CN1772026A - 一种返魂草提取物,它的提取方法及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种返魂草提取物，它的提取方法及制剂，本发明的返魂草新的提取物，不含或几乎不含生物碱成分；其制备方法经过以下步骤：水提，醇沉，上阳离子交换树脂柱，本发明还提供用本发明的提取物作为药物活性成分制备的药物制剂，特别是口服的药物制剂，优选的是微丸制剂。

Description

一种返魂草提取物，它的提取方法及制剂

技术领域：

本发明涉及一种中药提取方法，特别涉及一种中药返魂草的提取方法，以及用该方法获得的提取物及其药物制剂。

背景技术：

上呼吸道感染(感冒)为多发病常见病。是呼吸道最常见的一种传染病，患者不分年龄、性别、职业和地区，全年皆可发病，冬春季多发，一个人一年内可有数次发病，并可引起严重并发症，不仅发病率高，而且是多种疾病的诱因。同时上呼吸道感染90％为病毒感染，发挥中药抗病毒作用势在必行。

慢性气管炎我国70年代全国6千万人普查平均发病率为3.82％，随着年龄增长患病率增高，50岁以上患者患病率高达15％或更多。北方气候寒冷高于南方，工矿地区高于一般城市，严重影响人们的身心健康。对此虽有研究，但迄今尚无特效疗法，对于抗炎抑菌西药虽有一定疗效但严重的毒副作用和耐药难以克服，

返魂草，是长白山特有的一种中草药，当地人患病，自己上山采药熬水喝已成***喘，消炎，国内还有人以此药治疗肺气肿，日本还有治疗肺癌的报道。现有返魂草冲剂有清热祛痰，止咳之功效。用于慢性支气管炎咳嗽。其制备方法遵从国家制定的中药标准，标准中的制备方法如下：

【制法】取返魂草1000g，加水煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1小时合并煎液，滤过，滤液浓缩成膏，加入蔗糖适量，混匀，制成颗粒，干燥，制成1000g，即得。

目前虽有返魂草冲剂、片剂、口服液上市，但均为药材的简单提取，有效部位不明确，而且未对特征性有毒成份生物碱进行研究，质量不易控制。本发明通过将返魂草深加工，制成新的制剂形式，特别是微丸制剂形式，集抗病毒、抑菌为一体，又具有止咳、化痰、平喘之功效。本发明先提取有效成份，随后通过阳离子交换树脂去除总生物碱，得到含有有效成分多，副产物少的新的提取物，然后经过制剂学技术制成微丸，毒性明显降低。

发明内容：

本发明提供一种返魂草新的提取物，该提取物的特征在于，不含或几乎不含生物碱成分。

本发明还提供本发明返魂草提取物的制备方法，该方法经过以下步骤：水提，醇沉，上阳离子交换树脂柱。

本发明还提供用本发明的提取物作为药物活性成分制备的药物制剂，特别是口服的药物制剂，优选的是微丸制剂。

本发明的返魂草提取物的制备方法，其中所述水提，是经过加水煎煮1-4次，每次加入水的量为5-15倍，每次1-3小时。

所述醇沉，是将水提取物浓缩得到清膏后，加入50-100％的乙醇，静置6-24小时，待沉淀析出后过滤掉沉淀，回收乙醇，浓缩得到清膏。

所述上阳离子交换树脂柱是将醇沉后得到的清膏加入到阳离子交换树脂柱，吸附10-60分钟，然后用水洗脱，得到水洗脱液，该洗脱液经干燥，得到本发明的提取物。。其中所述树脂是任何一种阳离子交换树脂，优选的是聚苯乙烯系阳离子交换树脂，或丙烯酸系阳离子交换树脂，其用量为清膏∶树脂＝1∶2-2∶1。

本发明得到的提取物形式可以是浸膏形式的物质，可以是干浸膏也可以是流浸膏，根据制剂的不同需要决定制成不同的浓度。

本发明最优选的制备方法如下：

取返魂草，加水煎煮三次，分别加水12-9倍、10-8倍、10-8倍，每次1-1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.30g/ml(80℃测)的清膏，放冷，加入95％乙醇，混匀，至醇相对密度75％，静置12小时，沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10～1.20g/ml(60℃测)的清膏，放冷，以清膏∶树脂＝1-2∶1-2的量，上阳离子交换树脂柱，在树脂柱上吸附20-40min，然后用水洗脱，收集水洗脱部分喷雾干燥，即得提取物。

以上方法得到的提取物，经过现有技术成规的生物碱检测仪器检测，其中生物碱含量小于0.5％。

本发明所术药物制剂，是将上述方法得到的不含或几乎不含生物碱成分的提取物作为药物活性成分，经过药物学常规技术，制备成任何一种形式的药物制剂，

在制备过程中，返魂草的重量是以生药计算的，该重量组成可制成药物制剂1000剂。所述1000剂指，制成的成品药物制剂，如制成胶囊制剂1000粒，片剂1000片，颗粒剂1000克，口服液1000ml等，作为颗粒剂也可以制成大包装，如100-500袋，具体可以是100袋、125袋、200袋、250袋、500袋等，每袋可作为1-2次服用剂量。以上组成，可制成50-1000次服用剂量的制剂，如作为片剂，制成1000片，制成胶囊1000粒，每次服用剂量可以是1-20片/或粒，共可服用50-1000次。如作为颗粒剂，制成125袋，每次服用1-2袋，共可服用62.5-125次。

以上组成是按重量作为配比的，在生产时可按照相应比例增大或减少，如大规模生产可以以公斤为单位，或以吨为单位。

本发明的中药制剂中的药物活性物质，其在制剂中所占重量百分比可以是0.1-99.9％，其余为药物可接受的载体。本发明的药物制剂，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，注射剂的每支等，单位剂量中，含有活性物质的量为5-800mg，优选的是20-500mg。

本发明的中药制剂可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、胶囊剂、口服液、糖浆剂、颗粒剂、丸剂、微丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴丸剂、贴剂、缓释制剂、控释制剂，优选的是微丸剂。

本发明的药物制剂，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。

适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂，例如硬脂酸镁。适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或***胶；非水性载体(它们可以包括食用油)，例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

本发明的药物制剂，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、微粉硅胶、碳酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

本发明的制剂在使用时根据病人的情况确定用法用量，可每日服1-4次，每次1-20剂，如：1-20粒或片。

以下通过药效学试验说明本发明的有益效果：

一、返魂草提取物抗病毒药效学研究报告

                          试验结果

1.各种病毒的TCID₅₀

流感病毒FM₁： $\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

CVB₃： $\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

HSV-1SM₄₄： $\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+30}{100}=-4.8$

AdV-3： $\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

RSV： $\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

副流感病毒： $\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

乙型流感病毒： $\mathrm{Log}{\mathrm{TCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

2.药物对细胞毒性测定结果

1)药物对细胞毒性测定结果

返魂草提取物对Hep-2、Hela细胞最大无毒浓度(TC₀)为12.50g/L，半数毒性浓度(TC₅₀)为98.53g/L，具体量效关系曲线详见图1。双黄连对Hep-2、Hela细胞

最大无毒浓度(TC₀)为18.75g/L，半数毒性浓度(TC₅₀)为90.61g/L。

2)药物对动物毒性测定结果

返魂草提取物小鼠灌胃给药半数致死剂量(LD₅₀)为2662g生药/kg，95％可信限为2134～3320g/kg。

3.药物对病毒致细胞病变保护作用结果

在感染30-100TCID₅₀的6种病毒的情况下，返魂草提取物在6.25g/L～12.5g/L浓度对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、单纯疱疹病毒I型有较明显的抑制其致细胞病变作用，对柯萨奇病毒B₃和腺病毒3型作用不明显。其作用结果详见表1、2。

                    表1  返魂草提取物对病毒致细胞病变作用的保护作用

病毒株	感染量	双黄连		返魂草提取物		病毒对照	细胞对照
								TCID5	18.75g/L	12.5g/L	6.25g/L	3.125g/L
	流感FM1CVB3AdV-3副流感RSVHSV-I	100301001005030	-+---	++--	+++++								++++++++	++++++++++++++++++++++++	------

注：-示无细胞病变；±示有延缓细胞病变作用；+示1/4以下的细胞病变；++示1/4～1/2的细胞有病变；+++示1/2～3/4的细胞有病变；++++示3/4以上的细胞有病变。

                    表2  返魂草提取物抑制细胞病毒感染的半数有效浓度及治疗指数

		流感FM1	CVB3	AdV-3	副流感	RSV	HSV-I
								返魂草提取物	IC 50(g/L)TI	3.38829.082	33.4672.944	19.3175.101	1.76555.824	1.96550.142	2.71436.304

4.药物对小鼠流感病毒性肺炎的影响

1)返魂草提取物对小鼠肺炎的影响结果，采用EXCEL统计软件，进行两组均数t检验，详见表3、4。返魂草提取物在9.430g/kg/d和28.300g/kg/d剂量时对甲型及乙型流感病毒性肺炎均有显著的治疗作用。

                  表3  返魂草提取物对小鼠甲型流感病毒性肺炎的作用( X±SD)

组别	剂量(g/kg/d)	动物(只)	肺指数值(g/g×100％)	肺病变减轻(％)	P值
						病毒对照正常对照双黄连返魂草提取物	--0.7828.3009.430	1010101010	1.604±0.1771.314±0.1361.408±0.0961.387±0.1321.429±0.096	--12.2213.5310.91	--＜0.01＜0.01＜0.05

2.8300.943

1010

1.488±0.1191.503±0.111

7.236.30

＞0.05＞0.05

             表4  返魂草提取物对小鼠乙型流感病毒性肺炎的作用( X±SD)

组别	剂量(g/kg/d)	动物(只)	肺指数值(g/g×100％)	肺病变减轻(％)	P值
						病毒对照正常对照双黄连返魂草提取物	--0.7828.3009.4302.8300.943	10101010101010	1.700±0.1861.314±0.1361.458±0.1021.443±0.0681.499±0.1561.573±0.1161.674±0.132	--14.2415.1211.827.471.53	--＜0.01＜0.01＜0.05＞0.05＞0.05

2)肺病变组织学和病理学检测结果

病毒性肺炎模型组镜下可见：支气管、细支气管壁、肺泡壁等肺间质充血、水肿以及淋巴细胞、单核细胞浸润，肺泡壁增宽，肺泡呈炎症反应。返魂草提取物治疗28.300g/kg/d及9.430g/kg/d剂量组鼠肺病变明显减轻，部分肺组织形态结构正常，最佳治疗剂量为28.300g/kg。

3)小鼠肺组织中病毒抗原滴度测定----血凝试验结果

血凝试验结果请见表5-6。

              表5  返魂草提取物对甲型流感病毒性肺炎小鼠肺组织血凝滴度的影响

组别	剂量(g/kg/d)	动物(只)	血凝滴度( X±S)	抑制率(％)	P
						病毒对照正常对照双黄连返魂草提取物	--0.7828.3009.4302.8300.943	10101010101010	32.40±3.500.0024.00±4.0022.00±3.6528.60±3.5330.20±3.3331.00±3.30	--25.9332.1011.736.794.32	--＜0.01＜0.01＜0.05＞0.05＞0.05

            表6  返魂草提取物对乙型流感病毒性肺炎小鼠肺组织血凝滴度的影响

组别	剂量(g/kg/d)	动物(只)	血凝滴度( X±S)	抑制率(％)	P
						病毒对照正常对照双黄连返魂草提取物	--0.7828.3009.4302.8300.943	10101010101010	33.20±3.430.0023.40±3.4322.60±3.5329.20±3.5530.40±3.3731.00±3.16	--29.5231.9312.058.436.63	--＜0.01＜0.01＜0.05＞0.05＞0.05

从上述两表可见，返魂草提取物治疗28.300g/kg及9.430g/kg剂量组，鼠肺中甲型和乙型流感病毒滴度均明显低于病毒对照组。

结论：返魂草提取物在体外有明显的抑制流行性感冒病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和单纯疱疹病毒I型的作用，对柯萨奇B3病毒和腺病毒3型的抑制作用不明显。体内抗病毒试验结果显示，返魂草提取物可有效抑制甲型和乙型流行性感冒病毒所致的病毒性肺炎，与模型对照组比较，差异显著。关于该药抗病毒的作用机理有待进一步深入研究。

二、返魂草提取物抗菌药效学试验结果

                   (一)体外抗菌试验试验结果

返魂草提取物对细菌的最小抑菌浓度(MIC)见表17。

                          表17  返魂草提取物对6种细菌体外MIC测定结果

细菌	株数	药物	MIC范围(g/L)	MIC50(g/L)	MIC90(g/L)
						金黄色葡萄球菌乙型溶血性链球菌肺炎球菌大肠埃希菌肺炎克雷伯菌铜绿假单胞菌	8116989	返魂草提取物双黄连返魂草提取物双黄连返魂草提取物双黄连返魂草提取物双黄连返魂草提取物双黄连返魂草提取物双黄连	62.5～12575～30062.5～12537.5～30031.25～62.518.75～30062.5～12537.5～30062.5～12537.5～15062.5～125150～300	62.57562.537.531.2562.562.537.562.537.562.5150	1253001253006.25300125300125150125300

                              试验结论

体外抑菌试验表明，返魂草提取物对肺炎球菌有一定的抑制作用，对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、乙型溶血性链球菌、肺炎克雷伯菌的抑制作用相对较弱。

                          (二)体内抗菌试验结果

返魂草提取物对肺炎链球菌感染小鼠的体内保护试验结果见表18。

                   表18  返魂草提取物对肺炎球菌感染小鼠的体内保护试验

药物	剂量(g/kg)	对数剂量	动物数(只)	死亡数(只)	死亡率(％)
						返魂草提取物	28.3009.4302.830	1.45180.97450.4518	101010	257	205070

双黄连生理盐水

0.9430.2830.780

-0.0255-0.5482

10101010

810210

8010020100

根据试验结果，采用Bliss软件处理，ED₅₀为：7.211g/kg

95％可信限：Ig(1.9756±1.2454)

95％可信区间：(2.0754-25.0545)

95％可信限：Ig(1.9756±2.2858)

95％可信区间：(0.7333-70.9117)

                              结论

体内试验结果表明返魂草提取物对肺炎链球菌菌株所致小鼠感染有明显的保护作用，其ED₅₀和95％可信限分别为7.211g/kg，2.0754-25.0545.

三、其他主要药效学试验研究

                            试验结果

一、抗炎试验

1、返魂草提取物对二甲苯致小鼠耳廓炎症水肿的影响

结果(见表20-1)表明，返魂草提取物8g/kg(低剂量组)、16g/kg(中剂量组)、32g/kg(高剂量组)给药1h后对二甲苯致小鼠的耳肿胀均有显著的抑制作用(p＜0.05，p＜0.001，p＜0.001)，抑制率分别为16.1％、24.9％、38.0％，且作用强度与剂量有一定的依赖性。阳性药返魂草颗粒16g/kg对此模型中耳肿胀也有明显的抑制作用(p＜0.01)，抑制率为23.7％。

          表20-1  返魂草提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响( X±SD，n＝12)

组别	剂量(g/kg)	肿胀度(mg)	抑制率(％)
				模型对照组返魂草提取物返魂草颗粒	-8163216	16.02±2.6313.44±2.02*12.03±1.60***9.93±2.44***12.23±2.35**	-16.124.938.023.7

^*p＜0.05 ^**p＜0.01 ^***p＜0.001，与模型对照组比较

2、返魂草提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响

结果(见表20-2)表明，此模型在致炎后4h达水肿高峰。返魂草提取物在致炎后2h即显效，与溶媒对照组相比，返魂草提取物5.4、10.8、21.6g/kg均能显著抑制1％角叉菜胶所致的大鼠足趾肿胀(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)。阳性药返魂草颗粒10.8g/kg在致炎后2h显效，其作用可持续到致炎后6h(p＜0.05，p＜0.01)。

             表20-2  返魂草提取物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的影响( X±SD，n＝12)

组别	剂量(g/kg)	不同时间点肿胀度(％)和肿胀抑制率
								1h	2h	3h	4h	5h	6h
		对照组返魂草提取物返魂草颗粒	5.410.821.610.8	28.66±15.3323.43±11.3818.2％23.12±4.8119.3％23.01±10.7919.7％23.62±5.1017.6％	57.97±23.1736.04±5.61*37.8％34.27±9.68*40.9％28.57±12.03**50.7％33.89±13.38*41.5％	72.87±25.1250.43±11.58*30.8％47.46±6.28**34.9％45.14±13.37**38.1％49.12±16..53*32.6％	91.95±29.2361.16±11.25*33.5％53.37±17.05**42.0％52.03±12.98***43.4％59.48±4.97*35.3％							79.58±30.4353.97±15.14*32.2％48.37±11.51*39.2％45.92±14.05**42.3％53.05±11.12*33.3％	80.05±25.3954.19±10.20*32.3％48.34±10.83*39.6％46.51±13.95**41.9％54.13±12.05*32.4％

^*p＜0.05 ^**p＜0.01，与对照组比较

3、返魂草提取物抗大鼠棉球肉芽肿的抑制作用

实验结果(见表20-3)表明，各剂量组返魂草提取物对大鼠棉球肉芽肿有明显的抑制作用：p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001。

              表20-3  返魂草提取物对大鼠棉球肉芽肿的抑制作用( X±SD，n＝12)

组别	剂量(g/kg)	肉芽肿干重(mg)	肉芽肿抑制率(％)
				空白对照组返魂草提取物返魂草颗粒	-5.410.821.610.8	95.2±25.868.2±21.0*25.9±11.8**19.6±10.4***32.3±13.2**	-28.372.879.466.1

二、解热试验

4、返魂草提取物对内毒素所致家兔发热的影响

结果表明(见表20-4)，耳缘静脉注射内毒素1小时后，家兔明显发热。灌胃给药0.5h，返魂草提取物2.81、5.62、11.24g/kg，即能明显发挥解热作用：p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001，且作用能够持续4小时。返魂草颗粒5.62g/kg也能明显抑制各时间点家兔的体温升高(p＜0.05，p＜0.01)。

5、返魂草提取物对啤酒酵母混悬液所致大鼠发热的影响

结果表明(见表20-5)，皮下注射啤酒酵母4小时后大鼠体温明显升高。与模型对照组相比，返魂草提取物5.4g/kg(低剂量组)、10.8g/kg(中剂量组)、21.6g/kg(高剂量组)灌胃给药1.0h即能显著抑制啤酒酵母的致热作用(p＜0.05，p＜0.01，p＜0.001)，且解热作用能够持续较长时间；返魂草颗粒10.8g/kg在各时间点也能明显抑制大鼠的体温升高(p＜0.05，p＜0.01)。

                  表20-4  返魂草提取物对内毒素致家兔发热的影响( X±SD，n＝8)

组别	剂量(g/kg)	基础体温(℃)	致热温度(℃)	给药后各时间点温度(℃)
											0.5h	1h	2h	3h	4h	5h	6h
				模型对照组返魂草提取物返魂草颗粒组	-2.815.6211.245.62	38.6±0.338.6±0.238.6±0.338.6±0.438.6±0.2	40.1±0.439.9±0.540.0±0.340.1±0.340.2±0.3	40.3±0.239.9±0.4*39.8±0.1**39.7±0.2**39.8±0.2**	40.4±0.340.0±0.2*39.8±0.1**39.4±0.2***39.7±0.4**	40.7±0.340.2±0.3*39.6±0.1***39.3±0.1***40.1±0.3*								40.2±0.239.9±0.2*39.6±0.3**39.2±0.2***39.8±0.2*	39.5±0.339.3±0.339.2±0.2*38.9±0.1**39.2±0.2*	39.0±0.238.8±0.338.8±0.238.8±0.139.0±0.2	38.6±0.238.6±0.238.6±0.338.7±0.238.8±0.3

^*p＜0.05 ^**p＜0.01 ^***p＜0.001，与模型对照组比较

                               表20-5  返魂草提取物对啤酒酵母致大鼠发热的影响( X±SD，n＝12)

组别	剂量(g/kg)	基础体温(℃)	致热温度(℃)	给药后各时间点温度(℃)
											0.5h	1h	2h	3h	4h	5h	6h
				模型对照组返魂草提取物组返魂草颗粒组	-5.410.821.610.8	37.5±0.237.4±0.237.3±0.237.3±0.337.4±0.4	39.0±0.239.0±0.239.0±0.239.0±0.338.9±0.3	39.4±0.239.0±0.4*38.9±0.2**38.8±0.2**39.0±0.2**	39.6±0.139.0±0.2**38.9±0.1**38.7±0.2***38.8±0.3**	39.4±0.238.8±0.3*38.5±0.3**38.3±0.2***38.5±0.4**								39.2±0.238.7±0.4*38.4±0.2**38.3±0.1***38.6±0.3*	39.0±0.238.6±0.4*38.4±0.2**38.3±0.1***38.7±0.2*	38.9±0.438.5±0.4*38.4±0.3*38.3±0.2**38.5±0.3*	38.7±0.238.5±0.338.4±0.2*38.1±0.1**38.5±0.2

^*p＜0.05 ^**p＜0.01 ^***p＜0.001，与模型对照组比较

四、镇痛试验

6、返魂草提取物对小鼠热板法致痛的影响

各试验组小鼠给药前对热板法疼痛反应的阈值相近，经给药后，返魂草提取物各剂量组小鼠在1h、2h、3h舔后足的时间均较空白对照组显著延长，提高疼痛反应的阈值，表明返魂草提取物具有显著的镇痛作用，返魂草颗粒也显著提高小鼠热板法疼痛反应的阈值。(表20-6)

                          表20-6  返魂草提取物对小鼠热板法的镇痛作用( X±s)

组别	动物数(只)	剂量(g/kg)	给药前痛阈(s)	给药后痛阈(s)
							1h	2h	3h
				空白对照组返魂草提取物低剂量组返魂草提取物中剂量组返魂草提取物高剂量组返魂草颗粒组	1212121212	-8163216				19.15±3.7819.38±2.9620.24±2.5619.76±3.7419.15±3.46	20.08±2.9729.16±4.67**35.50±6.54**40.83±4.15***31.08±4.26**	20.24±3.1626.00±2.79*32.12±2.95**34.65±3.84***30.35±3.29**	20.43±2.8524.25±3.16*30.75±3.15**33.58±2.15***28.16±2.97**

^*P＜0.05，^**P＜0.01^***P＜0.001与空白对照组比较

7、返魂草提取物对小鼠光热辐射法疼痛反应的影响

各试验组小鼠给药前对光热致痛的反应阈值接近，经给药后，返魂草提取物各剂量组小鼠在1h、2h、3h甩尾时间均较模型对照组显著延长，提高疼痛反应的阈值，表明返魂草提取物具有显著的镇痛作用(表20-7)。

                      表20-7  返魂草提取物对小鼠光热法的镇痛作用( X±s)

组别	动物数(只)	剂量(gkg)	给药痛阈(s)	给药后痛阈(s)
							1h	2h	3h
				空白对照组返魂草提取物低剂量组返魂草提取物中剂量组返魂草提取物高剂量组返魂草颗粒组	1212121212	-8163216				6.66±2.786.55±2.186.58±1.856.24±2.056.38±1.95	6.25±2.489.44±2.13**11.26±2.27**12.18±3.15***10.38±2.75**	6.17±2.5210.52±2.18**10.38±3.10**11.85±2.97***9.37±3.12**	6.44±1.988.25±2.04*10.11±2.08**10.98±2.87**8.98±2.84**

^*P＜0.05，^**P＜0.01 ^***P＜0.001与空白对照组比较

8、返魂草提取物对醋酸致小鼠扭体实验的影响

结果表明：返魂草提取物在所用剂量下均可显著抑制醋酸致小鼠扭体的次数，其作用与返魂草颗粒相当，并呈量效关系。见表20-8。

                表20-8  返魂草提取物对醋酸致小鼠扭体实验的影响( X±SD，n＝12)

组别	剂量(g/kg)	扭体次数	镇痛率(％)
				模型对照组返魂草提取物返魂草颗粒	-8163216	40.1±4.721.5±11.0***17.5±7.1***15.9±4.1***19.7±6.9***	-46.456.460.350.8

^*p＜0.05，^**p＜0.01，与模型组比较

五、免疫试验

9、对小鼠网状内皮***(RES)吞噬功能的影响

结果表明：返魂草提取物在所用剂量下均可显著增强其RES吞噬功能，K值均见明显增高并呈量效关系。见表20-9。

     表20-9  返魂草提取物对小鼠RES吞噬功能的影响( X±SD，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	吞噬指数K	P值
				生理盐水组返魂草提取物返魂草颗粒	-8163216	0.0301±0.01010.0409±0.00980.0442±0.00650.0471±0.00830.0423±0.0097	-＜0.05＜0.05＜0.01＜0.05

10、对绵羊红细胞所致小鼠溶血素抗体生成的影响

结果表明：返魂草提取物在所用剂量下溶血素增多，OD值增高，则说明有增强体液免疫的作用。见表20-10。

表20-10  返魂草提取物对绵羊红细胞所致小鼠溶血素抗体生成的影响( X±SD，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	抗体浓度(OD)值	P值
				生理盐水组返魂草提取物返魂草颗粒	-8163216	0.26±0.0590.31±0.0470.35±0.0440.42±0.0560.32±0.049	-＞0.05＜0.05＜0.01＜0.05

六、抗过敏试验

11、对小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响

结果见表20-11。由结果可知，返魂草提取物各剂量组都可显著抑制小鼠迟发型皮肤过敏反应，显著抑制小鼠耳肿胀，返魂草提取物中高剂量组使小鼠脾指数及胸腺指数增加。

表20-11  返魂草提取物对对小鼠迟发型皮肤过敏反应的影响( X±SD，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	耳肿胀度(mg)	脾指数(mg/10g)	胸腺指数(mg/10g)
					空白对照组返魂草提取物返魂草颗粒	-3216816	18.8±2.6510.5±3.15**11.6±2.97**15.7±3.2313.7±2.45*	52.1±11.268.0±11.0**63.2±7.3*60.1±10.562.9±8.2*	23.1±3.031.9±2.9*29.2±3.0*26.8±3.228.7±2.1*

^*p＜0.05，^**p＜0.01与空白对照组比较

七、止咳、平喘、祛痰试验

12、对豚鼠药物引喘的保护作用

结果见表20-12。由结果可知，返魂草提取物和返魂草颗粒都可显著延长由乙酰胆碱和组胺混合液喷雾引起豚鼠喘息的潜伏期。

表20-12  返魂草提取物对豚鼠药物引喘的保护作用的影响( X±SD，n＝8)

组别	剂量(g/kg)	发喘时间(s)	保护率(％)
				模型对照组返魂草提取物返魂草颗粒	-4.89.519.09.5	59.6±15.8160.5±115.8*222.6±137.4*266.4±121.6**193.4±138.8*	-255062.537.5

^*p＜0.05，^**p＜0.01，与模型组比较

13、对小鼠呼吸道酚红排出量的影响

结果表明：返魂草提取物在所用剂量下有明显的祛痰作用，并呈量效关系。见表20-13

表20-13  返魂草提取物对小鼠呼吸道酚红排出量的影响( X±SD，n＝10)

组别	剂量(g/kg)	酚红排出量(OD)值
			生理盐水组返魂草提取物返魂草颗粒	-8163216	0.184±0.1110.209±0.055*0.266±0.027**0.302±0.053***0.255±0.037**

^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001与生理盐水组比较

14、对小鼠氨水致咳的影响

结果：返魂草提取物在各剂量组有显著的镇咳作用。见表20-14

表20-14  注射用返魂草提取物对小鼠氨水致咳的影响( X±SD，n＝10)

组别	剂量(mg/kg)	咳嗽次数(2min内)	抑制率
				模型组返魂草提取物返魂草颗粒	-3216816	41.1±17.119.3±11.8***24.5±14.6**31.6±17.6*26.6±14.7*	-53.440.423.135.4

^*p＜0.05，^**p＜0.01，^***p＜0.001与模型组比较

综上所述，本发明的返魂草提取物具有显著地抗病毒、抗菌、解热、抗炎、镇痛止咳、平喘、祛痰及增强免疫的作用，并有一定的抗过敏作用，因此本发明还包括用本发明的提取物制备治疗上述疾病的药物中的应用。其功能与主治是宣肺祛邪，清热解毒，镇咳平喘。用于上呼吸道感染、急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作风热实证者，症见发热、咽痛、咳嗽、咳痰、流浊涕或鼻塞、便于尿黄、舌红苔黄、脉浮、滑数等。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1：提取物的制备

取5000g返魂草，加水煎煮三次，分别加水10倍、8倍、8倍，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.25g/ml(80℃测)的清膏，放冷，加入95％乙醇，混匀，至醇相对密度75％，静置12小时，沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10～1.20g/ml(60℃测)的清膏，放冷，以清膏∶树脂＝1∶1的量，上阳离子交换树脂柱，在树脂柱上吸附30min，然后用水洗脱，收集水洗脱部分喷雾干燥，即得提取物70g。

实施例2：提取物的制备

取5000g返魂草，加水煎煮三次，分别加水12倍、10倍、10倍，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.25g/ml(80℃测)的清膏，放冷，加入95％乙醇，混匀，至醇相对密度75％，静置24小时，沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10～1.20g/ml(60℃测)的清膏，放冷，以清膏∶树脂＝1∶1的量，上阳离子交换树脂柱，在树脂柱上吸附60min，然后用水洗脱，收集水洗脱部分喷雾干燥，即得提取物75g。

实施例3：提取物的制备

取5000g返魂草，加水煎煮三次，分别加水9倍、8倍、8倍，每次3小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.15～1.25g/ml(80℃测)的清膏，放冷，加入85％乙醇，混匀，至醇相对密度75％，静置6小时，沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10～1.20g/ml(60℃测)的清膏，放冷，以清膏∶树脂＝1∶1的量，上阳离子交换树脂柱，在树脂柱上吸附60min，然后用水洗脱，收集水洗脱部分喷雾干燥，即得提取物65g。

实施例4胶囊制剂

实施例1中的提取物粉碎制粒，加入微粉硅胶和糊精按4∶1组成的复合辅料，碳酸镁，混匀，按胶囊剂制法即可制成胶囊。

实施例5

片剂处方如下：

实施例1的提取物            70g

淀粉                       60g

乳糖                       30g

羟丙基纤维素               1.25g

硬脂酸镁                   0.5g

滑石粉                     5g

制成                       1000片

工艺

取提取物60g，加入淀粉60g、乳糖30g、羟丙基纤维素1.25g，制成颗粒，干燥，整粒，加入滑石粉5g和硬脂酸镁0.5g混合均匀，制成1000片，包糖衣，即得。

实施例6

颗粒剂处方如下：

实施例1的提取物            60g

淀粉                       60g

蔗糖                       30g

羟丙基纤维素               1.25g

制成                       1000g

制剂工艺

取实施例1的提取物60g，加入淀粉60g、蔗糖30g、羟丙基纤维素1.25g，制成颗粒，干燥，整粒，装袋1000g即得。

实施例7

微丸剂处方如下：

实施例1的提取物            60g

淀粉                       60g

蔗糖                       30g

羟丙基纤维素               1.25g

制成                       1000g

制剂工艺

取实施例1的提取物60g，加入淀粉60g、蔗糖30g、羟丙基纤维素1.25g，放到微丸机中，制成微丸，干燥，整粒，装袋1000g即得。

Claims (10)

1、一种返魂草提取物，其特征在于，所述提取物中不含或几乎不含生物碱成分。

2、权利要求1的提取物，其特征在于，所述提取物中生物碱含量小于0.5％。

3、权利要求1的提取物，其特征在于，所述提取物经过水提，醇沉，上阳离子交换树脂柱步骤制备的。

4、权利要求3的提取物，其特征在于，其中所述水提，是经过加水煎煮1-4次，每次加入水的量为5-15倍，每次1-3小时；所述醇沉，是将水提取物浓缩得到清膏后，加入50-100％的乙醇，静置6-24小时，待沉淀析出后过滤掉沉淀，回收乙醇，浓缩得到清膏；所述上阳离子交换树脂柱是将醇沉后得到的清膏加入到阳离子交换树脂柱，吸附10-60分钟，然后用水洗脱，得到水洗脱液，该洗脱液经干燥，得到提取物。

5、权利要求4的提取物，其特征在于，其中所述树脂是聚苯乙烯系阳离子交换树脂，或丙烯酸系阳离子交换树脂，其用量为清膏∶树脂＝1∶2-2∶1。

6、权利要求1的提取物的制备方法，其特征在于，经过水提，醇沉，上阳离子交换树脂柱步骤。

7、权利要求6的制备方法，其特征在于，经过以下步骤：取返魂草，加水煎煮三次，分别加水12-9倍、10-8倍、10-8倍，每次1-1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.10～1.30g/ml(80℃测)的清膏，放冷，加入95％乙醇，混匀，至醇相对密度75％，静置12小时，沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，浓缩至相对密度为1.10～1.20g/ml(60℃测)的清膏，放冷，以清膏∶树脂＝1-2∶1-2的量，上阳离子交换树脂柱，在树脂柱上吸附20-40min，然后用水洗脱，收集水洗脱部分喷雾干燥，即得提取物。

8、含有权利要求1的提取物的药物制剂。

9、权利要求8所述的药物制剂，是片剂、胶囊剂、口服液、糖浆剂、颗粒剂、丸剂、微丸剂、散剂、膏剂、丹剂、注射剂、栓剂、霜剂、喷雾剂、滴丸剂、贴剂、缓释制剂或控释制剂。

10、用权利要求1的提取物制备一种治疗上呼吸道感染、急性气管-支气管炎、慢性支气管炎急性发作风热实证者，症见发热、咽痛、咳嗽、咳痰、流浊涕或鼻塞、便干尿黄、舌红苔黄、脉浮、滑数疾病或抗病毒、抗菌、解热、抗炎、镇痛止咳、平喘、祛痰及增强免疫的药物中的应用。