CN1753690A - 抑制tace或双调蛋白调节egf受体信号反式激活 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在细胞或生物体内,抑制金属蛋白酶TACE/ADAM17的活性和/或受体酪氨酸激酶配体双调蛋白的活性,调节G蛋白或G蛋白偶联受体(GPCR)介导的信号转导对受体酪氨酸激酶的反式激活。
Description
本发明涉及在细胞或生物体内抑制金属蛋白酶TACE/ADAM17的活性和/或受体酪氨酸激酶配体双调蛋白的活性,调节G蛋白或G蛋白偶联受体(GPCR)介导的信号转导对受体酪氨酸激酶的反式激活。
G蛋白偶联受体(GPCR)和EGFR信号***间的交流涉及细胞表面生长因子前体proHB-EGF的蛋白水解(1-3)。不过在人类癌症细胞中EGFR信号反式激活的分子机制基本上还不清楚。
G蛋白偶联受体(GPCR)和EGFR间的受体间交流发生在不同的细胞类型中,这些细胞包括:成纤维细胞、角质细胞和平滑肌细胞(4)。用GPCR激动剂处理细胞导致EGFR的激活和酪氨酸磷酸化,随后导致产生EGFR特征的细胞内信号(5)。由于在GPCR刺激后,EGFR反式激活信号的快速动力学和检测不到EGFR配体释放,因此推测EGFR反式激活的机制仅仅依赖于细胞内因子(5,6)。相反,一个新型的EGFR反式激活的机制性概念涉及位于GPCR激活细胞的细胞表面的肝素结合EGF样生长因子(HB-EGF)的蛋白水解释放(1)。HB-EGF以及转化生长因子α(TGFα)和双调蛋白(AR)属于EGF样配体家族,直接激活EGFR。这些分子以跨膜前体的形式合成,经过蛋白水解切割产生可溶的并且可扩散的生长因子(7)。依赖HB-EGF的EGFR信号反式激活机制已经在血管平滑肌细胞(8)、心脏内皮细胞(9)和心肌细胞(10)的GPCR有丝***信号研究中获得了进一步的实验支持。重要的是,最近的数据表明了在囊性纤维化(3)、心脏病(2)和胃肠增生(11)的病理过程病因学中的EGFR信号反式激活通路。而且,不断增加的证据证明GPCR信号的异常和人癌症的发展和恶化直接相关(12)。我们最近证明GPCR-EGFR的串扰(cross-talk)通路广泛存在于头颈鳞状细胞癌(HNSCC)细胞中,而且,GPCR激动剂如:LPA和卡巴胆碱通过GEFR的反式激活调节HNSCC细胞的增殖和转移行为(13)。EGFR信号反式激活分子机制的阐明可能导致产生新的癌症预防和治疗方案,例如鳞状细胞癌。
这里,我们证明用GPCR的激动剂溶血磷脂酸(LPA)或卡巴胆碱刺激鳞状细胞癌细胞,特异导致EGFR配体双调蛋白(AR)的金属蛋白酶依赖型切割和释放。而且,小的干扰RNA(siRNA)沉默AR基因或用中和抗体抑制AR的生物学活性均能防止GPCR-诱导的EGFR酪氨酸磷酸化、下游有丝***信号事件、Akt/PKB的活化、细胞的增殖和迁移。而且,我们的证据表明在鳞状细胞癌细胞中通过表达显性失活的突变体或通过RNA干扰阻断金属蛋白酶-解聚素(disintegrin)TACE/ADAM17能够抑制GPCR刺激的AR释放和EGFR依赖的细胞反应。所以,TACE和/或AR发挥GPCR介导的信号效应子功能,并且是细胞受体串扰网络的关键因子。
首先,本发明涉及包括抑制金属蛋白酶TACE/ADAM17的活性和/或受体酪氨酸激酶配体双调蛋白的活性,通过在细胞中G蛋白或G蛋白偶联受体介导的信号转导来调节酪氨酸激酶受体的反式激活的方法。
根据本发明,术语“抑制”优选“特异性地”抑制,其中,TACE/ADAM17和/或双调蛋白的活性被选择性地抑制,即其它金属蛋白酶如ADAM12,或其它受体酪氨酸激酶配体如HB-EGF的活性,都没有被显著性地抑制。通过选择性地抑制TACE/ADAM17和/或双调蛋白,可以实现高度特异地破坏受体酪氨酸激酶反式激活,这对降低药物应用时出现的不期望的副作用很重要。
而且,术语“抑制”优选“直接”抑制,其中,抑制剂直接地和TACE/ADAM17和/或双调蛋白或编码上述物质的核酸分子结合。不过,本发明,还包括“间接地”抑制,其中抑制剂不直接和TACE/ADAM17和/或双调蛋白结合,而是和它们的前体或代谢物结合,特别是和双调蛋白的前体前双调蛋白结合。
术语“活性”优选TACE/ADAM17切割前双调蛋白和/或激活受体酪氨酸激酶,例如:双调蛋白激活EGFR。本发明的TACE/ADAM17抑制剂优选能抑制受体酪氨酸激酶配体双调蛋白的切割和释放。本发明的双调蛋白抑制剂优选能抑制双调蛋白的生物学活性、特别是EGFR酪氨酸磷酸化、下游有丝***信号事件、Akt/PKB的活化,细胞增殖和/或迁移。
本发明的另一方面是金属蛋白酶TACE/ADAM17的抑制剂和/或受体酪氨酸激酶配体双调蛋白的抑制剂预防和/或治疗疾病的用途,该疾病是通过G蛋白或G蛋白偶联受体介导的信号转导的受体酪氨酸激酶的反式激活引起的或与之相关。这种类型疾病的存在可通过测定G蛋白和/或GPCR的表达,例如在mRNA水平(cDNA阵列分析、SAGE、Northern印迹等)和/或在蛋白水平(Western印迹分析、免疫荧光显微术、原位杂交技术等)来确定。这种类型疾病的存在也可通过检测编码G蛋白或GPCRs的基因组和/或mRNA分子中的激活突变的存在和/或病毒编码的GPCRs的存在来确定。而且,可以确定血清中和/或疾病感染的组织中GPCR激动剂如LPA和/或双调蛋白的水平提高。需要指出的是这种类型的疾病不必与提高的受体酪氨酸激酶表达相关。
例如该疾病可以是如癌症的过度增殖性疾病,例如:鳞状细胞癌,或是其它疾病,如过度增殖性皮肤病,例如银屑病。
TACE/ADAM17和/或双调蛋白的活性可以在核酸水平受到抑制,如在基因水平或在转录水平。在基因水平的抑制可使部分或全部基因失活,即通过基因断裂(disruption)。另外,可以在转录水平进行抑制,如应用直接针对TACE/ADAM17和/或双调蛋白的mRNA的反义分子,如DNA分子、RNA分子或核酸类似物,核酶,如RNA分子或核酸类似物或能够RNA干扰(RNAi)的小RNA分子,如RNA分子或核酸类似物。例如在美国专利6,180,403号专利中描述了用反义分子抑制TACE/ADAM17的表达,在这里引入作为参考。
而且,可以在蛋白质水平抑制TACE/ADAM17和/或双调蛋白的活性,如应用能够引起TACE/ADAM17和/或双调蛋白活性特异性地抑制的化合物。在蛋白质水平的抑制包括例如采用抗TACE/ADAM17和/或双调蛋白的抗体或抗体片段。该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体或重组抗体,如:单链抗体或含有至少一个抗原结合位点的此类抗体的片段,例如蛋白水解抗体片段Fab、Fab’或F(ab’)2片段或重组抗体片段,如:scFv片段。为了治疗目的,特别是用于人的治疗时,特别优选应用嵌和抗体、人源化抗体或人抗体。
抗体或抗体片段可针对TACE/ADAM17的金属蛋白酶结构域或是针对该分子的其它部分。抗体或抗体片段可如免疫沉淀所示选择性地识别TACE/ADAM17的成熟形式,或TACE/ADAM17原形式(pro-form)。或该抗体或抗体片段可既识别成熟形式又识别原形式的TACE/ADAM17。
可以用已知的技术生产单克隆抗体,如:Khler等人(Nature256(1975),495-497)、Cole等人(Mol.Cell.Bill.62(1984),109-120)或Kozbor等人(J.Immunol.Meth.81(1985),31-42)所介绍的杂交瘤技术,上述文献在此引入作为参考。可以用Morrison等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984),6851-6855)、Neuberger等人(Nature 312(1984),604-608)、Takeda等人(Nature 314(1985),452-454)、Jones等人(Nature 321(1986),522-525)、Riechmann等人(Naure 322(1988),323-327)、Verhoeyen等人(Science 239(1988),1534-1536)或Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),10029-10033)所述的技术制造嵌和抗体或人源化抗体,上述文献在此引入作为参考。而且,Burton(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),11120-11123)、Orlandi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),3833-3837)、Winter等人(Nature 349(1991),293-299)或Huse等人(Science 254(1989),1275-1281)描述了制造抗体或抗体片段的方法,上述文献在此引入作为参考。
而且,可以使用TACE/ADAM17和/或双调蛋白的低分子量抑制剂。TACE/ADAM17抑制剂的实例为磺酸或磷酸衍生物,如:磺胺类、磺胺异羟肟酸、磷酸酰胺异羟肟酸,如:在WO 98/16503、WO 98/16506、WO 98/16514、WO 98/16520、Mac Pher son等人(J.Med.Chem.40,(1997),2525)、Tamura等人(J.Med.Chem.41(1998),690)、Levin等人(Bioorg.& Med.Chem.Lett.8(1998),2657)、Pikul等人(J.Med.Chem.41(1998),3568)、WO 97/18194、EP-A-0803505、WO 98/08853、WO 98/03166和EP-A-1279674所记述的抑制剂,上述文献在此引入作为参考。可以按照下面详述的筛选方法确认更多的抑制剂。
用于治疗目的时,以药物组合物的形式给药,该组合物中另外含有药学可接受的载体、稀释剂和/或辅料。
适用于本发明的药物组合物包括其中含有能达到预期目标的有效量的活性成分的组合物。治疗有效剂量是指引起患者的症状改善或生存期延长的的化合物的量。这类化合物的毒性和治疗效果可用标准药学方法在细胞培养或实验性动物中进行测定,例如:测定LD50(50%群体的致死剂量)和ED50(50%群体的治疗有效剂量)。任何用于本发明方法的化合物的治疗有效剂量可用细胞培养分析进行初步评估。例如,可以配制在动物模型中达到一定循环浓度范围的剂量,其中包括在细胞培养中测定IC50(例如:达到生长因子受体活性最大抑制效果一半时测试化合物的浓度)。这些信息可以用于更准确地确定人体的有用剂量。毒性和治疗效果的剂量比是治疗指数,治疗指数可以表示成LD50和ED50的比。优选具有高治疗指数的化合物。通过个人医生视患者的情况而选择确切的制剂、给药途径以及剂量(参见,如:Fingl等人,1975,《治疗的药理学基础》,Ch.1,p.1)。
分别调节剂量和间隔时间以达到能有效维持受体调节效果的活性部分的血浆水平或最小有效浓度(MEC)。不同化合物的MEC不同,不过可以通过体外数据进行估算,例如:使用此处描述的方法测定达到50-90%受体抑制所必需的浓度。采用一定方案(regimen)进行化合物给药,该方案能在10-90%的时间内维持血浆药物水平高于MEC,该维持时间优选在30-90%之间,最优选在50-90%之间。达到MEC所需剂量取决于个体特性和给药途径。在局部给药或选择性吸收时,药物的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。
所给化合物的准确剂量当然取决于接受治疗的个体,它取决于个体的体重、疾病的严重程度、给药方式和医生的处方建议。对于抗体或治疗性活性核酸分子以及其它化合物,每日的剂量从0.001到100mg/kg,特别是每天从0.01到10mg/kg是合适的。
合适的给药途径例如包括口服、直肠给药、肌内给药或胃肠道给药;非肠道给药,包括:肌肉内给药、皮下给药、髓内注射以及鞘内注射、直接室内注射、静脉注射、腹膜内注射、鼻内注射或眼内注射。
或可以采用局部给药,而不是***给药方式,例如经过注射化合物直接进入到实体瘤,通常采用长效制剂(depot)或持续释放剂型。
而且,可以采用靶向药物递送***施用药物,例如用肿瘤特异性抗体包被的脂质体。该脂质体将靶向肿瘤并选择性地被肿瘤吸收。
本发明的另外一个方面是一种方法,该方法用于确定通过G蛋白或G蛋白偶联受体介导的信号转导的受体酪氨酸激酶反式激活的调节子,该方法包括检测是否测试化合物能够抑制TACE/ADAM17的活性和/或双调蛋白的活性。该方法适合作为筛选方法,例如用于确定能调节G蛋白信号转导的新型化合物或化合物种类的高通量筛选方法。而且,该方法适合于表征药物效果和/或化合物的副作用的验证方法。该方法包括使用分离蛋白、细胞提取物、重组细胞或转基因非人的动物。优选重组细胞或非人的动物和相应的野生型细胞或动物相比,表现出TACE/ADAM17和/或双调蛋白表达的改变。
适当的受体酪氨酸激酶的例子为EGFR和其它EGFR家族成员,如HER2、HER3或HER4、PDGFR、血管内皮生长因子受体KDR/FIk-1、Trk受体、FGFR-1或IGF-1受体,还有其它类型的生长因子受体,如TNF受体1、TNF受体2、CD30和IL-6受体,其为G蛋白/GPCR介导的信号转导的靶点。
而且,用下面的图和实施例解释本发明。
图1.GPCR刺激EGFR涉及配体依赖性机制和伴随从细胞表面释放AR。a,EGFR信号反式激活需要金属蛋白酶的活性和EGFR细胞外结构域。SCC-9细胞和marimastat(BB2516,10μM;20分钟)、抗EGFR抗体ICR-3R(20μg/mL;60分钟)或PTX(100ng/mL;18小时)预孵育,并用LPA(10μM)、卡巴胆碱(Car,1mM)、EGF(7.5ng/mL)或pervanadate(PV,1mM)处理3分钟。然后用抗EGFR抗体蛋白免疫沉淀(IP)细胞提取物后,用抗磷酸酪氨酸抗体免疫印记(IB),并用抗EGFR抗体再次检测。b,流式细胞分析EGF样前体表达。收集SCC-9细胞对其表面HB-EGF、TGFa或AR染色,用流式细胞术进行分析。仅仅用FITC缀合的二抗标记的细胞作为对照。c,LPA诱导的AR原(pro AR)的蛋白水解过程。SCC-9细胞和batimastat(BB94,10μM)或PTX预孵育,用LPA或TPA(1μM)对该细胞刺激5分钟。收集细胞并用流式细胞术分析细胞表面AR密度。d,GPCR诱导的AR的蛋白水解释放。SCC-9细胞和batimastat或载体预孵育,然后用所示激动剂刺激120分钟。收集条件培养基(conditioned medium)并用ELISA分析总的AR数量。每个柱型条带表示3个值的平均值(平均值±s.d.),*,指激动剂和BB94+激动剂组间差异P<0.03。
图2.GPCR刺激需要AR触发EGFR依赖的信号和生物学反应。a,用RNA干扰(RNAi)阻滞EGF样生长因子前体表达。用针对AR原(proAR)、HB-EGF原(proHB-EGF)或TGFα原(proTGFα)的siRNA转染SCC-9细胞,培养2天,用所示RT-PCR分析基因表达或b,用LPA或卡巴胆碱刺激并且测定EGFR酪氨酸磷酸化含量。c,LPA诱导的细胞转移对AR的需要。分析SiRNA转染的SCC-9细胞朝向趋化剂纤连蛋白的跨室(transwell)迁移。每个柱型条带是表示3个值的平均值(平均值±s.d),*,指对照s iRNA+LPA和proAR siRNA+LPA的组间差异P<0.001。d,抗AR中和抗体和肝素对GPCR诱导的EGFR以及SHC酪氨酸磷酸化的作用。用抗AR抗体(aAR Ab,50μg/mL,60分钟)或肝素(100ng/mL,15分钟)预处理SCC-9细胞,然后如图所示刺激3分钟(EGFR)或5分钟(SHC)。用抗磷酸化酪氨酸抗体免疫印记检测沉淀的EGFR和SHC,然后用抗EGFR和抗SHC抗体分别重探测同一张膜。e,在体外Grb2和SHC的结合。如图所示,SCC-9细胞和抑制剂预孵育,然后刺激5分钟。用GST-Grb-2融合蛋白或单独的GST和裂解物共同孵育。用单克隆抗SHC抗体对蛋白进行免疫印记。f,AR是GPCR诱导的ERK/MAPK激活和Akt/PKB磷酸化所必需的。SCC-9或SCC-15细胞和抑制剂预孵育并刺激7分钟。用抗磷酸化的ERK抗体免疫印记分析总裂解物,检测磷酸化的ERK1/2。用抗ERK抗体重探测同一张膜。由3个独立的实验对ERK磷酸化进行了定量分析(平均值±s.d.)。*,指LPA和抑制剂+LPA的差异P<0.05。刺激Akt/PKB。用抗磷酸化的Akt/PKB抗体免疫印记细胞裂解物,然后用抗Akt/PKB抗体重探测同一张膜。g,AR抑制LPA诱导的DNA合成的作用。如图所示用抑制剂处理SCC-15细胞,然后在有配体(LPA;AR,10ng/ml)和无配体的情况下孵育18小时。然后用3H-胸苷脉冲标记细胞,用液闪计数仪测定胸苷掺入。由3个独立实验进行了定量分析(平均值±s.d.)。*,指LPA和抑制剂+LPA的差异P<0.001。
图3.显性失活的TACE抑制GPCR诱导的AR释放和EGFR信号反式激活。a,在HNSCC细胞系中表达TACE。用单克隆TACE/ADAM17抗体由裂解物免疫沉淀TACE。用人TACE cDNA转染的HEK-293细胞作为阳性对照。b,是Timp-3而不是Timp-1抑制EGFR信号的反式激活。用编码人Timp-1或Timp-3的逆转录病毒转染SCC-9细胞。用所示激动剂(左图)刺激后用免疫印记检测EGFR的激活。用抗VSV抗体对全细胞裂解物的免疫印记确定带有C-末端VSV-tag的Timp-1/3的表达(右图)。c,在逆转录病毒基因转移后,SCC-9细胞中野生型、显性失活的TACE或HA-标签标记的ADAM12的表达。如所示进行总裂解物的免疫印迹。d,分别用流式细胞术和AR ELISA测定显性失活的TACE中止了LPA诱导的proAR切割(左图)和AR释放到细胞培养基中(右图)。e,显性失活的TACE对GPCR刺激的EGFR信号反式激活的作用。
图4.TACE siRNA抑制EGFR信号传递和通过GPCR激动剂的细胞迁移。a,TACE siRNA阻断内源性TACE表达。用TACE或ADAM12 siRNA转染SCC-9细胞。用RT-PCR(左图)或用多克隆抗TACE抗体免疫印记(右图)分析基因表达。b,TACE敲除导致在细胞表面上proAR的积累。用FACS分析在siRNA转染的SCC-9细胞中AR的细胞表面含量。c,当GPCR激活时,EGFR信号传递需要TACE。如图所示用siRNA转染SCC-9细胞并用激动剂进行刺激。按照上述方法测定EGFR、SHC、ERK和Akt的激活。d,鳞状细胞癌响应LPA的运动性取决于TACE。用LPA或AR处理siRNA转染的SCC-9细胞并且进行跨室迁移测定分析。
图5.用抗金属蛋白酶结构域的单克隆抗体免疫沉淀成熟的TACE蛋白。使瞬时表达TACE-血凝素(HA)的HEK-293细胞血清饥饿(serum-starved)24小时,并且用含有5μM金属蛋白酶抑制剂BB94的TritonX-100裂解缓冲液裂解细胞。用200μg粗裂解物和5μg对照IgG(单克隆抗HA抗体)或5μg单克隆抗TACE抗体免疫沉淀。然后SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用多克隆TACE抗体(CHEMICON#19027)免疫印记分析免疫沉淀的TACE蛋白。
图6.内源性TACE蛋白的免疫沉淀。使SCC-9细胞血清饥饿24小时,用含有5μM金属蛋白酶抑制剂BB94的TritonX-100裂解缓冲液裂解细胞。用200μg粗裂解物和5μg对照IgG(单克隆抗HA抗体)或5μg单克隆抗TACE抗体免疫沉淀。然后SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。用多克隆TACE抗体(CHEMICON#19027)免疫印记分析免疫沉淀的TACE蛋白。
图7.TACE结合单克隆抗体的流式细胞分析。接种SCC9细胞,生长24小时。收集后,用抗TACE的金属蛋白酶结构域的单克隆TACE抗体细胞染色45分钟。用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤后,将细胞和藻红蛋白(PE)缀合的二抗孵育45分钟,并用PBS再次洗涤。用BectonDickinson FACScalibur流式细胞仪分析细胞。
图8.EGFR信号反式激活需要TACE活性。血清饥饿的SCC9细胞和5μg对照IgG(单克隆抗HA抗体)或所示的5μg单克隆抗TACE抗体预孵育30分钟,然后用LPA(10μM)处理3分钟。裂解之后,用抗EGFR抗体免疫沉淀(IP)EGFR。通过免疫印记(IB)用抗磷酸酪氨酸(αPY)抗体检测酪氨酸磷酸化的EGFR,然后用抗EGFR抗体重探测同一张膜。
图9.EGFR信号反式激活需要TACE活性。血清饥饿的SCC9细胞和5μg对照IgG(单克隆抗HA抗体)或所示的5μg单克隆抗TACE抗体预孵育30分钟,然后用LPA(10μM)处理3分钟。裂解之后,用抗EGFR抗体免疫沉淀(IP)EGFR。通过免疫印记(IB)用抗磷酸酪氨酸(αPY)抗体检测酪氨酸磷酸化的EGFR,然后用抗EGFR抗体重探测同一张膜。
实施例1在鳞状癌细胞中EGFR信号的反式激活需要通过TACE切割双
调蛋白原
1.方法
1.1细胞培养、质粒和逆转录病毒感染
所有细胞系(American Type Culture Collection,Manassas,VA)均按照供应商的建议进行常规培养。如前所述(1),用磷酸钙共沉淀法进行HEK-293细胞的转染。抗双调蛋白(AR)、抗HB-EGF中和抗体(R & D Systems,Minneapolis,MN)、PTX、肝素(Sigma,St.Louis,MO)、marimastat(BB2516,Sugen公司,South SanFrancisco,CA)、batimastat(BB94,British Biotech,Oxford,UK)在添加各自的生长因子之前将上述各物质添加到血清饥饿的细胞中。
用PCR从人胎盘cDNA文库中扩增编码ADAM10、12、15和17的全长cDNA,并且亚克隆到pcDNA3(Invitrogen,Carlsbad,CA)和pLXSN载体(Clontech,Palo Aito,CA)中。如前所述(2,26)制造用于病毒生产缺少pro-和金属蛋白酶结构域的显性失活蛋白酶构建体。所有的蛋白酶构建体包含C末端血凝素(HA)标签,可以用抗HA单克隆抗体(Babco,Richmond,CA)检测。如前所述(29),用pLXSN逆转录表达质粒通过磷酸钙/氯化钙法转染双嗜性包装细胞系Phoenix。在转染24小时后,收集病毒悬浮物并且用于转染亚融合SCC-9细胞(5×104细胞/6孔板)。
1.2蛋白质分析
裂解细胞并且如(13)所述进行蛋白质免疫沉淀。根据标准操作方法进行Western印迹。抗人EGFR(108.1)和SHC(1)抗体和GST-Grb2融合蛋白(5)已经在前面进行了表征。用4G10单克隆抗体(UBI,LakePlacid,NY)检测磷酸酪氨酸。多克隆抗磷p44/p42(Thr202/Tyr204)MAPK抗体和抗磷Akt(Ser473)抗体购自NewEngland Biolabs(Beverly,MA)。多克隆抗Akt1/2和抗ERK2抗体购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,CA),抗TACE抗体购自Chemicon(Harrow,UK)。
1.3流式细胞分析和ELISA
如以前(1)所述,进行ACS分析。用抗HB-EGF、AR(R & D Systems)或TGFα(Oncogene,Boston,MA)胞外域特异抗体对细胞进行染色,PBS洗涤后,细胞和FITC缀合的二抗孵育并且用Becton DickinsonFACScalibur流式细胞仪分析。
用单克隆抗AR捕捉抗体和生物素化的多克隆检测抗体以夹心ELISA(R&D Systems)法检测游离AR的浓度。用稀释在培养基中的重组人AR作为标准。用统计学分析Studen’s t检验比较两组间的数据。数值用平均值±s.d.表示,每个值至少一式三份样品。P<0.05表示具有统计学意义。
1.4RNA干扰和RT-PCR分析
用Oligofectamine(Invitrogen)将21个核苷酸的siRNA双链(Dharmacon Research,Lafayette,CO,USA)靶向内源性基因进行转染,并且如前所述(30),每6孔板加入4.2μg siRNA。转染的SCC-9细胞在转染后血清饥饿4天并进行分析。用靶向目的基因的不同区域的siRNA双链混合物取得了沉默靶基因的最高效果。所用的siRNA序列如下:
CCACAAAUACCUGGCUATAdTdT(SEQ ID NO:1),
AAAUCGAUGUAAUGCAGAAdTdT(SEQ ID NO:2)(AR);
GUGAAGUUGGGCAUGACUAdTdT(SEQ ID NO:3),
UACAAGGACUUCUGCAUCCdTdT(SEQ ID NO:4)(HB-EGF);
AACACUGUGAGUGGUGCCGdTdT(SEQ ID NO:5),
GAAGCAGGCCAUCACCGCCdTdT(SEQ ID NO:6)(TGFa);
AAAGUUUGCUUGGCACACCUUdTdT(SEQ ID NO:7),
AAAGUAAGGCCCAGGAGUGUUdTdT(SEQ ID NO:8),
AACAUAGAGCCACUUUGGAGAdTdT(SEQ ID NO:9)(TACE);
CCUCGCUGCAAAGAAUGUGdTdT(SEQ ID NO:10)(ADAM12),
GACCUUGATACGACUGCUGdTdT(SEQ ID NO:11)(ADAM12);
CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT(SEQ ID NO:12)(对照,GL2)。
用Western印迹(TACE)和RT-PCR分析验证靶向基因的特异性沉默。用AMV反转录酶(Roche,Mannheim,德国)反转录用RNeasy小型试剂盒(Qiagen,Hilden,德国)分离的RNA。用PuReTaqReady-To-Go PCR Beads(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ)进行PCR扩增。定制的引物(Sigma Ark,Steinheim,德国)为proAR5’-tggtgctgtcgctcttgata-3’(SEQ ID NO:13)和
5′-GCCAGGTATTTGTGGTTCGT-3′(SEQ ID NO:14);proHB-EGF,
5′-TTATCCTCCAAGCCACAAGC-3′(SEQ ID NO:15)和
5′-TGACCAGCAGACAGACAGATG-3′(SEQ ID NO:16);proTGFa,
5′-TGTTCGCTCTGGGTATTGTG-3′(SEQ ID NO:17)和
5′-ACTGTTTCTGAGTGGCAGCA-3′(SEQ ID NO:18);TACE,
5′-CGCATTCTCAAGTCTCCACA-3′(SEQ ID NO:19)和
5′-TATTTCCCTCCCTGGTCCTC-3′(SEQ ID NO:20);ADAM12,
5′-CAGTTT CAC GGA AAC CCA CT-3′(SEQ ID NO:21)和
5′-GAC CAG AAC ACG TGC TGA GA-3′(SEQ ID NO:22)。PCR产物在2.5%的琼脂糖凝胶中进行电泳,用溴乙锭染色显示DNA。用100-bp ladder(GIBCO,Gaathersburg,Maryland)在紫外灯下对该产物的位置和它们的大小进行确定。
1.5增殖和迁移分析
为了进行3H-胸苷掺入分析(5),将SCC-15细胞以3×104细胞/孔接种到12孔板上。不加血清培养48小时,如所示将细胞进行预孵育和刺激。18小时后,用3H-胸苷(1μCi/ml)脉冲标记细胞4小时,用三氯醋酸沉淀和随后的液闪计数器测定胸苷的掺入。
采用改良的Boyden室按照以前方法(13)对细胞的运动性进行分析。将siRNAs转染后24小时的SCC-9细胞以1×105细胞/孔接种到有或没有激动剂的24 transwell平皿的多聚碳酸酯膜插件(insert)(6.5mm直径,8μm孔径)上。下室充满无FCS的含有10μg/ml纤连蛋白化学引诱物的标准培养基。让细胞迁移36小时。在孵育后,从该膜的上表面去除未迁移的细胞。用结晶紫固定并且染色迁移到下表面的细胞。将染色细胞在10%的醋酸中溶解,用微板读数器检测570nm的吸光度。
2.结果
在HNSCC细胞中GPCR诱导的反式激活信号对广谱的金属蛋白酶抑制剂如batimastat(BB94)(13)和marimastat(BB2516,图1A)是敏感的。和EGFR信号反式激活的配位依赖机制相一致的,我们发现单克隆抗EGFR抗体ICR-3R能防止EGF样生长因子结合到该受体(14)的细胞外结构域上,终止了在SCC-9细胞中GPCR和EGF诱导的EGFR酪氨酸磷酸化(图1A)。相反,ICR-3R不能干扰高效酪氨酸磷酸化酶抑制剂(15)pervanadate所引发的反应,该抑制剂能增加很多胞内蛋白的酪氨酸磷酸化量。以前的报告显示GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化需要HB-EGF的蛋白水解切割(1-3),这促使我们提出是否在头颈癌细胞中,HB-EGF或其它EGF样生长因子参与EGFR反式激活通路的问题。通过cDNA微阵列分析,我们发现HB-EGF、TGFα和AR mRANs在SCC-4、SCC-9、SCC-15和SCC-25细胞中都有表达(没有显示数据)。而且,以胞外域特异性抗体通过流式细胞术确定这些配体的表达和细胞表明定位(图1B,展示了SCC-9的代表性数据)。令人惊讶的是,用LPA(10μM)或佛波醇酯TPA(1mM)处理头颈癌细胞,其发挥常规的脱落事件(shedding events)诱导剂的作用,减少了细胞表面外源性proAR的数量(图1C)。不过,在细胞内,LPA不能诱导proTGFα或proHB-EGF的蛋白水解切割,而用TPA刺激造成这两种EGF样生长因子的胞外域切割(未出示数据)。这些发现证明LPA刺激选择性诱导HNSCC中的proAR脱落。另外,batimastat(10μM)完全地终止了LPA诱导的proAR的胞外域切割(图1C),这证实proAR的脱落需要金属蛋白酶的活性。与该观察结果相同,主要的百日咳毒素(PTX)敏感的Gi/o家族G蛋白是LPA诱导的EGFR酪氨酸磷酸化的介质(图1A),PTX(100ng/mL)能够部分抑制SCC-9细胞表面的proAR脱落(图1C)。
除了细胞表面proAR减少之外,通过夹心ELISA测定发现,GPCR刺激造成在细胞培养基中成熟AR的积累(图1D)。发现响应卡巴胆碱的AR释放和LPA刺激时相比相当低,这表明在响应GPCR配体的AR释放的数量和EGFR酪氨酸磷酸化数量间存在直接关系(图1A)。不过,用batimastat预孵育完全地防止了在细胞培养基中的GPCR和TPA诱导的AR的积累(图1D),证明了AR释放的金属蛋白酶依赖性。
我们用3个实验检测是否AR发挥功能需要GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化和下游细胞反应。首先,我们用小的干扰RNA(siRNA)沉默proAR、proHB-EGF和proTGFα在SCC-9细胞中的内源性表达。用RT-PCR监视靶基因表达的效率和特异性敲除(图2A),证实通过mRNA降解实现了基因沉默。同时检测了siRNAs对EGFR反式激活信号的作用。如图2B所示,对proAR的siRNA完全地阻断了GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化。不过,对proHB-EGF和proTGFα的siRNAs没有显著地改变反式激活信号,这表明对于proAR的特异性需要。另外,我们对proAR敲除是否影响GPCR诱导的头颈癌细胞的转移进行了检测。事实上,proAR siRNA在体外显著抑制了LPA诱导的化学引诱性迁移(图2C)。
第二个实验,我们通过在鳞状癌细胞系的SCC-4、SCC-9、SCC-15和SCC-25中检测了AR中和抗体对通过LPA的EGFR酪氨酸磷酸化的效果。结果显示用抗人AR胞外域的多克隆山羊抗体或单克隆小鼠抗体任一进行预处理,能抑制EGFR反式激活信号(图2D,显示的是在SCC-9细胞中多克隆抗AR抗体的代表性数据)。在用卡巴胆碱刺激头颈癌细胞时得到了相似的结果(未出示数据)。相反,用白喉毒素突变体CRM197或抗HB-EGF中和抗体对HB-EGF特异性地抑制,表现出对LPA或卡巴胆碱诱导的EGFR反式激活没有影响(未出示数据)。
第三个实验,因为AR含有肝素结合结构域,而且葡糖胺聚糖肝素能防止角质细胞(16)和MCF-10A(17)细胞内AR激发的促有丝***反应,我们评价了肝素对EGFR反式激活信号的作用。和预期一致,肝素(100ng/mL)完全地阻断了LPA引起的EGFR酪氨酸磷酸化(图2D)。根据这一发现,我们接着检测了是否AR功能需要反式激活的EGFR的下游的SHC激活,因为已知连接物蛋白SHC的酪氨酸磷酸化和SHC-Grb2-Sos复合物的形成在连接激活的EGFR到Ras/MAPK级联时是关键性的一步(18)。事实上,AR阻断彻底防止了LPA诱导的SHC酪氨酸磷酸化(图2D)和谷胱苷肽-S-转移酶(GST)Grb2融合蛋白的结合(图2E)。
以前的多个实验表明EGFR反式激活是在GPCR激动剂激活的ERK/MAPK通路中一个重要机制(4,12,19,20)。为了检测是否在HNSCC细胞中LPA刺激的ERK/MAPK的活化需要AR,对AR抑制ERK1/2激活的作用进行了研究。如图2F所示,AR中和抗体、肝素和batimastat能在SCC-9和SCC-15细胞中阻止LPA诱导的ERK激活。除了促有丝***作用之外,LPA能够作为存活因子(survival factor)激活ERK/MAPK途径和Akt/PKB的磷酸肌醇3-激酶(PI3K)依赖性磷酸化(21,22)。因此我们进一步提出了是否在头颈癌细胞中LPA刺激能诱导Akt/PKB磷酸化的问题。结果表明LPA显著地增加了Akt/PKB的Ser-473位的磷酸化(图2F)。另外,通过LPA的Akt/PKB磷酸化对通过渥曼青霉素(wortmannin)或LY294002的PI3K抑制敏感(未出示数据),而且也能通过AR阻断或batimastat处理去处这种作用(图2F)。
为了进一步扩展我们对AR针对生长促进性GPCR信号的功能研究,我们评价了AR抑制对LPA诱导的DNA合成的作用。如图2G所示,当用AR抑制时,HNSCC细胞表现出LPA触发的DNA合成效率显著降低,表明通过LPA的完全增殖性反应需要AR。另外,batimastat和EGFR特异抑制剂酪氨酸磷酸化抑制剂(tyrphostin)AG1478使通过LPA的DNA合成降低至基底水平以下。总之,这些数据证明在HNSCC中的EGFR特征性的、促有丝***性以及转移促进性反式激活信号的产生需要AR。
最近的观察结果表明在小鼠成纤维细胞中金属蛋白酶解离素(disintegrin)TACE/ADAM17在proAR和其它EGF样生长因子前体的组成性脱落中的作用(23,24)。另外,在体外,TACE的蛋白水解活性能被金属蛋白酶-3(Timp-3)的而不是Timp-1的组织抑制剂所抑制(25)。因为TACE在HNSCC细胞系中广泛表达(图3A),所以我们研究了Timp-1和Timp-3对EGFR反式激活信号的作用。确实,在SCC-9细胞中,逆转录病毒转导产生的Timp-3而不是Timp-1的异位表达能抑制GPCR诱导的EGFR酪氨酸磷酸化(图3B)。而且,缺少pro-和金属蛋白酶结构域的显性失活TACE(26)(图3C)的异位表达抑制了在SCC-9细胞中GPCR诱导的proAR切割、成熟AR的释放(图3D)以及EGFR信号反式激活(图3E)。相反,ADAM10(3)和ADAM12(2)的显性失活突变体均没有表现出参与GPCR激发的proHB-EGF加工,类似的ADAM15突变体也没有影响GPCR诱导的反应(图3E,ADAM12的代表性数据)。
为了独立验证在HNSCC中EGFR反式激活途径对TACE的需要,我们用RNA干扰封闭了TACE的内源性表达。用RT-PCR和Western印迹分析(图4A)监测TACE表达的抑制。有意思的是,siRNA对TACE的定向抑制造成在SCC-9细胞的细胞表面proAR积累(图4B),这一现象支持了TACE参与proAR的胞外域加工的观点。另外,TACE siRNA特异性地抑制GPCR诱导的EGFR、SHC、ERK/MAPK和Akt/PKB的激活(图4C)。最后,TACE siRNA还阻止SCC-9细胞响应LPA产生的迁移(图4D)。
3.讨论
越来越多实验证据支持这一概念,即EGFR发挥多种GPCR信号的中心整合子(integrator)的作用,从而这些信号通往下游途径(4、6、12)。此处的数据支持一个意外的在人癌细胞中的EGFR反式激活机制以及确认了TACE在GPCR信号中的一个新型的生物学功能。我们的结果表明GPCR诱导的TACE激活具有生物学作用,能增加游离AR的数量。已经描述了其它机制,在肺上皮细胞(3)和COS-7细胞(27)中的ADAM10或心肌细胞中的ADAM12(2)介导了EGFR的HB-EGF依赖性的反式激活。这是首次阐明跨膜proAR被切割是响应GPCR刺激的结果,而且AR对介导特征在于GPCR激动剂的特征癌细胞(hallmarkcancer cell)是功能相关的。我们阐明TACE依赖的AR释放是GPCR诱导的EGFR刺激、ERK/MAPK途径的激活、Akt/PKB的磷酸化、诱导细胞增殖和迁移的必要条件。
TACE如何被异三聚体G蛋白所激活尚属未知。尽管已经表明ERK响应TPA的刺激在735位苏氨酸结合和磷酸化TACE的胞浆结构域(28),可是,在HNSCC细胞中GPCR诱导的AR释放以及EGFR酪氨酸磷酸化对MEK抑制剂不敏感(未发表的观察结果),这表明ERK不参与EGFR的上游。未来研究的一个重要的问题将是确定GPCR信号的传导是如何在一种细胞类型或生理学依赖性模式下被ADAM10/HB-EGF、ADAM12/HB-EGF或TACE/AR模型所介导。因此,我们的实验结果为在介导关键的癌细胞特性中的生理性重要的GPCR配体、TACE和AR的关联性提供了令人瞩目的证据。
实施例2,生产和表征抗TACE单克隆抗体
2.1生产单克隆抗体
产生抗TACE(ADAM17)的金属蛋白酶结构域的单克隆抗体(Mabs)。用重组蛋白免疫BALB/c小鼠(J.H.Peters,H.Baumgarten和M.Schulze,Monoclonale Antikrper-Herstellung undCharakterisierung,Springer-Verlag,1985,Berlin HeidelbergNew York Tokio),用购自Pierce,Rockford,IL,USA的T-GelTMAdsorbent进行单克隆抗体的纯化。
2.2功能分析
用ELISA鉴定8个识别TACE金属蛋白酶结构域的单克隆抗体。用上述抗体免疫沉淀HEK-293细胞的裂解物,所述细胞用编码带有血凝素表位标签(TACE-HA)的TACE(31)的真核表达质粒瞬时转染。单克隆抗体432-2、400-1、343-3和432-7特异性地免疫沉淀了TACE的成熟形式。而α-HA抗体主要免疫沉淀原形式的TACE(图5)。
而且,检测了单克隆抗体免疫沉淀来自SCC-9细胞裂解物的内源性TACE蛋白的能力。抗TACE金属蛋白酶结构域的单克隆抗体432-2、400-1、343-3和432-7特异地免疫沉淀TACE的成熟形式而不是原形式(pro-form)(图6)。
对单克隆抗体检测在活细胞的细胞表面的TACE的能力进行了检测。抗体402-6和368-3无细胞表面染色能力,而367-3表现出弱的信号。相反,抗体343-3、374-5、400-1、432-2和432-7表现出很强的信号(图7)。
最后,我们检测了单克隆TACE抗体对LPA诱导的鳞状细胞癌细胞系SCC-9中的EGFR酪氨酸磷酸化的作用。结果表明用374-5、432-2、400-1和367-3的预处理抑制了LPA诱导的EGFR信号反式激活(图8),而用单克隆TACE抗体进行预处理不会对用EGF对EGFR的直接刺激产生影响(图9)。
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序列表
<110>MPG zur Frderung d.Wiss.e.V.
<120>抑制TACE或双调蛋白调节EGF受体信号反式激活
<130>29475PWO
<140>
<141>
<150>EP 03 003 935.8
<151>2003-02-21
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<170>PatentIn Ver.2.1
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gaccagaaca cgtgctgaga 20
Claims (19)
1.调节细胞中G蛋白或G蛋白偶联受体介导的信号转导对受体酪氨酸激酶的反式激活的方法,包括抑制TACE/ADAM17和/或双调蛋白的活性。
2.权利要求1的方法,其中的细胞是人细胞。
3.权利要求1或2的方法,其中的细胞是癌细胞。
4.权利要求3的方法,其中的细胞是鳞状癌细胞。
5.权利要求1-4中任何一项的方法,其中TACE/ADAM17和/或双调蛋白的活性在核酸水平受到抑制。
6.权利要求5的方法,其中的抑制包括特异性的转录抑制。
7.权利要求6的方法,其中的抑制包括应用直接针对TACE/ADAM17和/或双调蛋白的反义分子、核酶或RNAi分子。
8.权利要求5的方法,其中的抑制包括基因失活。
9.权利要求1-4中任何一项的方法,其中TACE/ADAM17和/或双调蛋白的活性在蛋白质水平受到抑制。
10.权利要求9的方法,其中的抑制包括特异性的蛋白抑制。
11.权利要求9或10的方法,其中的抑制包括应用直接针对TACE/ADAM17和/或双调蛋白的抗体或抗体片段。
12.权利要求9或10的方法,其中的抑制包括应用TACE/ADAM17和/或双调蛋白的低分子量抑制剂。
13.TACE/ADAM17的抑制剂和/或双调蛋白的抑制剂在制备用于防止和/或治疗疾病的药物中的用途,所述的疾病是由G蛋白或G蛋白偶联受体介导的信号转导导致的受体酪氨酸激酶的反式激活引起的或与之相关。
14.权利要求13的用途,其中的疾病是过度增生性疾病。
15.权利要求14的用途,其中的疾病是癌症。
16.权利要求15的用途,其中的疾病是鳞状细胞癌。
17.权利要求13-16中任何一项的用途,其中的药物另外包含药物可接受的载体、稀释剂和/或辅料。
18.预防和/或治疗疾病的方法,该方法包括对有此需要的受试者给予有效量的TACE/ADAM17抑制剂和/或双调蛋白抑制剂,所述疾病是由G蛋白或G蛋白偶联受体介导的信号转导导致的受体酪氨酸激酶反式激活引起的或与之相关。
19.一种方法,用来鉴定通过G蛋白或G蛋白偶联受体介导的信号转导的受体酪氨酸激酶反式激活的调节剂,该方法包括测定测试化合物是否能够抑制TACE/ADAM17的活性和/或双调蛋白的活性。
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