CN1773285A - 一种联检epsps和bt蛋白的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒及方法。本试剂盒由底板、上盖组成；底板内有两条测试带；上盖有两个观测窗和两个加样孔。本试剂盒将检测EPSPS和BT蛋白的检测***主体膜反应体系装配在同一试剂盒内，可同时检测植物的种子、叶片及加工产品中是否含有抗除草剂EPSPS或杀虫BT晶体蛋白基因。本试剂盒不需其它任何附加仪器设备，且操作简便、检测结果形象、准确、快速：只要将送检物品的提取液分别滴加在试剂盒的两个加样孔中，3－5分钟后，通过肉眼就可以通过观测窗直接观察到准确的检测结果。

Description

一种联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒及方法

技术领域：

本发明涉及一种联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒。本发明还涉及用此试剂盒同时检测EPSPS和BT蛋白的方法。

背景技术：

在转基因植物的研制开发或在对转基因产品进行筛选或安全性评价时，往往需要对转入的外源性基因进行定性或半定量测定。

目前出现的转基因作物，无论是棉花，还是玉米、大豆，大多转入以下两种外源基因：

1.具有杀虫性的BT晶体蛋白基因(包括BT-Cry1Ab或BT-Cry1Ac，通常简称为BT基因)，Bt为Bacillus thuringiensis，即苏芸金芽孢杆菌的简称；Cry为晶体蛋白(crystalprotein)的简称；Cry1Ab和Cry1Ac为苏芸金芽孢杆菌基因编码的两种常见的杀虫晶体蛋白。

2.特异性抗除草剂EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因。

因此，实践中对一种植物样本往往都需要进行两种基因的检测。

现有的检测技术如酶免、放免等方法，受仪器(酶标仪、放免闪烁仪、离心机等)、场地等因素的限制，而且检测时间长(酶免检测时间需20hr、放免需30min～1hr)，检测成本较高，很难推广应用。

目前出现的用试纸条检测的方法虽可部分克服以上不足(如美国EnviroLogixIncorporated，Strategic Diagnostics，Inc.和重庆金标生物技术有限公司生产的试纸条)，但每种试纸条只能检测转基因作物中单一的外源基因，实际操作中容易产生错误结果。例如：如果检测者仅有EPSPS基因检测试纸条，而检测对象中并未转入EPSPS基因，而是转入BT基因，那么很可能会得出检测对象不存在外源基因的错误结果，造成不必要的损失。而且在操作时，需要将试纸条浸入待检测的液体中，操作不是很方便。

因此，实践中很需要有一种可同时检测转基因植物中BT晶体蛋白基因和EPSPS基因，且操作简便、结果准确可靠、快速的装置和检测方法。

发明内容：

本发明的目的是建立一种操作简便、结果准确可靠、快速，并能同时检测两种不同外源基因(EPSPS和BT蛋白基因)的方法和检测试剂盒。

试剂盒的技术方案是这样的：它包括底板和上盖，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于底板上放置有两条测试带；上盖有两个观测窗和两个加样孔。

底板的上表面可以设置两条凹槽，每条凹槽内嵌入一条测试带，底板的厚度不限。

所述底板或上盖可具有卡槽，以保证底板与上盖扣紧。

所述观测窗优选是长方形。

试剂盒的形状不限，如可以是扁平的长方形或正方形盒。

试剂盒的材料可以用塑料或玻璃等对样本和测试带无影响的材料，塑料为最佳材料，既可以避免磕碰损坏，且重量轻、造价低廉。

所述底板内的两条测试带，一条用于检测EPSPS，另一条用于检测BT蛋白。所述测试带是一种具有检测***主体膜反应体系功能的检测材料，由高分子纤维膜、塑料等多层材料制成。两种蛋白的测试带均可分为质控区和检测区，质控区可包被羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG多克隆抗体；EPSPS基因测试带的样品检测区包被特异功能性EPSPS，BT蛋白测试带的样品检测区包被BT-Cry 1Ab/Ac的单克隆抗体或多克隆抗体。

当外源基因转入植物，并在植物中表达，将产生目的蛋白(EPSPS和BT)，因此通过检测样品中是否含有上述两种蛋白来确定该基因是否存在。如果外源基因转入植物，发生基因沉默，无目的蛋白产生，将不能达到预期目的(杀虫或抗除草剂)。

在本发明的一个实例中，所述检测***主体膜反应体系由以下部分组成：

M1：反应膜，由高蛋白亲和性的高分子纤维素膜制备，作为***反应的载体和显示反应结果；

M2a、M2b、M3：样本垫，有较强吸水能力，可为反应***提供适合的反应条件，并帮助吸取样本。

M4：胶体金标记抗体载体膜，作为胶体金垫，吸附胶体金标记抗体并作为其固相载体；

M5：吸水垫，吸收检测后的样本；

M6：支撑板，由PVC制成，作为反应体系的支撑物；

M7：双面和单面胶带，可以有不同规格，用于固定各反应膜和吸水材料于M6上；

M8：透明保护胶带，固定和保护样本垫和胶体金垫；

M9：彩色标志胶带，作为该检测试条的特征标识。

包被好的EPSES测试带和BT-Cry1Ab/Ac测试带分别固定在试剂底板内，测试带中包含完整的膜反应体系(M1-M9)。M1-M9是固定胶体金垫采用吸附力较强的玻璃纤维，作为金标记抗体的固相载体；硝酸纤维素膜是高蛋白亲和性的高分子纤维素膜(NC膜)，经预处理后制备为反应膜用来作为***反应的载体和显示反应结果；样品吸收垫(含反应辅助材料垫)有较强吸水能力的玻璃纤维和无纺布，经特殊处理后，为反应***提供适合的反应条件，并帮助吸水；吸收垫是吸水垫；PVC底板是一种塑料基板，作为反应体系的支撑物。

所述高分子纤维素膜M1可选用硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、尼龙膜等高分子膜，经预处理后制备为反应膜；

所述的样本垫M2a、M2b、M3可选用玻璃纤维或其它吸水性强的纤维性薄膜；

所述胶体金标记抗体载体膜M4可选用吸附力较强的玻璃纤维或其它纤维性薄膜，在载体膜上喷涂胶体金-抗体复合物；

所述支撑板M6为塑料薄板或其它疏水性薄板。

所述的胶体金标记抗体为EPSPS或BT-Cry1Ab/Ac单克隆抗体。

上述胶体金的制备方法是：氯金酸(HAuCl₄)在还原剂作用下，聚合成一定大小(直径在1-150nm)的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，称胶体金，属于多相不均一体系，颜色呈桔红色到***，为反应提供肉眼可检测的信号。

胶体金标记，实质上是蛋白质(抗体)大分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合，属于物理吸附。

胶体金标记抗体通过高度特异的抗原抗体反应(双抗体夹心法：抗体-抗原-抗体)，实现对转基因产物的特异检测。

来自一种抗原决定簇的单抗或多抗包被于反应膜上作为检查带，来自另一种抗原决定簇的单抗标记上胶体金作为显色剂，以抗原(EPSPS蛋白 & BT-Cry1Ab1/Ac蛋白)为中间偶联体，将分散状态下太小肉眼无法观察到的胶体金颗粒通过免疫反应聚集在反应膜上，使胶体金颜色被放大肉眼能够观察到。胶体金的这种显色方式为物理显色，无需底物参与反应，方法简单直观。

本发明检测技术的核心是利用高度完善的膜反应体系，提供实现液体样本平行移动及完成免疫亲和层析的特异反应所须的各种条件，并将EPSPS & BT-Cry1Ab/1Ac测试带装配在同一试剂底板内。EPSPS & BT-Cry1Ab/1Ac联检金标免疫检测试剂盒***使用高分子纤维膜作为固相载体。该膜具有很强的吸附功能，EPSPS & BT-Cry1Ab/1Ac抗体分别包被于不同的膜并经干燥处理后即作为固相，可与液相中的相应抗原-胶体金标记抗体复合物快速结合。在湿润状态下，液相中的抗原-胶体金标记抗体复合物可因“灯芯引流现象”作快速定向泳动并与固相膜上的特异抗体结合，形成特异的金标记抗体-抗原-抗体红色沉积线。

本发明的目的是这样实现的：当底板盖入上盖后，每个观测窗和加样孔各分别对应一条测试带，通过盒盖上的加样孔和观测窗可进行加样和观察检测结果，每个观测窗可分别检查一种基因。

每个观测窗分为测试区(T)和质控区(C)两部分，可在上盖上用字母C、T标示出。

检测时，将送检物品的同一种提取液分别滴加在试剂盒的两个加样孔中，3-5分钟后，通过肉眼就可以从上盖的两个观测窗上直接观察到准确的检测结果。

对于每个观测窗来说，用以下方式判断检测结果(参见图4～图6)：

1、阴性(-)：

反应状况：观测窗质控区(C)出现一条***条带。

检测结果：待检样品中不含待检基因或其含量在其阈值以下。

原因分析：

质控区内(C)所显现的***条带是判定是否有足够的植物样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

如样本中不含特定EPSPS或BT-Cry1Ab/1Ac蛋白，或其浓度低于检测灵敏度，胶体金抗体在层析过程中不会与固定在膜上检测带内的抗体反应，因而测试区内(T)不会出现一条***检测带。

2、阳性(+)：

反应状况：观测窗质控区(C)出现一条***条带，在测试区(T)内同时出现***条带。

检测结果：待检基因含量在阈值以上。

原因分析：

如果待测植物样品中EPSPS或BT-Cry1Ab/1Ac蛋白浓度高于其检测阈值时，抗原免疫金与检测带上的另一抗体结合，因此在测试区内(T)出现***检测带。

3、无效：

反应状况：质控区(C)未出现***条带，

检测结果：表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。

本发明所述试剂盒和检测方法的优点在于：

1)特异性强：EPSPS & BT-Cry1Ab/1Ac的检测试条均以高特异性CP4 EPSPS或BT-Cry1Ab/1Ac抗体制备，与其它非目的蛋白的交叉反应很低。

2)敏感性高：EPSPS & BT-Cry1Ab/1Ac的检测试条分别选用EPSPS & BT-Cry1Ab/1Ac单抗标记胶体金，胶体金与抗体间无共价键形成，因而对抗体的特异性和亲和力影响很小，检测灵敏度可达0.5ng/ml，达到了与ELISA方法相似的灵敏度。

3)操作简便：一步法操作，同时检测EPSPS和BT-Cry1Ab/1Ac，不需其它任何附加仪器设备。直接将待测样品液滴加在加样孔中即可。

4)检测结果形象、准确、快速：检测结果可在3-5分钟内肉眼直接判定。两条***条带为阳性，一条***条带为阴性。

5)经济高效：一个检测盒可同时检测2种不同的转基因成份，大大降低了使用成本。

6)应用广泛：可检测玉米、棉花、水稻、烟草等各类农作物的叶片、种子及加工产品。由于本发明提供的联检试剂盒同时可对植物样品进行EPSPS & BT-Cry1Ab/1Ac分析，检测快速、特异、敏感、方便，特别适用于转基因产品的研制开发和转基因产品的快速筛选，可用于边防、海关植物检测、食品安全检测及种子经营销售部门现场、快速筛查待测样品。

附图说明：

图1～图3是本发明一种试剂盒的结构示意图。

其中图1是底板的俯视图，可看到底板内有两条测试带；

图2是试剂盒上盖的俯视图，图2中1是加样孔，2是观测窗；

图3是测试带膜反应体系的结构示意图。

图4～图6是试剂盒检测结果示意图。其中图4表示检测结果无效，图5表示阴性结果，图6表示阳性结果。图中T代表检测线，C代表质控线。

具体实施方式：

实施例1  制备测试带

以下用制备检测EPSPS的测试带来举例说明：

1.EPSPS单抗腹水的制备

小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml。1周后，将EPSPS单抗杂交瘤细胞注射于以上预先处理过的BALB/C小鼠腹腔，每只小鼠注射杂交瘤细胞1～3×106。10天后收获腹水，以上过程皆在无菌条件下完成。

2.EPSPS单克隆抗体的纯化

1)以DEAE离子交换层析及Sephacryl S300分子筛对单抗进行纯化；SDS-PAGE平板电泳检测纯化单抗的纯度；ELISA法测定单抗活性；

2)纯化过程：取小鼠单抗腹水→3,000rpm离心15分钟→上清液加50％硫酸铵沉淀，过夜→3,000rpm离心20分钟→沉淀溶于0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.2)→S-300凝胶柱→DEAE Blue层析柱→0-800mM NaCl梯度洗脱→超滤离心，浓缩单抗；

3)单抗纯度测定：常规SDS-PAGE电泳，上述方法所纯化的单抗的纯度皆在95％以上；

4)蛋白浓度测定：紫外分光光度计测定279nm处的O.D.值，按以下公式计算蛋白含量：OD_279/1.4＝mg/ml(纯化单抗)。将单抗浓度调节为约1mg/ml；

5)单抗活性测定：选用EPSPS抗原包被ELISA板(1μg/孔)，及羊抗鼠IgG-HRP复合物，测定各单抗效价(大于1∶5000)。

3.羊抗DOA_T高效价免疫抗血清的制备和纯化

1)纯化好的上述单抗+完全佐剂→免疫山羊→加强免疫二次，每次间隔一月→第二次加强后10天左右取血→离心取血清→硫酸铵沉淀→DEAE离子交换层析纯化；

2)效价测定：ELISA夹心法，抗体效价稀释度应大于1∶256；

3)蛋白浓度测定：紫外分光法测定OD₂₇₉，计算蛋白浓度。

4.胶体金及金标抗体制备

1)胶体金的制备：以柠檬酸盐还原法制备40-60nm的胶体金。将0.01％HauCl₄加热至沸，加入一定量的1％柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，继续加热煮沸5分钟，待胶体金溶液颜色由兰→紫→红，稳定后，冷却即可。胶体金溶液应清亮透明，如需长期保存，可加入0.02％NaN₃。

2)将胶体金液500ml用0.1M NaOH调pH8.4，磁力搅拌下缓慢加入单抗2ml，搅拌20分钟。5,500rpm离心30Min，除去上清液中未结合的蛋白质。离心后吸取胶体金标记抗体沉淀，沉淀溶于10ml保存液中，用0.45μm微孔滤膜过滤。取样进行检定，其余置4℃保存。

5.膜反应体系M1的制备

1)将EPSPS抗体及纯化的羊抗鼠IgG以0.1M磷酸盐缓冲液稀释，终浓度为约0.2-2mg/ml。

2)纯化的羊抗鼠IgG溶于0.1M磷酸盐缓冲液中，浓度为2.0mg/ml；

3)硝酸纤维素膜大小：10cm×27cm，每张膜可喷长25cm的检测及控制带各4条；

4)将以上两种溶液分别加入Biodot XYZ3000喷涂机的二个喷头储存瓶中；

5)设置喷速为2μl/cm，NC膜的移行速度为50mm/s。以单抗EPSPAD2(2mg/ml)在NC膜上包被反应检测线，以1.0mg/ml兔抗鼠IgG包被反应对照线，对照线与检测线的距离为4-4.5mm；

6)完成包被后，置37℃干燥箱24小时，用BB封闭液封闭处理半小时，用WB洗液抽洗一次；

7)37℃干燥箱干燥备用；

8)切制备好的硝酸纤维素膜：1.8cm×27cm/条，放入铝薄袋中密封干燥保存。置室温保存备用。

6.膜反应体系M2a、M2b及M3的制备

将吸水纤维膜分别浸泡于M2a、M2b、M3溶液中，浸透后，取出晾干，装入塑料袋中，室温保存。

1)M2a制备：将制好的玻璃纤维切27cm×1.2cm/条；

2)M2b制备：将制好的玻璃纤维切27cm×1.8cm/条；

3)M3制备：将制好的玻璃纤维切27cm×1.2cm/条。

7.膜反应体系M4的制备

1)取胶体金-单抗复合物加稀释液，混匀配成工作浓度；

2)将溶液加入喷涂机Biodot的Airjet喷头储存瓶中；

3)设定压力为15PSI，玻璃纤维膜的移动速度为50mm/s；

4)喷制规格为0.5-1.5cm×25cm/条，每条喷2遍；

5)于37℃烘干12小时，放入铝薄袋中，加入干燥剂，热合封口，室温保存。

8.反应体组装

1)在M6塑料基板上贴双面胶带M7二条；

2)在M7中间贴反应膜M1(18mm)，离M6上缘约22mm；

3)在M7上贴M5(22mm)，与M6上缘对齐并与M1上缘交1mm；

4)在M7上贴M2a(12mm)，与M1下缘相接；

5)在M2上贴M4(10mm)，压住M1下缘0.5mm；

6)在M7上贴M3(12mm)，上缘压住M4约2/3；

7)在M7上贴M2b(18mm)，上缘压住M4约2/3，下缘与M7的下缘对齐；

8)在M4和M7上贴透明保护胶带M8，上缘完全压住M4，并压住M1约1.5mm；

9)在M5上贴彩色标记胶带M9，与M1上缘交1mm，另一端翻过M6上缘，贴于M6被面；

10)将组装成型的反应体用全自动切条机切成3.5mm规格。

实施例2  试剂盒装配

将制备好的检测EPSPS蛋白和检测BT蛋白的两种测试带分别嵌入底板的两个凹槽中，然后将上盖与底板扣紧，即成试剂盒。

将试剂盒、滴管和使用说明书装塑料袋封装。

实施例3  试剂盒使用过程

1.检测样本处理及准备

植物种子、叶子、籽苗等样本在检测前需经研磨，并以蒸馏水抽提和稀释。为获得最佳检测效果，各不同样品应根据下表中的比例稀释，在完成研磨和稀释后，将样本混匀，静置，取上清液作为检测样品。

植物种类	叶子及籽苗	种子
			叶子/蒸馏水(g/ml)	种子/蒸馏水(g/ml)
	玉米	1∶20			1∶2
棉花			1∶10	1∶4
	其余双子叶植物	1∶10			1∶4
其余单子叶植物			1∶20	1∶2

2.检测及结果

将检测盒平放，用所配塑料吸管吸取样品液，滴加4-5滴于检测盒的加样孔1中，吸水材料使待检样品缓慢移动，膜反应体系被启动。无论待测基因是否存在于植物样品中，一条***条带都会出现在质控区内(C)。质控区内(C)所显现的***条带是判定是否有足够的植物样品液，层析过程是否正常的标准，同时也作为试剂的内控标准。

3.结果判定：

每一个观测窗检测一种待检基因是否存在。以下以检测EPSPS为例说明：

1)如样本中不含特定EPSPS蛋白，或其浓度低于检测灵敏度，胶体金抗体在层析过程中不会被固定在膜上检测带内的单抗免疫，因而测试区内(T)不会出现一条***检测带，显示阴性(-)结果，即仅在质控区(C)内出现一条***条带。(见图5)

2)如果待植物样品中EPSPS蛋白浓度高于其检测阈值时，抗原免疫金与检测带上的另一单抗结合，在测试区内(T)将还出现另一***检测带，显示阳性(+)结果，即在质控区(C)和检测区内各出现一条***条带。注意：测试区(T)内的***条带可显现出颜色深浅的现象。但是，在规定的观察时间内，不论该色带颜色深浅，都应判定为阳性结果。(见图6)

3)如质控区(C)未出现***条带，则检测结果无效，表明不正确的操作过程或试剂盒已变质损坏。(见图4)

Claims (4)

1.一种联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒，它包括底板和上盖，底板盖入上盖后组成试剂盒，其特征在于底板上放置有两条测试带；上盖有两个观测窗和两个加样孔。

2.根据权利要求1所述的联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒，其特征在于所述底板的上表面设置有两条凹槽，每条凹槽内嵌入一条测试带。

3.根据权利要求1或2所述的联检EPSPS和BT蛋白的试剂盒，其特征在于所述观测窗是长方形。

4.一种联检EPSPS和BT蛋白的方法，其特征在于用权利要求1或2所述的联检EPSPS基因和BT基因的试剂盒进行检测；操作步骤是：将送检物品的同一种提取液分别滴加在试剂盒的两个加样孔中，3-5分钟后，通过上盖的两个观测窗直接观察结果。

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