CN1786188A - 检测载脂蛋白e基因型的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测临床血液样品中载脂蛋白(ApoE)基因分型的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测ApoE基因型的方法及所使用的试剂盒。
Description
所属领域
本发明涉及检测临床血液样品中载脂蛋白(ApoE)基因分型的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测ApoE基因型的方法及所使用的试剂盒。
发明背景
人ApoE基因有三个等位基因，即ε2，ε3和ε4，共构成6种不同的基因型：3种纯合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3种杂合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。其等位基因频率因不同的种族和地区存在差异，在一般人群中，ε2，ε3和ε4等位基因的频率分别为8％，78％和4％。
目前已知，ApoEε4是早发性冠状动脉心脏病(coronary heart disease，CHD)发病的独立危险因素，Meta分析表明，ApoEε4携带者比其他等位基因携带者患冠心病的危险性显著增加(Song Y，Stampfer MJ，Liu S，et al.Meta-analysis：apolipoprotein E genotypes and risk for coronary heart disease.Ann Intern Med.2004，141(2)：137-147.)。近年来大量的研究发现，ApoEε4与晚发性家族性Alzheimer病(LOAD)和散发性Alzheimer病(SAD)有关，而ApoEε2则有延迟痴呆发生的作用。目前科学家已公认ApoEε4等位基因是Alzheimer病(AD)的易感因子，并且与散发性AD的发生密切相关(Yamagata K，et al.Highexpression of apolipoprotein E mRNA in the brains with sporadic Alzheimerpsdisease.Dement Geriatr Cogn Disord，2001，12：57-62.)。因此，ApoE基因分型检测对早期辅助诊断Alzheimer病具有重要的意义。结合临床诊断，ApoEε4的检测将使对Alzheimer病的预测准确性高达94-98％(The Ronald and Nancy ReagenResearch Institute of the Alzheimer’s Association and the National Institute onAging Working Group.Neurobiol Aging.1998；19：109-116)。此外，ApoE基因分型检测还有助于临床治疗方案的选择。临床研究表明，携带或不携带ε4等位基因的AD患者使用乙酰胆碱酯酶抑制剂药物的治疗效果有很大不同(Lendon C L，etal.Exploring the etiology of Alzheimer′s disease using molecular biology，JAMA，1997，27：825-831；Farlow M，et al.Differential qualitative responses torivastigmine in APOE epsilon4 carriers and noncarriers.Pharmacogenomics J.2004；4(5)：332-5.)。可见，ApoE等位基因多态性的检测对深入研究高脂血症、动脉粥样硬化和AD的发病机理及治疗策略，以及从人群中筛选这些疾病的易感个体均具有积极意义。
目前常用的基因分型方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)、序列特异性引物(PCR-SSP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)以及DNA序列测定等技术。这些方法都存在技术复杂、成本昂贵，效率低和分辨率不足等缺点。因此，本发明人试图结合已知的点印迹杂交技术和过滤杂交方法，建立一种能够在较短的时间内检测和分析ApoE基因型的方法。
发明目的
本发明涉及检测个体血液样品中载脂蛋白E(ApoE)基因型的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测ApoE基因型的方法及所使用的试剂盒。
本发明的一个目的是提供一种使用反向斑点杂交技术检测血液样品中个体载脂蛋白E基因型的方法，该方法包括：(1)提供待检靶核酸样品；(2)利用聚合酶链反应扩增体系扩增靶DNA片断；(3)使被标记的靶核酸与特异性寡核甘酸探针杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的载脂蛋白E基因型，特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO：1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：3)；
(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：4)；
(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO：5)；
(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO：6)；
(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO：7)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶核酸样品是得自被检者血液白细胞的人基因组DNA样品。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置完成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的标记分子是生物素。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶DNA的基因型包括3种纯合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3种杂合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
本发明的另一个目的是提供用于检测人个体载脂蛋白E基因型的的试剂盒，该试剂盒包括：(1)核酸提取试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交反应试剂，特征在于聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO：1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：3)；
(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：4)；
(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO：5)；
(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO：6)；
(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ ID NO：7)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸提取试剂包括由DNA提取液和灭菌生理盐水组成的提取待检样品DNA的抽提液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂包括由含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶(UDG酶)等组成的PCR反应混合液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液I和II、溶液I、II、III和IV、膜条以及标准对照品。
发明内容
本发明涉及检测个体血液样品中载脂蛋白(ApoE)基因型的方法及试剂盒，特别是涉及以反向斑点杂交技术快速检测ApoE基因型的方法及所使用的试剂盒。
本发明的一个目的是提供一种使用反向斑点杂交技术检测血液样品中个体ApoE基因型的方法，该方法包括：(1)提供待检靶核酸样品；(2)利用聚合酶链反应(PCR)扩增体系扩增靶DNA片断；(3)使被标记的靶核酸与特异性寡核甘酸探针杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的基因型，特征在于所说的聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO：1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：3)；
(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：4)；
(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO：5)；
(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO：6)；
(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ IDNO：7)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA样品是得自被检者血液白细胞的人基因组DNA样品。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置完成的。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的标记分子是生物素。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的靶DNA的基因型包括3种纯合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3种杂合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
众所周知，通常使用的点印迹杂交方法是将靶DNA固定于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，使标记的探针与待检靶DNA接触并杂交，显色后判断结果。这种方法每次杂交反应只能检测待检DNA是否含有某一种探针的同源序列，即用于判断一种基因型。如果某些基因座位有多个等位基因(如HLA-DRB位点或地中海贫血突变基因等)，用这种点杂交方法检测就很繁杂，甚至很难完成。而反向斑点杂交方法则是先将针对各等位基因特异性的探针点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后再将待测DNA样品(一般是使用5’-端标记有生物素等分子的引物PCR扩增目的片断后的产物)与之杂交，这样待测样本就会与具有同源序列的探针结合。经洗涤去除未结合的DNA后，即可直接或间接地显示出并检测到代表杂交信号的生物素等标记物。因此，使用该方法可一次同时检测某一基因座位的大部分或全部等位基因。
简单地说，为了完成本发明的方法，首先常规制备待检者的白细胞基因组DNA。该DNA样品经DNA提取液处理后离心收集上清液，并将该上清液用于PCR扩增反应。以如上得到的人基因组DNA为模板，并使用合成的正向和反向寡核苷酸引物进行PCR扩增。变性处理所得到的DNA扩增产物后，使之分别与足以揭示不同的载脂蛋白E等位基因的寡核苷酸探针杂交。最后，根据杂交产物染色后的颜色变化判断载脂蛋白E的基因型。以下针对本发明方法的几个主要步骤，分别详细描述如下。
1、引物的设计和合成
为了特异、高效地扩增待检核酸样品中的载脂蛋白E基因，我们从Gene Bank中调出ApoE基因DNA序列，针对包含编码ApoE第112位和158位氨基酸的多态性位点序列，按照引物设计的一般性原则，采用美国Amplied Biosystem，Inc.的PrimerExpress2.0软件分别设计并合成正向和反向引物：5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO：1)和生物素5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO：2)。通过美国NIH网站上Blast程序进行同源性比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)，保证引物设计的特异性。
2、探针的合成和标记
针对编码ApoE蛋白第112和158位氨基酸相对应的多态性位点，设计并合成分别命名为探针1，探针2，探针3和探针4的四条探针。此外，另设计一条用于控制显色反应的显色反应控制探针为探针5，借以控制显色反应作为对照。为了保证各探针均能在同一温度下与特定的靶DNA成功地杂交，须将探针的Tm值和GC含量严格控制在特定范围内。合成的探针经20％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并纯化后，分别进行NH2基团标记以用于继后的杂交反应：
(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：3)；
(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：4)；
(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO：5)；
(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO：6)；
(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ IDNO：7)。
3、杂交载体的制备
用作杂交载体的膜可以是由硝酸纤维素、尼龙或醋酸纤维素等材料制成的，大小约为3.2cm×2.5cm的多孔条。膜条使用前需用10％的EDC(N-乙基-N’-[二甲基氨丙基]-碳二亚胺，Sigama公司)溶液充分浸泡活化处理。新合成的探针(100pm/μl)经稀释后，按用每孔0.7μl在膜条的适当位置上以固定格式点加。点样后用NaOH溶液处理膜条并充分洗涤，然后保存于-20℃备用。
4、核酸的提取
采用常规DNA提取液提取人个体血液样品(白细胞)中的DNA。例如可以利用渗透作用裂解抗凝血液中的红细胞，然后离心收集富含白细胞的沉淀。然后向其中加入常规DNA提取液，抽提血液白细胞的基因组DNA。所得到的DNA经离心后收集上清液，将其作为核酸扩增的模板。
5、核酸扩增体系的优化
我们采取热启动结合逐渐降低退火温度的PCR方法，摸索出最佳的退火温度，借以提高核酸扩增的特异性和高效性。同时，使用dUTP-UNG酶处理待检核酸，以有效地消除PCR产物的污染。特别是，我们对PCR扩增中使用的引物和其浓度、以及Mg2+、模板、PCR佐剂(二甲基亚砜)等其他反应物的浓度均作了适当的调整和最佳化。
6、反向斑点杂交体系的优化
反向斑点杂交的操作过程包括：首先将如前制备的ApoE基因分型膜条固定在杂交仪上，然后在膜条的适当加样点加载经变性处理的扩增的样品DNA。杂交反应完成后，经洗膜和显色步骤以显示杂交斑点的存在，并根据所使用的探针的不同来判断各个体的ApoE基因型。
由图3所示的检测实例可以看出，如果探针2(SEQ ID NO：4)、探针4(SEQ IDNO：6)和显色反应控制探针5(SEQ ID NO：7)显色，可判定ApoE基因型为ε2/ε2；如果探针2(SEQ ID NO：4)、探针3(SEQ ID NO：5)和显色反应控制探针5(SEQ IDNO：7)显色，可判定ApoE基因型为ε3/ε3；如果探针1(SEQ ID NO：3)、探针3(SEQ ID NO：5)和显色反应控制探针5(SEQ ID NO：7)显色判定ApoE基因型为ε4/ε4；如果探针1(SEQ ID NO：3)、探针2(SEQ ID NO：4)、探针3(SEQ IDNO：5)和显色反应控制探针5(SEQ ID NO：7)显色，可判定ApoE基因型为ε3/ε4；如果探针2(SEQ ID NO：4)、探针3(SEQ ID NO：5)、探针4(SEQ ID NO：6)和显色反应控制探针5(SEQ ID NO：7)显色，可判定ApoE基因型为ε2/ε3；如果探针1(SEQ ID NO：3)、探针2(SEQ ID NO：4)、探针3(SEQ ID NO：5)、探针4(SEQ ID NO：6)和显色反应控制探针5(SEQ ID NO：7)显色，可判定ApoE基因型为ε2/ε4；如果只有显色反应控制探针5(SEQ ID NO：7)显色，其它探针不显色则说明PCR扩增失败(参见图3)。
另外，本发明通过摸索不同的杂交温度和探针浓度(例如，将杂交温度设定在59℃，探针1-4和显色反应控制探针5的浓度分别定为12.5μmol/L、6.25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L和2.5μmol/L)，可使检测的结果更为准确可靠，并具有更好的检测稳定性(可重复性)。
本发明中，由于发明人对靶DNA片断的扩增体系和杂交体系进行了优化，设计并合成了特异性强的探针和引物，同时检测中使用了配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，所以保证了方法的快捷和检测结果的可靠性。
如前所述，由于反向斑点杂交方法能够同时检测目的基因内多个碱基的突变或多态性，所以在病原体及复杂遗传性疾病的检测中有着更为简便的优越性。另一方面，由于ApoE在常见的心血管疾病(如CHD)以及神经***疾病(如AD)中的重要作用，所以ApoE基因成为临床检验研究的热点。本发明的ApoE等位基因检测方法显然可以为CHD、AD等疾病的诊断提供一种快速、简便、特异性和准确性均较高的实验室检验手段。
本发明的另一个目的是提供用于检测人个体载脂蛋白E基因型的的试剂盒，该试剂盒包括：(1)核酸提取试剂；(2)聚合酶链反应试剂；和(3)杂交反应试剂，特征在于所说的聚合酶链反应扩增体系中的所使用的正向和反向引物分别是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO：1)和5′-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO：2)；并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：3)；
(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：4)；
(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO：5)；
(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO：6)；
(5)生物素-5’-TCTTCCAATATCCGGTCCTGTTGAT-3’-NH2(SEQ IDNO：7)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的核酸提取试剂包括由DNA提取液和灭菌生理盐水组成的提取待检样品DNA的抽提液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应试剂由dNTPs(含dUTP)、耐热Taq酶、UDG酶等组成的PCR反应混合液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液I(和II、溶液I、II、III和IV、膜条以及标准对照品。
如前所说，为简单快速地检测个体血液样品中载脂蛋白(ApoE)基因型，本发明提供了相应的载脂蛋白(ApoE)基因反向斑点杂交分型检测试剂盒。具体地说，本发明的试剂盒提供：(1)血液样品ApoE核酸提取试剂，包括DNA提取液(500μl/管)、灭菌纯水(20ml/管)、生理盐水(10ml/管)；(2)聚合酶链反应试剂，包括PCR反应混合液10管(每管含PCR反应缓冲液，终浓度为2.5mmol/L的Mgcl2、0.2mmol/L的dNTPs、0.2umol/L的正反向引物，二甲基亚砜5μl)、Taq酶(3u/μl，15μl)1管、UDG酶(1U/μl)1管；(3)杂交检测试剂，主要为常规的20×SSC(主要含NaCL，柠檬酸钠等)、SDS(十二烷基磺酸钠)、POD(链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶结合物)、TMB(四甲基联苯胺)等。包括杂交液I(2×SSC-0.1％SDS，50ml/瓶)1瓶、杂交液II(0.5×SSC-0.1％SDS，35ml/瓶)1瓶、溶液I(250u/mlPOD，20μl/管)1管、溶液II(0.1mol/L柠檬酸钠，30ml/瓶)1瓶、溶液III(2mg/mlTMB，1ml/管)1管、溶液IV(3％H2O2，10μl/管)1管，标准对照品，另外包括用作杂交反应载体的膜条10张。
本发明的试剂盒除提供了各位点所对应的特异性探针外，还配有显色反应控制探针和标准对照品。由于本发明结合使用了配备有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置，其导流杂交的特性大大提高了核酸分子的扩散率、局部反应的浓度和核酸杂交效率。一般说来，使用本发明的方法和试剂盒，从样本的处理到判读基因型检测结果仅需要6小时左右的时间。因此，本发明的方法和试剂盒特别适用于临床标本的快速检测和大样本的普查。
附图说明
图1显示所使用的探针在膜条上的排列图。
号探针具有SEQ ID NO：3所示的序列，
号探针具有SEQ ID NO：4所示的序列，
号探针具有SEQ ID NO：5所示的序列，
号探针具有SEQ ID NO：6所示的序列，
号显色控制探针具有SEQID NO：7所示的序列。
图2显示靶DNA扩增片断经2％的琼脂糖凝胶电泳图，第1和2泳道为特异性靶DNA片断(265bp)，M泳道为标准分子量标志。
图3显示六种不同基因型样品的反向斑点杂交检测结果。
号探针、
号探针和
号探针显色判定ApoE基因型为ε4/ε4；
号探针、
号探针和
号探针显色判定ApoE基因型为ε3/ε3；
号探针、
号探针和
号探针显色判定ApoE基因型为ε2/ε2；
号探针、
号探针、
号探针和
号探针显色，可判定ApoE基因型为ε2/ε3；
号探针、
号探针、
号探针和
号探针显色，可判定ApoE基因型为ε3/ε4；
号探针、
号探针、
号探针、
号探针和
号探针显色判定ApoE基因型为ε2/ε4(参见下列表1和图3)。
表1
发明的具体实施方式
实施例1：样品靶核酸的制备
用无菌注射器抽取受检者的静脉血1ml，加入含EDTA抗凝管中，室温或低温保存。取抗凝全血300μl加到1.5ml离心管中，向离心管中加入1ml的灭菌纯水，充分混匀，室温静置2-4分钟。然后离心(5000rpm)6分钟，收集沉淀物。重复上述步骤一次后向离心管内加入1ml生理盐水并混匀，10000rpm离心10分钟后，收集管底的白色沉淀。向沉淀中加入50μl的DNA提取液，充分混匀，沸水浴10分钟并以12000rpm离心10分钟。取2μl上清液作为PCR反应模板。
实施例2：靶核酸的PCR扩增
取单管单人份PCR反应液若干管，每管加入1μl UDG酶，再直接加入2μl模板(或阴阳性标准品)，充分混匀，瞬时(3秒)离心，将各反应管放入PCR仪，50℃预处理3分钟后采用热启动结合“降落PCR”，按下列条件扩增：94℃4分钟，80℃3分钟，在此过程中加入Taq酶1μl。94℃2分钟变性，然后按94℃1分钟，70℃1分钟，72℃1分钟，共5个循环，再按94℃1分钟，64℃1分钟，72℃1分钟，共30个循环，最后72℃延伸7分钟。扩增产物经2％的琼脂糖凝胶电泳检测(见附图2)。
实施例3：六种已知基因型的样品反向斑点杂交检测
杂交前，取杂交液I(2×SSC-0.1％SDS)与杂交液II混合并预热至59℃备用。根据待检样品的数目取6个1.5ml离心管，各管分别加入0.5ml杂交液I并预加热至59℃。将PCR扩增产物97℃变性处理5分钟后，置于冰水混合物中放置2-5分钟。然后取1000μl杂交液I+2μl溶液I(1000∶2)混合溶液作为结合液4℃保存备用，并取溶液II∶溶液III∶溶液IV(1900∶200∶1)的混合物(19ml溶液II+2ml溶液III+10μl溶液IV)作为显色液避光备用。
杂交前用蒸馏水充满反应室，放置好金属多孔板，打开水泵以排出多孔板上的水份。设定杂交仪温度为59℃，首先将塑料垫片置于金属多孔板上并将ApoE基因分型膜条置于塑料垫片上，盖好硅胶分隔室和压扣盖。再在变性后的PCR扩增产物内加入59℃预热的0.5ml杂交液I，混匀后加入杂交槽中温育5分钟并打开泵进行杂交导流。然后加入预热的杂交液II清洗膜条(每孔1ml，重复洗3次)。设定杂交仪温度为25℃(或室温)并加入结合液(每孔1ml)。静置2分钟后泵出结合液，再加入室温杂交液I清洗膜条(每孔1ml，各重复洗3次)。随后加入溶液II静置2分钟后泵干，最后加入新鲜配制的显色液(每孔1ml)，显色6～8分钟并开泵抽干显色液观察结果(参见附图3)。
由图3所示的结果可以看出，各探针显色清晰可见，无非特异性杂交；根据附图一所示的排列格式可判读出这六种不同的基因型。
实施例4：不同基因型样品的反向斑点杂交基因分型检测结果判定
使用本发明的方法和试剂盒，对40份采自Alzheimer氏病患者的白细胞DNA样品进行ApoE基因型检测。结果检出：ε3/ε3(22例)、ε4/ε4(2例)、ε3/ε4(11例)、ε2/ε3(3例)、ε2/ε4(2例)，未检出ε2/ε2纯合型。
为了进一步证实本发明方法的准确性，对所有样品的PCR产物进行序列测定。结果表明，使用本发明的试剂盒检测的结果和测序结果完全吻合，特异性达100％。
序列表
<110>中山大学安达基因股份有限公司
<120>检测载脂蛋白E基因型的方法和试剂盒
<140>
<141>
<160>7
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>1
GGCACGGCTG TCCAAGGAGC
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400>2
GCGCTCGCGG ATGGCGCTG
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>3
TGGAGGACGT GCGCGGCCGC
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>4
GGAGGACGTG TGCGGCCGC
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>5
CTGCAGAAGC GCCTGGCAGTG
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>6
CTGCAGAAGT GCCTGGCAGT
<210>7
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作杂交探针。
<400>7
TCTTCCAATA TCCGGTCCTG TTGAT
Claims (9)
1、一种检测个体载脂蛋白E基因型的方法，该方法包括：(1)提供待检靶DNA样品；(2)利用聚合酶链反应扩增体系扩增靶DNA片断；(3)使被标记的靶DNA与特异性寡核甘酸探针杂交；(4)检测杂交结合物并借以判断靶DNA的载脂蛋白E基因型，特征在于聚合酶链反应扩增体系中使用的正向和反向引物分别是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO：1)和5′-生物素-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ IDNO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：3)；
(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：4)；
(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO：5)；
(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO：6)。
2、根据权利要求1的方法，其中所说的DNA样品是得自被检者血液白细胞的人基因组DNA样品。
3、根据权利要求1的方法所说的检测是使用带有多孔滤板和减压抽吸部件的反向点印迹杂交装置完成的。
4、根据权利要求1的方法，其中所说的标记分子是生物素。
5、根据权利要求1的方法，其中所说的靶DNA的基因型包括3种纯合子型(ε4/ε4、ε3/ε3和ε2/ε2)和3种杂合子型(ε3/ε4、ε2/ε3和ε2/ε4)。
6、用于检测人个体载脂蛋白E基因型的的试剂盒，该试剂盒包括：(1)核酸提取试剂；(2)聚合酶链反应试剂；(3)杂交反应试剂，特征在于聚合酶链反应扩增体系中所使用的正向和反向引物分别是5’-GGCACGGCTGTCCAAGGAGC-3’(SEQ ID NO：1)和5′-生物素-GCGCTCGCGGATGGCGCTG-3′(SEQ ID NO：2)，并且杂交反应中使用的寡核甘酸探针分别是：
(1)NH2-5’-TGGAGGACGTGCGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：3)；
(2)NH2-5’-GGAGGACGTGTGCGGCCGC-3’(SEQ ID NO：4)；
(3)NH2-5’-CTGCAGAAGCGCCTGGCAGTG-3’(SEQ ID NO：5)；
(4)NH2-5’-CTGCAGAAGTGCCTGGCAGT-3’(SEQ ID NO：6)。
7、根据权利要求6的试剂盒，其中所说的核酸提取试剂包括由DNA提取液和灭菌生理盐水组成的提取待检样品DNA的抽提液。
8、根据权利要求6的试剂盒，其中所说的聚合酶链反应试剂包括由含有脱氧尿嘧啶核苷三磷酸的脱氧核糖核苷三磷酸、耐热Taq酶和尿嘧啶-DNA-糖基化酶组成的PCR反应混合液。
9、根据权利要求6的试剂盒，其中所说的杂交反应试剂包括杂交液I和II、溶液I、II、III和IV、膜条以及标准对照品。
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