcgacccgg gccagataca ctccagttca cagtggatgt    960

cttccacttt gctaatgact ccagaaacat gatatacatc acctgccacc tgaaggtcac  1020

cctagctgag caggacccag atgaactcaa caaggcctgt tccttcagca agccttccaa  1080

cagctggttc ccagtggaag gctcggctga catctgtcaa tgctgtaaca aaggtgactg  1140

tggcactcca agccattcca ggaggcagcc tcatgtcatg agccagtggt ccaggtctgc  1200

ttcccgtaac cgcaggcatg tgacagaaga agcagatgtc accgtggggc cactgatctt  1260

cctggacagg aggggtgacc atgaagtaga gcagtgggct ttgccttctg acacctcagt  1320

ggtgctgctg ggcgtaggcc tggctgtggt ggtgtccctg actctgactg ctgttatcct  1380

ggttctcacc aggaggtgtc gcactgcctc ccaccctgtg tctgcttccg aataaaagaa  1440

gaaagcaata aaaaaaaaaa aaaaaaa                                      1467

<210>16

<211>373

<212>PRT

<213>人

<400>16

Met Val Met Val Ser Lys Asp Leu Phe Gly Thr Gly Lys Leu Ile Arg

1               5                   10                  15

Ala Ala Asp Leu Thr Leu Gly Pro Glu Ala Cys Glu Pro Leu Val Ser

            20                  25                  30

Met Asp Thr Glu Asp Val Val Arg Phe Glu Val Gly Leu His Glu Cys

        35                  40                  45

Gly Asn Ser Met Gln Val Thr Asp Asp Ala Leu Val Tyr Ser Thr Phe

    50                  55                  60

Leu Leu His Asp Pro Arg Pro Val Gly Asn Leu Ser Ile Val Arg Thr

65                  70                  75                  80

Asn Arg Ala Glu Ile Pro Ile Glu Cys Arg Tyr Pro Arg Gln Gly Asn

                85                  90                  95

Val Ser Ser Gln Ala Ile Leu Pro Thr Tro Leu Pro Phe Arg Thr Thr

            100                 105                 110

Val Phe Ser Glu Glu Lys Leu Thr Phe Ser Leu Arg Leu Met Glu Glu

        115                 120                 125

Asn Trp Asn Ala Glu Lys Ara Ser Pro Thr Phe His Leu Gly Asp Ala

    130                 135                 140

Ala His Leu Gln Ala Glu Ile His Thr Gly Ser His Val Pro Leu Arg

145                 150                 155                 160

Leu Phe Val Asp His Cys Val Ala Thr Pro Thr Pro Asp Gln Asn Ala

                165                 170                 175

Ser Pro Tyr His Thr Ile Val Asp Phe His Gly Cys Leu Val Asp Gly

            180                 185                 190

Leu Thr Asp Ala Ser Ser Ala Phe Lys Val Pro Arg Pro Gly Pro Asp

        195                 200                 205

Thr Leu Gln Phe Thr Val Asp Val Phe His Phe Ala Asn Asp Ser Arg

    210                 215                 220

Asn Met Ile Tyr Ile Thr Cys His Leu Lys Val Thr Leu Ala Glu Gln

225                 230                 235                 240

Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Ala Cys Ser Phe Ser Lys Pro Ser Asn

                245                 250                 255

Ser Tro Phe Pro Val Glu Gly Ser Ala Asp Ile Cys Gln Cys Cys Asn

            260                 265                 270

Lys Gly Asp Cys Gly Thr Pro Ser His Ser Arg Arg Gln Pro His Val

        275                 280                 285

Met Ser Gln Trp Ser Arg Ser Ala Ser Arg Asn Arg Arg His Val Thr

    290                 295                 300

Glu Glu Ala Asp Val Thr Val Gly Pro Leu Ile Phe Leu Asp Arg Arg

305                 310                 315                 320

Gly Asp His Glu Val Glu Gln Trp Ala Leu Pro Ser Asp Thr Ser Val

                325                 330                 335

Val Leu Leu Gly Val Gly Leu Ala Val Val Val 5er Leu Thr Leu Thr

            340                 345                 350

Ala Val Ile Ieu Val Leu Thr Arg Arn Cys Arg Thr Ala Ser His Pro

        355                 360                 365

Val Ser Ala Glu

    370

<210>17

<211>1740

<212>DNA

<213>禽流感病毒

<400>17

atggaaagaa tagtgattgc ccttgcaata atcaacattg tcaaaggtga ccaaatctgc     60

attggttatc atgcaaacaa ttcaacagag caggttgaca caatcatgga gaagaatgtg    120

acggtcacac atgctcagga catactggaa aaagagcaca atgggaaact ctgcagtctt    180

aaaggagtga ggcccctcat tctgaaggat tgcagtgtcg ctgggtggct tcttggaaac    240

ccaatgtgtg atgaattcct gaatgtaccg gaatggtcat acattgtgga aaaagataat    300

ccagtcaatg gcctgtgcta tccaggagac ttcaacgatt atgaagaact gaagcattta    360

atgagcagca caaaccattt tgagaaaatt cagataattc ctaggaactc ttggtccacc    420

catgatgcct catcaggagt gagctcagca tgcccataca atggtaggtc ttcctttttc    480

aggaatgtag tgtggttgat caagaagaat aatgcgtacc caacaataaa gaggacctac    540

aacaacacca atgtagaaga ccttttaata ttatggggaa tccaccaccc taatgatgca    600

gcagaacaaa caaaactcta ccagaactcg aacacttatg tgtctgtagg aacatcaaca    660

ctgaatcaga ggtcaatccc agaaatagcc accagaccca aagtgaacgg acaaagtgga    720

agaatggaat ttttttggac aatactaagg ccgaacgatg caatcagctt tgaaagtaat    780

gggaacttta tagctcctga atatgcgtac aagattgtta aaaaaggaga ttcagcaatc    840

atgaaaagtg aactggagta tggtaactgt gataccaaat gtcagacccc agtgggtgct    900

ataaattcca gtatgccttt ccacaatgtt catcccctta ccattgggga gtgccccaag    960

tatgtcaaat cggacaaact ggtccttgca acaggactaa gaaacgtacc ccaaagagaa   1020

acaagaggcc tatttggagc aatagcagga ttcatagaag gaggatggca aggaatggta   1080

gatggatggt atggatacca tcatagcaat gagcagggaa gtggatatgc tgcagacaaa   1140

gaatctaccc agaaagcaat cgatgggatc accaataaag taaactcaat cattgacaaa   1200

atgaacactc aattcgaagc cgttgggaaa gaattcaaca acctagaaag gagaatagaa   1260

aatttgaata agaaaatgga agatgggttt ttagatgtat ggacttacaa tgcagaactt   1320

ctagtgctca tggaaaacga aagaactctg gatttccatg attcaaatgt caagaactta   1380

tacgataagg tccgactcca gctgagagac aatgcaaaag aattaggcaa cgggtgcttt   1440

gaattctacc acaagtgtga caatgaatgc atggaaagtg tgagaaatgg aacgtatgac   1500

tatccacaat actcagaaga atcaagactg aacagggagg aaatagacgg agtcaaattg   1560

gaatcaatgg gcacttatca gatactatca atctactcaa cagtggcgag ttccctagca   1620

ctggcaatca tggtagctgg tctatctttt tggatgtgct ccaatggatc attgcagtgc   1680

agaatttgca tctagaattg tgagttcaga ttataattaa aaacacccta gtttctactg   1740

<Z10>18

<211>564

<212>PRT

<213>禽流感病毒

<400>18

Met Glu Arg Tle Val Ile Ala Ieu Ala Ile Ile Asn Ile Val Lys Gly

1               5                   10                  15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

            20                  25                  30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

        35                  40                  45

Leu Glu Lys Glu His Asn Gly Lys Leu Cys Ser Leu Lys Gly Val Arg

    50                  55                  60

Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Set Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65                  70                  75                  80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Leu Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

                85                  90                  95

Glu Lys Asn Asn Pro Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

            100                 105                 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Met Ser Ser Thr Asn His Phe Glu

        115                 120                 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Arg Asn Ser Trp Ser Thr His Asn Ala Ser

    130                 135                 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Asn Gly Arg Ser Ser Phe Phe

145                 150                 155                 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Thr Ile

                165                 170                 175

Lys Arg Thr Tyr Asn Asn Thr Asn Val Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp

            180                 185                 190

Gly Ile His His Pro Asn Aso Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

        195                 200                 205

Asn Ser Asn Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

    210                 215                 220

Ser Ile Pro Glu Ile Ala Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225                 230                 235                 240

Arg Met Glu Phe Phe Trn Thr Ile Leu Arg Prg Asn Asn Ala Ile Ser

                245                 250                 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

            260                 265                 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

        275                 280                 285

Asn Cys Asp Thr Lys Cys Gln Thr Pro Val Gly Ala Ile Asn Ser Ser

    290                 295                 300

Met Pro Phe His Asn Val His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305                 310                 315                 320

Tyr Val Lys Ser Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val

                325                 330                 335

Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile

            340                 345                 350

Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His

        355                 360                 365

Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln

    370                 375                 380

Lys Ala tle Asp Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys

385                 390                 395                 400

Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Asn Leu Glu

                405                 410                 415

Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp

            420                 425                 430

Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg

        435                 440                 445

Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val

    450                 455                 460

Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe

465                 470                 475                 480

Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Asn

                485                 490                 495

Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ser Arg Leu Asn Arg

            500                 505                 510

Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Thr Tyr Gln Ile

        515                 520                 525

Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser ser Leu Ala Leu Ala Ile Met

    530                 535                 540

Val Ala Gly Leu Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys

545                 550                 555                 560

Arg Ile Cys Ile

<210>19

<211>1734

<212>DNA

<213>新城疫病毒

<400>19

atggaccgcg ccgttagcca agttgcgtta gagaatgatg aaagagaggc aaaaaataca      60

tggcgcttga tattccggat tgcaatctta ttcttaacag tagtgacctt ggctatatct     120

gtagcctccc ttttatatag catgggggct agcacaccta gcgatcttgt aggcataccg     180

actaggattt ccagggcaga agaaaagatt acatctacac ttggttccaa tcaagatgta   240

gtagatagga tatataagca agtggccctt gagtctccgt tggcattgtt aaaaactgag   300

accacaatta tgaacgcaat aacatctctc tcttatcaga ttaatggagc tgcaaacaac   360

agcgggtggg gggcacctat ccatgaccca gattatatag gggggatagg caaagaactc   420

attgtagatg atgctagtga tgtcacatca ttctatccct ctgcatttca agaacatctg   480

aattttatcc cggcgcctac tacaggatca ggttgcactc gaataccctc atttgacatg   540

agtgctaccc attactgcta cacccataat gtaatattgt ctggatgcag agatcactca   600

cattcatatc agtattragc acttggtgtg ctccggacat ctgcaacagg gggggtattc   660

ttttctactc tgcgttccat caacctggac gacacccaaa atcggaagtc ttgcagtgtg   720

agtgcaactc ccctgggttg tgatatgctg tgctcgaaag tcacggagac agaggaagaa   780

gattataact cagctgtccc tacgcggatg gtacatggga ggttagggtt cgacggccag   840

taccacgaaa aggacctaga tgtcacaaca ttattcgggg actgggtggc caactaccca   900

ggagtagggg gtggatcttt tattgacagc cgcgtatggt tctcagttta cggagggtta   960

aaacccaatt cacccagtga cactgtacag gaagggaaat atgtgatata caagcaatac  1020

aatgacacat gcccagatga gcaagactac cagattcgaa tggccaagtc ttcgtataag  1080

cctggacggt ttggtgggaa acgcatacag caggctatct tatctatcaa ggtgtcaaca  1140

tccttaggcg aagacccggt actgactgta ccgcccaaca cagtcacact catgggggcc  1200

gaaggcagaa ttctcacagt agggacatct catttcttgt atcaacgagg gtcatcatac  1260

ttctctcccg cgttattata tcctatgaca gtcagcaaca aaacagccac tcttcatagt  1320

ccttatacat tcaatgcctt cactcggcca ggtagtatcc cttgccaggc ttcagcaaga  1380

tgccccaacc cgtgtgttac tggagtctat acagatccat atcccctaat cttctataga  1440

aaccacacct tgcgaggggt attcgggaca atgcttgatg gtgtacaagc aagacttaac  1500

cctgcgtctg cagtattcga tagcacatcc cgcagtcgca ttactcgagt gagttcaagc  1560

agtaccaaag cagcatacac aacatcaact tgttttaaag tggtcaagac taataagacc  1620

tattgtctca gcattgctga aatatctaat actctcttcg gagaattcag aatcgtcccg  1680

ttactagttg agatcctcaa agatgacggg gttagagaag ccaggtctgg ctag        1734

<210>20

<211>577

<212>PRT

<213>新城疫病毒

<400>20

Met Asp Arg Ala Val Ser Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu

1               5                   10                  15

Ala Lys Asn Thr Trp Arg Leu Ile Phe Arg Ile Ala Ile Leu Phe Leu

            20                  25                  30

Thr Val Val Thr Leu Ala Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Met

        35                  40                  45

Gly Ala Ser Thr Pro Ser Asp Leu Val Gly Ile Pro Thr Arg Ile Ser

    50                  55                  60

Arg Ala Glu Glu Lys Ile Thr Ser Thr Leu Gly Ser Asn Gln Asp Val

65                  70                  75                  80

Val Asp Arp Ile Tyr Lys Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu

                85                  90                  95

Leu Lys Thr Glu Thr Thr Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr

            100                 105                 110

Gln Ile Asn Gly Ala Ala Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His

        115                 120                 125

Asp Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp

    130                 135                 140

Ala Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His Leu

145                 150                 155                 160

Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile Pro

                165                 170                 175

Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val Ile

            180                 185                 190

Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala Leu

        195                 200                 205

Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Gly Val Phe Phe Ser Thr Leu

    210                 215                 220

Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser Val

225                 230                 235                 240

ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr Glu

                245                 250                 255

Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val His

            260                 265                 270

Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp Val

        275                 280                 285

Thr Thr Leu Phe Gly Asn Trp Val Ala Asn Tyr Prn Gly Val Gly Gly

    290                 295                 300

Gly Ser Phe Ile Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly Leu

305                 310                 315                 320

Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gln Glu Gly Lys Tyr Val Ile

                325                 330                 335

Tyr Lys Gln Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln Ile

            340                 345                 350

Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys Arg

        355                 360                 365

Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly Glu

    370                 375                 380

Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly Ala

385                 390                 395                 400

Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln Arg

                405                 410                 415

Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val Ser

            420                 425                 430

Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe Thr

        435                 440                 445

Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Ara Cys Pro Asn Pro

    450                 455                 460

Cys Val Thr Gly Val Tyr Thr Asp Pro Tyr Pro Leu Ile Phe Tyr Arg

465                 470                 475                 480

Asn His Thr Leu Arg Gly Val Phe Gly Thr Met Leu Asn Gly Val Gln

                485                 490                 495

Ala Arg Leu Asn Pro Ala Ser Ala Val Phe Asp Ser Thr Ser Arg Ser

            500                 505                 510

Arg Ile Thr Arg Val Ser Ser Ser Ser Thr Lys Ala Ala Tyr Thr Thr

        515                 520                 525

Ser Thr Cys Phe Lys Val Val Lys Thr Asn Lys Thr Tyr Cys Leu Ser

    530                 535                 540

Ile Ala Glu Ile Ser Asn Thr Leu Phe Gly Glu Phe Arg Ile Val Pro

545                 550                 555                 560

Leu Leu Val Glu Ile Leu Lys Asp Asp Gly Val Arg Glu Ala Arg Ser

                565                 570                 575

Gly

<210>21

<211>1377

<212>DNA

<213>原鸡

<400>21

atgctgggtg agctggaagc aggcgggatg caaggcggcc gcgtggtgct ggggctcctg    60

tgctgcttgg tggccggggt gggctcctac acgccctggg acatctcctg ggcagcacga   120

ggggacccct ctgcctggtc ctggggggcc gaggcgcact cacgggccgt ggccggctcg   180

cacccggtgg ccgtgcagtg ccaagaggcg cagctggtgg tgacggtgca cagggacctc   240

ttcgggaccg ggcgtctcat caacgctgct gacctgactc tgggcccggc tgcctgcaag   300

cactcctcgc tcaacgccgc acacaacacc gtcaccttcg ccgccggcct ccacgagtgc   360

ggcagcgtcg tgcaggtgac gccagacacc ctcatctacc gcacgctcat caactacgac   420

cccagccctg ctagcaaccc cgtcatcatc cgcaccaacc ctgctgtcat ccccatcgag   480

tgccactacc ccaggaggga gaacgtgagc agcaatgcca tccggcccac ctggtccccc   540

ttcaactccg cactgtcagc cgaggagagg ctggtgttct ccctgcgcct catgagtgat   600

gactggagca cagagagacc cttcaccggc ttccagctgg gcgacatcct caacatccag   660

gccgaggtca gcactgagaa ccatgtgccc ctgcggctct ttgtggacag ctgtgtggct   720

gccctgagcc ctgacggtga ctcctcgccc cactacgcca tcattgactt caacgggtgc   780

ttagtggatg ggagagtgga tgatactagc tctgccttca tcacaccccg gccacgggag   840

gatgtgctga ggttcaggat cgatgtcttc aggtttgcgg gggacaacag gaacctgatc   900

tacatcacct gccacctgaa ggtgacccca gcagaccaag gcccagaccc tcagaacaag   960

gcttgctcct tcaataaagc cagaaacacc tgggtgccag tggaaggcag ccgggatgtc  1020

tgcaactgct gtgagacagg caactgcgag ccgcctgcgc tctcccggag gctcaacccc  1080

atggagagat ggcagagccg ccgcttccgt cgtgatgccg ggaaagaggt tgcagctgat  1140

gtggtcattg gccccgtgtt gctctcggcg gacccgggag ctgtgggaca gcaggaggag  1200

ggtggtgacg gtgcggcggt gatggtgccc agcgtgggga cggggctggt gtgcgtggcc  1260

gtggctgtag ctctggctgc cgttggggtg gctgtatgta ttgcacgcaa gggatgcacc  1320

cgaacctcaa ctgcggtgtg agtgcagggc gagccgtgaa taaagcctgg aaaggcc     1377

<210>22

<211>446

<212>PRT

<213>原鸡

<400>22

Met Leu Gly Glu Leu Glu Ala Gly Gly Met Gln Gly Gly Arp Val Val

1               5                   10                  15

Leu Gly Leu Leu Cys Cys Leu Val Ala Gly Val Gly Ser Tyr Thr Pro

            20                  25                  30

Trp Asp Ile Ser Trp Ala Ala Arg Gly Asp Pro Ser Ala Trp Ser Trp

        35                  40                  45

Gly Ala Glu Ala His Ser Arg Ala Val Ala Gly Ser His Pro Val Ala

    50                  55                  60

Val Gln Cys Gln Glu Ala Gln Leu Val Val Thr Val His Arg Asp Leu

65                  70                  75                  80

Phe Gly Thr Gly Arg Leu Ile Asn Ala Ala Asp Leu Thr Leu Gly Pro

                85                  90                  95

Ala Ala Cys Lys His Ser Ser Leu Asn Ala Ala His Asn Thr Val Thr

            100                 105                 110

Phe Ala Ala Gly Leu His Glu Cys Gly Ser Val Val Gln Val Thr Pro

        115                 120                 125

Asp Thr Leu Ile Tyr Arg Thr Leu Ile Asn Tyr Asp Pro Ser Pro Ala

    130                 135                 140

Ser Asn Pro Val Ile Ile Arg Thr Asn Pro Ala Val Ile Pro Ile Glu

145                 150                 155                 160

Cys His Tyr Pro Arg Arg Glu Asn Val Ser Ser Asn Ala Ile Arg Pro

                165                 170                 175

Thr Trp Ser Pro Phe Asn Ser Ala Leu Ser Ala Glu Glu Arg Leu Val

            180                 185                 190

Phe Ser Leu Arg Leu Met Ser Asp Asp Trp Ser Thr Glu Arg Pro Phe

        195                 200                 205

Thr Gly Phe Gln Leu Gly Asp Ile Leu Asn Ile Gln Ala Glu Val Ser

    210                 215                 220

Thr Glu Asn His Val Pro Leu Arg Leu Phe Val Asp Ser Cys Val Ala

225                 230                 235                 240

Ala Leu Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Pro His Tyr Ala Ile Ile Asp

                245                 250                 255

Phe Asn Gly Cys Leu Val Asp Gly Arg Val Asp Asp Thr Ser Ser Ala

            260                 265                 270

Phe Ile Thr Pro Arg Pro Arg Glu Asp Val Leu Arg Phe Arg Ile Asp

        275                 280                 285

Val Phe Arg Phe Ala Gly Asp Asn Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Cys

    290                 295                 300

His Leu Lys Val Thr Pro Ala Asp Gln Gly Pro Asp Pro Gln Asn Lys

305                 310                 315                 320

Ala Cys Ser Phe Asn Lys Ala Arg Asn Thr Tro Val Pro Val Glu Gly

                325                 330                 335

Ser Arg Asp Val Cys Asn Cys Cys Glu Thr Gly Asn Cys Glu Pro Pro

            340                 345                 350

Ala Leu Ser Arg Arg Leu Asn Pro Met Glu Arg Trp Gln Ser Arg Arg

        355                 360                 365

Phe Arg Arg Asn Ala Gly Lys Glu Val Ala Ala Asp Val Val Ile Gly

    370                 375                 380

Pro Val Leu Leu Ser Ala Asp Pro Gly Ala Val Gly Gln Gln Glu Glu

385                 390                 395                 400

Gly Gly Asp Gly Ala Ala Val Met Val Pro Ser Val Gly Thr Gly Leu

                405                 410                 415

Val Cys Val Ala Val Ala Val Ala Leu Ala Ala Val Gly Val Ala Val

            420                 425                 430

Cys Ile Ala Arg Lys Gly Cys Thr Arg Thr Ser Thr Ala Val

        435                 440                 445

<210>23

<211>3024

<212>DNA

<213>鸭属物种

<400>23

catgcacacc tgaaagctta tgcaaagatt aacgaggaat cactggatag ggctaggaga    60

ttgctttggt ggcattacaa ttgtttactg tggggagaag ctaacgttac taattatatt   120

tctcggcttc gcacttggct atcaacacct gagagataca gaggccgaga tgccccaacc   180

attgaagcaa tcactagacc aatccaagtg gctcagggag gcagaaaaac atcttcgggt   240

actagaaaac ctcgtggact cgaacctaga agaagaaaag ttaaaaccac agttgtctat   300

gggagaagac gttcaaagtc cagggatagg agagcccctt caccccaacg tgcgggctcc   360

cctctcccgc gtagttcgag cagccacaga agatctccct cgcctaggaa atagattacc   420

tgctaggcat caccttggta aattgtcagg attatatcaa atgaagggat gtacatttaa   480

ccctgaatgg aaagtacctg atatttcgga tactcatttt gatatgcaaa tagtaaatga   540

gtgcccttcc cgaaattgga aatatctgac tccagccaaa ttctggccca agagcatttc   600

ctactttcct gtacaggcag gggttaaagc taagtaccct gacaatgtga tgcaacatga   660

atcaatagta ggtaaatatt taaccaggct ctatgaagca ggaatccttt ataagcggat   720

atctaaacat ttggtcacat ttaaaggtca gccttataat tgggaacttc aataccttgt   780

caagcaacat caagttcctg atgggtcaac aacctgcaaa atcaatggac gtgcggagaa   840

tcgaaggagg agaactcctg ctaaatcaat tagcaggccg catgatccca aaagggacag   900

tcacatggtc gggcaaattt ccaacaatag atcacatatt agaccatgtg caaacaatgg   960

aggaaataaa cactcttcaa aaccaagggg cttggcctgc tggggcggga aggagagcag  1020

gattaaccaa tcctgctcct caagagattc ctcagcccca gtggactccc gaagaagatc  1080

agaaagctcg cgaagctttt cgtcgttatc aagaagagag accaccagag accaccacaa  1140

ttcctcccac atctccaacg cagtggaaac tgcaacccgg ggacgatcca ctcctgggaa  1200

acaagtctct gctcgagact cacccgcttt accagaatac cgagccagcc gtgtctgtaa  1260

taaagactcc tccactgaga aagaaaatgt ctggtacctt cgggggaata ctagctggcc  1320

taatcggatt actggtaagc tttttcttgt tgataaaaat tctagaaata cttcggaggc  1380

tagattggtg gtggatttct ctcagttctc caaagggaaa aatgcaatgc gctttccaag  1440

atactggagc ccaaacctct ccacattacg tcggatcttg cccgtgggga tgcccaggat  1500

ttctctggac ttatctcagg ctttttatca tcttcctctt aatcctgcta gtagcagcag  1560

gcttgctgta tctgacggac aacgggtcta ctattttagg aaagctccga tgggagtcgg  1620

tcttagccct ttcctcctcc atctcttcac tactgccctc ggatccgaaa tcgctcgtcg  1680

ctttaatgtt tggactttta cttatatgga tgacttcctc ctctgccacc caaacgctcg  1740

tcaccttaac tcaattagcc acgctgtctg ctctttttta caagagctag gaataagaat  1800

aaactttgac aaaactactc catcaccagt caacgaaatt agattcctcg gttatcaaat  1860

tgatcaacga ttcatgaaga ttgaagaaag cagatggaaa gaattacgga ctgtaattaa  1920

aaagataaaa attggagaat ggtatgactg gaaatgtatt cagagatttg tcgggcattt  1980

aaactttgtg ttgccattta ccaaaggtaa catagaaatg ttaaaaccaa tgtatgctgc  2040

tataactcat aaagtcaatt ttagcttctc ttctgcctat aggactttgc tgtacaaatt  2100

aactatgggt gtttgtaaat tatcaatcaa accaaagtcc tctgtacctt tgccacgtgt  2160

agctacggat gctaccccaa cacatggcgc aatatcccat atcaccggcg ggagcgcagt  2220

gtttgctttt tcaaaggtca gagatataca tatacaggaa ttgctgatgg tatgtttagc  2280

taaattaatg attaagccta gatgcatact aaccgattct acctttgttt gtcacaaacg  2340

ttatcagacg ttaccatgga attttgcagt gtttgccaaa caattgttat cttctatacc  2400

attgtacttt gtaccgagca aatataatcc tgctgacggc ccatccaggc acaaaccgcc  2460

tgattggacg gctgttacat acacccctct ctcgaaagca atatatattc cacataggct  2520

atgtggaact taagaattac acccctctcc ttcggagctg cctgccaagg tatctttacg  2580

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tgcttatata tggatatcaa tgcttctaga gccttagcca atgtttatga tttgccagat  2700

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tggagatcag attcaataaa gaaacatgtt ttaattgcaa ctcactttgt ggatcttatt  2820

gaagacttct ggcaaactac tcagggtatg catgaaatag ctgaagcctt aagagcagtt  2880

ataccaccta ctacaacacc agttcccgca ggatatctga ttcagcacga agaggctgag  2940

gagattcctc tgggagattt atttaaacat caggaagaaa ggatagttag tttccaaccg  3000

gattatccta ttactgcacg aatt                                         3024

<210>24

<211>10575

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pCHA载体序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(8466)..(8467)

<223>n is a，c，g或t

<400>24

ggccgcaaca gaggtggatg gacagacccg ttcttacacc ggactgggcg cgggatagga      60

tattcagatt gggatgggat tgagcttaaa gccggcgctg agaccatgct caaggtaggc     120

aatgtcctca gcgtcgagcc cggcatctat gtcgagggca ttggtggagc gcgcttcggg     180

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gatatttgac gcatttatta gtatgtgtta attttcattt gcagtgcagt attttctatt     300

cgatctttat gtaattcgtt acaattaata aatattcaaa tcagattattgactgtcatt      360

tgtatcaaat cgtgtttaat ggatattttt attataatat tgatgatatc tcaatcaaaa     420

cgtagataat aataatattt atttaatatt tttgcgtcgc acagtgaaaa tctatatgag     480

attacaaaat accgacaaca ttatttaaga tacatagaca ttaaccctga gactgttgga     540

cagagctcat tggtacctca gatctgggta actggcctaa ctggccttgg aggagctggc     600

aactcaaaat ccctttgcca aaaaccaaca tcatgccatc caccatgctt gtatccagct     660

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tttggaaggc ctataacagc aaccacagac ttaaaacctt gcgcctccat agacttaagc     780

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agatcatcaa tccactcttg tggtgtttgt ggctctgtcc taaagttcac tgtagacgtc    1020

tcaatgtaat ggttaacgat atcacaaacc gcggccatat cagctgctgt agctggccta    1080

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tctgaagttg tatcctcagt acttcaaaga aaatagctta caccaatttt ttcttgtttt    1200

cacaaatgcc gaacttggtt ccttatatag gaaaactcaa gggcaaaaat gacacggaaa    1260

aatataaaag gataagtagt gggggataag attcctttgt gataaggtta ctttccgccc    1320

ttacattttc caccttacat gtgtcctcta tgtctctttc acaatcaccg accttatctt    1380

cttcttttca ttgttgtcgt cagtgcttac gtcttcaaga ttcttttctt cgcctggttc    1440

ttctttttca atttctacgt attcttcttc gtattctggc agtataggat cttgtatctg    1500

tacattcttc atttttgaac ataggttgca tatgtgccgc atattgatct gcttcttgct    1560

gagctcacat aatacttcca tagtttttcc cgtaaacattggattcttga tgctacatct     1620

tggataatta ccttctggcc ggccgcgaat tcgcttcaag acgtgctcaa atcactattt    1680

ccacacccct atatttctat tgcactccct tttaactgtt ttttattaca aaaatgccct  1740

ggaaaatgca ctcccttttt gtgtttgtta tttagtgaaa cgatgttgtc aggtaattta  1800

tttgtcagtc tactatggtg gcccattata ttaatagcaa ctgtcggtcc aatagacgac  1860

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

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<220>

<221> misc_特征

<222>(8568)..(8569)

<223>n is a，c，g或t

<400>25

ggccgcaaca gaggtggatg gacagacccg ttcttacacc ggactgggcg cgggatagga     60

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gcgcgcaatg taccccgggc tgtgtatccc aaagcctcat gcaacctaac agatggatcg    720

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aaatgtgtgt acaatgtgga tcctaggccc aacctttgat gcctatgtga cacgtaaaca    840

gtactctcaa ctgtccaatc gtaagcgttc ctagccttcc agggcccagc gtaagcaata    900

ccagccacaa caccctcaac ctcagcaacc aaccaagggt atctatcttg caacctctct    960

agatcatcaa tccactcttg tggtgtttgt ggctctgtcc taaagttcac tgtagacgtc   1020

tcaatgtaat ggttaacgat atcacaaacc gcggccatat cagctgctgt agctggccta   1080

atctcaactg gtctcctctc cggagaagcc atggtttgga tccacaaact tacaaatttc  1140

tctgaagttg tatcctcagt acttcaaaga aaatagctta caccaatttt ttcttgtttt  1200

cacaaatgcc gaacttggtt ccttatatag gaaaactcaa gggcaaaaat gacacggaaa  1260

aatataaaag gataagtagt gggggataag attcctttgt gataaggtta ctttccgccc  1320

ttacattttc caccttacat gtgtcctcta tgtctctttc acaatcaccg accttatctt  1380

cttcttttca ttgttgtcgt cagtgcttac gtcttcaaga ttcttttctt cgcctggttc  1440

ttctttttca atttctacgt attcttcttc gtattctggc agtataggat cttgtatctg  1500

tacattcttc atttttgaac ataggttgca tatgtgccgc atattgatct gcttcttgct  1560

gagctcacat aatacttcca tagtttttcc cgtaaacatt ggattcttga tgctacatct  1520

tggataatta ccttctggcc ggccgcgaat tcgcttcaag acgtgctcaa atcactattt  1580

ccacacccct atatttctat tgcactccct tttaactgtt ttttattaca aaaatgccct  1740

ggaaaatgca ctcccttttt gtgtttgtta tttagtgaaa cgatgttgtc aggtaattta  1800

tttgtcagtc tactatggtg gcccattata ttaatagcaa ctgtcggtcc aatagacgac  1850

gtcgattttc tgcatttgtt taaccacgtg gattttatga cattttatat tagttaattt  1920

gtaaaaccta cccaattaaa gacctcatat gttctaaaga ctaatactta atgataacaa  1980

ttttctttta gtgaagaaag ggataattag taaatatgga acaagggcag aagatttatt  2040

aaagccggta agagacaaca acgtaggtac gtggagtgtc ttaggtgact tacccacata  2100

acataaagtg acattaacaa acatagctaa tgctcctatt tgaatagtgc atatcagcat  2160

accttattac atatagatag gagcaaactc tagctagatt gttgagagag ctcggtaccg  2220

gatccgaaga cttaacctga tcttgcttca cgtacaccat catctttcag aatctccacc  2280

aaaagtggaa caattctgaa ttccccaaag agagtgttag aaatctcagc tatgctcaga  2340

caataggtct tgttcgtctt tacaactttg aaacatgtgg aggtagtgta tgctgcctta  2400

gtagaactag aggaaactct ggttatcctt gatctggatg tagaatcaaa cacagcagag  2460

gcaggattca acctagcttg aacaccatct aacattgttc caaacacccc tctcaaggta  2520

tgattacggt agaagatcaa agggtaagga tcagtgtaaa ctccagtcac acacgaattc  2580

ggacatctag ctgaagcttg gcaaggaatc gatccaggtc ttgtaaaggc attgaaagta  2640

tatggtgaat gtaatgtagc tgtcttgttg ctcacagtca ttggatacag taacgctggg  2700

ctaaagtagg aacttccacg ttgatagaga aagtggctag taccaacagt aagaatcctt  2760

ccctcagctc ccatcaatgt tacagtgttt ggtggaacag taaggactgg atcttctccc  2820

aatgatgtgc taaccttgat actgagaata gcttgttgta tcctcttacc tccaaatctt  2880

cctggtttgt atgatgactt agccattcga atctgatagt cttgctcatc aggacaagta  2940

tcattgtacc tcttgtagat aacatacttt ccctcttgca cagtatcact aggactgtta  3000

ggtttcaaac caccatagac agagaaccag actctggagt caatgaagct accacctcca  3060

actcctggat agttagctac ccaatcccca aacaatgtag tgacatccaa atctttctca  3120

tggtattgac catcaaaacc caatctgcca tgcaccatcc ttgtagggac tgcagaattg  3180

tagtcctctt cttcagtttc tgttacttta ctgcatagca tatcacagcc caaaggtgta  3240

gcagatacag agcaactttt gcgattctgt gtatcatcaa gattgatact gcgaagagtt  3300

gagaagaaca ctctaccagt agcagatgta cgaagaactc caagtgctaa gtactgataa  3360

gagtgagaat ggtcacgaca gccagataga atgacattgt gtgtatagca atagtgtgta  3420

gcactcatgt caaatgaggg tatccgagtg cacccactcc cagttgtggg tgcaggaatg  3480

aagttcagat gttcctggaa agctgaagga tagaaagatg taacatctga agcatcatct  3540

acaatgagtt ctttgccaat acctccaatg tagtctggat catgaattgg ggctccccaa  3600

cctgaattgt tggcagcccc attgatctga taggataggc tggtgattgc attcatgatg  3660

gtagtttctg tgttgagtaa tgcaagtgga ctttcaagtg caacttgttt gtagattcgg  3720

tccacaacat cctggttgga gcctagggta ctggtaatct tctcttcagc cctagagatt  3780

cgtgtgggta tgccaactaa gtctgagggg gtgcttgctc ccatagaata gagtaatgat  3840

gcaacagaga ttgctagggt gacaacagta agaaagagaa tggctatccg aaagataagc  3900

ctccaagtgt tcttggcttc cctctcatca ttctcaagag ccacttgtga aactgctcgg  3960

tccatggttt ggatccgcga tttggtgtat cgagattggt tatgaaattc agatgctagt  4020

gtaatgtatt ggtaatttgg gaagatataa taggaagcaa ggctatttat ccatttctga  4080

aaaggcgaaa tggcgtcacc gcgagcgtca cgctctagtc gaccatgtac gtaagcgctt  4140

acgtttttgg tggaccccct cgaccatgta cgtaagcgct tacgtttttg gtggaccccc  4200

tcgaccatgt acgtaagcgc ttacgttttt ggtggacccc ctcgaccatg tacgtaagcg  4260

cttacgtttt tggtggaccc cctcgacgga tcccccctcg accctagacg tatctattca  4320

aaagtcgtta atggctgcgg atcaagaaaa agttggaata gaaacagaat acccgcgaaa  4380

ttcaggcccg gttgccatgt cctacacgcc gaaataaacg accaaattag tagaaaaata  4440

aaaactagct cagatactta cgtcacgtct tgcgcactga tttgaaaaat ctcaatataa  4500

acaaagacgg ccacaagaaa aaaccaaaac accgatattc attaatctta tctagtttct  4560

caaaaaaatt catatcttcc acaccctcga gatctagata aacttaatta agcggccgat  4620

ccggtgagta atattgtacg gctaagagcg aatttggcct gtagacctca attgcgagct  4680

ttctaatttc aaactattcg ggcctaactt ttggtgtgat gatgctgact ggcaggatat  4740

ataccgttgt aatttgagct cgtgtgaata agtcgctgtg tatgtttgtt tgattgtttc  4800

tgttggagtg cagcccattt caccggacaa gtcggctaga ttgatttagc cctgatgaac  4860

tgccgagggg aagccatctt gagcgcggaa tgggaatgga tcgaaccggg agcacaggat  4920

gacgcctaac aattcattca agccgacacc gcttcgcggc gcggcttaat tcaggagtta  4980

aacatcatga gggaagcggt gatcgccgaa gtatcgactc aactatcaga ggtagttggc  5040

gtcatcgagc gccatctcga accgacgttg ctggccgtac atttgtacgg ctccgcagtg  5100

gatggcggcc tgaagccaca cagtgatatt gatttgctgg ttacggtgac cgtaaggctt  5160

gatgaaacaa cgcggcgagc tttgatcaac gaccttttgg aaacttcggc ttcccctgga  5220

gagagcgaga ttctccgcgc tgtagaagtc accattgttg tgcacgacga catcattccg  5280

tggcgttatc cagctaagcg cgaactgcaa tttggagaat ggcagcgcaa tgacattctt  5340

gcaggtatct tcgagccagc cacgatcgac attgatctgg ctatcttgct gacaaaagca  5400

agagaacata gcgttgcctt ggtaggtcca gcggcggagg aactctttga tccggttcct  5460

gaacaggatc tatttgaggc gctaaatgaa accttaacgc tatggaactc gccgcccgac  5520

tgggctggcg atgagcgaaa tgtagtgctt acgttgtccc gcatttggta cagcgcagta  5580

accggcaaaa tcgcgccgaa ggatgtcgct gccgactggg caatggagcg cctgccggcc  5640

cagtatcagc ccgtcatact tgaagctagg caggcttatc ttggacaaga agatcgcttg  5700

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gtagtcggca aataatgtct aacaattcgt tcaagccgac gccgcttcgc ggcgcggctt  5820

aactcaagcg ttagagagct ggggaagact atgcgcgatc tgttgaaggt ggttctaagc  5880

ctcgtacttg cgatggcatt tcgatcgaaa ggggtacaaa ttcccactaa gcgctcgggg  5940

gctgagaaag cccagtaagg aaacaactgt aggttcgagt cgcgagatcc cccggaacca  6000

aaggaagtag gttaaacccg ctccgatcag gccgagccac gccaggccga gaacattggt  6060

tcctgtaggc atcgggattg gcggatcaaa cactaaagct actggaacga gcagaagtcc  6120

tccggccgcc agttgccagg ccgtaaaggt gagcagaggc acgggaggtt gccacttgcg  6180

ggtcagcacg gttccgaacg ccatggaaac cgcccccgcc aggcccgctg cgacgccgac  6240

aggatctagc gctgcgtttg gtgtcaacac caacagcgcc acgcccgcag ttccgcaaat  6300

agcccccagg accgccatca atcgtatcgg gctacctagc agagcggcag agatgaacac  6360

gaccatcagc ggctgcacag cgcctaccgt cgccgcgacc cgcccggcag gcggtagacc  6420

gaaataaaca acaagctcca gaatagcgaa atattaagtg cgccgaggat gaagatgcgc  6480

atccaccaga ttcccgttgg aatctgtcgg acgatcatca cgagcaataa acccgccggc  6540

aacgcccgca gcagcatacc ggcgacccct cggcctcgct gttcgggctc cacgaaaacg  6600

ccggacagat gcgccttgtg agcgtccttg gggccgtcct cctgtttgaa gaccgacagc  6660

ccaatgatct cgccgtcgat gtaggcgccg aatgccacgg catctcgcaa ccgttcagcg  6720

aacgcctcca tgggcttttt ctcctcgtgc tcgtaaacgg acccgaacat ctctggagct  6780

ttcttcaggg ccgacaatcg gatctcgcgg aaatcctgca cgtcggccgc tccaagccgt  6840

cgaatctgag ccttaatcac aattgtcaat tttaatcctc tgtttatcgg cagttcgtag  6900

agcgcgccgt gcgcccgagc gatactgagc gaagcaagtg cgtcgagcag tgcccgcttg  6960

ttcctgaaat gccagtaaag cgctggctgc tgaaccccca gccggaactg accccacaag  7020

gccctagcgt ttgcaatgca ccaggtcatc attgacccag gcgtgttcca ccaggccgct  7080

gcctcgcaac tcttcgcagg cttcgccgac ctgctcgcgc cacttcttca cgcgggtgga  7140

atccgatccg cacatgaggc ggaaggtttc cagcttgagc gggtacggct cccggtgcga  7200

gctgaaatag tcgaacatcc gtcgggccgt cggcgacagc ttgcggtact tctcccatat  7260

gaatttcgtg tagtggtcgc cagcaaacag cacgacgatt tcctcgtcga tcaggacctg  7320

gcaacgggac gttttcttgc cacggtccag gacgcggaag cggtgcagca gcgacaccga  7380

ttccaggtgc ccaacgcggt cggacgtgaa gcccatcgcc gtcgcctgta ggcgcgacag  7440

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ctcgtagaac gtgaaggtga tcggctcgcc gataggggtg cgcttcgcgt actccaacac  7560

ctgctgccac accagttcgt catcgtcggc ccgcagctcg acgccggtgt aggtgatctt  7620

cacgtccttg ttgacgtgga aaatgacctt gttttgcagc gcctcgcgcg ggattttctt  7680

gttgcgcgtg gtgaacaggg cagagcgggc cgtgtcgttt ggcatcgctc gcatcgtgtc  7740

cggccacggc gcaatatcga acaaggaaag ctgcatttcc ttgatctgct gcttcgtgtg  7800

tttcagcaac gcggcctgct tggcctcgct gacctgtttt gccaggtcct cgccggcggt  7860

ttttcgcttc ttggtcgtca tagttcctcg cgtgtcgatg gtcatcgact tcgccaaacc  7920

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agggggagcc agttgcacgc tgtcgcgctc gatcttggcc gtagcttgct ggaccatcga  8040

gccgacggac tggaaggttt cgcggggcgc acgcatgacg gtgcggcttg cgatggtttc  8100

ggcatcctcg gcggaaaacc ccgcgtcgat cagttcttgc ctgtatgcct tccggtcaaa  8160

cgtccgattc attcaccctc cttgcgggat tgccccgact cacgccgggg caatgtgccc  8220

ttattcctga tttgacccgc ctggtgcctt ggtgtccaga taatccacct tatcggcaat  8280

gaagtcggtc ccgtagaccg tctggccgtc cttctcgtac ttggtattcc gaatcttgcc  8340

ctgcacgaat accagcgacc ccttgcccaa atacttgccg tgggcctcgg cctgagagcc  8400

aaaacacttg atgcggaaga agtcggtgcg ctcctgcttg tcgccggcat cgttgcgcca  8460

ctcttcatta accgctatat cgaaaattgc ttgcggcttg ttagaattgc catgacgtac  8520

ctcggtgtca cgggtaagat taccgataaa ctggaactga ttatggcnnc tcgaaattcc  8580

ctcggtcttg ccttgctcgt cggtgatgta cttcaccagc tccgcgaagt cgctcttctt  8640

gatggagcgc atggggacgt gcttggcaat cacgcgcacc ccccggccgt tttagcggct  8700

aaaaaagtca tggctctgcc ctcgggcgga ccacgcccat catgaccttg ccaagctcgt  8760

cctgcttctc ttcgatcttc gccagcaggg cgaggatcgt ggcatcaccg aaccgcgccg  8820

tgcgcgggtc gtcggtgagc cagagtttca gcaggccgcc caggcggccc aggtcgccat  8880

tgatgcgggc cagctcgcgg acgtgctcat agtccacgac gcccgtgatt ttgtagccct  8940

ggccgacggc cagcaggtag gccgacaggc tcatgccggc cgccgccgcc ttttcctcaa  9000

tcgctcttcg ttcgtctgga aggcagtaca ccttgatagg tgggctgccc ttcctggttg  9060

gcttggtttc atcagccatc cgcttgccct catctgttac gccggcggta gccggccagc  9120

ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg ccaggtgcga ataagggaca gtgaagaagg  9180

aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac ctatcctgcc cggctgacgc cgttggatac  9240

accaaggaaa gtctacacga accctttggc aaaatcctgt atatcgtgcg aaaaaggatg  9300

gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc cgaagcaggg ttatgcagcg gaaaagatcc  9360

gtcgaccctt tccgacgctc accgggctgg ttgccctcgc cgctgggctg gcggccgtct  9420

atggccctgc aaacgcgcca gaaacgccgt cgaagccgtg tgcgagacac cgcggccgcc  9480

ggcgttgtgg ataccacgcg gaaaacttgg ccctcactga cagatgaggg gcggacgttg  9540

acacttgagg ggccgactca cccggcgcgg cgttgacaga tgaggggcag gctcgatttc  9600

ggccggcgac gtggagctgg ccagcctcgc aaatcggcga aaacgcctga ttttacgcga  9660

gtttcccaca gatgatgtgg acaagcctgg ggataagtgc cctgcggtat tgacacttga  9720

ggggcgcgac tactgacaga tgaggggcgc gatccttgac acttgagggg cagagtgatg  9780

acagatgagg ggcgcaccta ttgacatttg aggggctgtc cacaggcaga aaatccagca  9840

tttgcaaggg tttccgcccg tttttcggcc accgctaacc tgtcttttaa cctgctttta  9900

aaccaatatt tataaacctt gtttttaacc agggctgcgc cctggcgcgt gaccgcgcac  9960

gccgaagggg ggtgcccccc cttctcgaac cctcccggcc cgctaacgcg ggcctcccat 10020

ccccccaggg gctgcgcccc tcggccgcga acggcctcac cccaaaaatg gcaggccaag 10080

ctagcttgct tggtcgttcc ggtacgtacc gtgaacgtcg gctcgattgt acctgcgttc 10140

aaatactttg cgatcgtgtt gcgcgcctgc ccggtgcgtc ggctgatctc acggatcgac 10200

tgcttctctc gcaacgccat ccgacggatg atgtttaaaa gtcccatgtg gatcactccg 10260

ttgccccgtc gctcaccgtg ttggggggaa ggtgcacatg gctcagttct caatggaaat 10320

tatctgccta accggctcag ttctgcgtag aaaccaacat gcaagctcca ccgggtgcaa 10380

agcggcagcg gcggcaggat atattcaatt gtaaatggct tcatgtccgg gaaatctaca 10440

tggatcagca atgagtatga tggtcaatat ggagaaaaag aaagagtaat taccaatttt 10500

ttttcaattc aaaaatgtag atgtccgcag cgttattata aaatgaaagt acattttgat 10560

aaaacgacaa attacgatcc gtcgtattta taggcgaaag caataaacaa attattctaa 10620

ttcggaaatc tttatttcga cgtgtctaca ttcacgtcca aatgggggcg gcgaatt    10677

<210>26

<211>10603

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pCHN载体序列

<220>

<221>misc_特征

<222>(8828)..(8829)

<223>n is a，c，g或t

<400>26

tgcgtagaaa ccaacatgca agctccaccg ggtgcaaagc ggcagcggcg gcaggatata    60

ttcaattgta aatggcttca tgtccgggaa atctacatgg atcagcaatg agtatgatgg   120

tcaatatgga gaaaaagaaa gagtaattac caattttttt tcaattcaaa aatgtagatg   180

tccgcagcgt tattataaaa tgaaagtaca ttttgataaa acgacaaatt acgatccgtc   240

gtatttatag gcgaaagcaa taaacaaatt attctaattc ggaaatcttt atttcgacgt   300

gtctacattc acgtccaaat gggggcggcg aattggccgc aacagaggtg gatggacaga   360

cccgttctta caccggactg ggcgcgggat aggatattca gattgggatg ggattgagct   420

taaagccggc gctgagacca tgctcaaggt aggcaatgtc ctcagcgtcg agcccggcat   480

ctatgtcgag ggcattggtg gagcgcgctt cggggatacc gtgcttgtaa ctgagaccgg   540

atatgaggcc ctcactccgc ttgatcttgg caaagatatt tgacgcattt attagtatgt   600

gttaattttc atttgcagtg cagtattttc tattcgatct ttatgtaatt cgttacaatt   660

aataaatatt caaatcagat tattgactgt catttgtatc aaatcgtgtt taatggatat   720

ttttattata atattgatga tatctcaatc aaaacgtaga taataataat atttatttaa   780

tatttttgcg tcgcacagtg aaaatctata tgagattaca aaataccgac aacattattt   840

aagatacata gacattaacc ctgagactgt tggacagagc tcattggtac ctcagatctg   g00

ggtaactggc ctaactggcc ttggaggagc tggcaactca aaatcccttt gccaaaaacc   960

aacatcatgc catccaccat gcttgtatcc agctgcgcgc aatgtacccc gggctgtgta  1020

tcccaaagcc tcatgcaacc taacagatgg atcgtttgga aggcctataa cagcaaccac  1080

agacttaaaa ccttgcgcct ccatagactt aagcaaatgt gtgtacaatg tggatcctag  1140

gcccaacctt tgatgcctat gtgacacgta aacagtactc tcaactgtcc aatcgtaagc  1200

gttcctagcc ttccagggcc cagcgtaagc aataccagcc acaacaccct caacctcagc  1260

aaccaaccaa gggtatctat cttgcaacct ctctagatca tcaatccact cttgtggtgt  1320

ttgtggctct gtcctaaagt tcactgtaga cgtctcaatg taatggttaa cgatatcaca  1380

aaccgcggcc atatcagctg ctgtagctgg cctaatctca actggtctcc tctccggaga  1440

agccatggtt tggatccaca aacttacaaa tttctctgaa gttgtatcct cagtacttca  1500

aagaaaatag cttacaccaa attttttctt gttttcacaa atgccgaact tggttcctta  1560

tataggaaaa ctcaagggca aaaatgacac ggaaaaatat aaaaggataa gtagtggggg  1620

ataagattcc tttgtgataa ggttactttc cgcccttaca ttttccacct tacatgtgtc  1680

ctctatgtct ctttcacaat caccgacctt atcttcttct tttcattgtt gtcgtcagtg  1740

cttacgtctt caagattctt ttcttcgcct ggttcttctt tttcaatttc tacgtattct  1800

tcttcgtatt ctggcagtat aggatcttgt atctgtacat tcttcatttt tgaacatagg  1860

ttgcatatgt gccgcatatt gatctgcttc ttgctgagct cacataatac ttccatagtt  1920

tttcccgtaa acattggatt cttgatgcta catcttggat aattaccttc tggccggccg  1980

cgaattcgct tcaagacgtg ctcaaatcac tatttccaca cccctatatt tctattgcac  2040

tcccttttaa ctgtttttta ttacaaaaat gccctggaaa atgcactccc tttttgtgtt  2100

tgttatttag tgaaacgatg ttgtcaggta atttatttgt cagtctacta tggtggccca  2160

ttatattaat agcaactgtc ggtccaatag acgacgtcga ttttctgcat ttgtttaacc  2220

acgtggattt tatgacattt tatattagtt aatttgtaaa acctacccaa ttaaagacct  2280

catatgttct aaagactaat acttaatgat aacaattttc ttttagtgaa gaaagggata  2340

attagtaaat atggaacaag ggcagaagat ttattaaagc cggtaagaga caacaacgta  2400

ggtacgtgga gtgtcttagg tgacttaccc acataacata aagtgacatt aacaaacata  2460

gctaatgctc ctatttgaat agtgcatatc agcatacctt attacatata gataggagca  2520

aactctagct agattgttga gagagctcgg taccggatcc gaagacttaa cctgatcttg  2580

cttcacgtac accatcatct ttcagaatct ccaccaaaag tggaacaatt ctgaattccc  2640

caaagagagt gttagaaatc tcagctatgc tcagacaata ggtcttgttc gtctttacaa  2700

ctttgaaaca tgtggaggta gtgtatgctg ccttagtaga actagaggaa actctggtta  2760

tccttgatct ggatgtagaa tcaaacacag cagaggcagg attcaaccta gcttgaacac  2820

catctaacat tgttccaaac acccctctca aggtatgatt acggtagaag atcaaagggt  2880

aaggatcagt gtaaactcca gtcacacacg aattcggaca tctagctgaa gcttggcaag  2940

gaatcgatcc aggtcttgta aaggcattga aagtatatgg tgaatgtaat gtagctgtct  3000

tgttgctcac agtcattgga tacagtaacg ctgggctaaa gtaggaactt ccacgttgat  3060

agagaaagtg gctagtacca acagtaagaa tccttccctc agctcccatc aatgttacag  3120

tgtttggtgg aacagtaagg actggatctt ctcccaatga tgtgctaacc ttgatactga  3180

gaatagcttg ttgtatcctc ttacctccaa atcttcctgg tttgtatgat gacttagcca  3240

ttcgaatctg atagtcttgc tcatcaggac aagtatcatt gtacctcttg tagataacat  3300

actttccctc ttgcacagta tcactaggac tgttaggttt caaaccacca tagacagaga  3360

accagactct ggagtcaatg aagctaccac ctccaactcc tggatagtta gctacccaat  3420

ccccaaacaa tgtagtgaca tccaaatctt tctcatggta ttgaccatca aaacccaatc  3480

tgccatgcac catccttgta gggactgcag aattgtagtc ctcttcttca gtttctgtta  3540

ctttactgca tagcatatca cagcccaaag gtgtagcaga tacagagcaa cttttgcgat  3600

tctgtgtatc atcaagattg atactgcgaa gagttgagaa gaacactcta ccagtagcag  3660

atgtacgaag aactccaagt gctaagtact gataagagtg agaatggtca cgacagccag  3720

atagaatgac attgtgtgta tagcaatagt gtgtagcact catgtcaaat gagggtatcc  3780

gagtgcaccc actcccagtt gtgggtgcag gaatgaagtt cagatgttcc tggaaagctg  3840

aaggatagaa agatgtaaca tctgaagcat catctacaat gagttctttg ccaatacctc  3900

caatgtagtc tggatcatga attggggctc cccaacctga attgttggca gccccattga  3960

tctgatagga taggctggtg attgcattca tgatggtagt ttctgtgttg agtaatgcaa  4020

gtggactttc aagtgcaact tgtttgtaga ttcggtccac aacatcctgg ttggagccta  4080

gggtactggt aatcttctct tcagccctag agattcgtgt gggtatgcca actaagtctg  4140

agggggtgct tgctcccata gaatagagta atgatgcaac agagattgct agggtgacaa  4200

cagtaagaaa gagaatggct atccgaaaga taagcctcca agtgttcttg gcttccctct  4260

catcattctc aagagccact tgtgaaactg ctcggtccat ggtttggatc cacaaactta  4320

caaatttctc tgaagttgta tcctcagtac ttcaaagaaa atagcttaca ccaaattttt  4380

tcttgttttc acaaatgccg aacttggttc cttatatagg aaaactcaag ggcaaaaatg  4440

acacggaaaa atataaaagg ataagtagtg ggggataaga ttcctttgtg ataaggttac  4500

tttccgccct tacattttcc accttacatg tgtcctctat gtctctttca caatcaccga  4560

ccttatcttc ttcttttcat tgttgtcgtc agtgcttacg tcttcaagat tcttttcttc  4620

gcctggttct tctttttcaa tttctacgta ttcttcttcg tattctggca gtataggatc  4680

ttgtatctgt acattcttca tttttgaaca taggttgcat atgtgccgca tattgatctg  4740

cttcttgctg agctcacata atacttccat agtttttccc gtaaacattg gattcttgat  4800

gctacatctt ggataattac cttctggcgc gcctttgccc gggctttcct gcagggttta  4860

aacttaatta agcggccgat ccggtgagta atattgtacg gctaagagcg aatttggcct  4920

gtagacctca attgcgagct ttctaatttt aaactattcg ggtctaactt ttggtgtgat  4980

gatgctgact ggcaggatat ataccgttgt aatttgagct cgtgtgaata agtcgctgtg  5040

tatgtttgtt tgattgtttc tgttggagtg cagcccattt caccggacaa gtcggctaga  5100

ttgatttagc tctgatgaac tgccgagggg aagccatctt gagcgcggaa tgggaatgga  5160

tcgaaccggg agcacaggat gacgcctaac aattcattca agccgacacc gcttcgcggc  5220

gcggcttaat tcaggagtta aacatcatga gggaagcggt gatcgccgaa gtatcgactc  5280

aactatcaga ggtagttggc gtcatcgagc gccatcttga accgacgttg ctggccgtac  5340

atttgtacgg ctccgcagtg gatggcggcc tgaagccaca cagtgatatt gatttgctgg  5400

ttacggtgac cgtaaggctt gatgaaacaa cgcggcgagc tttgatcaac gaccttttgg  5460

aaacttcggc ttcccctgga gagagcgaga ttctctgcgc tgtagaagtc accattgttg  5520

tgcacgacga catcattccg tggcgttatc cagctaagcg cgaactgcaa tttggagaat  5580

ggcagcgcaa tgacattctt gcaggtatct tcgagccagc cacgatcgac attgatctgg  5640

ctatcttgct gacaaaagca agagaacata gcgttgcctt ggtaggtcca gcggcggagg  5700

aactctttga tccggttcct gaacaggatc tatttgaggc gctaaatgaa accttaacgc  5760

tatggaactc gccgcccgac tgggctggcg atgagcgaaa tgtagtgctt acgttgtccc  5820

gcatttggta cagcgcagta accggcaaaa tcgcgccgaa ggatgtcgct gccgactggg  5880

caatggagcg cctgccggcc cagtatcagc ccgtcatact tgaagctagg caggcttatc  5940

ttggacaaga agatcgcttg gcctcgcgcg cagatcagtt ggaagaattt gttcactacg  6000

tgaaaggcga gatcaccaag gtagtcggca aataatgtct aacaattcgt tcaagccgac  6060

gccgcttcgc ggcgcggctt aactcaagcg ttagagagct ggggaagact atgcgcgatc  6120

tgttgaaggt ggttctaagc ctcgtacttg cgatggcatt tcgatcgaaa ggggtacaaa  6180

ttcccactaa gcgctcgggg gctgagaaag cccagtaagg aaacaactgt aggttcgagt  3240

cgcgagatcc cccggaacca aaggaagtag gttaaacccg ctccgatcag gccgagccac  6300

gccaggccga gaacattggt tcctgtaggc atcgggattg gcggatcaaa cactaaagct  6360

actggaacga gcagaagtcc tccggccgcc agttgccagg ccgtaaaggt gagcagaggc  6420

acgggaggtt gccacttgcg ggtcagcacg gttccgaacg ccatggaaac cgcccccgcc  6480

aggcccgctg cgacgccgac aggatctagc gctgcgtttg gtgtcaacac caacagcgcc  6540

acgcccgcag ttccgcaaat agcccccagg accgccatca atcgtatcgg gctacctagc  6600

agagcggcag agatgaacac gaccatcagc ggctgcacag cgcctaccgt cgccgcgacc  6660

cgcccggcag gcggtagacc gaaataaaca acaagctcca gaatagcgaa atattaagtg  6720

cgccgaggat gaagatgcgc atccaccaga ttcccgttgg aatctgtcgg acgatcatca  6780

cgagcaataa acccgccggc aacgcccgca gcagcatacc ggcgacccct cggcctcgct  6840

gttcgggctc cacgaaaacg ccggacagat gcgccttgtg agcgtccttg gggccgtcct  6900

cctgtttgaa gaccgacagc ccaatgatct cgccgtcgat gtaggcgccg aatgccacgg  6960

catctcgcaa ccgttcagcg aacgcctcca tgggcttttt ctcctcgtgc tcgtaaacgg  7020

acccgaacat ctctggagct ttcttcaggg ccgacaatcg gatctcgcgg aaatcctgca  7080

cgtcggccgc tccaagccgt cgaatctgag ccttaatcac aattgtcaat tttaatcctc  7140

tgtttatcgg cagttcgtag agcgcgccgt gcgcccgagc gatactgagc gaagcaagtg  7200

cgtcgagcag tgcccgcttg ttcctgaaat gccagtaaag cgctggctgc tgaaccccca  7260

gccggaactg accccacaag gccctagcgt ttgcaatgca ccaggtcatc attgacccag  7320

gcgtgttcca ccaggccgct gcctcgcaac tcttcgcagg cttcgccgac ctgctcgcgc  7380

cacttcttca cgcgggtgga atccgatccg cacatgaggc ggaaggtttc cagcttgagc  7440

gggtacggct cccggtgcga gctgaaatag tcgaacatcc gtcgggccgt cggcgacagc  7500

ttgcggtact tctcccatat gaatttcgtg tagtggtcgc cagcaaacag cacgacgatt  7560

tcctcgtcga tcaggacctg gcaacgggac gttttcttgc cacggtccag gacgcggaag  7620

cggtgcagca gcgacaccga ttccaggtgc ccaacgcggt cggacgtgaa gcccatcgcc  7680

gtcgcctgta ggcgcgacag gcattcctcg gccttcgtgt aataccggcc attgatcgac  7740

cagcccaggt cctggcaaag ctcgtagaac gtgaaggtga tcggctcgcc gataggggtg  7800

cgcttcgcgt actccaacac ctgctgccac accagttcgt catcgtcggc ccgcagctcg  7860

acgccggtgt aggtgatctt cacgtccttg ttgacgtgga aaatgacctt gttttgcagc  7920

gcctcgcgcg ggattttctt gttgcgcgtg gtgaacaggg cagagcgggc cgtgtcgttt  7980

ggcatcgctc gcatcgtgtc cggccacggc gcaatatcga acaaggaaag ctgcatttcc  8040

ttgatctgct gcttcgtgtg tttcagcaac gcggcctgct tggcctcgct gacctgtttt  8100

gccaggtcct cgccggcggt ttttcgcttc ttggtcgtca tagttcctcg cgtgtcgatg  8160

gtcatcgact tcgccaaacc tgccgcctcc tgttcgagac gacgcgaacg ctccacggcg  8220

gccgatggcg cgggcagggc agggggagcc agttgcacgc tgtcgcgctc gatcttggcc  8280

gtagcttgct ggaccatcga gccgacggac tggaaggttt cgcggggcgc acgcatgacg  8340

gtgcggcttg cgatggtttc ggcatcctcg gcggaaaacc ccgcgtcgat cagttcttgc  8400

ctgtatgcct tccggtcaaa cgtccgattc attcaccctc cttgcgggat tgccccgact  8460

cacgccgggg caatgtgccc ttattcctga tttgacccgc ctggtgcctt ggtgtccaga  8520

taatccacct tatcggcaat gaagtcggtc ccgtagaccg tctggccgtc cttctcgtac  8580

ttggtattcc gaatcttgcc ctgcacgaat accagcgacc ccttgcccaa atacttgccg  8640

tgggcctcgg cctgagagcc aaaacacttg atgcggaaga agtcggtgcg ctcctgcttg  8700

tcgccggcat cgttgcgcca ctcttcatta accgctatat cgaaaattgc ttgcggcttg  8760

ttagaattgc catgacgtac ctcggtgtca cgggtaagat taccgataaa ctggaactga  8820ttatggcnnc tcgaaattcc ctcggtcttg ccttgctcgt cggtgatgta cttcaccagc   8880

tccgcgaagt cgctcttctt gatggagcgc atggggacgt gcttggcaat cacgcgcacc   8940

ccccggccgt tttagcggct aaaaaagtca tggctctgcc ctcgggcgga ccacgcccat   9000

catgaccttg ccaagctcgt cctgcttctc ttcgatcttc gccagcaggg cgaggatcgt   9060

ggcatcaccg aaccgcgccg tgcgcgggtc gtcggtgagc cagagtttca gcaggccgcc   9120

caggcggccc aggtcgccat tgatgcgggc cagctcgcgg acgtgctcat agtccacgac   9180

gcccgtgatt ttgtagccct ggccgacggc cagcaggtag gccgacaggc tcatgccggc   9240

cgccgccgcc ttttcctcaa tcgctcttcg ttcgtctgga aggcagtaca ccttgatagg   9300

tgggctgccc ttcctggttg gcttggtttc atcagccatc cgcttgccct catctgttac   9360

gccggcggta gccggccagc ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg ccaggtgcga   9420

ataagggaca gtgaagaagg aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac ctatcctgcc   9480

cggctgacgc cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc aaaatcctgt   9540

atatcgtgcg aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc cgaagcaggg   9600

ttatgcagcg gaaaagatcc gtcgaccctt tccgacgctc accgggctgg ttgccctcgc   9660

cgctgggctg gcggccgtct atggccctgc aaacgcgcca gaaacgccgt cgaagccgtg   9720

tgcgagacac cgcggccgcc ggcgttgtgg ataccacgcg gaaaacttgg ccctcactga   9780

cagatgaggg gcggacgttg acacttgagg ggccgactca cccggcgcgg cgttgacaga   9840

tgaggggcag gctcgatttc ggccggcgac gtggagctgg ccagcctcgc aaatcggcga   9900

aaacgcctga ttttacgcga gtttcccaca gatgatgtgg acaagcctgg ggataagtgc   9960

cctgcggtat tgacacttga ggggcgcgac tactgacaga tgaggggcgc gatccttgac  10020

acttgagggg cagagtgatg acagatgagg ggcgcaccta ttgacatttg aggggctgtc  10080

cacaggcaga aaatccagca tttgcaaggg tttccgcccg tttttcggcc accgctaacc  10140

tgtcttttaa cctgctttta aaccaatatt tataaacctt gtttttaacc agggctgcgc  10200

cctggcgcgt gaccgcgcac gccgaagggg ggtgcccccc cttctcgaac cctcccggcc  10260

cgctaacgcg ggcctcccat ccccccaggg gctgcgcccc tcggccgcga acggcctcac  10320

cccaaaaatg gcaggccaag ctagcttgct tggtcgttcc ggtacgtacc gtgaacgtcg  10380

gctcgattgt acctgcgttc aaatactttg cgatcgtgtt gcgcgcctgc ccggtgcgtc  10440

ggctgatctc acggatcgac tgcttctctc gcaacgccat ccgacggatg atgtttaaaa  10500

gtcccatgtg gatcactccg ttgccccgtc gctcaccgtg ttggggggaa ggtgcacatg  10560

gctcagttct caatggaaat tatctgccta accggctcag ttc                    10603

Claims (23)

1.编码新城疫病毒HN抗原的分离的植物优化的核苷酸序列，其含有SEQ ID NO：1的序列。

2.含有SEQ ID NO：1的重组表达载体。

3.权利要求2的载体，选自pCHN、pGHN、pGHN151、pGHN153、pMHN、pUHN。

4.权利要求2的载体，其中植物功能性启动子可操作地连接到SEQ ID NO：1。

5.供免疫保护性抗原在植物细胞中表达的重组表达载体，其含有编码禽流感病毒HA抗原的DNA序列，其中载体是pCHA。

6.用于表达免疫保护性抗原的转基因植物细胞，其含有权利要求2、3或5的载体。

7.权利要求6的植物细胞，其中所述植物细胞是马铃薯植物细胞、番茄植物细胞或烟草植物细胞。

8.含有权利要求2、3或5的载体的转基因植物。

9.含有重组病毒抗原性蛋白和药学上可接受递体的疫苗，其中病毒抗原性蛋白是由权利要求2或3的载体产生的新城疫病毒的HN抗原，其中所述疫苗施用于动物时能激发免疫应答。

10.权利要求9的疫苗，其中所述HN蛋白含有SEQ ID NO：2。

11.权利要求9的疫苗，其中所述HN蛋白在植物细胞中产生。

12.保护动物抵抗新城疫病毒的方法，包括向动物施用有效量的权利要求9的疫苗。

13.含有重组病毒抗原性蛋白和药学上可接受递体的疫苗，其中病毒抗原性蛋白是由权利要求5的载体产生的禽流感病毒的HA抗原，其中所述疫苗施用于动物时能激发免疫应答。

14.权利要求13的疫苗，其中所述HA蛋白在植物细胞中产生。

15.保护动物抵抗禽流感病毒的方法，包括向动物施用有效量的权利要求13的疫苗。

16.权利要求12或15的方法，其中疫苗经口腔、鼻内、腹膜内、肌内、静脉内或皮下施用。

17.权利要求12或15的方法，其中有效量为1μg-50μg/kg体重。

18.在转基因植物中生产抗原的方法，包括以下步骤：

a)生成含编码所述抗原的载体的转基因植物；

b)在所述植物表达所述抗原的条件下培育所述植物；

其中在成熟发生之前培育所述植物。

19.权利要求18的方法，其中所述植物含成熟果实。

20.权利要求18的方法，其中所述植物是番茄植物。

21.权利要求19的方法，其中所述植物的果实在成熟发生之前收获。

22.权利要求21的方法，其中所述抗原从所述收获的果实中分离。

23.权利要求18的方法，其中所述抗原选自新城疫病毒的HN抗原、禽流感病毒的HA抗原、LTB、NVCP、透明带糖蛋白和HBsAg。

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