CN1748740A - 枳实总黄酮及其制剂的制备方法和质量控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种枳实总黄酮及其制剂的制备方法和质量控制方法，制备方法是将枳实药材先经乙醇回流提取、减压干燥得干膏细粉后，再经水沉盐析工艺对黄酮类成分进行分离纯化，再用高浓度的乙醇净化、干燥得到枳实总黄酮；然后以枳实总黄酮为原料按常规方法制备成临床可接受的各种制剂。本发明所采用的质量控制方法是用照紫外分光光度法和照高效液相色谱法分别对枳实总黄酮原料及其制剂中的总黄酮、柚皮柑的含量进行测定。本发明还公开了枳实总黄酮具有促进胃肠动力方面的用途，可用于运动障碍型功能性消化不良的治疗，具有有良好的开发前景。

Description

枳实总黄酮及其制剂的制备方法和质量控制方法
技术领域
本发明涉及一种单味中药有效部位及其制剂的制备方法和质量控制方法，特别是涉及枳实总黄酮及其制剂的制备方法和质量控制方法，属医药技术领域。
背景技术
消化不良包括功能性和器质性消化不良两类。无组织结构和生化改变的消化不良可以认为是功能性消化不良，临床表现可见到上腹不适、饱胀、隐痛、烧心、嗳气、早饱或餐后饱胀加重等，症状持续时间超过4周。消化不良在成年人很常见，且严重影响患者的生活质量，患者常多次就诊，耗费巨大，在国、内外均已引起密切关注。各国报道的消化不良的患病率在20％～49％之间。目前，促动力药是主要的治疗药物。其中，除多潘立酮外，其余的药物均因存在的副作用而使其使用受到限制。
近年来，中药治疗功能性消化不良的研究报道甚多，显示了中药对该病良好的治疗效果，而且通过对枳实消痞丸进行实验研究，发现体现消导之法的药物(枳实、厚朴、麦芽)促进胃排空的作用最为明显。通过查阅《中华人民共和国药典》2000年版一部、原***药品标准中药成方制剂1～20册、新药转正标准1～16册和《中华人民共和国药典》1995年版增补本、国家药品监督管理局药品审评中心编辑的新药数据库，有132种用于消化不良的中成药，但未见有明确用于功能性消化不良的中成药。而且，市售的枳实药材质量优劣的评价标准为柚皮苷含量的高低，无法保证枳实药材中新橙皮苷有较高含量。
因此，从枳实中提取得到枳实总苷并制成临床可接受的剂型，并提供能保证有效成分含量更高的质量控制方法，用于运动障碍型功能性消化不良的治疗，可以填补这个空白，具有有良好的开发前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种枳实总黄酮的制备方法；本发明的第二个目的在于提供一种枳实总黄酮的质量控制方法；本发明的第三个目的在于提供一种枳实总黄酮片剂的制备方法；本发明的第四个目的在于提供一种枳实总黄酮在促进胃肠动力方面的用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现的。
枳实总黄酮的制备方法为：
取枳实做成枳实药材粗粉，加5～7倍量60％～80％的乙醇，回流提取2～4次，每次1～3小时；醇溶液滤过，合并滤液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入5～8倍量水，充分搅拌溶散，加入1/5水量的食盐，充分搅拌，冷藏静置24小时；弃去上清液，取沉淀，加入6～8倍量95％～100％的乙醇，回流提取2小时，静置，取上清液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入4～10倍量水，充分搅拌溶散，静置过夜，弃去上清液，取沉淀，减压干燥至干，即得枳实总黄酮原料。
本发明枳实总黄酮的含量测定方法为：
A.照紫外分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)测定。
对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：称取枳实总黄酮细粉20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超声20分钟，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
测定法：取供试品溶液，以甲醇为空白，在283nm的波长处测定吸收度，计算，即得；
枳实总黄酮原料含总黄酮以柚皮苷计，应在60％～80％间。
B.照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；30～40∶60～70的甲醇-水为流动相；检测波长为285nm；理论塔板数按柚皮苷峰计算应不低于1500，按新橙皮苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备：称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的柚皮苷和新橙皮苷对照品，加甲醇制成对照品混合溶液，浓度分别为0.1mg/ml和0.3mg/ml；
供试品溶液的制备：称取枳实总黄酮细粉0.02g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
枳实总黄酮原料柚皮苷含量应在10％～13％范围内。
按药剂学方法，可将本发明枳实总黄酮作为原料，按常规药剂学方法，制备成各种临床可接受的剂型，包括但不限于如下剂型当中的一种：片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂等。
取枳实总黄酮原料细粉，加入适量低取代羟丙基纤维素、可溶性淀粉，混匀，60％～80％乙醇制粒，干燥，过筛，加入1％硬脂酸镁，压片，薄膜包衣，即得本发明片剂，0.3克/片，每日三次，每次两片。
用本发明枳实总黄酮制成的各种制剂如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、混悬剂、滴丸、口服液体制剂等，可按如上所述枳实总黄酮原料的含量测定方法对枳实总黄酮各种制剂进行测定，样品量可按本发明片剂的日服用量折合为其他制剂的日服用量取样。经测定，本发明片剂总黄酮含量以柚皮苷计，为135～150mg/片；本发明片剂柚皮苷为18～22mg/片。
已有报道中，枳实有效部位总提物的含量在30％左右，还没有针对本发明中主要两个黄酮成分柚皮苷、新橙皮苷的提取工艺报道，我们对本发明工艺进行了进一步水洗-醇沉纯化，新橙皮苷含量可以达到90％纯度，本发明制剂采用了两种方法测量总黄酮：紫外分光光度法、高效液相色谱法测定柚皮苷、新橙皮苷，含量均在50％以上，可控性好。
而且，枳实总黄酮的制备工艺简单，适合大生产，每吨加工成本(包括药材)仅为2万元，所用试剂还可回收，所用标准品已有成熟的制备方法。而且本发明枳实总黄酮的质量控制方法，把枳实总黄酮原料中枳实总黄酮含量控制在60％～80％间，柚皮苷含量控制在10％～13％间，新橙皮苷含量控制在50％～70％范围内，使枳实总黄酮原料的质量标准具备了可控性。
由本发明枳实总黄酮制备而成的片剂，其服药量较一般的复方制剂要少，服用方便，而且能严格地控制产品质量。再加之患病人群之众，当有良好的市场前景，不仅可带来经济效益，而且通过改善症状，提高患者的生活质量而能发挥出一定的社会效益。
同时，采用室温条件下留样观察的方法，对按本发明制备工艺制备的三批枳实总黄酮原料，三批本发明枳实总黄酮片剂进行稳定性考察，结果表明：本发明原料和制剂均质量稳定，基本无变化。
经药效学试验，本发明枳实总黄酮能提高小鼠小肠推进率，促进正常小鼠小肠运动及拮抗阿托品所致的小鼠小肠运动功能的抑制，对新斯的明所致的小鼠小肠运动亢进无明显的影响；枳实总黄酮能明显促进胃的排空。枳实总黄酮高、低剂量对0.6％醋酸所致小鼠扭体反应无明显影响，说明其无明显的镇痛作用；枳实总黄酮低、高剂量对于胃酸、胃蛋白酶的影响不明显；对于25％乙醇+20mmol/L水杨酸所致的大鼠实验性胃炎无明显的影响；枳实总黄酮对于家兔离体肠平滑肌的收缩有抑制作用，可明显减少其收缩力，既能使乙酰胆碱所致过度亢进的兔肠肌抑制，又能使阿托品所致过度抑制的兔肠肌兴奋，说明其有双向调节作用。
下面实验例用于进一步说明本发明但不限于本发明。
实验例1：枳实总黄酮提取纯化工艺技术条件优选研究
(1)乙醇浓度初选  浓度分别为50％、60％、70％、80％，提取2次，2小时/次。药液经纱布过滤，合并滤液，减压回收乙醇并浓缩成稠膏，减压真空干燥。比较其出膏率和有效成分的提取率(以新橙皮苷和柚皮苷总量为指标)的影响，结果见表1。
                              表1不同浓度乙醇提取结果
  醇提浓度   50％   60％   70％   80％
  干膏得率黄酮苷含量   18.77％6.68％   17.14％9.59％   13.89％9.24％   11.54％7.69％
根据上述结果，选用较高浓度的乙醇提取，其浸膏黄酮苷含量较高，易于净化处理。
(2)醇提工艺优选为了研究枳实醇提的最佳工艺，我们对醇提工艺采用正交试验法，在药材等量的前提下，以乙醇为溶媒，提取净化工艺以多提取、少破坏、时间短、消耗小、质量好为原则进行优选，比较其不同加醇量、回流时间、回流次数以及不同的醇提浓度对其出膏率和有效成份(以新橙皮苷和柚皮苷总量为指标)提取率的影响。
根据初步实验结果，用正交实验法优选提取工艺，以不同加醇量、回流时间、回流次数、醇提浓度4因素3水平，采用L9(34)正交表，进行正交试验见表2～表6。
                 表2醇提工艺正交试验因素水平设计
Figure A20041007790300101
按照L9(34)正交表安排9次试验，结果见表3
                           表3醇提工艺正交试验、L9(34)计算表
       因素   A   B   C   D  枳实黄酮苷提取量(g)
       列号   1   2   3   4
试验号   123456789   111222333   123123123   123231312   123312231  0.64751.40261.67531.26490.72211.59741.06051.13110.7187
  IjIIjIIIjI2jII2jIII2jRj＝I2j+II2j+III2jSj＝RJ/3-CT   3.7254   2.97293.25583.99148.838110.600215.931335.36960.1843   3.3763.38623.457911.397311.466411.957134.82080.0013   2.08834.06054.07134.361016.487716.575537.42420.8691 G＝10.2201CT＝G2/9＝11.6056SE＝0.0013
  3.58442.9103
  13.878612.84798.469835.19630.1265
                          表4方差分析表
 来源   平方和   自由度   均方和   F比值   显著性
 ABCD误差e   Sa＝0.1265SB＝0.1843SC＝0.0013SD＝0.8691   2222∞   0.06330.09220.00070.4346   90.4286131.7141620.857   *********
F1-0.01(2，∞)＝4.61 F1-0.05(2，∞)＝3.0 F1-0.10(2，∞)＝2.3
从试验结果和方差分析表上看，因素D、B、A对结果有非常显著的影响，C对结果影响较小，影响顺序为D＞B＞A＞C。
                                     表5、L9(34)计算表
       因素   A   B   C   D   提取出膏率(％)
       列号   1   2   3   4
试验号   123456789   111222333   123123123   123231312   123312231   11.0918.1621.0217.8411.5516.412.6713.718.84
  IjIIjIIIjI2jII2jIII2jRj＝I2j+II2j+III2jSj＝RJ/3-CT   50.27   41.643.4246.261730.561885.302139.985755.843.67   41.244.8445.241697.442010.632046.665754.733.30   31.4847.2352.57990.992230.672763.605985.2680.15 G＝131.28CT＝G2/9＝1914.94SE＝3.30
  45.7935.22
  2527.072096.721240.455864.2439.81
                                表6方差分析表
  来源   平方和   自由度   均方和   F比值   显著性
  ABCD误差e Sa＝39.81SB＝3.67SC＝3.30SD＝80.15   2222∞   19.911.8351.6540.07 12.071.112124.28 ****
F1-0.01(2，∞)＝4.61 F1-0.05(2，∞)＝3.0 F1-0.10(2，∞)＝2.3
从试验结果和方差分析表上看，因素A、D对结果有非常显著的影响，B和C对结果有一定影响，影响顺序为D＞A＞B＞C。
由上述两方差结果可以看出，提取次数和醇浓度为出膏量及总苷提取量的主要影响因素，取其最佳条件为60％乙醇，提取时间、乙醇用量在设定选择范围内，影响较小，考虑到实际生产的需要，选择加醇量6倍，每次2小时。
在其他最佳工艺条件基础上，进一步考察提取次数(1、2、3、4)，确立最佳提取次数，见表7。
             表7醇提工艺最佳提取次数考察
  提取次数   累计出膏率(％)   黄酮累计提取率(％)
  第一次   11.2   54.2
  第二次   20.5   92.8
  第三次   22.6   97.5
  第四次   23.5   100
由上表可见，在醇浓度、醇用量、提取时间最佳工艺条件下，提取2次，黄酮苷提取转移率已达到92.8％，从节能角度考虑，选择提取次数为2次。综合考虑，选择最后的最佳工艺为A1B2C2D2。
(3)黄酮类的分离纯化：
根据枳实黄酮类成分水溶性较小的特点，采用水沉(第一次)-高浓度醇提-水沉工艺(第二次)去除水溶性较大的杂质成分，并分别采用稠膏直接加水沉淀(I)、稠膏加淀粉-干燥-水洗(II)、稠膏加微粉硅胶-干燥-水洗(III)、稠膏加水分散-食盐盐析(IV)、干膏细粉直接水洗(V)、干膏细粉水分散-食盐盐析(VI)、稠膏碱溶-酸沉(VII)等纯化工艺进行了比较，以去除药材残渣和水溶性杂质，其工艺优选结果见表8。
                            表8枳实醇提取物纯化工艺研究
  工艺   水沉效果   出膏率(％)   最终产物黄酮含量(％)   总体评价
  I   第一次水沉不明显   0.3   28   +
  II   多次水洗   0.92   62   +++
  III   第一次水沉明显   3.5   36   +++
  IV   即刻沉淀、静置时间短   2.1   43   ++++
  V   第一次水沉不明显   1.1   42   ++
  VI   即刻沉淀，静置时间短   3.1   53   +++++
  VII   不易水沉   0   0   -
研究表明，由于枳实中含有大量的果胶，使得第一次水沉工艺(果胶含量高时)易产生沉淀溶胶分散现象，黄酮类成分不易下沉，给生产带来困难。通过采用工艺VII，沉淀明显，易工业化生产，且食盐可回收，经两次水洗，沉淀物中黄酮即可达到新药要求，且除去了食盐，操作步骤简单。
在此基础上，对工艺VII进行了优化筛选：
1.水沉盐析工艺：
稀醇提取后的干膏，其中含有大量的水溶性杂质成分，其总黄酮苷含量约为10％，没有达到技术要求，因此采取水洗沉方法去除水溶性杂质。不同加水量试验结果如下表9：
               表9第一次水沉工艺考察
  水量(倍)   溶散效果   沉降效果   综合效果
  3   -   ++   +
  5   ++   ++   ++++
  8   +++   +   ++++
考虑到黄酮苷有一定的水溶性，为了在保证溶解、净化的基础上，尽量减少黄酮苷的损失，而且在后面还有一步水洗除盐、净化过程，因此在第一次水沉时，在保证干粉充分溶散的基础上，尽量减少加水量，故选用加5倍量的水洗沉。
经实验，常温条件下，在水中加入1/5重量的的食盐即能出现饱和现象(20℃时氯化钠固体在水中的溶解度36g)，考虑到水沉液密度较大，且为了方便后续盐的净化，不宜在盐析时沉淀过多的盐，因此确立该工艺的加盐量为水量的1/5。通过盐析来减小枳实黄酮的溶解度、加快沉降过程。
2.醇提净化工艺：
2.1乙醇浓度选择：
20℃时氯化钠固体在100％乙醇中的溶解度为0.07g。
100℃时氯化钠固体在水中的溶解度为40g。
因此选用高浓度的乙醇(95％)提取作为除盐的第一道工序，并实现了第二步纯化。
2.2乙醇用量比较：取等量的盐析后稠膏100ml，分别加入6倍、8倍量的95％乙醇回流2小时，结果提取后的干膏量分别为18.5g、19.4g，从省时、节能考虑，选用加入6倍量95％乙醇。
3.水沉工艺：
在经过前两步次的净化后，仍有少量食盐未除去，需进一步纯化处理，因此增加第二次水洗沉工艺，并对加水量进行了考察，结果如下表所示
                  表10第二次水沉工艺考察
  水量(倍)   溶散效果   出膏率(％)   黄酮苷含量(％)
  4   +   74.66   46.48
  8   ++   62.50   50.75
  10   +++   54.06   54.63
上述结果显示，经前两次纯化后，黄酮苷在第二次水洗时易沉降。经10倍量水洗沉，黄酮苷含量达到了中药新药的要求，有效部位含量大于50％，因此第二次水洗沉选用加入10倍量水。
实验例2：枳实总黄酮苷紫外分光光度法测定的方法学考察
精密称取柚皮苷2.47mg，用甲醇超声定容于5ml容量瓶中，即得0.494mg/ml的对照品储备液。
取枳实总黄酮20mg精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超声20分钟，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
准确量取0.10，0.20，0.30，0.40，0.50ml对照品储备液分别置于10ml容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得系列对照品溶液。以甲醇为空白，照分光光度法(中国药典2000版一部附录VA)在283nm处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，绘制标准工作曲线(见图1)。
1.线性关系考察
                            表11线性关系测定结果
  序号   1   2   3   4   5
  对照溶液浓度(μg/ml)吸收度   4.940.1790   9.880.3127   14.820.4536   19.760.5975   24.700.7423
其回归方程为：A＝34.995 Cx-1.17491 r＝0..9997
2.精密度的测定
将同一浓度的柚皮苷标准溶液，用上述方法重复检测5次。结果见表12
                        表12精密度测定结果
  序号   1   2   3   4   5
  吸收度   0.4536   0.4533   0.4540   0.4535   0.4538
  平均(％)   0.4536
  RSD   0.06％
3.再现性试验
将批号为20020523的枳实总黄酮样品液用上述方法重复操作5次，并测定。结果见表13：
                                表13再现性测定结果
  序号   取样量(mg)   吸收度   样品中总黄酮含量(％)   平均含量(％)   RSD(％)
  12345   20.4020.2920.0619.8520.35   0.45500.45280.44840.44310.4539   72.2972.3172.3772.2072.28 72.29 0.08
4.样品稳定性试验
取批号为20020523的样品溶液，放置3、6、9、12小时后，经分光光度法测定，其总黄酮含量变化不大，说明样品溶液在12小时内稳定。结果见表14。
                                表14稳定性试验结果
时间(小时) 0 3 6 9 12
  吸收度   0.4550   0.4546   0.4560   0.4562   0.4580
  平均值(％)   0.4560
  RSD(％)   0.29
5.加样回收率试验
取批号20020523样品5份，每份2.5mg，用甲醇定容于25mL容量瓶中，超声20min，摇匀，过滤，取续滤液1mL于10mL容量瓶中，加入对照品储备液150μL，甲醇定容。按上述方法测定加样回收率。结果见表15。
                                   表15加样回收率试验测定结果
  序号   样品总黄酮浓度(μg/mL)   对照品加入浓度(μg/mL)   总黄酮测出量浓度(μg/mL)   回收率(％)   平均值(％)   RSD(％)
  12345   7.587.176.807.067.29   7.417.417.417.417.41   14.9514.7714.1014.5814.56   99.53102.5898.54101.5098.09 100.05 1.93
6.样品测定
取三批枳实总黄酮干粉约20mg，精密称定，按上述方法制备样品液，将样品液在283nm处测定吸收度，根据回归方程计算枳实药材中总黄酮含量。结果见表16。
                        表16样品测定结果
  批号   取样量(mg)   吸收度   总黄酮含量(％)
20020523   20.33   0.4535   72.28
  19.94   0.4454   72.28
20020525   20.00   0.4469   72.32
  20.21   0.4516   72.38
20020527   20.43   0.4557   72.31
  20.05   0.4478   72.30
根据以上测定结果，枳实总黄酮限度范围确定为含总黄酮以柚皮苷计60％～80％。
实验例3：枳实总黄酮苷高效液相色谱法测定的方法学考察
1、仪器和色谱条件及试药
1.1仪器  Waters 600 controller；KQ-500DB型数控超声波清洗器(40KHz，500W)；UV-265紫外-可见分光光度计。
1.2色谱条件  色谱柱采用Kromasil C18(150×4.6mm，5um)，流动相为甲醇-水＝34∶66，检测波长λ＝285nm，流速为1ml/min，柱温为室温，理论板数按柚皮苷峰计算应不低于1500，按新橙皮苷峰计算应不低于1500。
1.3试药  柚皮苷对照品(中国药品生物制品检定所提供)，批号：0722-9805新橙皮苷对照品(首都师范大学分析测试中心提供)所用试剂甲醇，韦斯实验用品有限公司；水为超重过滤水。
1.4对照品来源及纯度
柚皮苷对照品购自中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：0722-9805。新橙皮苷对照品由首都师范大学分析测试中心提供，纯度99.9％。
2、方法学考察
2.1测定波长的选择：
在参考文献的基础上，对柚皮苷和新橙皮苷对照品做了紫外扫描，从光谱图可以看出：柚皮苷和新橙皮苷在285处有最大吸收值，故选择测定波长为285nm。
2.2提取溶剂的确定
试验中考察了提取溶剂的影响，用甲醇、50％甲醇及30％甲醇可以将柚皮苷和新橙皮苷从样品中提取出来，但用50％甲醇及30％甲醇提取率低，故选择提取溶剂为甲醇。
2.3提取时间的确定
试验中考察了提取时间的影响，精密称取样品0.01g，加入甲醇超声处理，取不同时间段的提取液进行HPLC分析，记录峰面积积分值。结果见表17：
                 表17提取时间考察结果
  时间(min)   15   20   25
  柚皮苷峰面积   2345374   2681309   2703750
  新橙皮苷峰面积   7223134   8239620   8282771
由测定数据看出，样品超声处理20分钟，峰面积积分值已基本稳定，选择超声处理20分钟。
2.4***适应性试验
对照品溶液的制备  精密称取柚皮苷对照品0.58mg，新橙皮苷对照品1.56mg，置5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成对照品混合溶液，分别为0.116mg/mL和0.312mg/mL。
供试品溶液的制备  取本品粉末，精密称取约0.02g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声处理(功率100W，频率40KHZ)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。
分析色谱图可知：对照品、供试品中柚皮苷和新橙皮苷峰的保留时间基本一致，理论板数按柚皮苷峰计算不少于1500，按新橙皮苷峰计算不少于1500。
2.5线性关系考察
精密吸取上述对照品混合溶液4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μL，进行HPLC测定，记录色谱图；以对照品的进样量(μg)为横坐标，以色谱峰面积值为纵坐标作标准曲线(见图2、图3)，并进行回归，计算标准曲线的回归方程。
                             表17-1柚皮苷线性关系考察结果
序号 1 2 3 4 5
  X进样量(ug)   0.464   0.928   1.392   1.856   2.320
  Y柚皮苷峰面积*106   1.013991   2.029613   2.936325   4.062516   5.130336
经计算，回归方程为：Y＝2212410X-45121.7 R＝0.99938；结果表明柚皮苷进样量在0.464～2.320ug范围内线性关系良好。
                               表17-2新橙皮苷线性关系考察结果
  序号   1   2   3   4   5
  X进样量(ug)   1.248   2.496   3.744   4.992   6.240
  Y新橙皮苷峰面积*106   2.628795   5.218506   7.829511   10.508039   13.230377
经计算，回归方程为：Y＝2122810X-64763.5 R＝0.99994；结果表明新橙皮苷进样量在1.248～6.240ug范围内线性关系良好。
2.6稳定性试验
取同一样品，按供试品溶液制备方法制备后，分别在0、1、3、5、8小时测定，考察其稳定性，结果见表18：
                            表18稳定性试验结果
  时间(h)  0   1   3   5   8
  柚皮苷峰面积  1147144   1151916   1150248   1162172   1161466
  新橙皮苷峰面积  3370107   3382332   3368713   3369946   3369573
  RSD(％)  0.591％(柚皮苷)、0.170％(新橙皮苷)
由试验结果知，在八小时之内信号基本稳定。
2.7精密度试验
取对照品混合溶液，照含量测定方法重复测定五次，数据见表19：
                        表19精密度试验结果
  序号   1   2   3   4   5
  峰面积(柚)   2977417   2963773   2914782   2797576   2927884
  峰面积(新)   7665368   7629310   7519305   7235004   7553478
  RSD(％)   1.148％(柚皮苷)、1.185％(新橙皮苷)
试验结果表明仪器精密度和操作精密度较好。
2.8重复性试验
精密称取同一样品(约0.01g)5份，按供试品溶液的制备方法制备后，进行HPLC测定，数据见表20：
                            表20重现性试验结果(n＝5)
编号   1   2   3   4   5
称样量(g)   0.00975   0.00957   0.00967   0.01024   0.00984
柚皮苷含量(％)   13.0164   13.2585   13.2742   12.9059   13.3830
新橙皮苷含量(％)   39.4806   39.5022   38.8409   39.9132   38.60324
平均含量(％)   13.1676(柚皮苷)、39.2680(新橙皮苷)
RSD(％)   1.506％(柚皮苷)、1.360％(新橙皮苷)
试验结果表明，重复性良好。
2.9回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量的同批号样品5份，分别加入已知浓度的对照品混合溶液300ul(即含柚皮苷0.061mg、新橙皮苷0.154mg)，按供试品溶液制备方法制备后，照含量测定项下方法测定含量，以下式计算回收率，数据见表21、表22：
回收率％＝(测出总量-样品中含量)×100％/加入对照品量
                                表21柚皮苷回收率试验结果
序号   称样量(g)   测定总量(mg)   样品中柚皮苷的含量(mg)   柚皮苷对照品加入量(mg)   回收率(％)
  1   0.02016   0.1111   0.0524   0.061   96.16
  2   0.01984   0.1118   0.0516   0.061   98.69
  3   0.02073   0.1122   0.0539   0.061   95.64
  4   0.02117   0.1131   0.0550   0.061   95.24
  5   0.02106   0.1138   0.0548   0.061   96.77
计算平均回收率为96.50％，RSD％＝1.402％
                               表22新橙皮苷回收率试验结果
  序号   称样量(g)   测定总量(mg)   样品中新橙皮苷的含量(mg)   新橙皮苷对照品加入量(mg)   回收率(％)
  1   0.02016   0.3109   0.1497   0.154   97.19
  2   0.01984   0.3137   0.1550   0.154   100.62
  3   0.02073   0.3144   0.1485   0.154   96.44
  4   0.02117   0.3175   0.1481   0.154   96.18
  5   0.02106   0.3186   0.1501   0.154   97.49
计算平均回收率为97.59％，RSD％＝1.825％
2.10样品测定结果
精密称取三批样品，每批3份，每份约0.01g，按供试品溶液的制备方法制备后，进行HPLC测定，记录芍药苷峰面积积分值，计算柚皮苷和新橙皮苷含量，结果见表23：
                                 表23样品测定结果
  批号           柚皮苷和新橙皮苷含量(％)   平均值(％)
20020523   柚皮苷   12.3155  13.0311  12.0315   12.4927
新橙皮苷 41.4360  40.7672  39.4476 40.5502
20020525   柚皮苷   12.4912  12.9600  13.2300   12.8937
新橙皮苷 39.1107  40.5298  40.5310 40.0572
20020527   柚皮苷   13.9923  13.8007  13.1897   13.6609
  新橙皮苷   39.8363  39.6034  39.0261   39.4886
根据上述测定结果和国家《药品注册管理办法》中中药、天然药物第五类原料的有关规定，确立本原料总黄酮含量不得低于70％，柚皮苷含量不得低于12％，新橙皮苷含量不得低于38％。
实验例4：本发明片剂制备工艺的研究
根据出膏率和制剂经验，在本发明片剂成型工艺中，选用低取代羟丙基纤维素、可溶性淀粉(1∶1)作为辅料，对润湿剂乙醇浓度(60％，70％，80％)进行了考察，结果表明，用70％湿润(干粉∶乙醇＝5∶1)，18目筛挤压制粒，70℃烘1h，20目筛除去大颗粒，60目筛去小颗粒，整粒后，细粉少、颗粒整齐、硬度合适，成型后不易碎；加入1％硬脂酸镁，压片成型，其崩解时限在40分钟左右，符合片剂要求。
实验例5：本发明片剂照紫外分光光度法测定的试验条件及方法学考察
1.空白试验  按处方量比例称取微晶纤维素和微粉硅胶，用甲醇溶解，用与原料总黄酮相同的测定方法测定其吸收度。
2.再现性试验  以技术方案中所述的总黄酮测定方法对同一批样品(批号20020620)进行再现性试验，结果见表24。
                             表24再现性试验测定结果
  序号   1   2   3   4   5   X   RSD％
  含量％   51.51   51.57   51.46   51.44   51.59   51.51   0.13
3.回收率试验  取批号20020620样品5份，每份15mg，用甲醇定容于100mL容量瓶中，超声20min，摇匀，过滤，取续滤液1mL于10mL容量瓶中，加入对照品储备液150μL，甲醇定容。按技术方案所述方法测定加样回收率。结果见表25。
                                  表25回收率试验测定结果
  编号   样品总黄酮浓度(μg/mL)   柚皮苷加入浓度(μg/mL)   总黄酮测出浓度(μg/mL)   回收率(％)   平均(％)   RSD(％)
  12345   7.797.887.717.767.98   7.417.417.417.417.41   14.9515.1214.9214.9515.28   96.5997.7297.3597.1298.53 97.46 0.74
4.样品测定  取本发明片剂即理气消痞片约30mg，精密称定，按技术方案所述方法制备样品液，将样品液在283nm处测定吸收度，根据回归方程计算枳实药材中总黄酮含量。结果见表26。
                    表26样品测定结果
  批号   取样量(mg)   吸收度   总黄酮含量％
20020620   30.23   0.4789   51.55
  29.89   0.4733   51.48
20020621   30.06   0.4761   51.52
  30.27   0.4792   51.52
20020622   29.95   0.4747   51.54
  30.13   0.4768   51.46
根据以上测定结果，确定1片含总黄酮以柚皮苷计为105mg。
实验例6：本发明片剂照高效液相色谱法测定的方法学考察
1.测定波长的选择：
在参考文献的基础上，对柚皮苷和新橙皮苷对照品做了紫外扫描，从光谱图可以看出：柚皮苷和新橙皮苷在285处有最大吸收值，故选择测定波长为285nm。
2.提取溶剂的确定
试验中考察了提取溶剂的影响，用甲醇、50％甲醇及30％甲醇可以将柚皮苷从样品中提取出来，但用50％甲醇及30％甲醇提取率低，故选择提取溶剂为甲醇。
3.提取时间的确定
试验中考察了提取时间的影响，精密称取样品0.015g，加入甲醇超声处理，取不同时间段的提取液进行HPLC分析，记录峰面积积分值。结果见表27：
              表27提取时间考察结果
  时间(min)   15   20   25
  柚皮苷峰面积   1200542   1408376   1425624
由测定数据看出，样品超声处理20分钟，峰面积积分值已基本稳定，选择超声处理20分钟。
4.***适应性试验
对照品溶液的制备精密称取柚皮苷对照品0.58mg，置5mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成对照品混合溶液，分别为0.116mg/mL和0.312mg/mL。
供试品溶液的制备取本品20片，精密称定，研细，混匀，取约0.015g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，超声处理(功率100W，频率40KHZ)20分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。
分别吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。
分析色谱图可知：对照品、供试品柚皮苷的保留时间基本一致，理论塔板数按柚皮苷峰计算不得少于1500。
5.线性关系考察
精密吸取上述对照品混合溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL，进行HPLC测定，记录色谱图，结果见表28；以对照品的进样量(μg)为横坐标，以色谱峰面积值为纵坐标作标准曲线(见图4)，并进行回归，计算标准曲线的回归方程。
                          表28柚皮苷线性关系考察结果
  序号   1   2   3   4   5
  X进样量   0.232   0.464   0.696   0.928   1.160
  Y柚皮苷峰面积   464516   1013991   1490745   2029613   2545592
经计算，回归方程为：Y＝2231800X-44440.8 R＝0.99982；结果表明柚皮苷进样量在0.232～1.160ug范围内线性关系良好。
6.稳定性试验
取同一样品，按供试品溶液制备方法制备后，分别在1、2、3、5、8小时测定，考察其稳定性，结果见表29：
                                  表29稳定性试验结果
  时间(h)   1   2   3   5   8
  柚皮苷峰面积   1118376   1130303   1124337   1127994   1126510
  RSD(％)   0.403％
由试验结果知，在八小时之内信号基本稳定。
7.精密度试验
取处理后的同一样品，照技术方案所述方法重复测定五次，数据见表30：
                            表30精密度试验结果
  序号   1   2   3   4   5
  峰面积(柚)   2977417   2963773   2914782   2797576   2927884
  RSD(％)   1.148％
试验结果表明仪器精密度和操作精密度较好。
8.重现性试验
精密称取同一样品(约0.15g)5份，按供试品溶液的制备方法制备后，进行HPLC测定，数据见表31：
                         表31重现性试验结果(n＝5)
编号   1   2   3   4   5
称样量(g)   0.01557   0.01534   0.01746   0.01586   0.01578
柚皮苷含量(％)   7.53   7.25   7.44   7.34   7.40
平均含量(％)   7.39
RSD(％)   1.430％
试验结果表明，重现性良好。
9.回收率试验
采用加样回收法，精密称取已知含量的同批号样品5份，分别加入已知浓度的对照品混合溶液300ul(即含柚皮苷0.064mg)，按供试品溶液制备方法制备后，照技术方案所述方法测定含量，以下式计算回收率，数据见表32：
回收率％＝(测出总量-样品中含量)×100％/加入对照品量
                            表32柚皮苷回收率试验结果
序号   称样量(g)   测定总量(mg)   样品中柚皮苷的含量(mg)   柚皮苷对照品加入量(mg)   回收率(％)
  1   0.03065   0.1085   0.0441   0.064   100.58
  2   0.03186   0.1094   0.0459   0.064   99.23
  3   0.03211   0.1093   0.0462   0.064   98.53
  4   0.03275   0.1102   0.0472   0.064   98.52
  5   0.03304   0.1106   0.0476   0.064   98.49
计算平均回收率为99.07％，RSD％＝0.908％
10.样品测定结果
按技术方案所述方法测定，结果见表33：
                              表33样品测定结果
  批号             柚皮苷含量(％)   平均值(％)
20020620   柚皮苷   7.26  7.33  7.13   7.24
20020621   柚皮苷   7.24  7.15  7.15   7.18
20020622   柚皮苷   7.18  7.13  7.24   7.19
根据上述三批中试产品的测定结果，确立本发明片剂中柚皮苷标示量，限度范围为标示量的90％～110％。
实验例7：枳实总黄酮对小鼠小肠推进运动的影响(墨汁法)
将小鼠按体重随机分为8组，每组10只，即枳实总黄酮多剂量组(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg)，莫沙必利组和生理盐水组。
取禁食24小时的小鼠分别灌服八种墨汁液混悬液20ml/kg，给药后15分钟脱颈椎处死，打开腹腔，分离肠系膜，剪取上端至幽门，下端至回盲部，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测定总长度，量出从幽门至墨汁前沿的距离作为肠内推进距离。墨汁推进率＝墨汁在小肠中的推进距离/小肠全长×100％。结果见表34：
             表34枳实总黄酮对小鼠小肠推进运动的影响
  组别   动物数   剂量(/Kg)   推进率(％)
  生理盐水枳实总黄酮莫沙必利   1010101010101010   20ml4.0g2.0g1.0g0.5g0.2g0.1g2.2mg   32.77±5.6857.75±9.88△△△53.44±9.10△△45.08±9.37△42.79±12.36△43.31±10.83△39.33±10.4542.25±6.44△
采用t’检验，与生理盐水组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
从表34可看出，与生理盐水组比较，枳实总黄酮4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg组和莫沙必利组均能明显提高小鼠小肠推进率，表明有促进小肠运动的作用。
实验例8：枳实总黄酮对阿托品所致小鼠肠道推进运动的影响
将小鼠随机分为9组，每组10只，即枳实总黄酮多剂量组(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg)，阿托品组(1.5mg/Kg)、莫沙必利组和生理盐水组，以上药物均含有10％炭末。
取禁食24小时的各组小鼠，空白组(生理盐水组)、模型组灌胃给以生理盐水、其余分别灌服各不同浓度的药物，给药容量为20ml/Kg，给药前10min空白组im生理盐水、其余各组分别im1.5mg/Kg硫酸阿托品注射液，给药容量为5ml/Kg，给药后15分钟脱颈椎处死，立即打开腹腔，将消化道自幽门至直肠末端完整摘出，不加牵引平铺于玻璃板上，测其全长并记录炭末前沿互幽门的距离作为肠内推进距离。炭末推进率＝炭末在全肠中的推进距离/全肠总长×100％。结果见表35：
     表35枳实总黄酮对阿托品所致小鼠小肠推进运动抑制的影响
  组别   动物数   剂量(/Kg)   推进率(％)
  生理盐水组阿托品组实总黄酮莫沙必利组   101010101010101010   25ml1.5mg4.0g2.0g1.0g0.5g0.2g0.1g2.2mg   57.50±13.5728.58±5.45▲▲▲44.43±4.84△△38.84±14.64△41.10±7.02△42.97±9.01△37.54±12.91△34.11±9.5930.12±9.68
采用t’检验，与生理盐水组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；与模型组比较，△P＜0.05△△P＜0.01。
从表35可看出，与生理盐水组比较，阿托品组小鼠肠推进率明显减少(P＜0.001)，枳实总黄酮剂量4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg组均能明显提高阿托品所至小鼠肠运动功能抑制推进率，表明对于阿托品所致的小鼠推进运动抑制有促进的作用。
实验例9：枳实总黄酮对新斯的明所致小鼠小肠推进功能亢进的影响
将小鼠随机分为8组，每组10只，即枳实总黄酮多剂量组(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg)，莫沙必利组、新期的明组(0.08mg/Kg)和生理盐水组，以上药物均含有10％炭末。
取禁食24小时的各组小鼠，空白组(生理盐水组)、模型组灌胃给以生理盐水、其余分别灌服各不同浓度的药物，给药容量为20ml/Kg，给药前10min空白组im生理盐水、其余各组分别im0.08mg/Kg甲基硫酸新斯的明注射液，给药容量为5ml/Kg，给药后15分钟脱颈椎处死，立即打开腹腔，将消化道自幽门至小肠末端完整摘出，不加牵引平铺于玻璃板上，测其全长并记录炭末前沿互幽门的距离作为肠内推进距离。炭末推进率＝炭末在小肠中的推进距离/小肠全长×100％。结果见表36：
    表36枳实总黄酮对新斯的明所致小鼠小肠推进运动亢进的影响
  组别   动物数   剂量(/Kg)   推进率(％)
  生理盐水组新斯的明组枳实总黄酮莫沙必利组   1010101010101010   25ml0.08mg2.0g1.0g0.5g0.2g0.1g2.2mg   36.45±6.7060.48±8.17▲▲▲69.52±9.9164.57±6.4060.46±13.4260.89±6.3259.87±8.0058.87±6.85
采用t’检验，与生理盐水组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；
从表36可看出，与生理盐水组比较，新斯的明组小肠推进率增加，说明新斯的明可促进小肠运动，而与新斯的明组比较，枳实总黄酮各组、莫沙必利组对小鼠小肠推进率无明显差别，表明枳实总黄酮对新斯的明所致的小鼠小肠运动功能亢进无明显的作用。
实验例10：枳实总黄酮对小鼠镇痛作用(扭体法)
将小鼠动物随机分为9组，每组10只，即枳实总黄酮各剂量组，***组、模型组和对照组。
除***组，各组均灌胃给药，容量为20ml/Kg；***组腹腔注射，给药60分钟后，各鼠均腹腔注射0.6％醋酸0.2ml，观察10分钟内各组出现扭体反应小鼠只数(腹部内凹、伸展后肢、臀部抬高)和次数，计算各药镇痛百分率，结果见表37。
                  表37枳实总黄酮对小鼠镇痛百分率的影响
  组别   动物数   剂量(/Kg)   扭体次数(次)   未出现扭体鼠数(只)
  生理盐水枳实总黄酮***   1010101010   20ml4.0g2.0g1.0g0.5g0.2g0.1g20mg   024.20±6.8819.30±7.1320.20±5.2925.80±9.3822.30±7.7322.00±9.660.30±0.67△△△   100000008△△△
采用t’检验，与生理盐水组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
从表37可看出，除***组外，其他各药对醋酸所致小鼠疼痛(扭体反应)无抑制效应。
实验例11：枳实总黄酮对大鼠胃酸、胃蛋白酶分泌的影响
取SD大鼠50只，单笼禁食24小时，自由饮水，随机均分五组：空白组、枳实总黄酮低剂量组(0.5g/kg)、枳实总黄酮中剂量组(1g/kg)、枳实总黄酮高剂量组(2g/kg)和雷尼替丁组(30mg/kg)。用***轻度麻醉动物，剪去腹部的毛，常规消毒皮肤，于剑突下沿腹白线开一个约2.5cm长的切口，小心提起胃，在幽门与十二指肠结合部用缝线结扎，小心避开血管。立即十二指肠注入各对应不同浓度的药液10ml/kg，空白组动物同法给予等容量的生理盐水蒸气溶液。缝合后送回笼中，术后禁食禁水，4小时后脱臼处死动物，取出胃，收集胃液于刻度离心管，以2000rpm离心10分钟，吸取上清液计算胃液量，并进行胃液分析。
(1)胃酸测定：①取清晰胃液2ml置小烧杯中，加入托佛氏及酚酞指示剂各2滴，含游离酸时呈樱红色，如呈黄色则指示无游离酸。②用滴定管慢慢用0.01mol/L氢氧化钠滴定，同时不断摇动，恰至红色消失，出现姜黄色为止，即为游离酸滴定终点，记录消耗0.01mol/L氢氧化钠溶液的ml数。③继续用氢氧化钠滴定直至微红色不退为止，即为总酸度滴定终点，记录两次滴定所消耗的0.02mol/L氢氧化钠总毫升数。④结果计算：游离酸(mEq/L)＝游离酸滴定终点消耗的氢氧化钠溶液毫升数×10；总酸度(mEq/L)＝两次滴定消耗的氢氧化钠溶液毫升数×10；总酸排出量(μEq/h)＝总酸度×每小时的胃液量。
(2)胃蛋白酶测定：采用麦特氏毛细玻管测定法，将内径1～2mm粗细均匀的毛细玻管裁成10cm长，洗净烤干。用鸡蛋一枚，取其蛋清充分打匀后用纱布过滤，将上述毛细玻管利用虹吸作用，灌满蛋清(注意管内应无气泡)。然后放在85℃热水中使蛋白固定，贮冰箱中备用。试验时取胃液1ml放入100ml的试剂瓶中，加0.05mol/L盐酸溶液15ml摇匀，放进蛋白管二根，盖好瓶口，在37℃恒温箱中孵育24小时，取出蛋白管，用尺测量两端透明部分的长度(mm)，以四端之值求其平均值。胃蛋白酶活性单位＝平均值2×16；胃蛋白酶排出量(活性单位/h)＝胃蛋白酶活性单位×每小时的胃液量。实验结果见表38、39。
                              表38枳实总黄酮对大鼠胃酸的影响
  组别   动物数   剂量(/Kg)   PH   总酸度(mEq/L)   总酸排出量(μEq/h)
  生理盐水枳实总黄酮雷尼替丁组   1010101010   20ml2.0g1.0g0.5g30   1.77±0.131.82±0.131.91±0.232.09±0.432.03±0.10△   109.60±14.84102.50±23.4195.50±13.5091.40±17.1272.50±11.35△   137.09±44.34128.54±60.54114.19±24.54109.31±30.0078.50±17.23△
采用t’检验，与生理盐水组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
                         表39枳实总黄酮对大鼠胃蛋白酶的影响
组别 动物数 剂量(/Kg)   胃蛋白酶活性(活性单位/ml)   胃蛋白酶排出量(活性单位/h)
  生理盐水枳实总黄酮雷尼替丁组   1010101010   20ml2.0g1.0g0.5g30   5.20±3.033.23±1.693.26±1.583.13±1.482.29±0.99△   630.70±405.43409.70±266.01399.20±210.47384.10±253.47249.37±98.16△
采用t’检验，与生理盐水组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
试验结果显示：枳实总黄酮高、中、低剂量对于胃酸、胃蛋白酶无明显的影响。
实验例12：枳实总黄酮对小鼠胃排空的影响
取KM种小鼠80只，雌雄各半，随机均分八组：即枳实总黄酮多个剂量组(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg)，莫沙必利组和生理盐水组。
空白组灌胃20ml/kg生理盐水，其余各组小鼠分别灌胃等容量各对应不同浓度的药液，连续给药两次，末次给药后40分钟，每只小鼠口服0.2ml0.1％的甲基橙溶液，20分钟后脱臼处死小鼠，剖腹摘取胃置于小烧杯里，加入10ml蒸馏水，用小剪刀沿胃大弯剪开胃，将胃内容物充分洗于蒸馏水中，用NaCO3溶液调节PH值至6.0～6.5，倒入刻度离心管，以2000rpm离心10分钟，取上清液用721型分光光度计(波长420nm)比色，用蒸馏水调零，测量溶液的光密度，测得的光密度为胃中甲基橙光密度。并以0.1％甲基橙0.2ml加入10ml蒸馏水摇匀后测量其光密度作为基数甲基橙光密度，并按下列公式计算甲基橙胃残留率。甲基橙胃残留率的高低可反映胃排空的快慢。
基数甲基橙光密度为0.256
                   表40枳实总黄酮对小鼠胃排空作用的影响
  组别   动物数   剂量(/Kg)   甲基橙光密度   残留率(％)
  生理盐水枳实总黄酮莫沙必利   1010101010101010   20ml4.0g2.0g1.0g0.5g0.2g0.1g2.2mg   0.077±0.0130.068±0.007△0.063±0.008△0.064±0.006△0.066±0.009△0.070±0.0110.071±0.0110.069±0.011   30.20±5.2326.68±2.90△24.57±3.30△25.03±2.22△25.82±3.65△27.46±4.3927.53±4.4127.10±4.18
采用t检验，与生理盐水组比较，△P＜0.05。
试验结果显示：枳实总黄酮0.5g/kg、1.0g/kg、2.0g/kg均明显促进胃的排空，与空白组比较，均有显著性差异。
实验例13：对乙醇加水杨酸所致胃炎模型的影响
取SD小鼠50只，雌雄各半，随机均分五组：即枳实总黄酮组(4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg)，雷尼替丁组和模型组。
模型组ig生理盐水、枳实总黄酮组ig枳实总黄酮溶液，雷尼替丁组动物ig30mg/ml雷尼替丁10ml/kg，30分钟后各组分别灌胃乙醇+水杨酸溶液1ml/100g，拉脱颈椎处死大鼠，3.45mmlo/L甲醛固定15分钟后取胃，肉眼观察胃炎的发生情况，结果见表41。
病变判断标准如下：“-”无胃炎发生；“+”局部充血，轻度炎症充血；“++”局部炎症明显；“+++”全胃弥漫性炎症
                           表41枳实总黄酮对小鼠胃排空作用的影响
组别 动物数 剂量(/Kg) 胃溃疡个数             炎症情况
  +   ++   +++
  模型组枳实总黄酮组雷尼替丁组   1010101010   20ml2.0g1.0g0.5g30mg   11.10±2.5110.70±2.2110.00±2.009.50±1.502.90±1.79   00005△   00005△   101010100△△△
采用t检验，与模型组比较，P＞0.05；
采用卡方检验，与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
从上表可看出，枳实总黄酮对大鼠实验性胃炎无明显作用，既不能减轻炎症症状，对于胃溃疡也无改善作用。
实验例14：枳实总黄酮对正常离体兔肠平滑肌的影响
药物及制剂：
枳实总黄酮混悬液：
1号：20g浸膏加台氏液至20ml(1g/ml)；
2号：10g浸膏加台氏液至20ml(0.5g/ml)；
3号：5g浸膏加台氏液至20ml(0.25g/ml)；
4号：2.5g浸膏加台氏液至20ml(0.125g/ml)；
5号：1.25g浸膏加台氏液至20ml(0.0625g/ml)；
6号：0.625g浸膏加台氏液至20ml(0.0313g/ml)；
7号：0.313g浸膏加台氏液至20ml(0.0156g/ml)；
8号：0.156g浸膏加台氏液至20ml(0.0078g/ml)；
9号：0.078g浸膏加台氏液至20ml(0.0039g/ml)；
10号：0.039g浸膏加台氏液至20ml(0.00195g/ml)；
试验方法与结果：
(1)调节电子水浴锅，保持恒温，麦氏浴槽内的台氏液30ml，保持37±0.5℃；
(2)调整张力换能器，氧气发生器、BL-410生物信号采集处理***；
(3)离体肠平滑肌的制备：取2Kg左右的家兔一只，用空气栓塞处死，立即剖开腹腔，取出回肠，置入盛有冷的台式液中。沿肠壁分离肠系膜，用台式液将肠内容物冲洗干净，将肠管剪成2-2.5cm的肠段。将肠管两端穿线结扎，一端系于通气钩上，另一端系于肌张力换能器上，连接记录仪。通气调节速度为1-2个气泡/s，不能影响肠肌的自主舒缩运动；
(4)观察正常肠肌运动，待舒缩稳定后，描记一段肠肌的正常曲线，然后依次向浴槽中加入各种药液0.3ml。每次加药液前均不冲洗而计算累积药物浓度，描记舒缩曲线；
(5)药液由低到高累加，枳实总黄酮组做10个标本，全部加完后再冲洗一次，观察肠肌能否恢复到给药前，电脑自动分析结果，并打印出描记曲线；
(6)结果见表42：
                            表42枳实总黄酮混悬液对离体肠平滑肌的影响
         组别   标本数   频率(次)   最大收缩力(g)   最大舒张力(g)
枳实总黄酮组(g/L)   给药前给药后0.01950.05850.13650.29250.60281.22752.47754.97759.977519.9775   1010101010101010101010   10.20±1.149.80±1.489.50±2.0110.40±2.5013.20±6.2815.90±8.11△17.00±8.04△18.80±7.85△23.20±9.77△△26.60±7.69△△△24.80±2.78△△△   9.55±0.639.90±1.389.75±2.227.97±1.73△6.51±2.36△△5.26±2.08△△4.45±1.97△△3.48±1.70△△△2.29±1.63△△△1.35±1.05△△△0.88±0.52△△△   0.37±0.320.34±0.280.46±0.300.60±0.330.66±0.340.66±0.290.60±0.270.55±0.270.47±0.260.44±0.260.34±0.30
结果采用t检验，与给药前组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。
从上表可看出，随着药物浓度的递增，对离体肠平滑肌收缩频率明显增加，林0.6028g/L开始，作用有显著性差异；而枳实总黄酮在收缩力方面，随着浓度增加，最大收缩力明显降低，从0.1365g开始，收缩力的降低呈现出显著性差异；在最大舒张力方面，枳实总黄酮从0.1365g开始呈增加的趋势，但经检验无显著性差异。
实验例15：枳实总黄酮对乙酰胆碱和阿托品所致离体兔肠平滑肌的影响
药物及制剂：
枳实总黄酮混悬液：
1号：1.25g浸膏加台氏液至20ml(0.0625g/ml)；
2号：0.625g浸膏加台氏液至20ml(0.0313g/ml)；
3号：0.313g浸膏加台氏液至20ml(0.0156g/ml)；
4号：0.156g浸膏加台氏液至20ml(0.0078g/ml)；
5号：0.078g浸膏加台氏液至20ml(0.0039g/ml)；
6号：0.039g浸膏加台氏液至20ml(0.00195g/ml)；
试验方法与结果：
(1)试验方法同上，待舒缩稳定后，描记一段肠肌的正常曲线，然后依次向浴槽中加入乙酰胆碱或阿托品，描记舒缩曲线。再依次向浴槽中加入各种药液0.3ml。每次加药液前均不冲洗而计算累积药物浓度，描记舒缩曲线；
(2)药液由低到高累加，每组做6个标本，全部加完后再冲洗一次，观察肠肌能否恢复到给药前，电脑自动分析结果，并打印出描记曲线；
(3)结果见表43、44：
                          表43枳实总黄酮混悬液对乙酰胆碱所致离体肠平滑肌亢进的影响
  组别   标本数   频率(次)   最大收缩力(g)   最大舒张力(g)
  空白组   6   10.66±1.03   5.52±0.12   1.56±0.15
  乙酰胆碱(10-8M)   6   257.16±24.47△△△   0.16±0.016△△△   0.052±0.008△△△
  枳实总黄酮(0.313g/L)   6   23.16±2.13▲▲▲   2.50±0.15▲▲▲   0.42±0.020▲▲▲
  枳实总黄酮(0.939g/L)   6   12.16±1.72▲▲▲   2.06±0.071▲▲▲   0.54±0.030▲▲▲
结果采用t检验，与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。与乙酰胆碱组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；
                          表44枳实总黄酮混悬液对阿托品所致离体肠平滑肌抑制的影响
  组别   标本数   频率(次)   最大收缩力(g)   最大舒张力(g)
  空白组   6   12.16±0.75   4.06±0.14   1.28±0.047
  阿托品组(5×105)   6   58.00±3.52△△△   0.74±0.13△△△   0.22±0.061△△△
  枳实总黄酮(0.078g/L)   6   12.33±2.16▲▲▲   2.24±0.23▲▲▲   0.67±0.029▲▲▲
结果采用t检验，与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001。与阿托品组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01，▲▲▲P＜0.001；
从表43、表44可看出，乙酰胆碱对兔离体肠平滑肌有明显的兴奋作用，收缩频率非常明显加快，肠肌处于收缩痉挛状态，而枳实总黄酮在较低剂量时能抑制乙酰胆碱的作用，使收缩痉挛的肠肌收缩频率和幅度均明显下降；阿托品对兔离体肠平滑肌有明显的抑制作用，肠肌最大收缩力明显下降，以上说明枳实总黄酮对兔离体肠肌有双向调节作用，既能使过度亢进的肠肌抑制，又能使过度抑制的肠肌兴奋。
说明书附图
图1：柚皮苷标准曲线
图2：柚皮苷标准曲线
图3：新橙皮苷标准曲线
图4：柚皮苷标准曲线
实施例1枳实总黄酮的制备
取枳实33kg做成粗粉，加6倍量60％的乙醇，回流提取2次，每次2小时；醇溶液滤过，合并滤液，回收乙醇并进一步浓缩、60℃(0.1mpa)减压干燥12小时至干，干膏粉碎成细粉，加入5倍量水，充分搅拌溶散，加入1/5水量的食盐，充分搅拌，冷藏静置24小时；弃去上清液，取沉淀，加入6倍量95％的乙醇，回流提取2小时，静置，取上清液，回收乙醇并进一步浓缩、65℃(0.1mpa)减压干燥8小时至干，干膏粉碎成细粉，加入10倍量水，充分搅拌溶散，静置过夜，弃去上清液，取沉淀，70℃(0.1mpa)减压干燥4小时至干，即得枳实总黄酮。
实施例2本发明片剂(理气消痞片)的制备
取枳实60kg，按实施例1制备枳实总黄酮，加入辅料低取代羟丙基纤维素0.5kg和可溶性淀粉0.5kg，混匀，用70％乙醇(干粉∶乙醇＝5∶1)湿润，18目筛挤压制粒，70℃烘1小时，20目筛除去大颗粒，60目筛除去小颗粒，加入1％硬脂酸镁0.03kg，压片，薄膜包衣，得9615片，0.3克/片，每日三次，每次两片。
实施例3本发明枳实总黄酮的质量控制方法
含量测定：
A.紫外分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)测定；
对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取枳实总黄酮20mg精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超声20分钟，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
测定法：取枳实总黄酮20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，超声处理20分钟，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以甲醇为空白，在283nm的波长处测定吸收度，计算，即得；
枳实总黄酮原料含总黄酮以柚皮苷计，应在60％～80％间；
B.照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定。
色谱条件与***适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；34∶66的甲醇-水为流动相；检测波长为285nm；理论塔板数按柚皮苷峰计算应不低于1500，按新橙皮苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的柚皮苷和新橙皮苷对照品适量，加甲醇适量制成对照品混合溶液，浓度分别为0.1mg/mL和0.3mg/mL；
供试品溶液的制备：取枳实总黄酮约0.02g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，以功率100W，频率40KHZ的超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
枳实总黄酮原料柚皮苷含量应在10％～13％范围内。
实施例4本发明片剂(理气消痞片)的质量控制方法
含量测定：
A.照紫外分光光度法(中国药典2000年版一部附录VA)测定；
对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：取本发明片剂20mg精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超声20分钟，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
测定法：取本发明片剂20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，超声处理20分钟，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以甲醇为空白，在283nm的波长处测定吸收度，计算，即得；
本发明片剂总黄酮含量以柚皮苷计，标示量为150mg/片，限度范围为标示量的90％～110％；
B.照高效液相色谱法(中国药典2000年版一部附录VID)测定；
色谱条件与***适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以34∶66甲醇-水为流动相；检测波长为285nm；理论塔板数按柚皮苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的柚皮苷和新橙皮苷对照品适量，加甲醇适量制成对照品混合溶液，浓度分别为0.1mg/mL和0.3mg/Ml；
供试品溶液的制备：取本发明片剂约0.015g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，以功率100W，频率40KHZ的超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本发明片剂柚皮苷标示量为20mg/片，限度范围为标示量的90％～110％。
实施例5枳实总黄酮的制备
取枳实50kg做成枳实药材粗粉，加5倍量80％的乙醇，回流提取4次，每次1小时；醇溶液滤过，合并滤液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入8倍量水，充分搅拌溶散，加入1/5水量的食盐，充分搅拌，冷藏静置24小时；弃去上清液，取沉淀，加入8倍量95％的乙醇，回流提取4小时，静置，取上清液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入4倍量水，充分搅拌溶散，静置过夜，弃去上清液，取沉淀，减压干燥至干，即得枳实总黄酮。
按实施例3所述的含量测定方法进行测定，测得含总黄酮72.28％，含柚皮苷12.49％。
实施例6枳实总黄酮的制备
取枳实70kg做成枳实药材粗粉，加7倍量75％的乙醇，回流提取2次，每次3小时；醇溶液滤过，合并滤液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入6倍量水，充分搅拌溶散，加入1/5水量的食盐，充分搅拌，冷藏静置36小时；弃去上清液，取沉淀，加入7倍量100％的乙醇，回流提取3小时，静置，取上清液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入8倍量水，充分搅拌溶散，静置过夜，弃去上清液，取沉淀，减压干燥至干，即得枳实总黄酮。
按实施例3所述的含量测定方法进行测定，测得含总黄酮72.35％，含柚皮苷12.89％。
实施例7理气消痞片的制备
取按实施例2制备的枳实总黄酮原料细粉70g，加入低取代羟丙基纤维素、可溶性淀粉，二者比例为1∶1，混匀，80％乙醇制粒，干燥，过筛，加入1％硬脂酸镁，压片，薄膜包衣，得500片，0.3克/片，每日三次，每次两片。
按实施例4所述的含量测定方法进行测定，测得含总黄酮为154.55mg/片，含柚皮苷为21.72mg/片。
实施例8理气消痞片的制备
取按实施例3制备的枳实总黄酮原料细粉140g，加入低取代羟丙基纤维素、可溶性淀粉，混匀，60％乙醇制粒，干燥，过筛，加入1％硬脂酸镁，压片，薄膜包衣，得1000片，0.3克/片，每日三次，每次两片。
按实施例4所述的含量测定方法进行测定，测得含总黄酮为154.56mg/片，含柚皮苷为21.54mg/片。
实施例9本发明片剂的制备
取枳实总黄酮原料细粉140g，加入辅料，按常规制备方法，制成1000片，0.3克/片，3次/日，2片/次。
按实施例4所述的含量测定方法进行测定，测得含总黄酮为154.50mg/片，含柚皮苷为21.56mg/片。
实施例10本发明胶囊剂的制备
取枳实总黄酮原料细粉1400克，加入1/3糊精辅料，按常规制备方法，制成胶囊剂。
实施例11本发明丸剂的制备
取枳实总黄酮原料细粉1000克，加入辅料，按常规制备方法，制成丸剂。
实施例12本发明颗粒剂的制备
取枳实总黄酮原料细粉700克，加入糊精辅料，按常规制备方法，制成颗粒剂。
实施例13本发明滴丸的制备
取枳实总黄酮原料细粉900克，加入辅料，按常规制备方法，制成滴丸。
实施例14本发明口服液体制剂的制备
取枳实总黄酮原料细粉800克，加入辅料，按常规制备方法，制成口服液体制剂。
实施例15本发明混悬液的制备
取枳实总黄酮原料细粉1200克，加入辅料，按常规制备方法，制成混悬液制剂。

Claims (10)

1、一种枳实总黄酮的制备方法，其特征在于该方法为：
取枳实做成粗粉，加5～7倍量60％～80％的乙醇，回流提取2～4次，每次1～3小时；醇溶液滤过，合并滤液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入5～8倍量水，充分搅拌溶散，加入1/5水量的食盐，充分搅拌，冷藏静置24小时；弃去上清液，取沉淀，加入6～8倍量95％～100％的乙醇，回流提取2小时，静置，取上清液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入4～10倍量水，充分搅拌溶散，静置过夜，弃去上清液，取沉淀，减压干燥至干，即得枳实总黄酮。
2、如权利要求1所述的枳实总黄酮的制备方法，其特征在于该方法为：
取枳实做成粗粉，加6倍量60％的乙醇，回流提取2次，每次2小时；醇溶液滤过，合并滤液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入5倍量水，充分搅拌溶散，加入1/5水量的食盐，充分搅拌，冷藏静置24小时；弃去上清液，取沉淀，加入6倍量95％的乙醇，回流提取2小时，静置，取上清液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入10倍量水，充分搅拌溶散，静置过夜，弃去上清液，取沉淀，减压干燥至干，即得枳实总黄酮。
3、如权利要求1所述的枳实总黄酮的制备方法，其特征在于该方法为：
取枳实做成粗粉，加5倍量80％的乙醇，回流提取4次，每次1小时；醇溶液滤过，合并滤液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入8倍量水，充分搅拌溶散，加入1/5水量的食盐，充分搅拌，冷藏静置24小时；弃去上清液，取沉淀，加入8倍量95％的乙醇，回流提取4小时，静置，取上清液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入4倍量水，充分搅拌溶散，静置过夜，弃去上清液，取沉淀，减压干燥至干，即得枳实总黄酮。
4、如权利要求1所述的枳实总黄酮的制备方法，其特征在于该方法为：
取枳实做成粗粉，加7倍量75％的乙醇，回流提取2次，每次3小时；醇溶液滤过，合并滤液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入6倍量水，充分搅拌溶散，加入1/5水量的食盐，充分搅拌，冷藏静置36小时；弃去上清液，取沉淀，加入7倍量100％的乙醇，回流提取3小时，静置，取上清液，回收乙醇并进一步浓缩、减压干燥至干，干膏粉碎成细粉，加入8倍量水，充分搅拌溶散，静置过夜，弃去上清液，取沉淀，减压干燥至干，即得枳实总黄酮。
5、一种枳实总黄酮的含量测定方法，其特征在于该方法为如下方法中的一种或几种：
A、照紫外分光光度法测定
对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：称取枳实总黄酮细粉20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超声20分钟，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
测定法：取供试品溶液，以甲醇为空白，在283nm的波长处测定吸收度，计算，即得；
枳实总黄酮原料含总黄酮以柚皮苷计，应在60％～80％间；
B、照高效液相色谱法
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；30～40∶60～70的甲醇—水为流动相；检测波长为285nm；理论塔板数按柚皮苷峰计算应不低于1500，按新橙皮苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备：称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的柚皮苷和新橙皮苷对照品，加甲醇制成对照品混合溶液，浓度分别为0.1mg/ml和0.3mg/ml；
供试品溶液的制备：称取枳实总黄酮细粉0.02g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
枳实总黄酮原料柚皮苷含量应在10％～13％范围内。
6、如权利要求5所述的一种枳实总黄酮的含量测定方法，其特征在于该方法为如下方法中的一种或几种：
A、照紫外分光光度法测定
对照品溶液的制备：取柚皮苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，摇匀，即得；
供试品溶液的制备：称取枳实总黄酮细粉20mg，置100ml容量瓶中，加甲醇至刻度，超声20分钟，摇匀，过滤，精密吸取续滤液1ml，置10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液；
测定法：取供试品溶液，以甲醇为空白，在283nm的波长处测定吸收度，计算，即得；
枳实总黄酮原料含总黄酮以柚皮苷计，应在60％～80％间；
B、照高效液相色谱法
用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；34∶66的甲醇—水为流动相；检测波长为285nm；理论塔板数按柚皮苷峰计算应不低于1500，按新橙皮苷峰计算应不低于1500；
对照品溶液的制备：称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥36小时的柚皮苷和新橙皮苷对照品，加甲醇制成对照品混合溶液，浓度分别为0.1mg/ml和0.3mg/ml；
供试品溶液的制备：称取枳实总黄酮细粉0.02g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇25ml，超声处理20分钟，取出，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
枳实总黄酮原料柚皮苷含量应在10％～13％范围内。
7、一种枳实总黄酮片剂的制备方法，其特征在于该方法为：取枳实总黄酮原料细粉，加入辅料低取代羟丙基纤维素、可溶性淀粉，混匀，60％～80％乙醇制粒，干燥，过筛，加入1％硬脂酸镁，压片，薄膜包衣，即得。
8、枳实总黄酮在制备具有促进胃肠动力作用的药物中的应用。
9、如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的促进胃肠动力是指提高小肠推进率，促进小肠运动。
10、如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的促进胃肠动力是指促进胃的排空。
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