CN1773263A - 一种酚红比色双试剂及其测定血清碳酸氢根的方法 - Google Patents
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Abstract
一种酚红比色双试剂及其测定血清碳酸氢根的方法，含R1、R2试剂组成的测定液和A、B液等量混合的标准液，R1试剂含3.0g～15.0g氯化钠、0.5g～5.0g叠氮钠、0.6ml～2.0ml盐酸、0.5ml～5.0ml TritonX－100、1000ml蒸馏水等；R2试剂为1.0g/L～10.0g/L酚红浓溶液；A液为30.0mmol/L～80.0mmol/L NaHCO3溶液，B液含1.0g～2.0g KH2PO4、10.0g～20.0gNa2HPO4·12H2O、0.5ml～5.0ml TritonX－100、0.5g～5.0g叠氮钠、1000ml蒸馏水等。手工测定法：将R1、R2试剂加入血清、标准液中，进行显色对比计算；全自动测定法：将R1、R2试剂加入标准液中，确定线形参数，再测定血清，与其对比计算；具有试剂稳定，保存期长，准确可靠，操作简便，适应各级实验室等特点。
Description
技术领域
本发明涉及一种在临床检查中用于分析测定血清碳酸氢根的酚红比色双试剂及使用该试剂分析测定血清碳酸氢根的方法。
背景技术
血清碳酸氢根是临床常规测定项目，对诊断酸碱平衡紊乱有着重要意义。目前国内外测定血清碳酸氢根(分子式：HCO3 -)的方法主要有血气分析仪法、电极法、酶法及滴定法。但这些方法都不同程度地存在着一定的缺陷.
1、血气法 原理：根据pH＝pk+log[HCO3 -]/α.PCO2，通过测出pH、PCO2计算出HCO3 -浓度。需要价格10万至几十万元昂贵的血气分析仪才能测定，分析仪中有三个电极即pH电极、CO2分压电极、氧分压电极。基层医院因经济原因难以采用，而且需抽取动脉血，也不适合临床常规应用。
2、电极法 原理：样品酸化后CO2穿过硅橡胶膜扩散到稀释的碳酸氢盐缓冲液中，结果引起的PH改变后若用PH电极测定，则与总CO2含量有关。虽简便快速，但仪器昂贵且测定成本较高，基层医院仍难以应用，结果的准确性受CO2电极的状态影响较大，测定线性在10-50mmol/L，低于10mmol/L的标本结果测定不准。
3、酶法 原理：磷酸烯醇丙酮酸(PEP)+HCO3 -后在PEP羧化酶作用下生成草酰乙酸和磷酸；乙酰乙酸+NADH+H+在苹果酸脱氢酶作用下生成苹果酸和NAD+。
酶法优点是特异性较强，可以进行半自动和全自动测定。但缺陷是试剂主要依赖进口，多为干粉单一试剂，受溶解液的pH值、试剂瓶口径、平衡时间长短等因素影响较大，试剂空白不稳定，需经常进行定标，试剂成本高(4-10元/ml)，试剂保存期短，单一试剂不能自动消除样本空白对结果的干扰。测定线性5-40mmol/L，高于40mmol/L的标本需要稀释后重做，相对较麻烦，测定标准液为单一碳酸氢钠溶液，稳定性差。
4、滴定法原理：血清中加入过量标准盐酸溶液，使酸与HCO3 -起中和反应，释放出CO2，然后以标准的NaOH溶液滴定剩余的盐酸，以NaOH的消耗量计算出血清HCO3 -含量，以血清原来的pH值作为滴定终点。优点是标本量少时省时省力，成本低廉，但缺点是精密度差，特别是低结果标本滴定准确非常困难，大批量测定时费时费力，不能用于自动化分析。
通过比较以上现有测定技术，综合存在以下缺陷：(1)测定条件要求高，需要昂贵的仪器，不能在各级医院开展应用(如血气法和电极法)。(2)测定试剂需要依赖进口(酶法)，成本高，酶试剂不稳定保存期短，单一试剂不能消除标本内源性干扰。(3)滴定法为手工测定法，误差大，不能用于仪器测定，成本虽低，应用越来越少。
发明内容
本发明的目的是提供一种酚红双色对比的酚红比色双试剂，该试剂成份稳定，保存期长，所采用的标准液基质成份与血清基本相同；以及利用该试剂进行测定血清碳酸氢根的方法，该方法准确可靠，操作简便，成本低廉，能适应各级实验室应用。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案是：本发明是将血气法和滴定法的测定原理科学地结合起来，根据朗-伯比尔定律，利用酚红双色对比法，采用液体双试剂分步反应与显色，通过自动测定显色液吸光度来计算血清碳酸氢根浓度。
本发明的试剂为双试剂，包含有测定液和标准液；测定液包含有R1试剂、R2试剂；R1试剂为中和血清中部分碳酸氢根的酸性反应试剂，R2试剂为显色的酚红溶液。标准液包含有A液、B液；在测定时把A液和B液等量混合为标准液，标准液的基质成分与血清基本接近。标准液中的A液、B液具有成分稳定，保存期长的特点。
R1试剂包含有氯化钠、叠氮钠、盐酸、TritonX-100、蒸馏水等，pH4.5～6.8；氯化钠、叠氮钠、盐酸、TritonX-100、蒸馏水的配比为：
氯化钠(AR级)3.0g～15.0g，
叠氮钠(AR级)0.5g～5.0g，
1mol/L盐酸0.6ml～2.0ml(可用相同摩尔数的硫酸、草酸、硝酸代替)；
TritonX-100(AR级)0.5ml～5.0ml。
蒸馏水1000ml。
R1试剂的制取方法：将氯化钠、叠氮钠、盐酸、TritonX-100、溶于蒸馏水中，并调整pH值。
R2试剂包含有酚红、氯化钠、TritonX-100、蒸馏水等，酚红、氯化钠、TritonX-100、蒸馏水的配比为
1.0g/L～10.0g/L酚红浓溶液0.6ml～20.0ml，
氯化钠(AR级)3.0g～15.0g，
TritonX-100(AR级)0.5～5.0ml，
蒸馏水1000ml。
R2试剂的制取方法：将精确称取1.0g/L～10.0g/L酚红溶于蒸馏水中，加1mol/LNaOH10ml～40ml，制取中间液，过滤备用。在使用时，将该中间液与氯化钠、TritonX-100溶于蒸馏水中，制取R2试剂。
为适应各型全自动生化仪的使用，R2试剂可以是浓缩型R2试剂。浓缩型R2试剂包含有酚红、氯化钠、TritonX-100、蒸馏水等，酚红、氯化钠、TritonX-100、蒸馏水的配比为
1.0g/L～10.0g/L酚红浓溶液0.6ml～20.0ml，
氯化钠(AR级)3.0g～15.0g，
TritonX-100(AR级)0.5～5.0ml，
蒸馏水250ml。
浓缩型R2试剂的制取方法：在使用时，将中间液、氯化钠、TritonX～100溶于蒸馏水中。
A液为30.0mmol/L～80.0mmol/LNaHCO3溶液，
A液的制取方法：将NaHCO3(AR级)溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水中。
B液为pH7.20～7.50磷酸盐缓冲液：B液包含有：KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、叠氮钠、蒸馏水等。KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、叠氮钠、蒸馏水的配比为：
KH2PO4(AR级)1.0g～2.0g，
Na2HPO4.12H2O(AR级)10.0g～20.0g，
TritonX-100(AR级)0.5ml～5.0ml，
叠氮钠(AR级)0.5g～5.0g，
蒸馏水1000ml。
B液的制取方法：将KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、叠氮钠溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml，调节pH值在7.20～7.50范围内。
标准液：临用前取A、B二液等量混合为标准液，标准液的浓度值在15.0mmol/L～40.0mmol/L之间，pH值在7.45～7.85之间。
利用本发明的酚红比色双试剂对血清碳酸氢根(HCO3 -)进行测定，其测定原理如下：根据H-H方程即pH＝pK+log[HCO3 -]/α.pCO2原理，pH的高低主要取决于血清HCO3 -与pCO2的比值大小，当待测血清和标准液与试剂R1混合，中和掉血清和标准液中部分HCO3 -，显色液pH的高低则主要取决于血清中剩余部分HCO3 -浓度。用试剂R2酚红显色，其显色液吸光度在558nm与血清HCO3 -浓度成线性关系。与同样处理的标准液比色即可求出血清中碳酸氢根浓度。
本发明的血清碳酸氢根测定的方法有两种：全自动分析法、手工测定法。
手工测定法：取三支试管，分别标记测定管(R)、标准管(S)、对照管(B)。在测定管(R)中加入待测血清，在标准管(S)中加入与血清等量的标准液；然后在测定管(R)、标准管(S)、对照管(B)中各加入血清10倍量的R1试剂(此时对照管(B)中只有R1试剂)；混匀放36～38℃水浴580～620秒钟；R1试剂中的酸中和掉部分碳酸氢根，经加温反应后CO2分压下降在0.32～0.34kPa左右；取出再各加入与R1试剂等量的R2试剂(显色反应)，置半自动生化仪以对照管(B)调零比色测定(测定结果)。
在半自动生化仪比色测定时，设置参数为：比色法为终点法，波长546nm，温度37℃，比色光径1cm，吸液量不少于500μl，标准液浓度25.0mmol/L。
根据测定结果计算出血清HCO3 -浓度。计算方法为：
血清HCO3 -浓度(mmol/L)＝AR/AS×标准应用液浓度(mmol/L)。
式中：AR为测定管(R)吸光度值，
AS为标准管(S)吸光度值。
全自动分析法：首先确定主要线性参数，然后测定血清，与线性参数进行对比，计算出血清HCO3 -。
主要线性参数的确定：反应类型：两点终点法；反应温度：36～38℃；主波长530～570nm，次波长不设；孵育时间580～620秒钟；标准液置于标准管(S)内，R1试剂、R2试剂均为标准液的10倍的量(R2试剂为浓缩型时，浓缩型R2试剂为标准液的2.5倍的量)；反应方向：正反应。第一点读数290～310秒钟，第二点读数580～620秒钟；两点线性校正，以此为基准。
将待测血清置于测定管(R)内，R1试剂、R2试剂均为血清的10倍的量；采用浓缩型R2试剂时，浓缩型R2试剂为血清的2.5倍的量；反应方向：正反应；反应温度：36～38℃；主波长530～570nm，次波长不设；孵育时间580～620秒钟；第一点读数290～310秒钟，第二点读数580～620秒钟。再将读数与基准进行对比，并根据测定结果计算出血清HCO3 -浓度。其计算方法同手工测定方法中的计算方法。
由于本发明采用测定液与血清分步反应、显色，再利用测定液与标准液分步反应、显色，将两者显色结果进行对比，来计算血清碳酸氢根浓度。测定液包含有R1试剂、R2试剂；R1试剂为中和血清中部分碳酸氢根的酸性反应试剂，R2为显色的酚红溶液。标准液包含有A液、B液；在测定时把A液和B液等量混合为标准液，标准液的基质成分与血清基本接近。标准液中的A液、B液成分稳定，保存期长。测定方法可用手工测定法，该方法操作简单。试剂和标准液所用的药品为常见和价格低廉的药品，成本低。因此本发明具有试剂成份稳定，保存期长，基质成份与血清基本相同；以及利用该试剂进行测定血清碳酸氢根的方法准确可靠，操作简便，成本低廉，是一种能适应各级实验室应用的血清碳酸氢根测定的方法；该测定方法既能满足手工测定，也能满足全自动、半自动的测定等特点。
具体实施方式
本发明的酚红比色试剂为双试剂，包含有测定液和标准液；测定液包含有R1试剂、R2试剂；R1试剂为中和血清中部分碳酸氢根的酸性反应试剂，R2为显色的酚红溶液。标准液包含有A液、B液；在测定时把A液和B液等量混合为标准液，标准液的基质成分与血清基本接近。
测定液的实施例：
测定液实施例1：
R1试剂：pH4.5～pH5.0：
氯化钠(AR级)4.0g～6.0g；
叠氮钠(AR级)0.5g～1.0g；
lmol/L盐酸1.6ml～2.0ml(可用相同摩尔数的硫酸、草酸、硝酸代替)、
TritonX-100(AR级)0.5ml～1.5ml。
溶于1000ml蒸馏水中。
R2试剂：
1.0g/L～3.0g/L酚红浓溶液：精确称取酚红(AR级)1.0g～3.0g，溶于1000ml
蒸馏水中，加1mol/LNaOH20ml～40ml，制取中间液，过滤备用。
在使用时，取中间液4.5ml～20.0ml，
氯化钠(AR级)3.0g～7.0g，
TritonX-100(AR级)0.5ml～1.5ml，
溶于蒸馏水1000ml。
当R2试剂为浓缩型时：
R1试剂与R2试剂体积为4∶1剂型(主要适用各型全自动生化仪)：
R1试剂配制方法不变。只将R2试剂体积浓缩4倍(蒸馏水体积为250ml，试剂成份不变)。
测定液实施例2
R1试剂与R2试剂体积为1∶1剂型(适用于半自动和全自动)：
R1试剂：pH5.1～pH5.5：
氯化钠(AR级)5.0g～12.0g；
叠氮钠(AR级)1.0g～3.5g；
1mol/L盐酸1.1ml～1.5ml(可用相同摩尔数的硫酸、草酸、硝酸代替)，
TritonX-100(AR级)1.5ml～3.5ml。
溶于1000ml蒸馏水中。
R2试剂：
3.1g/L～5.0g/L酚红浓溶液：精确称取酚红(AR级)3.1g～5.0g，溶于1000ml蒸馏水中，加lmol/LNaOH 20ml～25ml，制取中间液，过滤备用。使用时，取中间液1.5ml～6.0ml，
氯化钠(AR级)5.0g～9.0g，
TritonX-100(AR级)2.0ml～5.0ml，
溶于蒸馏水1000ml。
R1试剂与R2试剂体积为4∶1剂型(主要适用各型全自动生化仪)：
R1试剂配制方法不变。只将R2试剂体积浓缩4倍(蒸馏水体积为250ml，试剂成份不变)。
测定液实施例3
R1试剂与R2试剂体积为1∶1剂型(适用于半自动和全自动)：
Rl试剂：pH5.6～PH6.0：
氯化钠(AR级)6.0g～11.0g，
叠氮钠(AR级)2.5g～4.0g，
1mol/L盐酸0.7ml～1.5ml(可用相同摩尔数的硫酸、草酸、硝酸代替)，
TritonX-100(AR级)1.0ml～3.5ml，
溶于1000ml蒸馏水中。
R2试剂：
5.1g/L～8.0g/L酚红浓溶液：精确称取酚红(AR级)5.1g～8.0g，溶于1000ml蒸馏水中，加1mol/LNaOH 22ml-30ml，制取中间液，过滤备用。使用时，取中间液1.0ml～4.5ml，
氯化钠(AR级)5.0g～13.0g，
TritonX-100(AR级)1.5ml～3.6ml，
溶于蒸馏水1000ml。
R1试剂与R2试剂体积为4∶1剂型(主要适用各型全自动生化仪)：
R1试剂配制方法不变。只将R2试剂体积浓缩4倍(蒸馏水体积为250ml，试剂成份不变)。
测定液实施例4
R1试剂与R2试剂体积为1∶1剂型(适用于半自动和全自动)：
R1试剂：pH6.0～pH6.8，
氯化钠(AR级)8.0g～15.0g，
叠氮钠(AR级)3.5g～5.0g，
1mol/L盐酸0.6ml～1.2ml(可用相同摩尔数的硫酸、草酸、硝酸代替)，
TritonX-100(AR级)1.0ml～2.5ml。
溶于1000ml蒸馏水中。
R2试剂：
8.1g/L～10.0g/L酚红浓溶液：精确称取酚红(AR级)8.1g～10.0g，溶于1000ml蒸馏水中，加lmol/LNaOH 30ml～40ml，制取中间液，过滤备用。使用时，取中间液0.6ml～4.0ml，
氯化钠(AR级)4.0g～10.0g，
TritonX-100(AR级)2.3ml～3.8ml，
溶于蒸馏水1000ml。
R1试剂与R2试剂体积为4∶1剂型(主要适用各型全自动生化仪)：
R1试剂配制方法不变。只将R2试剂体积浓缩4倍(蒸馏水体积为250ml，试剂成份不变)。
标准液实施例1
A液(30mmol/L～35mmol/LNaHCO3溶液)：
精确称取NaHCO3(AR级)2.52克～2.94克溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml中。
B液：pH7.20～7.25磷酸盐缓冲液：
KH2PO4(AR级)1.0g～1.8g，
Na2HPO4.12H2O(AR级)10.0g～19.1g，
TritonX-100(AR级)0.5ml～3.0ml，
叠氮钠(AR级)0.5g～1.9g，
溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml。
用时取A、B等量混合即为标准液(浓度15.0mmol/L～17.5mmol/L)。
标准液实施例2
A液(40mmol/L～50mmol/LNaHCO3溶液)：
精确称取NaHCO3(AR级)3.36g～4.2g溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml中。
B液：pH7.3～7.35磷酸盐缓冲液：
KH2PO4(AR级)1.1g～1.9g，
Na2HPO4.12H2O(AR级)10.6g～19.3g，
TritonX-100(AR级)2.0ml～4.5ml，
叠氮钠(AR级)1.5g～3.5g，
溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml。
用时取A、B等量混合即为标准液(浓度20.0mmol/L～25.0mmol/L)。
标准液实施例3
A液(55mmol/L～60mmol/LNaHCO3溶液)：
精确称取NaHCO3(AR级)4.62克～5.04克溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml中。
B液：pH7.4～7.45磷酸盐缓冲液：
KH2PO4(AR级)1.2g～1.95g，
Na2HPO4.12H2O(AR级)11.0g～19.6g，
TritonX-100(AR级)1.5～2.8ml，
叠氮钠(AR级)3.6～5.0g，
溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml。
用时取A、B等量混合即为标准液(浓度27.5mmol/L～30.0mmol/L)。
标准液实施例4
A液(70mmol/L～80mmol/LNaHCO3溶液)：
精确称取NaHCO3(AR级)5.88克～6.72克溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml中。
B液：pH7.46～7.5磷酸盐缓冲液：
KH2PO4(AR级)1.3g～2.0g，
Na2HPO4.12H2O(AR级)11.5g～20.0g，
TritonX-100(AR级)0.5ml～4.0ml，
叠氮钠(AR级)2.0g～5.0g，
溶于新鲜煮沸冷却的蒸馏水1000ml。
用时取A、B等量混合即为标准液(浓度35.0mmol/L～40.0mmol/L)。
本发明的血清碳酸氢根测定方法的实施例：
手工测定法：取三支一次性塑料试管，分别标记测定管(R)、标准管(S)、对照管(B)。分别在测定管(R)、标准管(S)中加入30μl待测血清和标准液，在测定管(R)、标准管(S)、对照管(B)中各加入R1试剂300μl，混匀放37℃水浴10分钟；试剂R1中的酸中和掉部分碳酸氢根，经加温反应后CO2分压下降在0.33kPa左右；取出再各加入R2试剂300μl(显色反应)，置半自动生化仪以对照管(B)调零比色测定(测定结果)。设置参数为：比色法为终点法，波长546nm，温度37℃，比色光径1cm，吸液量500μl，标准液浓度25.0mmol/L。
根据测定结果计算出血清HCO3 -浓度。计算方法为：
血清HCO3 -浓度(mmol/L)＝AR/AS×标准应用液浓度(mmol/L)。
式中：AR为测定管(R)吸光度值，
AS为标准管(S)吸光度值。
全自动分析法：首先确定主要线形参数，然后测定血清，与线形参数进行对比，计算出血清HCO3 -。
主要线性参数的确定：反应类型：两点终点法；反应温度：37℃；主波长546nm，次波长不设；孵育时间600s；标准液20μl，R1试剂200μl，R2试剂200μl(R2试剂为浓缩型时，浓缩型R2试剂为50μl)；反应方向：正反应。第一点读数300s，第二点读数600s；两点线性校正，以此为基准。
将血清样品20μl，R1试剂200μl，R2试剂200μl(R2试剂为浓缩型时，浓缩型R2试剂为50μl)；反应方向：正反应；反应温度：37℃；主波长546nm，次波长不设；孵育时间600s；第一点读数300s，第二点读数600s。再将读数与基准进行对比，并根据测定结果计算出血清HCO3 -浓度。其计算方法同手工测定方法中的计算方法。
利用本发明的酚红比色双试剂及其测定血清碳酸氢根的方法，经吸收光谱、检测线性、重复性、回收率、对照结果、干扰试验(溶血干扰、胆红素干扰、脂血干扰、肝素干扰)、试剂稳定性等试验，并与血气法、电极法、酶法、滴定法对比(详见附件：酚红比色双试剂测定血清碳酸氢根的效果情况的报告)表明，本发明具有试剂成份稳定，保存期长，基质成份与血清基本相同；以及利用该试剂进行测定血清碳酸氢根的方法，该方法准确可靠，操作简便，成本低廉，能适应各级实验室应用的血清碳酸氢根测定的方法等特点。
参考文献：
(1)柯军、王以立：二氧化碳酶法测定不稳定的因素 临床检验杂志 1996，14(6)：300
(2)韩志钧等主编：血气酸碱分析 辽宁科学技术出版社 第一版 1993，144
(3)孟泽姜剑铭：血液酸碱状态简易化学测定 临床检验杂志 1988，6(3)：127-129
附件：酚红比色双试剂测定血清碳酸氢根的效果情况的报告
Claims (4)
1、一种酚红比色双试剂，其特征在于包含有试剂和标准液；试剂包含有R1试剂、R2试剂；R1试剂为中和血清中部分碳酸氢根的酸性反应试剂，R2为显色的酚红溶液；标准液包含有A液、B液；把A液和B液等量混合后为标准液；
R1试剂包含有氯化钠、叠氮钠、盐酸、TritonX-100、蒸馏水，pH4.5～6.8；氯化钠、叠氮钠、盐酸、TritonX-100、蒸馏水的配比为：
氯化钠(AR级)3.0g～15.0g，
叠氮钠(AR级)0.5g～5.0g，
1mol/L盐酸0.6ml～2.0ml，
TritonX-100(AR级)0.5ml～5.0ml，
蒸馏水1000ml；
R2试剂包含有酚红、氯化钠、TritonX-100、蒸馏水；酚红、氯化钠、TritonX-100、蒸馏水的配比为：
1.0g/L～10.0g/L酚红浓溶液0.6ml～20.0ml，
氯化钠(AR级)3.0g～15.0g，
TritonX-100(AR级)0.5ml～5.0ml，
蒸馏水1000ml；
A液为30.0mmol/L～80.0mmol/LNaHCO3溶液；
B液为pH7.20～7.50磷酸盐缓冲液，B液包含有：KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、叠氮钠、蒸馏水，KH2PO4、Na2HPO4.12H2O、TritonX-100、叠氮钠、蒸馏水的配比为：
KH2PO4(AR级)1.0g～2.0g，
Na2HPO4.12H2O(AR级)10.0g～20.0g，
TritonX-100(AR级)0.5ml～5.0ml，
叠氮钠(AR级)0.5g～5.0g，
蒸馏水1000ml；
标准液：临用前取A、B二液等量混合为标准液，标准液的浓度值在15.0mmol/L～40.0mmol/L之间，PH值在7.45～7.85之间。
2、根据权利要求1所述的酚红比色双试剂，其特征在于所述的R2试剂为浓缩型R2试剂；浓缩型R2试剂包含有酚红、氯化钠、TritonX-100、蒸馏水，酚红、氯化钠、TritonX-100、蒸馏水的配比为
1.0g/L～10.0g/L酚红浓溶液0.6ml～20.0ml，
氯化钠(AR级)3.0g～15.0g，
TritonX-100(AR级)0.5～5.0ml，
蒸馏水250ml。
3、一种权利要求1所述的酚红比色双试剂测定血清碳酸氢根的方法，其特征在于：手工测定方法：取三支试管，分别标记测定管(R)、标准管(S)、对照管(B)，在测定管(R)中加入待测血清，在标准管(S)中加入与血清等量的标准液；然后在测定管(R)、标准管(S)、对照管(B)中各加入血清10倍量的R1试剂；混匀放36～38℃水浴580～620秒钟；R1试剂中的酸中和掉部分碳酸氢根，经加温反应后CO2分压下降在0.32～0.34kPa左右；取出再各加入与R1试剂等量的R2试剂(显色反应)，置半自动生化仪以对照管(B)调零比色测定(测定结果)；
根据测定结果计算出血清HCO3 -浓度，计算方法为：
血清HCO3 -浓度(mmol/L)＝AR/AS×标准应用液浓度(mmol/L)；式中：AR为测定管(R)吸光度值，
AS为标准管(S)吸光度值。
4、一种权利要求1所述的酚红比色双试剂测定血清碳酸氢根的方法，其特征在于：全自动分析法：首先确定主要线形参数，然后测定血清，与线形参数进行对比，计算出血清HCO3；
主要线性参数的确定：反应类型：两点终点法；反应温度：36～38℃；主波长530～570nm，次波长不设；孵育时间580～620秒钟；标准液置于标准管(S)内，R1试剂、R2试剂均为标准液的10倍的量(R2试剂为浓缩型时，浓缩型R2试剂为标准液的2.5倍的量)；反应方向：正反应。第一点读数290～310秒钟，第二点读数580～620秒钟；两点线性校正，以此为基准；
将待测血清置于测定管(R)内，R1试剂、R2试剂均为血清的10倍的量；采用浓缩型R2试剂，浓缩型R2试剂为血清的2.5倍的量；反应方向：正反应；反应温度：36～38℃；主波长530～570nm，次波长不设；孵育时间580～620秒钟；第一点读数290～310秒钟，第二点读数580～620秒钟。再将读数与基准进行对比，并根据测定结果计算出血清HCO3 -浓度；其计算方法同手工测定方法中的计算方法。
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