CN1780920B - 基因表达抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种通过使用一种重组DNA构建体制造用于真核细胞的基因抑制剂的方法，这种重组DNA构建体包含至少一个转录单元，该转录单元包括转录启动子、用于制造RNA分子的模板序列、和转录终止子。RNA介导的基因抑制的机制包括，但并不局限于，RNA干涉(RNAi)。也揭示了该抑制剂作为生物医学研究的工具和医药产品的应用。

Description

基因表达抑制剂
相关申请
本申请要求2002年5月7日提交的临时申请号为60/377,964的优先权权益。
发明背景
技术领域
本发明涉及药物和生物医学研究。更具体地说，本发明涉及在真核细胞里产生在本申请中统称为siRNA的小发夹RNAs(shRNAs)或干涉RNAs(siRNAs)的表达***，以及用于在真核细胞里表达siRNAs的方法。本发明还涉及所述表达***作为药物产品的应用。
现有技术
RNA干涉(RNAi)是由与沉默基因同源的双链RNA(dsRNA)引发的动植物体中序列特异的转录后基因沉默(PTGS)过程。它是一种进化保守现象，并且是一种多步骤过程，其涉及通过未完全了解机制的反应在体内产生活性siRNAs。RNAi已被用作反向遗传工具，在诸如植物、线虫(Caenorhabditis elegants)和果蝇(Drosophila)等多种模式生物体中研究基因功能，在这些生物体里大的dsRNAs能有效地引起基因特异沉默。
在哺乳动物细胞里，30个或更长碱基对的dsRNAs会激活抗病毒反应，导致RNA转录本的非特异性降解和寄主细胞蛋白质翻译的总体中止。因此，长的dsRNA不是用于沉默哺乳动物细胞中特异基因的常用方法。近来，化学合成或用DNA模板和RNA聚合酶的生物学方法产生的不同siRNAs已被用于在人工培养的哺乳动物细胞里下调靶基因的表达。在用过的方法中，人们总希望，使用包含转录启动子和siRNAs的模板的DNA构建体，在体内和体外产生siRNAs。尽管在这种DNA构建体中可适用多种不同启动子，但所用启动子的类型仍保持局限于诸如U6启动子和H1启动子的III型RNA聚合酶III(Pol III)启动子，以及诸如T7启动子的需要病毒RNA聚合酶的启动子。本发明提供了产生基因表达抑制剂的方法和设计，所述基因表达抑制剂能大大拓宽siRNAs的潜在应用。
发明概述
本发明涉及产生用于在哺乳动物细胞中siRNAs表达的基因表达抑制剂的方法。这种抑制剂包含RNA聚合酶III(Pol III)转录启动子元件、用于在寄主细胞里转录的siRNAs的模板序列、及终止子序列。
所述启动子是任何天然的或工程化的转录启动子。作为这种启动子的例子(不意味着局限于此)，在一个实施方案中，所述启动子是I型Pol III启动子，而在另一个实施方案中，所述启动子是I型Pol III启动子元件和III型Pol III启动子元件的组合。在其它实施方案中使用了其它类型的启动子。
siRNA的靶区域是在真核生物或病毒基因组中任何序列的转录本上的任意位置。所述终止子是任何天然的或工程化的序列，其通过Pol III或其它类型的RNA聚合酶终止转录。
这种基因表达抑制剂以任何路线、程序或方法，例如(但并不局限于)体内、体外、离体、电穿孔、转染或病毒载体转导，被运送进入真核细胞，包括(但并不局限于)哺乳动物、昆虫、蠕虫和植物。
附图说明
图1表示在哺乳动物细胞中用脊椎动物的I型Pol III启动子产生siRNA的实施方案。具体地说，图1表示在哺乳动物细胞中用脊椎动物的I型Pol III启动子(5S rRNA基因启动子及其它)产生siRNA的方法。“Abox”、“C box”、“D box”和“IE”是Pol III启动子元件，“+1”是转录的起始位点，“Tn”是Pol III启动子转录本的终止位点，并且箭头表示转录的方向。siRNA模板由有义、间隔区、反义和终止子序列组成，并且在表达时产生发夹dsRNA。“有义”是一段17-23核苷酸(nt)的有义序列，其与靶基因的序列相同，并且是发夹dsRNA中茎的一条链的模板。“间隔区”是一段4-15核苷酸的序列，并且是发夹dsRNA中茎链的环的模板。“终止子”是5个胸腺嘧啶脱氧核苷(5Ts)的转录终止信号。
图2表示在哺乳动物细胞中用脊椎动物的III型Pol III启动子(U6基因启动子、H1 RNA基因启动子、Y1基因启动子、Y3基因启动子、RNA酶P基因启动子及其它)产生siRNA的实施方案。DSE是Pol III启动子的远端序列元件(distal sequence element)；PSE是Pol III启动子的近端序列元件(proximal sequence element)；TATA是一个启动子元件；+1是转录的起始位点；箭头表示转录的方向；siRNA模板是一段43-66核苷酸(nt)的工程化的***物，其是用于相对于靶基因产生一发夹dsRNA的模板；有义是来自靶基因的一段17-23核苷酸的有义序列，是发夹中茎的一条链的模板；间隔区是一段4-15核苷酸的序列，是发夹的环的模板；反义是一段17-23核苷酸的反义序列，是发夹中茎的另一条链的模板；终止子是5个胸腺嘧啶脱氧核苷(5Ts)的转录终止信号。
图3表示在哺乳动物细胞中用工程化的包含I型和III型启动子中的元件的Pol III启动子产生siRNA的实施方案。“DSE”是III型Pol III启动子的远端序列元件(distal sequence element)。“PSE”是III型Pol III启动子的近端序列元件(proximal sequence element)；“TATA”是一个III型Pol III启动子元件。“A box”、“C box”、和“IE”是I型Pol III启动子元件。“+1”是转录的起始位点。“Tn”是III型Pol III启动子转录本的终止位点。箭头表示转录的方向。siRNA模板由有义、间隔区、反义和终止子序列组成，并且在表达时产生发夹dsRNA。“有义”是一段17-23核苷酸的有义序列，其与靶基因序列相同，并且是发夹dsRNA中茎的一条链的模板。间隔区是一段4-15核苷酸的序列，并且是发夹dsRNA的环的模板；“反义”是一段17-23核苷酸反义序列，并且是发夹dsRNA中茎的另一条链的模板。终止子是5个胸腺嘧啶脱氧核苷(5Ts)的转录终止信号。
图4表示在哺乳动物细胞中用脊椎动物的两个I型Pol III启动子产生siRNA的实施方案，所述两个I型Pol III启动子分别启动有义siRNA和反义siRNA转录。“A box”、“C box”、“D box”和“IE”是Pol III启动子元件。“+1”是转录的起始位点。“Tn”是Pol III启动子转录本的终止位点。箭头表示转录的方向。“有义siRNA模板”是一段22-28核苷酸的工程化的***序列，其是用于相对于靶基因产生一个有义单链RNA(ssRNA)的模板，并且由有义和终止子序列组成。“反义siRNA模板”是一段22-28核苷酸的工程化的***序列，其是用于相对于靶基因产生一个反义ssRNA的模板，并且由反义和终止子序列组成。“有义”是一段17-23核苷酸的有义序列，其与靶基因序列相同，并且是发夹dsRNA中茎的一条链的模板。“间隔区”是一段4-15核苷酸的序列，并且是发夹dsRNA的环的模板。“反义”是一段17-23核苷酸反义序列，并且是发夹dsRNA中茎的另一条链的模板。“终止子”是5个胸腺嘧啶脱氧核苷(5Ts)的转录终止信号。
图5表示在哺乳动物细胞中用工程化的T7聚合酶和T7启动子产生siRNA的实施方案。“启动子”是一个组成型的或依赖环境的启动子，例如可诱导启动子或细胞类型特异的启动子；“T7聚合酶基因”是一段编码T7聚合酶的序列。T7启动子是一种T7启动子。“+1”是转录的起始位点。箭头表示转录的方向。siRNA模板由有义、间隔区、反义和终止子序列组成，并且在表达时产生发夹dsRNA。“有义”是一段17-23核苷酸的有义序列，其与靶基因序列相同，并且是发夹dsRNA中茎的一条链的模板。“间隔区”是一段4-15核苷酸的序列，并且是发夹dsRNA的环的模板。“反义”是一段17-23核苷酸的反义序列，并且是发夹dsRNA中茎的另一条链的模板。“终止子”是T7聚合酶的工程化的终止子。
图6表示在哺乳动物细胞中用单个的多转录单元构建体产生多个siRNA的实施方案。“单元”是一个包含脊椎动物的I型Pol III启动子和siRNA模板的转录单元。“A box”、“C box”、“D box”和“IE”是Pol III启动子元件。“+1”是转录的起始位点。“Tn”是Pol III启动子转录本的终止位点。箭头表示转录的方向。siRNA模板的结构由有义、间隔区、反义和终止子序列组成，并且是一段设计的***序列，其是用于相对于靶基因产生一个发夹dsRNA的模板。“有义”是一段17-23核苷酸的有义序列，其与靶基因序列相同，并且是发夹dsRNA中茎的一条链的模板。“间隔区”是一段4-15核苷酸的序列，并且是发夹dsRNA的环的模板。“反义”是一段17-23核苷酸的反义序列，并且是发夹dsRNA中茎的另一条链的模板。“终止子”是5个胸腺嘧啶脱氧核苷(5Ts)的转录终止信号。多个siRNA可以靶向一个基因的单个区域、一个基因的不同区域、或多个基因中每一个基因的一个区域。
本发明的详细描述
提供以下的详细说明是为了帮助本领域的技术人员应用本发明。不能视作对本发明的限制。
本发明旨在通过制造和使用DNA构建体，选择性地抑制哺乳动物中靶基因的表达，所述构建体包含RNA聚合酶III(Pol III)转录启动子元件、将在寄主细胞里转录的siRNAs的模板序列、和终止子序列。
启动子是任何天然的或工程化的转录启动子。在一个实施方案中，启动子是I型Pol III启动子。I型启动子的必要元件，如“A box”、“C box”、“D box”和“IE”都包含在DNA构建体中。在这个实施方案中，siRNA模板置于“D box”和“A box”之间。在另一个实施方案中，启动子是I型Pol III启动子元件和III型Pol III启动子元件的组合。在这个实施方案中，两种启动子的必要元件，如I型启动子的“A box”、“C box”、和“IE”，以及III型启动子的“DSE”、“PSE”和“TATA”都包含在DNA构建体中，其中“DSE”、“PSE”和“TATA”位于“+1”位点的上游区域，“A box”、“C box”、和“IE”位于“+1”位点的下游区域。任何在哺乳动物细胞中起作用的启动子都适用于本发明。对现有启动子做的修饰，如增加可诱导或增强元件也适用于本发明。
siRNA的靶区域是哺乳动物或病毒基因组的任何序列的转录本的任何位置。在一些实施方案中，编码具有“发夹”结构的RNA分子的siRNA的模板包含靶基因的有义和反义序列。在其他实施方案中，有义序列的模板和反义序列的模板由不同启动子启动。
终止子是任何天然的或工程化的序列，通过Pol III或其它类型的RNA聚合酶终止转录，例如(并不局限于)，DNA分子中一段4个或更多胸腺嘧啶脱氧核苷残基。
任何包含启动子、RNA的模板和终止子的转录单元都适用于与另一个单元或多个单元一起构建到作为抑制剂的DNA分子里。在一个实施方案中，表示了多转录单元的构建体。多于一种的基因表达抑制剂(DNA分子)适用于一起被导入到哺乳动物细胞中。在同一个哺乳动物细胞里由这些多转录单元或共-导入方法产生的siRNAs使得抑制剂能靶向于一个靶RNA分子的一个特定区域、一个靶RNA分子的多个区域、或多于一个的RNA分子的多个区域。
上述这种DNA构建体可以被构建作为任何合适的克隆载体或表达载体的一部分。然后抑制剂可以任何路线、程序或方法，例如体内、体外、离体、注射、电穿孔法、转染或病毒载体转导，被运送进细胞、组织或生物体。
实施例
实施例1人类5S rDNA调节序列的克隆
用于下面提供的实验设计的启动子是人类5S rRNA基因。该序列在数据库里提供：Genebank登录号X12811。5S rRNA启动子包含下游的Abox和C box和上游的D box。在图1中，在5S rRNA的起始位点和A box之间的49个核苷酸的序列要被干涉RNA序列替换。用2个步骤产生包含上游和下游box的盒(cassette)。A box和C box的克隆可以由化学合成得到。上游的D box由PCR得到。
重组的5S rRNA的D box的克隆是通过PCR得到，其中使用了正向引物(AACggatccaaaacgctgcctccgcga)和反向引物(TAGACGCTGCAGGAGGCGCCTGGCT)，然后其被亚克隆到pBS2SK载体的BamHI和PstI位点。A/C box可以被作为顶链(top strand)(AGAAGACGAagctaagcagggtcgggcctggttagtacttggatgggagaccgcctgggaataccgggtgctgtaggctttttg)和底链(bottom strand)(TCGACAAAAAGCCTACAGCACCCGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATCCAAGTACTAACCAGGCCCGACCCTGCTTAGCTTCGTCTTCT)合成，然后被退火、亚克隆到克隆的D box下游的EcoRV和SalI位点。退火的DNA片断工程化为带有BbsI位点。
实施例2RNAi序列的***和克隆
RNAi盒(cassette)以两条链合成，并克隆到PstI位点和BbsI位点之间。RNAi盒(cassette)设计如下：
5’GC(N19)TTTCGG(61N)TTTTT3’
3’ACGTCG(61N)AAAGCC(N19)AAAAATCGA5’
N19是从靶基因的转录区域挑选出的19核苷酸的靶DNA序列。61N是N19的反向互补链。转录从N19靶序列的第一个碱基开始，终止于polyT。
实施例3靶向于乳腺癌的ErbB2/Her2
ErbB2/Her2基因在约30％的人类乳腺癌里扩增，导致癌细胞的快速生长和转移。Herceptin是Genentech公司生产的一种能阻遏ErbB2作用的抗体，与只进行化疗的病人相比，只有Herceptin当与化疗联用给药时能使ErbB2阳性的乳腺癌病人减缓转移乳腺疾病的发展，提高总存活率。通过本发明研发的产生靶向于ErbB2的siRNA的方法，能够提供一种可供选择的治疗方法。
实施例4靶向于慢性粒细胞性白血病(CML)和其他癌症的BCR-AbI酪氨酸激酶
BCR-AbI是一种在CML中经常产生的融合基因产物。Novartis公司研制的ST1571又称Gleevec，新近被批准为靶向于CML中的BCR-AbI的抗癌药物。通过本发明研发的产生针对融合基因BCR-AbI的siRNAs的方法，不干涉BCR或AbI基因的正常表达，从而应有以基因治疗方法治疗CML的很大潜力。
实施例5靶向于B型肝炎病毒(HBV)
应用本发明靶向于HBV基因组的不同位点，能够提供一种强效的基因治疗方法以治疗B型肝炎病人。
实施例6靶向于I型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)
应用本发明靶向于HIV基因组的不同位点，能够提供一个强效的基因治疗方法以治疗HIV感染病人。一个能同时靶向于多个位点，例如env、gag、pol、Vif、nef、vpr、vpu和tat的多单元抑制剂，可适用于解决HIV基因组变异引起的抗性。

Claims (15)

1.一种重组DNA构建体，包含至少一个转录单元，该转录单元含有转录启动子、制造RNA分子的模板序列和转录终止子，
其中所述转录启动子包含I型Pol III启动子的必要元件A Box、IE、C Box和D Box，或所述转录启动子包含I型Pol III启动子的必要元件ABox、IE和C Box、以及III型Pol III启动子的必要元件DSE、PSE和TATA；
所述模板序列包含有义序列、间隔区、反义序列和终止子，所述有义序列和反义序列各为17-23nt的序列，所述间隔区为4-15nt的序列；
所述模板序列设置在转录起始点和所述转录启动子的第一个必要元件A Box之间，所述转录终止子设置在siRNA反义序列和所述转录启动子第一个必要元件A Box之间。
2.如权利要求1所述的构建体，其中所述I型Pol III启动子是天然的。
3.如权利要求1所述的构建体，其中所述I型Pol III启动子是工程化的。
4.如权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中所述模板包括，能产生全长或部分RNA分子的序列，所产生的RNA分子能通过RNAi下调靶基因的表达。
5.如权利要求4所述的构建体，其中所述靶基因是选自哺乳动物和病毒基因组的基因。
6.如权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中所述转录单元与多于一个的其它这种单元一起构建到同一个DNA构建体里，以靶向于一个或多个基因的相同或不同的区域。
7.包含如权利要求1至3中任一项所述构建体的克隆或表达载体。
8.包含权利要求1至3中任一项所述的构建体的分子。
9.包含权利要求1至3中任一项所述的构建体的细胞。
10.包含权利要求1至3中任一项所述的构建体的组织。
11.包含权利要求1至3中任一项所述的构建体的器官。
12.包含权利要求1至3中任一项所述的构建体的其它工程化的材料。
13.如权利要求1至3中任一项所述的构建体，其中所述模板包含能产生全长或部分RNA分子的序列，所产生的RNA分子能结合其靶并调节靶的功能。
14.一种制造用于真核细胞的基因抑制剂的方法，这种方法包括使用重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含至少一个转录单元，
所述转录单元包含转录启动子、用于制造RNA分子的模板序列和转录终止子，其中所述转录启动子包含I型Pol III启动子的必要元件A Box、IE、C Box和D Box，或所述转录启动子包含I型Pol III启动子的必要元件A Box、IE和C Box、以及III型Pol III启动子的必要元件DSE、PSE和TATA；
所述模板序列包含有义序列、间隔区、反义序列和终止子，所述有义序列和反义序列各为17-23nt的序列，所述间隔区为4-15nt的序列；
所述模板序列设置在转录起始点和所述转录启动子的第一个必要元件A Box之间，所述转录终止子设置在siRNA反义序列和所述转录启动子第一个必要元件A Box之间。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述I型Pol III启动子是天然的或工程化的。
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