CN1756767A - 在丝状真菌中表达人重链抗体 - Google Patents

在丝状真菌中表达人重链抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及产生功能性人免疫球蛋白的方法，其中表达了缺乏任何轻链的人重链免疫球蛋白，该方法包括步骤：a)用编码修饰的人重链免疫球蛋白的重组构建体转化丝状宿主细胞，其中修饰包括参与联系轻链的重链蛋白质区域的一个或多个突变；b)在促进所述修饰的人重链免疫球蛋白表达的条件下培养所述丝状宿主细胞；和c)回收所述修饰的人重链免疫球蛋白。

Description

在丝状真菌中表达人重链抗体
发明领域
本发明涉及人免疫球蛋白重链蛋白质及其片段在丝状真菌中的表达。
发明背景
抗体作为治疗剂的用途成而为焦点已有数十年了。与此同时，许多关注聚焦于抗体的产生。如今，在哺乳动物细胞中表达治疗性抗体，这既困难又昂贵。因为微生物具有巨大的表达潜能并且易于操纵，所以已经有很多尝试在微生物中表达抗体。
然而，已证明在这些生物中表达抗体是困难的，特别是因为抗体由两种蛋白质(重链和轻链)组成。最近发现骆驼科(Camelidae)表达一种只由重链蛋白质组成的抗体类型。但是，这种的类型抗体具有同正常抗体相同程度的亲和力。这是因为重链上的可变区比较大。已经证明这类抗体中的一些可以在酵母或霉菌中表达，如见WO 94/25591。
除了其中一个可变区稍微大一些以外，骆驼科的重链蛋白质与人重链蛋白质十分同源。
为了解决人抗体在非哺乳动物表达***中有效表达这一难题，我们寻找了其它适宜的生物，该生物可以表达人抗体，从而产生只含有修饰重链的功能性抗体。
发明概述
我们惊奇地发现可以通过在丝状真菌(例如曲霉属(Aspergillus))中仅表达人抗体重链来得到功能性人抗体或人抗体片段。此外，可以在丝状真菌(例如曲霉属)中有效表达功能性修饰的重链人抗体或人重链蛋白质的片段，并且可通过在通常与轻链相联系的区域引入适当的突变来解决人重链蛋白质的低溶解性问题。
本发明涉及产生功能性人免疫球蛋白的方法，其中表达缺乏任何轻链的人重链免疫球蛋白，该方法包括步骤：
a)用编码修饰的人重链免疫球蛋白的重组构建体转化丝状宿主细胞，其中修饰包括参与联系轻链的重链蛋白质区域的一个或多个突变；
b)在促进表达所述修饰的人重链免疫球蛋白的条件下培养所述丝状宿主细胞；并且
c)回收所述修饰的人重链免疫球蛋白。
定义
在讨论本发明的详细实施方案之前，提供了涉及本发明主要方面的特定术语的定义。
功能性免疫球蛋白：术语“功能性免疫球蛋白”定义为一种免疫球蛋白，尽管它只包含重链蛋白质或其部分，但它保留着能够与靶抗原结合和/或激活免疫***的功能。
修饰的免疫球蛋白：术语“修饰的免疫球蛋白”其中替代、缺失或添加/***一个或多个氨基酸的免疫球蛋白。具体而言，修饰包括在正常的人免疫球蛋白中参与重链和轻链相联系的氨基酸，这种联系被认为影响免疫球蛋白的可溶性。在另一个实施方案中，修饰包括在正常的人免疫球蛋白中参与重链和抗原相接触的氨基酸，该种修饰影响免疫球蛋白的特异性。
功能等效：术语“功能等效残基”定义为参与所述免疫球蛋白重链和轻链相联系的氨基酸残基。
突变：术语“突变”定义为替代、缺失或***。
发明详述
本发明的的之一是提供在丝状真菌中产生修饰的人抗体的有效方法，在该方法中只有重链蛋白质被表达，并且抗体仍保留功能活性。
在本发明的一个实施方案中，通过将编码修饰的免疫球蛋白的DNA序列***到适当的表达载体，并将所述重组载体导入丝状真菌宿主细胞，产生了修饰的人重链免疫球蛋白或其片段，此片段可能是如重链蛋白质的可变区。然后在促进人免疫球蛋白重链表达的条件下培养丝状真菌宿主细胞。接着，应用本领域众所周知的方法回收并纯化产生免疫球蛋白。
在一个特定的实施方案中，人重链免疫球蛋白或修饰的人重链免疫球蛋白至少包含可变区和Fc受体识别的Fc区。
在进一步的实施方案中，人重链免疫球蛋白或修饰的人重链免疫球蛋白至少包含可变区。
在进一步的实施方案中，可变区包含SEQ ID NO 1所示的肽序列。
在进一步的实施方案中，可变区由SEQ ID NO 1所示的肽序列组成。
引入到修饰的人重链免疫球蛋白的修饰包括重链蛋白质中参与联系轻链的区域的突变。
在一个特定的实施方案中，所述修饰导致修饰人重链免疫球蛋白的溶解性提高(Reichmann(1996)Journal of molecular Biology 259卷957-969页)。
因此在进一步的实施方案中，人免疫球蛋白的完整重链可变结构域或其至少包括可变区或者至少包括可变区和Fc区的片段的修饰包括重链人免疫球蛋白中参与联系轻链的区域的突变。
在可变区中涉及到上面提到的重链和轻链相联系的可能的残基在下面以及使用人免疫球蛋白重链可变区结构域的实例——赫赛汀(Herceptin)，(在WO01/15730A1中公开)中有所例举，并且涉及SEQ ID NO.1中所示的肽序列的如下位置：V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
人免疫球蛋白(及赫赛汀)中的重链可变结构域(SEQ ID NO.1)：evqlvesggglvqpggslrlscaasgftftdytmdwvrqapgkglewvadvnpnsggsiynqrfkgrftlsvdrskntlylqmnslraedtavyycarnlgpsfyfdywgqgtlvtvss。
SEQ ID NO.1所示的肽序列由人免疫球蛋白(及赫赛汀)的重链可变结构域组成，但是至于其它的人重链可变区，参与所述联系的残基可能具有不同的位置，只要残基是功能等效物。
在本发明还有的实施方案中，本发明的修饰包括重链蛋白质中涉及与轻链相联系的区域的突变，所述突变包括SEQ ID NO 1中V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109任一残基的突变，所述序列代表人免疫球蛋白(及赫赛汀)的重链可变结构域或者在其它人重链免疫球蛋白中以功能等效残基的突变种。
通过用本领域已知的计算机程序，例如使用默认设置的Blast(BLASTP 2.1.2(参考文献：Altschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller和DavidJ.Lipman(1997)，“缺口BLAST和PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序”，Nucleic Acids Res.25：3389-3402.))或者使用默认设置的FastaP(3.3t08版本，W.R.Pearson & D.J.Lipman PNAS(1988)85：2444-2448)，进行同源性搜索和比对，可以在其它重链可变结构域中鉴别上述位点。
默认设置指示如下：
blastall参数：
-p程序名称[字符串]
-d数据库[字符串]
默认值＝nr
-i查询文件[输入]
默认值＝stdin
-e期望阈值(E)[实数]
默认值＝10.0
-m比对结果视图选项：
0＝配对方式，
1＝显示同一性的查询锚定，
2＝没有同一性的查询锚定，
3＝显示同一性的平面查询锚定(flat query-anchored)，
4＝没有同一性的平面查询锚定，
5＝没有同一性和钝末端的查询锚定，
6＝没有同一性和钝末端的平面查询锚定，
7＝XML Blast输出[整数]
默认值＝0
-o BLAST报告输出文件[输出]可选
默认值＝stdout
-F过滤查询序列(DUST使用blastn，SEG使用其它)[字符串]
默认值＝T
-G打开空位的代价(零调用默认值行为)[整数]
默认值＝0
-E延长空位的代价(零调用默认值行为)[整数]
默认值＝0
-X接受空位比对的X跌落值(bits)(零调用默认值行为)[整数]
默认值＝0
-I在定义中显示Gl′s[T/F]
默认值＝F
-q核苷酸错配的罚分(只用于blastn)[整数]
默认值＝-3
-r核苷酸错配的加分(只用于blastn)[整数]
默认值＝i
-v对于(V)单行描述显示的数据库序列的数目[整数]
默认值＝500
-b对于(B)比对显示的数据库序列的数目[整数]
默认值＝250
-f扩展采样数的阈值，如果为零则是默认值[整数]
默认值＝0
-g执行接受空位的比对(对于tblastx不可用)[T/F]
默认值＝T
-Q查询使用的遗传密码[整数]
默认值＝1
-D DB遗传密码(只对tblast[nx])[整数]
默认值＝1
-a可用处理器的数目[整数]
默认值＝1
-O SeqAlign文件[输出]可选
-J信任查询定义[T/F]
默认值＝F
-M矩阵[字符串]
默认值＝BLOSUM62
-W字大小，为零时使用默认值[整数]
默认值＝0
-z数据库的有效长度(对于真实大小使用零)[实数]
默认值＝0
-K从保留的区域最佳匹配点的数目(默认值为关，如果使用推荐值为100)[整数]
默认值＝0
-P对于0为多次采样点1-遍，对于1为单次采样点1-遍，对于2为2-遍[整数]
默认值＝0
-Y搜索空间的有效长度(对于真实大小使用零)[实数]
默认值＝0
-S搜索数据库时的查询链(对于blast[nx]和tblastx).3是两条链，1是top链，2是bottom链[整数]
默认值＝3
-T产生HTML输出[T/F]
默认值＝F
-I为了列出GI′s对数据库进行限制性搜索[字符串]可选
-U使用小写字体过滤FASTA序列[T/F]可选
默认值＝F
-y使用bit的对于blast扩展的跌落值(X)(0.0调用默认值行为)[实数]
默认值＝0.0
-Z对于最终接受空位比对的跌落值X(bit)[整数]默认值＝0
上面给出的涉及SEQ ID NO.1的残基和位置是野生型残基。
在另一个实施方案中，修饰包括增加与抗原结合特异性和结合亲和力的氨基酸。此种修饰包括在正常的人免疫球蛋白中参与重链和抗原接触的氨基酸。所述氨基酸包括Seq ID No.1中27-35、50-57和99-108位置所包含的残基，该序列代表人免疫球蛋白(及赫赛汀)重链可变结构域或者其它人重链免疫球蛋白的功能等效位置。通过标准的噬菌体展示技术(Wandersee NJ；Sillah NM；Watkins NA；Scott JP；Ouwehand WH；Hillery CA Blood，第98卷(11第1部分)484a页(2001)Azzazy HME；Highsmith Jr WE Clinical Biochemistry，35(6)卷425-445页(2002)，(165篇参考文献))可以鉴定这些修饰，由此可以对特异性和结合亲和力进行测试。
因此，在本发明还有的实施方案中涉及根据发明的方法，其中修饰包括在涉及与抗原接触的人可变重链免疫球蛋白区域中的突变，所述突变包括SEQ ID NO 1中27-35、50-57和99-108位置任一残基的突变，所述序列代表人免疫球蛋白(及赫赛汀)的重链可变结构域或者其它人重链免疫球蛋白中的功能等效残基的突变。
核酸构建体
本发明还涉及含有与一个或多个控制序列有效连接的本发明核苷酸序列的核酸构建体，所述控制序列在与控制序列兼容的条件下指导编码序列在适当的宿主细胞内表达。
可以以多种方式操作编码本发明多肽的核苷酸序列，以便提供多肽的表达。***载体前的核苷酸序列的操作可能是需要的或者是必要的，这取决于表达载体。利用重组DNA方法来修饰核苷酸序列的技术是本领域众所周知的。
控制序列可以是适当的启动子序列，即可以被宿主细胞识别用于表达核苷酸序列的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选择的宿主细胞内表现出转录活性的任何核苷酸序列，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从编码细胞外或者细胞内的与宿主细胞同源或者异源的的多肽的基因得到。
用于指导本发明核酸构建体在丝状真菌宿主细胞内转录的适当启动子的实例有从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉或者泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶和尖镰孢(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)基因得到的启动子，以及NA2-tpi启动子(从黑曲霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶得到的杂合启动子)和它们的突变、截短和杂合启动子。
对于丝状真菌宿主细胞，优选的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶基因得到的终止子。
控制序列还可以是适宜的前导序列、对宿主细胞进行翻译而言重要的mRNA非翻译区。前导序列与编码多肽的核苷酸序列的5′末端有效连接。在所选择的宿主细胞内具有功能的任何前导序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶基因得到的前导序列。
控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，即与核苷酸序列的3′末端有效连接并且转录后作为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号而被宿主细胞识别的序列。在所选择的宿主细胞内具有功能的任何聚腺苷酸化序列均可用于本发明。
用于丝状真菌宿主细胞的优选的聚核苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶基因得到的序列。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码的氨基酸序列与多肽的氨基末端连接并且指导编码的多肽进入细胞的分泌途径。在核苷酸序列的编码序列的5′末端可以天然的含有信号肽编码区，该信号肽编码区于翻译阅读框内与编码所分泌多肽的编码区片段天然连接。另外，编码序列的5′末端可以含有对于编码序列而言为外来的信号肽编码区。在编码区天然不含有信号肽编码区时，可能需要外来的信号肽编码区。另外，外来的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强多肽的分泌。然而，能够指导表达的多肽进入所选择宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码区可以用于本发明。
对于丝状真菌宿主细胞，有效的信号肽编码序列是来自于米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、孤独腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶和柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂酶基因的信号肽编码序列。
加入使多肽表达的调节与宿主细胞的生长相关的调节序列也是需要的。调节***的实例是那些应答于化学或物理刺激(包括调节化合物的出现)，而引起基因表达开或关的调节***。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵基因***。在酵母中，可以使用ADH2***或者GAL1***。在丝状真菌中，TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子可以用来作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的调节序列。在真核***中，它们包括在氨甲喋呤存在时能够扩增的二氢叶酸还原酶基因和重金属存在时能够扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列有效连接。
表达载体
本发明还涉及包含发明的核酸构建体的重组表达载体。上述多种核苷酸和控制序列可连接在一起产生重组表达载体，其可以包括一个或多个便利的限制性酶切位点，以便允许编码多肽的核苷酸序列在此种位点进行***或替代。另外，本发明的核苷酸序列可以通过将该核酸序列或者含有该序列的核酸构建体***到用于表达的恰当载体中来表达。在构建表达载体时，编码序列定位于载体，以致于编码序列与用于表达的恰当控制序列有效连接。重组表达载体可以是能够方便地进行重组DNA操作并且能够引起核苷酸序列表达的任何载体(例如质粒或者病毒)。载体的选择通常依赖于载体和欲导入载体的宿主细胞的兼容性。载体可以是线性的或者闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外遗传因子、微型染色体或者人工染色体。
载体可含有保证自我复制的任何手段。另外，载体可以是导入宿主细胞原整合进入基因组并且与整合进入的染色体一起复制的载体。
此外，可以使用单一载体或质粒、或共同含有欲被导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或使用转座子。
本发明的载体优选含有便于选择转化细胞的一个或多个选择标记。选择标记是其产物能够提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、从原养型到自养型等等的基因。
在丝状真菌宿主细胞中使用的选择标记包括(但不限于)，amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，以及它们的等效物。
在曲霉属细胞中优先使用的是构巢曲霉或者米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。
本发明的载体优选含有允许载体稳定整合到宿主细胞基因组中的元件或者允许载体在细胞内不依赖基因组而自主复制的元件。
为了整合进入宿主细胞基因组，载体可依赖于编码多肽的核苷酸序列或者载体中用于通过同源重组或者非同源重组将载体稳定整合进入基因组的任何其它元件。另外，载体可以包含用于通过同原重组指导整合进入宿主细胞基因组的附加核苷酸序列。附加核苷酸序列使载体能够在染色体上的精确位置整合进入宿主细胞基因组。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核苷酸，例如100至1,500个碱基对，优选400至1,500个碱基对，并且最优选800至1,500个碱基对，它们与相应的靶序列高度同源以便增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码的或者编码的核苷酸序列。另一方面，载体可以通过非同源重组的方式整合进入宿主细胞的基因组。
宿主细胞
本发明还涉及含有本发明核酸构建体的重组宿主细胞，该细胞有利于多肽的重组产生。将含有本发明核苷酸序列的载体导入宿主细胞，以便载体以作为先前描述的染色体整合体或者自主复制的染色体外载体而得以维持。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞是真菌细胞。如此处所使用“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等在《Ainsworth and Bisby′s Dictionaryof The Fungi》，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK，中所定义)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等1995，同前，171页，所引用)和所有的有丝***孢子真菌(Hawksworth等1995，同前)。
在另一个更加优选的实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(如Hawksworth等1995，同前)细分的所有丝状形式。丝状真菌以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、脱乙酰壳多糖、甘露聚糖和其它复合多糖组成的菌丝体壁为特征。通过菌丝延长进行营养生长并且碳的分解代谢是专性需氧的。相反，诸如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)之类的酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽完成并且碳的分解代谢可通过发酵进行。
在甚至更加优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是(但不限于)枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或者木霉属(Trichoderma)种类的细胞。
在最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉或者米曲霉细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusariumcrookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰胞(Fusarium sulphureum)、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或者Fusarium venenatum的细胞。在一个甚至最优选的实施方案中，丝状真菌母细胞是Fusariumvenenatum(Nirenberg sp.nov.)细胞。在另一个最优选的实施方案中，丝状真菌宿主细胞是孤独腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、Thielavia terrestris、Trichodrma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或者绿色木霉(Trichoderma viride)的细胞。
真菌细胞可以通过包括原生质体形成、原生质体转化和细胞壁回收的过程以本质上已知的方式进行转化。转化曲霉属细胞的适宜的操作在EP238 023和Yelton等，1984，Proceedings of the National Academy ofSciences USA 81：1470-1474中有所描述。转化镰刀菌属物种的适宜的方法在Malardier等，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787中有所描述。可以使用Becker和Guarente，在Abelson，J.N.和Simon，M.I.，编，“Guideto Yeast Genetics and Molecular Biology”，《Methods in Enzymology》，194卷，182-187页，Academic Press，Inc.，New York；Ito等，1983，Journalof Bacteriology 153：163；和Hinnen等，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920中描述的操作转化酵母。
生产方法
本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)培养菌株，其野生型形式能够产生多肽；和(b)回收多肽。优选地，菌株是曲霉属，并且更加优选的是米曲霉和黑曲霉。
本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收多肽。
在本发明的生产方法中，使用本领域已知的方法将细胞在适于生产多肽的营养培养基中培养。例如，细胞可以通过在实验室或者工业发酵罐中，在适宜的培养基上以及允许多肽表达和/或分离的条件下进行摇瓶培养、小规模或者大规模发酵(包括连续、批式、补料分批式或者固态发酵)。使用本领域已知的操作，在含有碳源和氮源和无机盐的适宜的营养培养基中进行培养。适宜的培养基可以从商品供应商得到或者根据公布的组合物(例如American Type Culture Collection的目录中所分布的)进行配制。如果多肽分泌到营养培养基中，则可从培养基中直接回收多肽。如果多肽是非分泌的，可以从细胞裂解液中回收多肽。
可使用本领域已知的对多肽特异的方法来检测多肽。这些检测方法可包括使用特异的抗体、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可使用酶测定法测定此处所述多肽的活性。
可使用本领域已知的方法回收产生的多肽。例如可通过包括(但不限于)离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸发或者沉淀的常规操作从营养培养基中回收多肽。
可通过本领域已知的多种操作，包括(但不限于)层析(例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和大小排阻层析)、电泳过程(例如制备型等电聚焦电泳)、差异溶解性(如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE，或者抽提(例如见《蛋白质纯化》，J.-C.Janson和Lars Ryden编，VCHPublishers，New York，1989)对多肽进行纯化。
应用
可以以本领域已知的方法配制按照本发明生产的抗体治疗制剂。
制剂可以含有对于治疗的特定适应症所必需的不只一种活性化合物。例如，可能需要提供另一种类型的抗体和/或组合物可以含有细胞毒性剂、细胞因子或生长抑制剂。
用于体内施用的制剂必须是无菌的。通过如无菌滤膜过滤可容易地实现这一点。
抗体的另一个应用是由抗体结合部分和酶组成的嵌合蛋白。以这种方式，催化的生物分子可以设计成具有两个结合特性，一个是酶的、另一个是抗体的结合特性。这可导致产生具有优越活性的酶。
实施例
实施例1
曲霉属菌株Jal355的构建：
BECh2描述于WO 00/39322，WO 00/39322而它进一步参考了专利WO 98/12300(描述JaL228)。
pJaL173描述于WO 98/12300
pJaL335描述于WO 98/12300
为了除去米曲霉属菌株Bech2中位于碱性蛋白酶基因内的缺陷的pyrG基因，进行下面的操作：
分离pyrG-米曲霉菌株——ToC1418：
筛选米曲霉属菌株Bech2对5-氟-乳清酸(FOA)的抗性，以鉴定自发的pyrG突变体。一个菌株(ToC1418)被鉴定为pyrG-。ToC1418是尿嘧啶核苷依赖的，因此可以用野生型pyrG基因转化并且可以通过在缺乏尿嘧啶核苷条件下的生长能力选择转化体。
pyrG+的米曲霉菌株——JaL352的构建：
通过测序确定位于碱性蛋白酶基因内的缺陷pyrG基因中的突变。通过使用引物104025和104026的PCR方法制备米曲霉属菌株Bech2的染色体DNA。
104025(SEQ ID NO.2)：5′-CCTGAATTCACGCGCGCCAACATGTCTTCCAAGTC，和104026(SEQ ID NO.3)：5′-GTTCTCGAGCTACTTATTGCGCACCAACACG
扩增出含有缺陷pyrG基因的编码区的933bp片段。将933bp的片段进行纯化并用下列引物进行测序：
引物104025、引物104026、引物104027(Seq ID No.4)：
5′-ACCATGGCGGCACTCTGC，引物104028(Seq ID No.5)：
5′-GAGCCGTAGGGGAAGTCC，引物108089(Seq ID No.6)：
5′-CTTCAGACTGAACCTCGCC和引物108091(Seq ID No.7)：
5′-GACTCGGTCCGTACATTGCC。
测序表明一个额外的碱基G***到pyrG编码区的第514位(从pyrG基因起始密码子的A开始算起)，以此产生了移码突变。
为了使位于碱性蛋白酶中的缺陷pyrG基因变成野生型pyrG基因，使用标准的操作，用150皮摩尔的寡核苷酸
5′-CCTACGGCTCCGAGAGAGGCCTTTTGATCCTTGCGGAG-3′(SEQ ID NO.8)转化米曲霉pyrG-菌株ToC1418。寡核苷酸的5′末端可以有利地被磷酸化。寡核苷酸恢复了pyrG的阅读框，但是同时引入了一个沉默突变，因此产生了StuI限制性内切酶位点。然后通过在尿嘧啶核苷缺乏条件下生长的能力选择转化体。在重新分离之后，制备了8个转化体的染色体DNA。为了证实其变化，通过使用引物135944(Seq ID No.9)：
5′-GAGTTAGTAGTTGGACATCC和引物108089的PCR扩增了785bp的片段，该片段覆盖了目的区域。将785bp的片段进行纯化并用引物108089和135944进行测序。将具有预期改变的一个菌株命名为JaL352。
分离pyrG-的米曲霉菌株——JaL355：
为了除去位于碱性蛋白酶基因内的pyrG基因，用pJaL173的5.6kb的BamHI片段通过标准操作转化JaL352，所述片段携带米曲霉碱性蛋白酶基因的5′和3′侧翼序列。在非选择平板上再生原生质体，并收集孢子。为了鉴定pyrG突变体，对大约109个孢子筛查了对FOA的抗性。当从14个FOA抗性转化体中重新分离染色体DNA后。用BalI消化染色体DNA，并用使用1kb 32P-标记的pJaL173 BalI DNA片段作为探针的进行DNA印迹分析，该标记的片段含有米曲霉碱性蛋白酶基因的部分5′和3′侧翼。通过4.8kb BalI带的消失和1kb BalI带的出现来鉴定目的菌株。用来源于pJaL335、含有米曲霉pyrG基因的3.5kb 32P-标记的DNA Hind III片段对同一张滤膜进行探测，导致4.8kb BalI带在目的菌株消失。将来源于这些转化体的一个菌株命名为JaL355。
实施例2
构建用于表达的质粒
为了促进位于表达质粒上的目的基因的表达，有必要降低用于选择的标记基因(此处以pyrG基因为例)的表达。通过在正常选择压力下培养具有表达质粒的宿主细胞，该表达质粒含有已经降低表达的选择基因，导致对具有增加质粒拷贝数量的宿主细胞的选择，从而使选择基因的总表达水平达到存活所必需。然而，更高的质粒拷贝数量也导致目的基因的增强的表达。
降低选择基因表达水平的一种方式是通过使用转录较弱的启动子或者降低mRNA的功能半寿期来降低mRNA水平。另一种方式是降低mRNA的翻译效率。此种作法的一种方式是突变Kozak区(Kozak M Gene，234(2)卷187-208页(1999))。这是一个仅仅位于起始密码子(ATG)上游的对于翻译起始而言重要的区域。
质粒pENI2155在pyrG基因上游含有差的kozak区，其构建如下：
使用质粒pENI1861(其构建在下面描述)作为模板并使用PWO聚合酶(按照制造商推荐的条件)，进行两次PCR反应，在一次反应中使用引物141200J1和270999J9，在另一次反应中使用引物141200J2和290999J8：
141200J1(SEQ ID NO：10)：5′ATCGGTTTTATGTCTTCCAAGTCGCAATTG
141200J2(SEQ ID NO：11)：5′CTTGGAAGACATAAAACCGATGGAGGGGTAGCG
290999J8(SEQ ID NO：12)：5′TCTGTGAGGCCTATGGATCTCAGAAC
270999J9(SEQ ID NO：13)：5′GATGCTGCATGCACAACTGCACCTCAG
使用QIAGENTM旋转柱从1％琼脂糖凝胶中纯化PCR片段。使用该两个片段作为模板并使用引物270999J8和270999J9进行第二轮PCR反应。如所述将这次反应的PCR片段从1％琼脂糖凝胶中纯化出来，用限制性内切酶StuI和SphI对片段和载体pENI1849(含有脂酶基因作为表达报告基因)进行切割，用常规的方法从1％琼脂糖凝胶中纯化产生的片段。
将纯化的片段连接并转化进入大肠杆菌(E.coli)菌株DH10B。将一个转化体的质粒DNA分离出来并且进行测序以证实导入了突变的Kozak区：GGTTTTATG(而不是野生型GCCAACATG)。将该质粒命名为：pENI2155。
用质粒pENI1849(对照野生型质粒)和pENI2155(pyrG基因上游突变的Kozak区)转化曲霉属细胞。用大约1微克pENI1849和pENI2155转化米曲霉Jal355(如WO 98/01470中所述，JaL355是米曲霉A1560的衍生物，其中pyrG基因已经失活；转化操作步骤如WO 00/24883中所述)。将转化体在37℃培养4天。
将来自pENI2155转化的24个转化体和pENI1849转化的12个转化体接种于含有1×Vogel培养基和2％麦芽糖(《Methods in Enzymology》，17卷，84页)的96孔微滴定板中。在34℃生长4天之后，用对硝基苯戊酸(pnp-valerate)作为脂酶底物来测定培养液中的脂酶活性。
从每个孔中取出10微升培养基等分试样加入到200微升含有0.018％对硝基苯戊酸，0.1％TritonXTM-100，10mM CaCl2，50mM Tris pH7.5的脂酶底物的微滴定板中。使用标准的酶学操作步骤(例如EnzymeKinetics，Paul C.Engel，著者，1981，Chapman and Hall Ltd)用动力学酶标仪(Molecular Device Corp.，Sunnyvale CA)以分光光度法在跨越5分钟的时期内以15秒的间隔测定脂酶活性。简言之，在底物周转的起始阶段测定产物的形成并且将其定义为从5分钟内每15秒的405nm吸光值计算出来的曲线的斜率。相对表现出最高脂酶活性的转化体标准化任意的脂酶活性单位。对于每组的30个转化体，计算出其平均值和标准差。给定任意的单位，平均脂酶活性和相对标准差为：
1849转化体： 65±14
2155转化体： 120±22
显然2155转化体内的脂酶表达几乎加倍了，其中突变的Kozak区已经被导入到选择基因pyrG的前面。
为了在表达质粒中具有领域内曲霉属启动子和若干用于克隆的单一限制性酶切位点，制备了质粒pENI1861。使用质粒pMT2188(pMT2188的构建在下面描述)作为模板和下面的引物得到了PCR片段(大约620bp)：
051199J1(SEQ ID NO：14)：5′-CCTCTAGATCTCGAGCTCGGTCACCGGTGGCCTCCGCGGCCGCTGGATCCCCAGTTGTG
1298TAKA(SEQ ID NO：15)：5′-GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT
将此片段用BssHII和BglII切割，并且克隆到同样用BssHII和BglII切割的pENI1849中。通过测序证实克隆。
为了减小质粒的大小因而提高转化效率，构建了质粒pENI1849，以便将pyrG基因截短至pyrG表达所必需的序列。使用pENI1299(描述于WO 00/24883图2和实施例1)作为模板和下面的引物得到了PCR片段(大约1800bp)：
270999J8(SEQ ID NO：12)和270999J9(SEQ ID NO：13)
将此PCR片段用限制性内切酶StuI和SphI进行切割并且克隆到也被StuI和SphI进行切割的pENI1298(描述于WO00/24883图1和实施例1)中；通过测序证实克隆。
质粒pMT2188基于曲霉属表达质粒pCaHj483(描述于WO98/00529)，质粒pCaHj483含有基于与构巢曲霉丙糖磷酸异构酶非翻译前导序列融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子(Pna2/tpi)和黑曲霉淀粉葡糖苷酶终止子(Tamg)的表达盒。在pCaHj483上还存在来源于构巢曲霉的曲霉属选择标记amdS，该选择标记使宿主能够以乙酰胺作为唯一氮源生长。这些元件被克隆到大肠杆菌载体pUC19(New England Biolabs)上。用能够补偿大肠杆菌中pyrF突变的酿酒酵母URA3标记替换能够在大肠杆菌中选择pUC19的氨苄青霉素抗性标记，替换方式如下：
用下面的引物从pCaHj483上PCR扩增pUC19的复制起点：
142779(SEQ ID NO：16)：5′-TTGAATTGAAAATAGATTGATTTAAAACTTC
142780(SEQ ID NO：17)：5′-TTGCATGCGTAATCATGGTCATAGC
引物142780在PCR片段中引入了BbuI位点。使用ExpandTM PCR***(Roche Molecular Biohcemicals，Basel，Switserland)按照制造商的说明书进行此次和随后的PCR扩增。
使用下面的引物从普通酿酒酵母克隆载体pYES2(Invitrogen公司，Carlsbad，Ca，USA)扩增了URA3基因。
140288(SEQ ID NO：18)：5′-TTGAATTCATGGGTAATAACTGATAT
142778(SEQ ID NO：19)：5′-AAATCAATCTATTTTCAATTCAATTCATCATT
引物140288在PCR片段中引入了EcoRI位点。将该两个片段混合，并用引物142780和140288在拼接处通过重叠法(Horton等(1989)Gene，77，61-68)进行扩增，从而将该两个PCR片段融合起来。
用EcoRI和BbuI消化得到的片段，并且将其连接到用同样的酶消化的pCaHj 483大片段上。连接混合物用于转化用Mandel和Higa法(Mandel，M.和A.Higa(1970)J.Mol.Biol.45，154)制备的pyrF大肠杆菌菌株DB6507(ATCC 35673)感受态。用添加1g/l酪蛋白氨基酸、500μg/l硫胺素和10mg/l卡那霉素的固体M9培养基(Sambrook等(1989)《Molecularcloning，a laboratory manual》，第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress)选择转化体。
来源于所选择的转化体的质粒称为pCaHj527。用单一的PCR方法对存在于pCaHj527上的Pna2/tpi启动子进行定点诱变。使用诱变引物141223将134-144位核苷酸从GTACTAAAACC改变为CCGTTAAATTT。使用诱变引物141222将423-436位核苷酸从ATGCAATTTAAACT改变为CGGCAATTTAACGG。产生的质粒称为pMT2188。
141223(SEQ ID NO：20)：5′-GGATGCTGTTGACTCCGGAAATTTAACGGTTTGGTCTTGCATCCC
141222(SEQ ID NO：21)：5′-GGTATTGTCCTGCAGACGGCAATTTAACGGCTTCTGCGAATCGC
降低OMP脱羧酶的活性和稳定性
为了提高目的基因从质粒中的表达，如已经在实施例1中所提及的，可能需要降低选择基因(例如pyrG基因)编码蛋白质的稳定性和/或活性。
降低选择基因所编码的蛋白质的稳定性的一种方式是向蛋白质添加一“降解决定子”基序(Dohmen R.J.，Wu P.，Varshavsky A.，(1994)Science263卷1273-1276页)。另一种方式是根据与同源蛋白质进行比对或者根据蛋白质的模拟结构(如果可得的话)来鉴定结构上重要的保守氨基酸残基。然后可突变这些氨基酸以降低酶的稳定性和/或活性。
使用蛋白质序列swissprot_dcop_aspng(质粒pENI2155上的pyrG基因编码的OMP脱羧酶)与下列数据库条目：Swissprot_dcop_sapor、geneseqp_r05224、geneseqp_y99702、tremblnew_aag34761、swissprot_dcop_phybl、remtermbl_aab01165、remtembl_aab16845和sptrembl_q9uvz5进行蛋白质比对。
使用程序ClustalW(Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：通过序列加权、位置特异缺口惩罚和权矩阵选择提高递增多重序列比对的敏感性.Nucleic Acids Research，22：4673-4680)进行比对。
根据这些比对和相关的枯草杆菌(Bacillus subtilis)OMP脱羧酶的结构(Appleby t.，Kinsland C.，Begley T.P.，Ealick S.E..(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97卷2005-2010页)鉴定出下列保守的残基为潜在的结构上重要、并且可以作为突变的适宜靶位点的残基：P50、F91、F96、N101、T102、G128、G222、D223、G239。构建了许多诱变引物并且用T4多核苷酸激酶(New England Biolabs)进行磷酸化。
P50-260301j1(SEQ ID NO：22)：5′-ACAGGACTCGGT NCGTACATTGCCGTG
F91-260301j2(SEQ ID NO：23)：5′-AATTTCCTCATC TNCGAAGATCGCAAG
F96-260301j3(SEQ ID NO：24)：5′-GAAGATCGCAAG TNCATCGATATCGGA
N101，T102-260301j4(SEQ ID NO：25)：5′-ATCGATATCGGA NACANCGTCCAAAAGCAG
G128-260301j5(SEQ ID NO：26)：5′-AGTATTCTGCCC GNTGAGGGTATCGTC
G222，D223-260301j6(SEQ ID NO：27)：5′-CTCTCCTCGAAG GNTNACAAGCTGGGACAG
G239-230301j7(SEQ ID NO：28)：5′-GCTGTTGGACGC GNTGCCGACTTTATT
使用pENI2155作为模板进行了七次单独的PCR/连接反应(如SawanoA.，Miyawaki A.(2000)Nucleic Acid Research 28卷e78所述)，从七个文库中各取出1微升用来转化大肠杆菌菌株DH10B。从每个文库得到了大约1000个大肠杆菌克隆。从各文库制备DNA制品并且合并DNA(命名为pBIB16)。
使用标准的操作步骤，以每100微升原生质体1微克pBIB16DNA和10微克鲱鱼精DNA(载体DNA)的量转化曲霉属菌株MT2425(pyrG-菌株，当在选择平板上生长时能够长出小的转化体克隆)
将转化后的原生质体涂布在选择平板上(2％麦芽糖(诱导小的形态和脂酶表达)、10mM NaNO3、1.2M山梨醇、2％细菌琼脂和标准盐溶液)。
在生长5天后，向曲霉属转化克隆上铺上一覆盖层(含有0.004％亮绿、2.5％橄榄油、1％琼脂、50mM TRIS pH7.5，用混合器(UltrathoraxTMT25B型，IKA Labortechnic，Germany)处理1分钟。将平板在室温下孵育过夜。
将对橄榄油具有最高活性的20个克隆培养在96孔微滴定板中的200微升YPM中。在34℃生长4天后，如上所述，使用对硝基苯戊酸来测定培养液中的脂酶活性。
将脂酶测定中具有最高活性的6个转化体培养在5ml YPM中。分离DNA并转化进大肠杆菌菌株DH10B，然后回收(rescuing)质粒(也描述于WO 00/24883中)。鉴定出两个pyrG变体：
1)F96S；将质粒称作pENI2343，和
2)T102N；将质粒称作pENI2344。
使用标准的操作步骤，将大约2微克的每种质粒pENI2155、pENI2343和pENI2344转化称作Jal355的米曲霉pyrG-突变体和称作Mbin115的黑曲霉pyrG-突变体。
将转化后的原生质体涂布在选择平板上(2％麦芽糖、10mM NaNO3、1.2M山梨醇、2％细菌琼脂、盐溶液)。生长4天之后，可见pENI2343Jal355转化体孢子形成很差，并且对于用pENI 2343转化的MBIN115则未见转化体。
将每种质粒转化的6个独立的转化体接种于96孔微滴定板中的200微升1×Vogel，2％麦芽糖中。在34℃生长4天后，测定培养液中的脂酶活性。结果以相对脂酶单位和相对标准差的形式示于下表，并且结果是独立克隆活性的平均值。
  Jal355   Mbin115
  pENI2155(wt)   48±8％   7±14％
  pENI2343(F96S)   49±15％   未生长
  pENI2344(T102N)   71±13％   80±11％
相对于孔中的真菌生物量，pENI2343转化体中的脂酶表达十分高，这非常少(少于其它转化体的1/10)。当将pENI2155转化体与pENI2344转化体进行比较时，可见对于Jal355转化体脂酶表达大约增加1.5倍，在Mbin115转化体中增加大约11倍。
因此pyrG T102N突变导致脂酶表达增加，这是由于选择基因pyrG编码的不稳定的、较低活性的OMP脱羧酶而选择出来的，脂酶表达增加可能是由于质粒拷贝数的增加。
为了评估质粒的稳定性，建立评估含有稳定附加型复制质粒(含有pyrG选择基因)孢子百分数的筛选。
构建了两个DNA文库。第一个文库已被克隆进入了一个含有作为选择基因的野生型pyrG基因的质粒，而第二个文库已被克隆进入了一个含有突变的Kozak区和T102N突变的突变型pyrG基因的质粒。
从每个文库的制备了孢子悬液并且将其铺于平板上(2％麦芽糖、10mM NaNO3、1.2M山梨醇、2％细菌琼脂、盐、含或不含20mM尿嘧啶核苷)。平板在37℃生长3天。结果示于下面的表中。
  选择基因   -尿嘧啶核苷  +尿嘧啶核苷   ％存活孢子
  野生型pyrG   11  83   13
  突变型(Kozak/T102N)pyrG   36  63   57
当使用突变的(Kozak/T102N)pyrG基因时，很明显含有质粒的孢子占有更大部分。
pENI2151的构建：
将pENI1902和pENI1861用Hind III酶切，并且用碱性磷酸酶处理pENI1902。
从1％的凝胶中纯化来自pENI1861的2408bp片段并且连接到从1％的凝胶中纯化的pENI1902载体上，从而产生了pENI2151。
pENI2207(具有弱的pyrG上游kozak区)的构建：
将pENI2151和pENI2155用StuI和SphI酶切。
从1％的凝胶中纯化来自pENI2155的2004bp的片段用并且连接到从1％的凝胶中纯化的酶切pENI2151上，从而产生了pENI2207。
pENI2229(在接头中具有额外的限制酶切位点)的构建：
以pENI2151为模板使用寡核苷酸2120201J1和1298-TAKA进行PCR。
用BssH II和Bgl II酶切PCR片段(650bp)和pENI2207。从1％凝胶中纯化载体和PCR片段并连接，从而产生pENI2229。
1298-TAKA(SEQ ID NO.15)：5′-GCAAGCGCGCGCAATACATGGTGTTTTGATCAT
210201J1(SEQ ID NO.29)：5′-GCCTCTAGATCTCCCGGGCGCGCCGGCACATGTACCAGGTCTTAAGCTCGAGCTCGGTCACCGGTGGCC
具有弱kozak和受损pyrG基因的pENI2376的构建：
用SphI和StuI酶切质粒pENI2344并且从1％的琼脂糖凝胶中分离含有pyrG基因的DNA片段(2004bp)。
用SphI和StuI酶切质粒pENI2229并且从1％琼脂糖凝胶中分离载体片段。
将pENI2229的载体片段和来自pENI2344的含有pyrG的片段连接起来，从而产生pENI2376。
pENI2516的构建：
用Hind III酶切质粒pENI2376并且将6472bp的主要载体片段进行连接，从而产生了pENI2516。
实施例3
赫赛汀是一种用于治疗乳腺癌的人抗体。它是十分昂贵的产品，在具有很高表达潜能的丝状真菌生产相似的产品会更便宜。
根据赫赛汀的人重链片段的氨基酸序列构建基因，该基因具有与曲霉中发现的高表达基因具有相同的密码子习惯。
为了能够合成编码赫赛汀重链可变区的基因，根据上述DNA序列合成示于图1的引物。引物的相对位置示于图1。
pENI2716的构建：
将引物230402j3(10pmol)、230402j4(2pmol)、230402j7(10pmol)和230402j8(2pmol)在20μl的总体积中混合，并且使用TGO聚合酶和缓冲液(Roche)进行PCR反应(94℃5分钟，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟)25个循环，72℃2分钟)。
230402j3(SEQ ID NO 30)：5′-ACCTTCACCGACTACACGATGGACTGGGTCCGGCAGGCGCCGGGCAAGGGCCTGGAGTG
230402j4(SEQ ID NO 31)：5′-CCGGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTCGCGGACGTGAACCCGAACTCCGGCGGGTCGATCTACAACCAGCGCT
230402j7(SEQ ID NO 32)：5′-AGACGGCGGTGTCCTCCGCCCGGAGGGAGTTCATCTGCAGGTACAGCGTGTTCTTCGACC
230402j8(SEQ ID NO 33)：5′-GTACAGCGTGTTCTTCGACCGGTCGACCGAGAGCGTGAACCGGCCCTTGAAGCGCTGGTTGTAGATCGAC
将产生的PCR片段(见图1)克隆到pCR4TOPO平端(blunt)载体中(Invitrogen，如产品所推荐)，并且转化进入TOP10大肠杆菌细胞中。从大肠杆菌转化体中制备DNA并测序。具有编码赫赛汀重链可变区片段的正确序列的质粒命名为pENI2716。
pENI2769的构建：
将引物230402J1(10pmol)、230402j2(2pmol)、230402j5(10pmol)和230402j6(2pmol)和质粒pENI 2716在20μl的总体积中混合，并且使用TGO聚合酶和缓冲液(Roche)进行PCR反应(94℃5分钟，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟)25个循环，72℃2分钟)。
230402J1(SEQ ID NO 34)：5′-GAGGTCCAGCTCGTCGAGTCCGGCGGCGGCCTCGTGCAGCCGGGGGGCTCGCTGCGGCTC
230402j2(SEQ ID NO 35)：5′-CGGGGGGCTCGCTGCGGCTCTCCTGCGCCGCGTCGGGCTTCACCTTCACCGACTACACGA
230402j5(SEQ ID NO 36)：5′-ATCGAGCCGCGGCTACGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTGGCCCCAGTAGTCGAAGTAGAACGACGGGCC
230402j6(SEQ ID NO 37)：5′-TCGAAGTAGAACGACGGGCCGAGGTTCCGGGCGCAGTAGTAGACGGCGGTGTCCTCCGCC
将产生的PCR片段(见图1)克隆到pCR4TOPO平端载体中(Invitrogen，如产品所推荐)，并且转化进入TOP10大肠杆菌细胞中。从大肠杆菌转化体中制备DNA并测序。具有编码赫赛汀重链可变区全长的正确序列的质粒命名为pENI2769。
实施例4
用于表达赫赛汀重链可变区的表达载体pENI-Herceptin1和pENI-Herceptin2的构建
使用引物230402j1和230402j5以及模板(pENI2769)，并使用TGO聚合酶和缓冲液(Roche)进行PCR反应(94℃5分钟，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟)25个循环，72℃2分钟)。所得到的PCR片段编码赫赛汀的重链可变区。
大型亚灰树花菌(Meripilus giganteus)纤维素结合结构域的PCR使用引物090103j1和230402J9以及从DSM(DSM9971)储存的菌株中分离的质粒并使用TGO聚合酶和缓冲液(Roche)进行PCR反应(94℃5分钟，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟)25个循环，72℃2分钟)。DSM 9971是酿酒酵母，它含有已经克隆到表达质粒pYES2.0(Invitrogen)中的内切葡聚糖酶。在所述质粒中还含有大型亚灰树花菌纤维素结合结构域。所述酵母根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure)储存于德意志微生物保藏中心(Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH.，MascheroderWeg 1b，D-38124 Braunschweig Federal Republic ofGermany)(DSM)。
储存日期：11.05.95
Depositor′s ref：NN49008
DSM名称：酿酒酵母DSM No.9971
产生的PCR片段含有TAKA-启动子和大型亚灰树花菌纤维素结合结构域，它能够在曲霉属中良好地表达。
230402J9(SEQ ID NO 38)：5′-GACTCGACGAGCTGGACCTCCGAGCCAGGGCACGCGGACGG
090103j1(SEQ ID NO 39)：5′-GTAGACGGATCCACCATGAAGGCGATCCTCTCTCTCGC
将使用090103j1/230402j9和230402j1/230402j5产生的PCR片段混合，使用TGO聚合酶和缓冲液(Roche)以及引物090103j1和230402j5进行新的PCR反应(94℃5分钟，(94℃30秒，50℃30秒，72℃1分钟)25个循环，72℃2分钟)。为了保证赫赛汀重链可变区能够很好地表达，将编码能够很好表达的大型亚灰树花菌纤维素结合结构域与赫赛汀重链可变区融合。
为了在曲霉库中表达，将产生的PCR片段用BamHI和SacII酶切，并且克隆到已用BamHI和SacII酶切的表达载体pENI2376上，因而产生pENI-Herceptin1。
为了能够在曲霉属中进行表达，将产生的PCR片段用BamHI和SacII酶切，并且克隆到已用BamHI和SacII酶切的表达载体pENI2516上，因而产生pENI-Herceptin2。
将pENI-herceptin2转化进入如实施例2中提到的曲霉属菌株Jal355中。将20个曲霉属转化体接种于96孔微滴定板中的200微升YPM中。在34℃生长4天后，用20微升培养液进行16％SDS-PAGE电泳。以16％SDS-PAGE中的条带鉴定表达赫赛汀重链可变区的转化体。
实施例5
从pENI-herceptin2表达赫赛汀重链可变区的曲霉属转化体的发酵
将具有最好地表达赫赛汀的曲霉属转化体培养于含有100ml G2-gly(酵母提取物18g/L，87％甘油24g/L，Pluronic PE-61000.1ml/L)的摇瓶里，并在30℃、275转每分的速度摇动生长过夜。第二天，将2ml培养液接种到含有100ml MDU-2B(麦芽糖45g/L，硫酸镁1g/L，氯化钠1g/L，硫酸钾2g/L，酵母提取物7g/L，痕量金属(KU6)0.5ml/L，Pluronic PE 61000.1ml/L)+1％脲的摇瓶里。接种了10个摇瓶并且在30℃、275转每分的速度摇动生长72小时。痕量金属：ZnCl2 6.8g/L，CuSO4.5H2O 2.5g/L，NiCl2.6H2O 0.24g/L，FeSO4.7H2O 13.9g/L，MnSO4.H2O 8.45g/L，柠檬酸C6H8O7.H2O 3g/L。
实施例6
构建具有编码处于赫赛汀重链可变区上游之Thermomyces lanuginosa脂酶信号肽的序列的表达载体pENI-herceptin3
使用引物081102J5和211102j1以及模板(pENI2769)并使用TGO聚合酶和缓冲液(Roche)进行PCR反应(94℃5分钟，(94℃30秒，50℃30秒，72℃ 1分钟)25个循环，72℃ 2分钟)。产生的PCR片段编码赫赛汀重链可变区。
081102J5(SEQ ID NO 40)：5′-GCCTTGGCTAGCCCTATTCGTCGAGAGGTCCAGCTCGTCGAGTCC
211102j1(SEQ ID NO 41)：5′-CACGAGCTCGAGCCGCGGCTACGAGGA
将产生的PCR片段和质粒pENI1163(WO 99/42566)用Nhe I和Xho I酶切。从1.5％的琼脂糖凝胶中纯化PCR片段和载体质粒(pENI1163)，连接并转化进入大肠杆菌菌株DH10B。将产生的质粒(pENI-herceptin3)转化进入曲霉属菌株Bech2(见上)，并且如上所述筛查赫赛汀重链可变区的表达。
实施例7
构建具有编码处于赫赛汀重链可变区上游之Thermomyces lanuginosa脂酶信号肽和下游脂酶编码基因的序列的表达载体pENI-herceptin4
使用引物081102J5和030103j1以及模板(pENI2769)并使用TGO聚合酶和缓冲液(Roche)进行PCR反应(94℃ 5分钟，(94℃ 30秒，50℃30秒，72℃ 1分钟)25个循环，72℃ 2分钟)。产生的PCR片段编码赫赛汀重链可变区。
081102J5(SEQ ID NO 42)：5′-GCCTTGGCTAGCCCTATTCGTCGAGAGGTCCAGCTCGTCGAGTCC
030103j1(SEQ ID NO 43)：5′-GTCAGCGCTAGCCGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC
将产生的PCR片段和质粒pENI1163(WO 99/42566)用Nhe I酶切。从1.5％的琼脂糖凝胶中纯化PCR片段和载体质粒(pENI1163)，连接并转化进入大肠杆菌菌株DH10B。将产生的质粒(pENI-herceptin4)测序并转化进入曲霉属菌株Bech2(见上)，并且通过测定脂酶活性(见专利WO 00/24883A1)筛选赫赛汀重链可变区的表达。
实施例8
用于在曲霉菌属中进行文库筛选的pENI-herceptin5的构建
使用引物1298-taka(见上)和991213j5以及模板(pENI-herceptin4)并使用TGO聚合酶和缓冲液(Roche)进行PCR反应(94℃ 5分钟，(94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 1分钟)25个循环，72℃ 2分钟)。产生的PCR片段编码以翻译融合体克隆到脂酶上游的赫赛汀重链可变区。
991213j5(SEQ ID NO 44)：5′-CCTCTSGATCTCGAGCTCGGTCACCGGTGGCCTCCGCGGCCGCTGCGCCAGGTGTCAGTCACCCTC
将产生的PCR片段和质粒pENI2376(WO 99/42566)用BamHI和SacII酶切。从1.5％的琼脂糖凝胶中纯化PCR片段和载体质粒(pENI2376)，连接并转化进入大肠杆菌菌株DH10B。将产生的质粒(pENI-herceptin5)测序并转化进入曲霉属菌株jal355(见上)，并且通过测定脂酶活性(见专利WO 00/24883A1)筛选赫赛汀重链可变区的表达。
实施例9
筛选从pENI-herceptin5表达的重链可变区增加的溶解性和产量
为了提高重链可变区的表达和溶解性，显然可以对参与重链和轻链相互联系的氨基酸残基进行突变。潜在的任何氨基酸的变化都可能通过轻微改变整体蛋白质结构而实现这一点。氨基酸残基应该优选地突变成亲水的残基，例如K、R、H、D、E、G、N、Q、C、S、T或者Y。在给定的实施例中突变的位点优选是V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
为了增加表达和溶解性，进行了下面的筛选。设计了下面的磷酸化引物，其中X代表天然存在的氨基酸并且氨基酸位置参考SEQ ID NO 1。
301202j1 V37X，Q39X(SEQ ID NO 45)：
5′-ACGATGGACTGGNNSCGGNNSGCGCCGGGCAAG
301202j2 G44X，L45X，W47X(SEQ ID NO 46)：
5′-GCGCCGGGCAAGNNSNNSGAGNNSGTCGCGGACGTG
301202j3 Y95X(SEQ ID NO 47)：
5′-ACCGCGGTCTACNNSTGCGCCCGGAAC
301202j4 W109X(SEQ ID NO 48)：
5′-ACTTCGACTACNNSGGCCAGGGCACC
7887 (SEQ ID NO 49)：
5′-GAA TGA CTT GGT TGA GTA CTC ACC AGT CAC
(因此将在氨苄青霉素抗性基因发现的用于酶切的Mlu I位点改变成ScaI位点)。
使用pENI-herceptin5作为模板，突变寡核苷酸301202j1、301202j2、301202j3、301202j4和寡核苷酸7887作为选择寡核苷酸，和商品化试剂盒在大肠杆菌中构建了文库。可按照产品说明书使用Chameleon双链定点诱变试剂盒(Stratagene)。
将产生的大肠杆菌文库转化曲霉属菌株Jal355(如专利WO 00/24883A1中所提及的)。
使用标准的操作步骤(参考如WO 98/01470中所述的)，将文库转化进入JaL355。然后将细胞于37℃培养于Cove平板上。
培养3天后，出现转化体，转化率为104-105/μg DNA。
将5000个独立的转化体接种于386孔每孔含有40μl 1×Vogel，2％麦芽糖的基本培养基的微量滴定盘(例如《Methods in Enzymology》，第17卷84页)。
在34℃培养3天后，测定微量滴定盘中培养液中的脂酶活性。将来自每孔的5μl培养基等分试样加入到含有40μl的0.018％对硝基苯丁酸脂酶底物、0.1％Triton X-100、10mM CaCl2、50mM Tris pH7.5的微滴定孔中。使用标准的酶学操作步骤(例如《Enzyme Kinetics》，Paul C.Engel编，1981，Chapman and Hall Ltd)用动力学酶标仪(Victor 2，Wallac)在5分钟的时期内每隔15秒用分光光度法测定活性。简言之，在底物周转的起始阶段中测定产物的形成并且将其定义为从5分钟内每15秒的405nm吸光值计算出的曲线的斜率。分离出脂酶表达水平最高的50株。增高的脂酶表达可以用来指示重链可变区的表达和溶解性的增加。该50株的培养液进一步用来进行SDS-PAGE分析以鉴定最好的表达。
实施例10
筛查从pENI-herceptinl表达的重链可变区提高的溶解性和产量
为了提高重链可变区的表达和溶解性，显然可以对参与重链和轻链相联系的氨基酸残基进行突变。潜在的任何氨基酸的变化都可能通过轻微改变整体蛋白质结构而实现这一点。氨基酸残基应该优选地突变成亲水的残基，例如K、R、H、D、E、G、N、Q、C、S、T或者Y。在给定的实施例中突变的位点优选是V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
为了增加表达和溶解性，进行了下面的筛选。设计了下面的磷酸化引物(与上面的实施例9中一样)：
301202j1 V37X，Q39X(SEQ ID NO 45)：
5′-ACGATGGACTGGNNSCGGNNSGCGCCGGGCAAG
301202j2 G44X，L45X，W47X(SEQ ID NO 46)：
5′-GCGCCGGGCAAGNNSNNSGAGNNSGTCGCGGACGTG
301202j3 Y95X(SEQ ID NO 47)：
5′-ACCGCGGTCTACNNSTGCGCCCGGAAC
301202j4 W109X(SEQ ID NO 48)：
5′-ACTTCGACTACNNSGGCCAGGGCACC
7887(SEQ ID NO 49)：
5′-GAA TGA CTT GGT TGA GTA CTC ACC AGT CAC
(因此将在氨苄青霉素抗性基因中发现的用于酶切的Mlu I位点改变成Sca I位点)。
使用质粒pENI-herceptin1作为模板，突变寡核苷酸301202j1、301202j2、301202j3、301202j4和引物7887作为选择引物，和商品化试剂盒在大肠杆菌中构建了文库。可按照产品说明书使用Chameleon双链定点诱变试剂盒(Stratagene)。
将产生的大肠杆菌文库转化曲霉属菌株Jal355(如专利WO 00/24883A1中所提及，见上)
如专利WO 01/98484A1中所提及的，筛选最后的转化体。
实施例11
pENI3318的构建：
pENI2155和pHerceptin4均用BamHI和SgrA I酶切。
从琼脂糖凝肢中分离pENI2155载体片段和pHerceptin4的1300bp片段，并连接，由此产生了pENI3318。
实施例12
筛选从pENI3318表达的重链可变区提高的溶解性性和产量
为了提高重链可变区的表达和溶解性，突变了参与重链和轻链相联系的氨基酸残基。潜在的任何氨基酸的变化都可能通过轻微改变整体蛋白质结构而实现。氨基酸残基应该优选突变成亲水的残基，例如K、R、H、D、E、G、N、Q、C、S、T或者Y。在给定的实施例中突变的位点优选是V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
为了增加表达和溶解性，进行了下面的筛选。设计了下面的磷酸化引物，其中X代表天然存在的氨基酸并且氨基酸位置参考SEQ ID NO 1。
301202j1 V37X，Q39X(SEQ ID NO 45)：
5′-ACGATGGACTGGNNSCGGNNSGCGCCGGGCAAG
301202j2 G44X，L45X，W47X(SEQ ID NO 46)：
5′-GCGCCGGGCAAGNNSNNSGAGNNSGTCGCGGACGTG
301202j3 Y95X(SEQ ID NO 47)：
5′-ACCGCGGTCTACNNSTGCGCCCGGAAC
301202j4 W109X(SEQ ID NO 48)：
5′-ACTTCGACTACNNSGGCCAGGGCACC
19670(SEQ ID NO 50)：
5′-CCCCATCCTTTAACTATAGCG
060302J1(SEQ ID NO 51)：
5′-AGAGCTTAAAGTATGTCCCTTG
使用pENI3318作为模板和突变寡核苷酸301202j1、301202j2、301202j3、301202j4和寡核苷酸19670，并使用Phusion(Finnzymes)按产品所推荐的进行PCR。
从琼脂糖凝胶中分离片段(900bp-1100bp)。使用纯化的片段和pENI3318作为模板，使用寡核苷酸060302j1和Phusion进行新的PCR。将产生的PCR片段用BamHI和SgrAI酶切并且与用同样的酶切割的pENI2155连接。
使用电转化将连接物转化进入XL10-gold，得到4500个大肠杆菌克隆，并且只有载体的对照连接物转化后没有出现克隆。
将产生的大肠杆菌文库转化进入曲霉属菌株Jal355中(如专利WO00/24883A1中所提及)。
使用标准的操作步骤(参考如WO 98/01470中所述的)，将文库转化进入Jal355。然后将细胞于37℃培养于Cove平板上。
培养3天后，出现转化体，转化率为104-105/μg DNA。
将400个独立的转化体接种于每孔含有200μl YPM的96孔微量滴定盘中。接种3份用亲本质粒pENI 3316转化的曲霉作为对照。
在34℃培养3天后，对微量滴定盘中的培养液进行脂酶活性的测定。将每孔中的5μl培养基等分试样加入含有200μl 0.018％对硝基苯丁酸脂酶底物、0.1％Triton X-100、10mM CaCl2、50mM Tris pH7.5的微滴定孔中。使用标准的酶学操作步骤(例如《Enzyme Kinetics》，Paul C.Engel编，1981，Chapman and Hall Ltd)用动力学酶标仪在5分钟的时期内每隔15秒以分光光度法测定活性。简言之，在底物周转的起始阶段中测定产物的形成并且将其定义为从5分钟内每15秒的405nm吸光值计算出的曲线的斜率。分离出脂酶表达水平最高的34株。在pENI3318曲霉属转化体中未见脂酶的表达。提高的脂酶表达可以用来指示重链可变区的表达和溶解性的增加。从每一个转化体中分离出质粒并且鉴定了突变。
实施例13
筛选从pENI3318表达的重链可变区提高的溶解性和产量
为了提高重链可变区的表达和溶解性，突变了参与重链和轻链相联的氨基酸残基。潜在的任何氨基酸的变化都可能通过轻微改变整体蛋白质结构而实现这一点。氨基酸残基应该优选突变成亲水的残基，例如K、R、H、D、E、G、N、Q、C、S、T或者Y。在给定的实施例中突变的位点优选是V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109。
为了增加表达和溶解性，进行了下面的筛选。设计了下面的磷酸化引物，其中X代表天然存在的氨基酸并且氨基酸位置参考SEQ ID NO 1。
301202j1 V37X，Q39X(SEQ ID NO 45)：
5′-ACGATGGACTGGNNSCGGNNSGCGCCGGGCAAG
301202j2 G44X，L45X，W47X(SEQ ID NO 46)：
5′-GCGCCGGGCAAGNNSNNSGAGNNSGTCGCGGACGTG
301202j3 Y95X(SEQ ID NO 47)：
5′-ACCGCGGTCTACNNSTGCGCCCGGAAC
301202j4 W109X(SEQ ID NO 48)：
5′-ACTTCGACTACNNSGGCCAGGGCACC
7887 (SEQ ID NO 49)：
5′-GAA TGA CTT GGT TGA GTA CTC ACC AGT CAC
(因此将在氨苄青霉素抗性基因中发现的用于酶切的Mlu I位点改变成Sca I位点)。
使用pENI3318作为模板，突变寡核苷酸301202j1、301202j2、301202j3、301202j4和寡核苷酸7887并且使用下面提到的操作步骤在大肠杆菌中构建了文库。
将最后的大肠杆菌文库转化曲霉属菌株Jal355(如专利WO 00/24883A1中所提及)。
使用标准的操作步骤(参考如WO 98/01470中所述的)，将文库转化进入Jal355。然后将细胞于37℃培养于Cove平板上。
培养3天后，出现转化体，转化率为104-105/μg DNA。
将40个独立的转化体接种于每孔含有200μl YPM的96孔微量滴定盘中。接种3份用亲本质粒pENI3318转化的曲霉作为对照。
在34℃培养3天后，对微量滴定盘中的培养液进行脂酶活性的测定。将每孔中的5μl培养基等分试样加入含有200μl 0.018％对硝基苯丁酸脂酶底物、0.1％Triton X-100、10mM CaCl2、50mM Tris pH7.5的微滴定孔中。使用标准的酶学操作步骤(例如Enzyme Kinetics，Paul C.Engel，著者，1981，Chapman and Hall Ltd)用动力学酶标仪在5分钟的时期内每隔15秒以分光光度法测定活性。简言之，在底物周转的起始阶段测定产物的形成并且将其定义为从5分钟内每15秒的405nm吸光值计算出的曲线的斜率。分离出脂酶表达水平最高的8株。提高的脂酶表达可以用来指示重链可变区的表达和溶解性的增加。在pENI3318曲霉属转化体中未见脂酶的表达。进行SDS-page并证实提高的表达。从每一个转化体中分离出质粒并且鉴定了突变。发现了下面的突变——所有的突变都比野生型的产量要高：
V37S，D，G
Q39C，W，S
L45G
W47G，R，L
Y95L，F
W109K。
使用Proof start聚合酶(Qiagen，202205)和Taq耐热连接酶(Biolabs208L)的诱变方法：
混合5μl连接酶缓冲液和5μl Proofstart缓冲液。加入10μl dNTP(2.5mM)，2.5μl连接酶和2.5μl Proof start聚合酶。转移2.5μl至每一个PCR反应管中(放置于冰上)。加入100ng模板DNA。加入20pmol各引物。
用灭菌水补足10μl的总体积。
过夜进行PCR反应：98℃1分钟，(96℃ 1分钟，50℃ 1分钟，65℃ 15分钟)30次。向PCR反应中加入1μl Dpn1并且轻轻混匀。在37℃孵育2小时。转化进入DH10b(化学感受态)。加入200μl LB并且在eppendorf管中于37℃生长1小时。铺板于LB+AMP的平板上并且在培养于37℃。对生长出的克隆进行DNA制备。
序列表
<110>诺和酶股份有限公司
<120>在丝状真菌中表达人重链抗体
<130>10307.204-WO
<160>51
<170>Patent版本3.2
<210>1
<211>119
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>结构域
<222>(1)..(119)
<223>人免疫球蛋白重链可变结构域、Herceptin
<400>1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1                 5                  10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>2
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物104025
<400>2
cctgaattca cgcgcgccaa catgtcttcc aagtc                           35
<210>3
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物104026
<400>3
gttctcgagc tacttattgc gcaccaacac g                               31
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物104027
<400>4
accatggcgg cactctgc                                              18
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物104028
<400>5
gagccgtagg ggaagtcc                                              18
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物108089
<400>6
cttcagactg aacctcgcc                                             19
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物108091
<400>7
gactcggtcc gtacattgcc                                            20
<210>8
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>Primer
<400>8
cctacggctc cgagagaggc cttttgatcc ttgcggag                        38
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物135944
<400>9
gagttagtag ttggacatcc                                            20
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物141200J1
<400>10
atcggtttta tgtcttccaa gtcgcaattg                                 30
<210>11
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物141200J2
<400>11
cttggaagac ataaaaccga tggaggggta gcg                             33
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物270999J8
<400>12
tctgtgaggc ctatggatct cagaac                                     26
<210>13
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物270999J9
<400>13
gatgctgcat gcacaactgc acctcag                                    27
<210>14
<211>59
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物051199J1
<400>14
cctctagatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctggatcc ccagttgtg 59
<210>15
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物1298TAKA
<400>15
gcaagcgcgc gcaatacatg gtgttttgat cat                             33
<210>16
<211>31
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物142779
<400>16
ttgaattgaa aatagattga tttaaaactt c                               31
<210>17
<211>25
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物142780
<400>17
ttgcatgcgt aatcatggtc atagc                                      25
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物14288
<400>18
ttgaattcat gggtaataac tgatat                                     26
<210>19
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物142778
<400>19
aaatcaatct attttcaatt caattcatca tt                              32
<210>20
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物141223
<400>20
ggatgctgtt gactccggaa atttaacggt ttggtcttgc atccc                45
<210>21
<211>44
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物141222
<400>21
ggtattgtcc tgcagacggc aatttaacgg cttctgcgaa tcgc                 44
<210>22
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物P50-260301j1
<220>
<221>混杂特征
<222>(13)..(13)
<223>n is a、c、g或t
<400>22
acaggactcg gtncgtacat tgccgtg                                    27
<210>23
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物F91-260301j2
<220>
<221>混杂特征
<222>(14)..(14)
<223>n is a、c、g或t
<400>23
aatttcctca tctncgaaga tcgcaag                                    27
<210>24
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>Prime F96-260301j3
<220>
<221>混杂特征
<222>(14)..(14)
<223>n is a、c、g或t
<400>24
gaagatcgca agtncatcga tatcgga                                    27
<210>25
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物N101，T102-260301j4
<220>
<221>混杂特征
<222>(13)..(13)
<223>n is a、c、g或t
<220>
<221>混杂特征
<222>(17)..(17)
<223>n is a、c、g或t
<400>25
atcgatatcg ganacancgt ccaaaagcag                                 30
<210>26
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物G128-260301j5
<220>
<221>混杂特征
<222>(14)..(14)
<223>n is a、c、g或t
<400>26
agtattctgc ccgntgaggg tatcgtc                                    27
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物G222、D223-260301j6
<220>
<221>混杂特征
<222>(14)..(14)
<223>n is a、c、g或t
<220>
<221>混杂特征
<222>(16)..(16)
<223>n is a、c、g或t
<400>27
ctctcctcga aggntnacaa gctgggacag                                 30
<210>28
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物G239-230301j7
<220>
<221>混杂特征
<222>(14)..(14)
<223>n is a、c、g或t
<400>28
gctgttggac gcgntgccga ctttatt                                    27
<210>29
<211>69
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物210201J1
<400>29
gcctctagat ctcccgggcg cgccggcaca tgtaccaggt cttaagctcg agctcggtca  60
ccggtggcc                                                          69
<210>30
<211>59
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402j3
<400>30
accttcaccg actacacgat ggactgggtc cggcaggcgc cgggcaaggg cctggagtg  59
<210>31
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402j4
<400>31
ccgggcaagg gcctggagtg ggtcgcggac gtgaacccga actccggcgg gtcgatctac  60
aaccagcgct                                                         70
<210>32
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402j7
<400>32
agacggcggt gtcctccgcc cggagggagt tcatctgcag gtacagcgtg ttcttcgacc  60
<210>33
<211>70
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402j8
<400>33
gtacagcgtg ttcttcgacc ggtcgaccga gagcgtgaac cggcccttga agcgctggtt  60
gtagatcgac                                                         70
<210>34
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402J1
<400>34
gaggtccagc tcgtcgagtc cggcggcggc ctcgtgcagc cggggggctc gctgcggctc  60
<210>35
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402j2
<400>35
cggggggctc gctgcggctc tcctgcgccg cgtcgggctt caccttcacc gactacacga  60
<210>36
<211>72
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402j5
<400>36
atcgagccgc ggctacgagg agacggtgac cagggtgccc tggccccagt agtcgaagta  60
gaacgacggg cc                                                      72
<210>37
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402j6
<400>37
tcgaagtaga acgacgggcc gaggttccgg gcgcagtagt agacggcggt gtcctccgcc  60
<210>38
<211>41
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物230402J9
<400>38
gactcgacga gctggacctc cgagccaggg cacgcggacg g                      41
<210>39
<211>38
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物090103j1
<400>39
gtagacggat ccaccatgaa ggcgatcctc tctctcgc                        38
<210>40
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物081102J5
<400>40
gccttggcta gccctattcg tcgagaggtc cagctcgtcg agtcc                45
<210>41
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物211102j1
<400>41
cacgagctcg agccgcggct acgagga                                    27
<210>42
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物081102J5
<400>42
gccttggcta gccctattcg tcgagaggtc cagctcgtcg agtcc                45
<210>43
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物030103j1
<400>43
gtcagcgcta gccgaggaga cggtgaccag ggtgcc                          36
<210>44
<211>66
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物991213j5
<400>44
cctctsgatc tcgagctcgg tcaccggtgg cctccgcggc cgctgcgcca ggtgtcagtc60
accctc                                                           66
<210>45
<211>33
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物301202j1 V37X、Q39X
<220>
<221>混杂特征
<222>(13)..(14)
<223>n is a、c、g或t
<220>
<221>混杂特征
<222>(19)..(20)
<223>n is a、c、g或t
<400>45
acgatggact ggnnscggnn sgcgccgggc aag                             33
<210>46
<211>36
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物301202j2 G44X、L45X、W47X
<220>
<221>混杂特征
<222>(13)..(14)
<223>n is a、c、g或t
<220>
<221>混杂特征
<222>(16)..(17)
<223>n is a、c、g或t
<220>
<221>混杂特征
<222>(22)..(23)
<223>n is a、c、g或t
<400>46
gcgccgggca agnnsnnsga gnnsgtcgcg gacgtg                          36
<210>47
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物301202j3 Y95X
<220>
<221>混杂特征
<222>(13)..(14)
<223>n is a、c、g或t
<400>47
accgcggtct acnnstgcgc ccggaac                                    27
<210>48
<211>26
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物301202j4 W109X
<220>
<221>混杂特征
<222>(12)..(13)
<223>n is a、c、g或t
<400>48
acttcgacta cnnsggccag ggcacc                                     26
<210>49
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物7887
<400>49
gaatgacttg gttgagtact caccagtcac                                 30
<210>50
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物19670
<400>50
ccccatcctt taactatagc g                                          21
<210>51
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>引物060302J1
<400>51
agagcttaaa gtatgtccct tg                                         22

Claims (7)

1.产生功能性人免疫球蛋白的方法，其中表达了缺乏任何轻链的人重链免疫球蛋白，该方法包括步骤：a)用编码修饰的人重链免疫球蛋白的重组构建体转化丝状宿主细胞，其中修饰包括参与联系轻链的重链蛋白质区域的一个或多个突变；b)在促进所述修饰的人重链免疫球蛋白表达的条件下培养所述丝状宿主细胞；和c)回收所述修饰的人重链免疫球蛋白。
2.根据权利要求1的方法，其中丝状宿主是曲霉宿主。
3.根据权利要求1的方法，其中人重链免疫球蛋白至少包含可变区和被Fc受体识别的Fc区。
4.根据权利要求1的方法，其中人重链免疫球蛋白至少包含可变区。
5.根据权利要求1的方法，其中修饰包含在重链蛋白质参与联系轻链区域的突变，所述突变包括在SEQ ID NO 1中V37、Q39、G44、L45、W47、Y95和W109残基的任一突变，该序列代表人免疫球蛋白的重链可变区、赫赛汀或其它的人重链免疫球蛋白的功能等效残基突变。
6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中修饰进一步包括重链免疫球蛋白中涉及与抗原接触的区域的突变。
7.根据权利要求6的方法，其中修饰包括在人可变重链免疫球蛋白中与抗原相接触的区域内的突变，所述突变包括SEQ ID NO 1中位置27-35、50-57和99-108内残基的任何突变，所述序列代表人免疫球蛋白的重链可变区，赫赛汀，或其它的人重链免疫球蛋白的功能等效残基突变。
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