CN1738833A - Hcv疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于治疗和预防丙型肝炎病毒(HCV)感染及相关症状和疾病的方法和组合物。具体而言，本发明涉及编码HCV核心蛋白的DNA疫苗和编码至少一种其它HCV蛋白的多核苷酸序列，其中所述疫苗导致相同细胞内的蛋白表达，并且编码核心蛋白的多核苷酸序列的序列进行了突变或相对于编码至少一种其它HCV蛋白的多核苷酸序列进行定位，以便减少或消除核心蛋白表达对所述至少一种其它HCV蛋白表达的负面影响。
Description
本发明涉及用于治疗和预防丙型肝炎病毒(HCV)感染及相关症状和疾病的方法和组合物。具体而言，本发明涉及包含编码HCV核心蛋白和至少一种其它HCV蛋白的多核苷酸序列的DNA疫苗，以及治疗HCV感染个体的方法，包括施用本发明的疫苗。
最近，HCV被认为是输血后和群体获得性非甲非乙型肝炎的主要病原体。大约有1亿7千万人被慢性感染上HCV，患病率为1-10％。据估计，卫生保健费用在1.8％患病率的美国约为20亿美圆。40-60％肝病是由于HCV，在英国，有30％的移植是因为HCV感染。尽管HCV在初期为亚临床感染，仍有超过90％的患者发展成慢性病。该疾病过程典型地从慢性活动性肝炎(70％)、纤维变性、肝硬化(40％)发展成肝细胞癌(60％)。从感染到肝硬化的中值时间为20年，到肝细胞癌的中值时间也为20年(Lauer G.and Walker B.2001，Hepatits Cvirus Infection.N Engl J.Med 345，41，Cohen J.2001，The Scientificchallenge of Hepatitis C.Science 285(5424)26)。
HCV疗法非常需要改进。目前尚无可利用的小分子复制抑制剂。病毒唑和聚乙二醇化干扰素的现有金标准提供了治疗HCV感染的主要依据。但现有方案实现持续应答的能力仍然不是最佳(一般为50％应答率持续达6个月，但对基因型1b而言的应答率则较低(27％))。该治疗也伴有不良副作用，导致了高失败率，尤其是在最初6个月的治疗后。
一些研究结果表明个别HCV蛋白在正常小鼠体内具有免疫原性，包括下述的DNA免疫接种。一些用于预防或治疗的HCV疫苗尚处于临床实验阶段。目前最前沿的研究是Chiron and Innogenetics利用E1或E2包膜蛋白进行的2期临床试验。Transvax的表位疫苗也处于2期临床试验阶段。一些疫苗利用包括DNA在内的多种送递***，以及来源自核心和非结构抗原的序列，尚处于临床前研发阶段。
HCV是属于黄病毒家族的正链RNA病毒，其基因组长度为9.4kb，具有一个可读框。HCV基因组被作为单个多蛋白翻译，并随后被宿主和病毒蛋白酶加工，生成结构蛋白(核心，包膜E1和E2，和p7)和具有多种酶活性的6种非结构蛋白。1b基因型的一个实例，即HCV J4L6分离物的基因组被编号为AF054247(Yanagi，M.，StClaire，M.，Shapiro，M.，Emerson，S.U.，Purcell，R.H.and Bukh，J.″Transcripts of a chimeric cDNA clone of hepatitis C virus genotype1b are infectious in vivo″(丙型肝炎病毒基因型1b的嵌合cDNA克隆转录物在体内具有传染性).Virology 244(1)，161-172(1998))，如图1所示。
该包膜蛋白负责识别、结合目标细胞，并使病毒进入目标细胞。病毒复制涉及的主要非结构蛋白包括NS2(依赖于Zn的金属蛋白酶)、NS3(丝氨酸蛋白酶/解旋酶)、NS4A(蛋白酶辅因子)、NS5A和NS5B(RNA聚合酶)(Bartenschlager B and Lohmann V.2000.Replication ofhepatitis C virus.J.Gen Virol 81，1631)。
HCV多蛋白的结构可被表示如下(数字表示各蛋白中第一个氨基酸的位置；J4L6分离物的全部多蛋白有3010个氨基酸长)
| 核心1-191 | E1 | E2 | P7 | NS2 | NS31027-1657 | NS4A | NS4B1712-1972 | NS5A | NS5B2420-3010 |
该病毒具有高突变率，且根据保守和非保守区的核苷酸序列，有至少6种主要基因型已被确定。但仍然存在其它异质性，诸如分离自个体患者的HCV往往以多个紧密相关基因组或准种的混合物形式存在。
HCV基因组显示出高度的遗传变异，已被划分为6个主要的基因型(1a、1b、2、3、4、5和6)。基因型1a、1b、2和3主要流行于欧洲、北美和南美、亚洲、中国、日本和澳大利亚。基因型4和5主要流行于非洲，基因型6则主要出现在东南亚。
因此，HCV感染的疗法非常需要改进，同时也需要提供在治疗诸多HCV基因型的能力方面具有多样性的疗法。
已有文献描述过含有编码一个或多个HCV蛋白的多核苷酸的HCV疫苗。Brinster等人描述了含有编码NS3的质粒DNA或SemlikiForest Virus载体的疫苗(2002，Journal of General Virology，83，369-381)。WO 99/51781公开了编码NS5B的多核苷酸疫苗。WO97/47358描述了编码HCV E1、E1+E2融合蛋白、NS5A和NS5B蛋白的密码子优化基因及包含这些基因的疫苗。WO 01/04149公开了来源于核心、NS3、NS4或NS5A，并编码HCV表位嵌合体的多肽或多核苷酸。WO 01/30812描述了可应用在疫苗中，并含有NS3、NS4、NS5A和NS5B的融合蛋白，以及编码这些融合蛋白的DNA；或者说该融合蛋白含有核心蛋白的片段。WO 03/031588则描述了一种适合被用作疫苗的腺病毒载体，该载体编码HCV蛋白NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B。
WO 96/37606描述了含有特定多肽的疫苗，该多肽包括“未加工的”核心蛋白和非结构蛋白。
需要在多核苷酸疫苗中包括编码核心蛋白和至少一种其它HCV蛋白的基因。但是，已知相同细胞中核心和其它HCV蛋白的共表达可以导致与不共表达核心蛋白的细胞相比，其它HCV蛋白产生水平的降低。因此，本领域相对较少提到在多核苷酸疫苗中使用核心蛋白。
本发明提供了该问题的解决方案，并且提供了包含编码HCV核心蛋白的多核苷酸序列和编码至少一种其它HCV蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸疫苗，其中所述疫苗导致相同细胞内的蛋白表达，并且编码核心蛋白的多核苷酸的序列进行了突变或相对于编码至少一种其它HCV蛋白的多核苷酸序列进行定位的方式使得减少或消除核心蛋白表达对所述至少一种其它HCV蛋白表达的负面影响。
已经发现减少或阻止核心蛋白的表达对其它HCV蛋白的表达的下调，导致了其它HCV蛋白引起的免疫应答强度的增加。优选地，通过ELISPOT测量用抗原接种和体外重刺激后的产生IL-2的脾细胞数目所测量的抗非核心HCV蛋白的免疫应答强度的增加是两倍或更高。
本发明的疫苗的设计方式使得核心对其它HCV蛋白的表达水平的调节作用被减少或消除。本发明的多核苷酸疫苗优选导致细胞中产生的非核心HCV蛋白的量不少于等同量的不导致相同细胞内核心蛋白表达的相似疫苗转染细胞所产生的量的50％。更优选地，多核苷酸导致细胞中产生的非核心HCV蛋白的水平不少于等同量的不导致相同细胞内核心蛋白表达的相似疫苗转染细胞所产生的水平的60％，更优选不少于70％，更优选不少于80％，更优选不少于90％，最优选不少于95％。最优选地，蛋白产生的水平采用Western印迹技术测量，通过实时化学发光技术显示。
最优选地，疫苗被设计为使得核心蛋白存在于编码其它HCV蛋白的表达盒下游的表达盒中，或者核心蛋白的氨基酸序列进行了突变。
由本发明的多核苷酸疫苗编码的至少一种其它HCV抗原可以是非核心HCV蛋白的任意一种，如E1、E2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B或p7。但是，其它HCV蛋白优选选自NS3、NS4B和NS5B。本发明的多核苷酸疫苗优选不编码NS4A HCV蛋白和/或NS5A蛋白。优选地，本发明的多核苷酸疫苗编码核心蛋白或突变的核心蛋白(mCore)和NS3、NS4B和NS5B HCV蛋白，并且不编码其它蛋白。本发明也提供了编码这些抗原的多核苷酸疫苗在医学和在制备用于治疗或预防HCV感染的药物中的用途。
本发明疫苗所用的多核苷酸序列优选DNA序列。
编码上述HCV蛋白的多核苷酸可能存在多种组合或构型。例如，这些蛋白质可能以单个蛋白或融合蛋白的形式被表达。可能在DNA或蛋白质水平上的融合体实例可以是由含有或编码NS4B和NS5B的氨基酸序列的单个多肽或多核苷酸所构成的双融合体(NS4B-NS5B)、含有或编码NS3-NS4B-NS5B的氨基酸序列的三融合体，或本发明全部四种抗原的融合(核心-NS3-NS4B-NS5B)。
本发明的优选融合体是编码NS4B与NS5B的双融合体(NS4B-NS5B或NS5B-NS4B)的多核苷酸；和编码核心与NS3的双融合体(NS3-核心或核心-NS3)的多核苷酸。优选的三融合体是编码NS3-NS4B-NS5B的氨基酸序列的多核苷酸。
编码各抗原的多核苷酸优选地存在于相同的表达载体或质粒中，使得HCV蛋白的表达发生在相同细胞中。在本说明书中，编码HCV蛋白的多核苷酸可存在于单个表达盒或相同多核苷酸载体内的一系列表达盒中的多个表达盒中。
为优化其它HCV蛋白的表达，编码HCV核心蛋白或mCore蛋白的多核苷酸优选地出现在位于另一特定表达盒下游的表达盒中，该特定表达盒含有编码至少一种或其它HCV蛋白的多核苷酸。HCV核心蛋白优选地出现在位于另一特定表达盒下游的表达盒中，该特定表达盒含有编码NS5B的多核苷酸。在本说明书中，核心蛋白可以与HCVNS3蛋白融合表达。
为了在相同细胞中最小化核心生成对其它HCV蛋白的负面影响，所采用的核心蛋白是截短蛋白。如果核心蛋白不由存在于含编码其它HCV蛋白的多核苷酸的表达盒下游的表达盒中的多核苷酸编码，本发明的该方面是特别优选的。同样，如果核心蛋白作为包含核心和其它HCV蛋白序列的融合蛋白的一部分而存在，本发明的该方面是优选的。在本发明的该方面中，被编码的核心蛋白优选从羧基末端被截短，截短量足以减少核心对其它HCV蛋白表达的抑制作用。核心蛋白最为优选地从羧基末端被截短，从而使被生成的蛋白序列无法自然释放因第二次切割核心所生成的C末端肽序列；更为优选的是该蛋白缺失至少最后10个氨基酸，优选地缺失至少最后15个氨基酸，更为优选地缺失最后20个氨基酸，更为优选地缺失最后26个氨基酸和最为优选地缺失最后40个氨基酸。编码核心且适用于本发明的最优选多核苷酸是那些编码含氨基酸1-171、1-165、1-151的截短核心的多核苷酸。编码核心且适用于本发明的最优选多核苷酸编码氨基酸1-151之间的截短核心蛋白。如实施例1所描述的，可以存在一个或多个共有突变。
由本发明的寡核苷酸疫苗编码的其它非核心HCV多肽可含有全长氨基酸序列，或者可选地，该多肽比全长蛋白短，其中它们均含有一定比例的全长多核苷酸序列，该比例足以使截短基因的表达产物产生可与全长蛋白交叉反应的免疫应答。例如，本发明的多核苷酸可编码特定HCV蛋白的片段，该HCV蛋白是已缺失原始序列若干区域的截短HCV蛋白，本发明多核苷酸也可编码含有不足90％原始全长氨基酸序列的最终片段，该片段也可能含有不足70％或50％的原始序列。换言之，编码长度至少为8个氨基酸，例如8-10个氨基酸或多达20、50、60、70、80、100、150或200个氨基酸的片段的多核苷酸被认为属于本发明范畴，只要被编码的寡肽或多肽表现出HCV抗原性即可。具体而言，本发明的该方面包括，但不仅包括多核苷酸编码完整HCV蛋白序列的片段，并可能表现该蛋白的一个或多个离散表位的情况。
在本发明的优选疫苗中，至少1个HCV多肽，优选全部HCV多肽均通过截短或突变被灭活。例如，NS3的解旋酶和蛋白酶活性优选地通过基因的突变而得以降低或消除。已表达多肽的NS5B聚合酶活性优选地通过突变而得以降低或消除。已表达多肽的NS4B活性优选地通过突变而得以降低或消除。已表达多肽的核心蛋白活性优选地通过截短或突变而得以降低或消除。此处所用的突变可包括编码特定多肽的多核苷酸的***、缺失、替代或重排情况。可选地，全长序列可被表达为两个或多个分离部分。
本领域已有文献描述了HCV多肽NS3和NS5B的功能结构和酶功能。
有文献将NS5B描述为RNA依赖性RNA聚合酶，参见Qin et al.，2001，Hepatology，33，pp 728-737；Lohmann et al.，2000，Journal ofViral Hepatitis；Lohmann et al.，1997，Nov.，Journal of Virology，8416-8428；De Francesco et al.，2000，Seminars in Liver Disease，20(1)，69-83。NS5B多肽被描述为具有4个功能基序A、B、C和D。
由本发明的多核苷酸疫苗编码的NS5B多肽序列优选地经过突变，降低或消除了RNA依赖性RNA聚合酶活性。该多肽优选地经过突变，破坏了NS5B的基序A，例如2639位的天冬氨酸(D)被替代为甘氨酸(G)；或2644位的天冬氨酸(D)被替代为甘氨酸(G)。优选地，由本发明的疫苗多核苷酸编码的NS5B多肽含有上述两种天冬氨酸突变。
优选地，被编码的NS5B在基序C中存在破坏。例如，不变天冬氨酸残基D2737突变为H、N或E，导致NS5B的完全灭活。
由本发明的DNA疫苗编码的NS5B优选地包括基序A突变，也可任选地包括基序C突变。基序A中的优选突变包括2639位的天冬氨酸(D)被替代为甘氨酸，2644位的天冬氨酸(D)被替代为甘氨酸。优选地存在上述两种突变。如下文实施例1所描述的，可能存在其它进一步的共有突变。
NS3被描述为具有蛋白酶和解旋酶两种活性。由本发明的DNA疫苗编码的NS3多肽优选地经过突变，破坏了NS3的蛋白酶和解旋酶两种活性。已知NS3的蛋白酶活性与H-1083、D-1107和S-1165的“催化三联体”相关联。由本发明疫苗编码的NS3优选地包括该催化三联体残基中的突变，NS3最为优选地包括从1165位的丝氨酸到缬氨酸的单点突变(De Francesco，R.，Pessi，a and Steinkuhler C.1998.Thehepatitis C Virus NS3 proteinase：structure and function of a zinccontaining proteinase.(丙型肝炎病毒NS3蛋白酶：含锌蛋白酶的结构和功能)Anti-Viral Therapy 3，1-18.)。
NS3的结构和功能可被表示为：
| 蛋白酶 | 解旋酶 |
催化三联体：
已确定的功能基序：
H-1083
I II III IV
D-1107
GKS DECH TAT QRrGRtGR
S-1165
负责NS3的解旋酶活性的4个关键基序被确定是I、II、III和IV。由本发明的DNA疫苗编码的NS3优选地包括对上述至少一个基序的破坏性突变。最为优选的是1316位的天冬氨酸被替代为谷氨酰胺(Paolini，C.Lahm A，De Francesco R and Gallinari P 2000，Mutationalanalysis of hepatitis C virus NS3-associated helicase.(对丙型肝炎病毒NS3相关解旋酶的突变分析)J.Gen Virol.81，1649)。在这些最优选的NS3突变，即S1165V或D1316Q均不位于已知或被预测的T细胞表位内。
由本发明的DNA疫苗编码的NS3多肽最为优选地包括从1165位的丝氨酸(S)到缬氨酸(V)和从1316位的天冬氨酸(D)到谷氨酰胺(Q)的突变。如实施例1所描述的，可存在一种或多种其它共有突变。
由本发明多核苷酸编码的优选NS4B多肽含有N末端截短，除去了HCV分离物与基因型之间的高变区。NS4B多肽优选地从N末端开始存在30-100个氨基酸的缺失，更为优选地是存在40-80个氨基酸的缺失，最为优选地是缺失了N末端前48个氨基酸(在J4L6分离物的情况中，则对应于氨基酸1760处的截短，缺失NS4B的前48个氨基酸；在其它HCV分离物中的等同截短也属于本发明范畴)。此外，NS4B序列可被分为2个或多个片段，并以具有特定NS4B序列的多肽形式被表达，该NS4B序列的排列次序不同于在野生型分子中发现的次序。
存在于本发明疫苗中的多核苷酸可包含在HCV病毒中发现的天然核苷酸序列，但该核苷酸序列优选地被密码子优化用于在哺乳动物细胞中的表达。
除了密码子优化以外，优选的是改变本发明核苷酸中编码HCV核心、NS3、NS4B和NS5B的密码子使用，以使罕用密码子不出现在浓缩簇中，而是与之相反，相对均匀地分布在整个多核苷酸序列中，或者从密码子优化基因中被排除。
DNA编码具有4个字母(A、T、C和G)，利用这些字母可拼写具有3个字母的“密码子”，可表示在生物基因中被编码蛋白质的氨基酸。密码子沿DNA分子的线性序列被翻译为上述基因所编码蛋白质中的氨基酸线性序列。该编码高度简并，有61个密码子编码20种天然氨基酸，有3个密码子表示“终止”信号。因此，大部分氨基酸被1个以上的密码子编码---事实上，一部分氨基酸由4个或4个以上的不同密码子编码。
在可利用1个以上的密码子编码特定氨基酸的情况中，已发现生物的密码子使用模式高度地非随机。不同物种在其密码子使用方面显示了不同的偏爱，此外，密码子的选择可能在单一物种中以高和低水平表达的基因之间也存在显著差异。这一偏爱在病毒、植物、细菌和哺乳动物细胞中的表现不同，某些物种表现出比其它物种更强的偏离随机密码子使用的偏爱。例如，人类及其它哺乳动物在这方面的偏爱没有某些细菌或病毒强。出于这些原因，有一个大的可能性是，在
大 肠杆菌中表达的哺乳动物基因或在哺乳动物细胞中表达的病毒基因具有与有效表这不相称的密码子分布。不过，具有适用于
大肠杆菌表达的密码子使用模式的基因也可能被有效地表达在人类中。在应发生表达的宿主中罕见的密码子簇出现在异源DNA序列中被认为预示着该密码子簇将以低水平被异源表达在该宿主中。
有若干实例是将宿主罕有的密码子替代成宿主优选的密码子(“密码子优化”)，并已提高了异源表达水平，例如，BPV(牛***瘤病毒)晚期基因L1和L2可被密码子优化为哺乳动物密码子使用模式，并已在哺乳动物(Cos-1)细胞培养物中表现出比野生型HPV序列高的表达水平(Zhou et al.，J.Virol 1999.73，4972-4982)。在该研究中，每一个在BPV中出现的频率比在哺乳动物中出现的频率高2倍的BPV密码子(选择比例＞2)，和大部分选择比例＞1.5的密码子均被保守替代为优选哺乳动物密码子。在WO97/31115、WO97/48370和WO98/34640(Merck & Co.，Inc.)中，当密码子优化序列被作为DNA疫苗应用在适合该优化的宿主哺乳动物中时，HIV基因或其片段的密码子优化被证实可使蛋白质表达提高，并使免疫原性增强。上述资料中的序列完全由优化密码子构成(将导入不希望有的限制位点、内含子剪接位点等的地方除外)，因为每一个病毒密码子均被保守替代为对指定宿主而言的最佳密码子。
术语“密码子使用模式”指所有密码子在核苷酸序列、基因或尚存争议的基因种类(例如，被高度表达的哺乳动物基因)中的平均频率。对包括人类在内的哺乳动物而言的密码子使用模式可参见文献(参见例如Nakamura et al.，Nucleic Acids Research 1996，24：214-215)。
在本发明的多核苷酸中，密码子使用模式优选地从HCV的典型模式被变换为更接近表现目标生物，例如大肠杆菌或哺乳动物，尤其是人类的密码子偏爱的密码子使用模式。“密码子使用系数”或密码子适应指数(Sharp PM.Li WH.Nucleic Acids Research.15(3)：1281-95，1987)是衡量特定多核苷酸序列的密码子使用模式与目标物种的密码子使用模式相似程度的量度。将61个密码子中每一个密码子的密码子频率(被表达为在所选种类基因的每1000个密码子中出现的次数)标准化用于20种天然氨基酸中的每一个氨基酸，从而将与各氨基酸最常选择的密码子对应的数值设为1，与较少选择的密码子对应的频率数值则按比例被设定在0-1之间。因此，对目标物种中被高度表达的基因而言，这61个密码子中的每一个密码子均被设定为1或小于1的数值。该值被称为优选值(W)。为计算特定多核苷酸的密码子使用系数，相对于上述物种中被高度表达的基因，记录与该特定多核苷酸中每一个密码子对应的设定值，并取全部数值的几何平均值(通过将这些数值的自然对数的总和用密码子的总数除，并取反对数)。该系数的数值应在0-1之间，该系数越高，在特定多核苷酸中被常用的密码子越多。如果多核苷酸序列的密码子使用系数为1，则全部密码子均是目标物种中被高度表达基因的“最常用”密码子。
本发明提供了编码HCV核心、NS3、NS4B或NS5B氨基酸序列的多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列的密码子使用模式与被高度表达的哺乳动物基因的密码子使用模式相似。该多核苷酸序列优选DNA序列。该多核苷酸序列的密码子使用模式与被高度表达的人类基因的密码子使用模式相似是理想的。
编码HCV核心(1-191)的密码子优化多核苷酸序列如图2所示。编码HCV NS3并含有S1165V和D1316Q多肽突变的密码子优化多核苷酸序列如图3所示。编码HCV NS4B且N-末端1-48位存在多肽截短的密码子优化多核苷酸序列如图4所示。编码HCV NS5B并含有D2639G和D2644G多肽突变的密码子优化多核苷酸序列如图5所示。
相应地，本发明提供了含有共同编码HCV核心、NS3、NS4B或NS5B氨基酸序列的复杂密码子的合成基因，其中对可能被用于编码这些氨基酸序列的密码子的选择已经过改变，与最佳的哺乳动物密码子使用相似，从而使该合成基因中的密码子使用频率比丙型肝炎病毒基因的密码子使用频率更近似于被高度表达的哺乳动物基因的密码子使用频率。该密码子使用模式优选地与被高度表达的人类基因的密码子使用模式基本上相同。有研究已分析了“天然”HCV核心、NS3、NS4B和NS5B序列的密码子使用情况。HCV蛋白的密码子使用系数为核心(0.487)、NS3(0.482)、NS4B(0.481)和NS5B(0.459)。对本发明多核苷酸中被高度表达的人类基因而言，通常应具有的密码子使用系数(如上所定义的)大于0.5，优选地大于0.6，最为优选地大于0.7，但小于1。理想的是该多核苷酸也具有与被高度表达的大肠杆菌基因对应，并大于0.5的密码子使用系数，该系数优选地大于0.6，最为优选地大于0.7。
除了密码子优化以外，该合成基因也可经过突变，以避免罕有密码子簇的出现。该突变可通过两种方式实现。优选方式是从该基因序列中排除罕有密码子。定义罕有密码子的一种方法是在目标生物被高度表达的基因中，该密码子在特定氨基酸所用密码子中占的比例＜20％，优选的是在特定氨基酸所用密码子中占的比例＜10％。可选地，可将罕有密码子定义为在目标生物被高度表达的基因中，相对同义密码子使用(RSCU)值＜0.3，或优选＜0.2的密码子。RSCU值是当特定氨基酸所用的所有密码子以相同频率被选用时，被预期值除的密码子观察值。对罕有密码子的恰当定义应是本领域技术人员易于理解的。
可选地，将HCV核心、NS3、NS4B和NS5B多核苷酸优化，以避免集中范围内存在的罕有、非最佳密码子成簇。因此，将多核苷酸优化，可使单个罕有密码子，诸如RSCU＜0.4(和更为优选的＜0.3)的密码子均匀分布在整个多核苷酸中。
本发明的疫苗可包含引导HCV多肽单独表达的载体，可选地，HCV多肽可以一种或多种融合蛋白的形式被表达。
本发明的优选疫苗包括在蛋白质或多核苷酸水平上的四融合体，包括：
HCV组合A：
| Mcore | NS3 | NS4B | NS5B |
HCV组合B：
| NS3 | NS4B | NS5B | mCore |
HCV组合C：
| NS4B | NS5B | mCore | NS3 |
HCV组合D：
| NS5B | mCore | NS3 | NS4B |
本发明的其它优选疫苗如下，且包括存在于相同质粒内不同表达盒中的多核苷酸双核和三融合体，其中各表达盒均在启动子单元(例如HCMV IE)的独立控制下(如箭头所示)。
这种双重启动子构建体驱动了四种蛋白质抗原在相同细胞中作为两种独立蛋白质的表达。
对上述HCV组合E-L而言，所用术语，例如(核心NS3)+(NS4B5B)，应被理解为公开了一种含有两个表达盒的多核苷酸，其中两个表达盒均受单个启动子的独立控制，且在该实例的情况中，一个表达盒编码核心NS3双融合体蛋白，另一个表达盒则编码NS4B-NS5B双融合体蛋白。相应地也可以相同方式解释HCV组合E-L。
上述HCV组合1-19公开了HCV蛋白、多蛋白融合体或多核苷酸的相对定位。此处还具体公开的是上述HCV组合A-L均被公开存在各自的优选突变或截短，消除了组分蛋白的活性。例如，组合A-L的优选变体(除非另外指明有相反情况)包括核心(1-191(完整序列，而没有将序列分为2个或2个以上的片段从而失去生物学活性外)或优选地以截短形式1-151或1-165或1-171存在的核心)的核苷酸序列；NS3 1027-1657(突变使解旋酶(天冬氨酸1316被替代为谷氨酰胺)和蛋白酶(丝氨酸1165被替代为缬氨酸)的活性灭活)的核苷酸序列；NS5B 2420-3010(突变(天冬氨酸2639被替代为甘氨酸，天冬氨酸2644被替代为甘氨酸，基序A)使聚合酶活性灭活)的核苷酸序列；和NS4B1712-1972(任选地被截短为1760-1972，除去了N末端高变片段)的核苷酸序列。
本发明提供了新型DNA疫苗和如上所述的多肽。本发明也提供了上述多肽的类似物，以及包含这些类似物的DNA疫苗。
术语“类似物”指与本发明的另一种多核苷酸一样编码相同氨基酸序列的多核苷酸，但其通过遗传密码的冗余性，具有不同的核苷酸序列，同时保持了相同的密码子使用模式，例如具有相同的密码子使用系数或者与另一个多核苷酸的密码子使用系数的差值在0.1，优选的在0.05内。
HCV多核苷酸序列可来源于多种HCV基因型、菌株或分离物中的任意一种。HCV分离物可被分类为下述6种包括一种或多种亚型的主要基因型：HCV1(1a、1b或1c)、HCV2(2a、2b或2c)、HCV3(3a、3b、10a)、HCV4(4a)、HCV5(5a)和HCV6(6a、6b、7b、8b、9a和11a)；Simmonds，J.Gen.Virol.，2001，693-712。在本发明的上下文中，各HCV蛋白可来源于相同HCV基因型或亚型的多核苷酸序列，或者可选地，可采用HCV基因型或亚型与HCV蛋白的任意组合。优选的基因来源于1b型基因型，诸如传染性克隆J4L6(编号AF0542478-----参见图1)。
已测序的特异性菌株包括HCV-J(Kato et al.，1990，PNAS，USA，87；9724-9528)和BK(Takamizawa et al.，1991，J.Virol.65：1105-1113)。
本发明的多核苷酸可应用在生产中，表达被编码的蛋白质，该表达可发生在体外、体内或来自体内。因而可在重组蛋白合成中包括本发明核苷酸，例如，以提高产量，或者还可发现其可以被用作治疗剂，以其自身的方式应用在DNA疫苗接种技术中。在本发明多核苷酸被用于以体外或来自体内的方式生产被编码蛋白质的情况中，细胞，例如在细胞培养物中的细胞应经过修饰，从而包括应被表达的多核苷酸。这种细胞包括短命或优选稳定的哺乳动物细胞系。可通过***编码本发明多蛋白的载体而得以修饰的细胞的特定实例包括哺乳动物HEK293T、CHO、HeLa、293和COS细胞。优选的细胞系应不仅稳定，还应允许多蛋白的成熟糖基化和细胞表面表达。表达可在转化的***中实现。多肽可在转基因非人类动物，优选小鼠的细胞中从本发明多核苷酸表达而来。可表达本发明多核苷酸来源多肽的转基因非人类动物属于本发明的范畴。
本发明包括含有本发明核苷酸序列的表达载体。该表达载体可在分子生物学领域被常规构建，并且为了实现蛋白质表达，还可能例如，包括利用质粒DNA与合适的起始子、启动子、增强子及其它元件，诸如可能需要的多腺苷酸化信号，且该表达载体应以正确方向定位。其它合适的载体应是本领域技术人员易于理解的。作为该方面进一步的实例，我们可参考Sambrook et al.Molecular Cloning：a LaboratoryManual.2nd Edition.CSH Laboratory Press.(1989)。
优选地，本发明多核苷酸或应用在本发明载体中的多核苷酸被可操作地连接至特定控制序列上，该控制序列能够通过宿主细胞促成编码序列的表达，即该载体为表达载体。术语“被可操作地连接”指并列，其中所述组分之间的关系使它们能够以各自的特定方式发挥功能。“被可操作地连接”至编码序列的调节序列，诸如启动子是以特定方式定位的，该方式使编码序列可在与调节序列相容的条件下实现表达。
表达盒是能够引导被关注序列或基因的表达的部件。该表达盒包括控制元件，诸如被可操作地连接至被关注基因上的启动子。
该载体可以是，例如带有复制起点，任选地带有表达本发明多核苷酸所用的启动子和任选地带有该启动子的调节基因的质粒，人工染色体(例如BAC、PAC、YAC)、病毒或噬菌体载体。该载体可含有一个或多个选择性标记基因，例如在细菌质粒情况中的氨苄青霉素或卡那霉素抗性基因或用于真菌载体的抗性基因。载体可体外应用，例如用于生成DNA或RNA，或被用于转染或转化宿主细胞，例如哺乳动物宿主细胞，例如，用于生成该载体编码的蛋白质。该载体也可被改装应用于体内，例如在DNA疫苗接种或基因治疗的方法中。
启动子及其它表达调节信号可被选择用来与表达经过设计的宿主细胞相容。例如，哺乳动物启动子包括可在应答诸如镉的重金属时被诱导的金属硫蛋白启动子，和β-肌动蛋白启动子。也可采用病毒启动子，诸如SV40大T抗原启动子、人巨细胞病毒(CMV)立即早期(IE)启动子、劳斯肉瘤病毒LTR启动子、腺病毒启动子或HPV启动子，尤其是HPV上游调节区(URR)。上述全部启动子在本领域已得到充分描述，并且易于利用。
合适病毒载体的实例包括单纯疱疹病毒载体、牛痘或α-病毒载体和逆转录病毒，包括慢病毒、腺病毒和腺伴随病毒。利用这些病毒的基因转移技术是本领域技术人员已知的。例如，逆转录病毒可被用于将本发明多核苷酸稳定地整合进宿主基因组中，但这种重组并不优选。与之相反，复制缺陷型腺病毒载体保留了游离基因，因而允许瞬时表达。能够驱动在昆虫细胞(例如杆状病毒载体)、人类细胞或细菌中的表达的载体可以被应用，以生成大量由本发明多核苷酸编码的HCV蛋白，例如被用作亚单位疫苗或被应用在免疫测定中。
在进一步的方面中，本发明提供了一种含有此处所描述的多核苷酸序列的药物组合物。优选地，该组合物含有根据本发明第二个方面的DNA载体。在优选实施方案中，该组合物含有多种包被有DNA的粒子，优选金粒子，该DNA包括编码特定多核苷酸序列的载体，而该特定多核苷酸序列编码HPV氨基酸序列，其中该多核苷酸序列的密码子使用模式与被高度表达的哺乳动物基因，尤其是人类基因的密码子使用模式相似。在可选实施方案中，该组合物含有药学可接受赋形剂和根据本发明第二个方面的DNA载体。该组合物也可包括佐剂。
DNA疫苗可通过液体疫苗的间质施用方法被送递进肌肉(WO90/11092)，或者通过除肌内注射以外的机制送递。例如，送递进皮肤利用了一个事实，即免疫机制在作为感染屏障的组织，诸如皮肤和粘膜中高度活跃。送递进皮肤可通过注射，通过喷射注射器(在压力下迫使液体进入皮肤，或包括肌肉在内的下层组织)或通过粒子辐射，其中DNA可被包被在粒子上，其密度足以穿透上皮(美国专利No.5371015)。例如，该核苷酸序列可被整合进金珠上所包被的质粒中，该金珠随后在高压下被施用进表皮，诸如，例如在Haynes et al.，J.Biotechnology
44：37-42(1996)中所描述的方法。将这些粒子导入皮肤，导致了表皮细胞和表皮朗氏细胞的直接转染。朗氏细胞是抗原呈递细胞(APC)，可摄取DNA，表达被编码的肽，并对它们进行加工，以展示在细胞表面MHC蛋白上。被转染的朗氏细胞迁移进***，在这里将被展示的抗原片段呈递至淋巴细胞，从而诱发免疫应答。通过粒子介导送递进皮肤，诱发免疫应答仅需要极少量的DNA(少于1μg，通常少于0.5μg)，而与之形成对比的是，在直接肌内注射后产生免疫应答则需要毫克量级的DNA。
在本发明多核苷酸充当治疗剂，例如在DNA疫苗接种的情况中，对将接种疫苗的哺乳动物，例如人施用了核酸。该核酸，诸如RNA或DNA，优选DNA以载体，诸如上述载体的形式被提供，可被表达在哺乳动物的细胞中。本发明多核苷酸可通过任何可利用的技术施用。例如，该核酸可通过针注射，优选皮内、皮下或肌内注射被导入。可选地，采用核酸送递装置，诸如粒子介导DNA送递(PMDD)将该核酸直接送递进皮肤。在该方法中，惰性粒子(诸如金珠)被核酸包被，并被加速至特定速度，该速度足以使其穿透受体表面(例如皮肤)，例如通过在高压下从发射装置释放的方式。(本发明核酸分子包被的粒子属于本发明范畴，加载有该粒子的送递装置同样也在本发明范畴内)。本发明组合物理想地包括平均直径为0.5-5μm，优选大约2μm的金粒子。在优选实施方案中，已包被的金珠被加载进管中，充当了药筒，各药筒含有0.1-1mg，优选0.5mg金珠，而这些金珠包被了每药筒0.1-5μg，优选大约0.5μg DNA。
本发明的另一个方面提供了含有此处所描述的多核苷酸序列的宿主细胞。该宿主细胞可以是细菌，例如大肠杆菌，哺乳动物，例如人类，或者是昆虫细胞。含有本发明载体的哺乳动物细胞可以是被体外转染的培养细胞，或者是通过将该载体施用给哺乳动物从而得以体内转染的细胞。
在进一步的方面中，本发明提供了制备上述药物组合物的方法，包括改变野生型HCV核苷酸序列的密码子使用模式的步骤，或通过合成方式构建多核苷酸序列以生成特定序列的步骤，该序列的密码子使用模式与被高度表达的哺乳动物基因的密码子使用模式相似，并且编码野生型HCV氨基酸序列或突变HCV氨基酸序列，该突变HCV氨基酸序列包括具有特定氨基酸变化的野生型序列，该氨基酸变化足以灭活本发明多肽的一种或多种天然功能。
本发明还提供了此处所描述的多核苷酸或疫苗在治疗或预防HCV感染方面的用途。
将裸多核苷酸或载体导入患者体内的合适技术包括采用合适媒介物进行的体表接种。本发明核酸可通过例如，鼻内、口、***内或直肠内施用方法，被局部施用至皮肤或粘膜表面。本发明的裸多核苷酸或载体可与药学可接受赋形剂，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)一起存在。通过单独利用助剂，诸如丁哌卡因，或者将其包括在DNA配方中，可进一步利于DNA摄取。将本发明核酸直接施用给受体的其它方法包括超声、电刺激、电穿孔和US-5,697,901中所描述的微接种。
核酸构建体的摄取可通过若干已知的转染技术增强，例如那些包括利用转染剂的技术。这些转染剂的实例包括阳离子剂，例如磷酸钙和DEAE-葡聚糖和lipofectant，例如lipofectam和transfectam。需施用的核酸剂量可以变化。该核酸的施用量范围典型地为1pg-1mg，对粒子介导基因送递的核酸而言，优选1pg-10μg，对其它途径送递的核酸而言，则优选10μg-1mg。
本发明的核酸序列也可借助于在基因治疗中有用的特种送递载体而得以施用。基因疗法在例如Verme et al.，Nature 1997，389：239-242中已得到论述。也可采用病毒和非病毒两种载体***。病毒基础的***包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和以金丝雀痘和牛痘-病毒为基础的***。优选的腺病毒载体是来源自非人类的灵长类动物的腺病毒载体。具体而言，是美国专利6083716中描述的Pan9(C68)，和在WO03/046124中描述的Pan5、6或7。
非病毒基础的***包括核酸的直接施用、微球体被囊化技术(聚丙交酯-乙交酯共聚物)和脂质体基础的***。当需要在基础接种疫苗后提供强化注射时，可将病毒和非病毒送递***二者结合，例如，采用非病毒载体，诸如质粒进行最初的“基础”DNA接种，随后采用病毒载体或非病毒基础的***进行一次或多次“加强”接种。基础加强方案也可利用佐剂中蛋白质的引发，和编码本发明多核苷酸的DNA或病毒载体的强化。可选地，该蛋白质基础的疫苗可被用作加强剂。优选的是该蛋白质疫苗应含有DNA/病毒介导疫苗所含的所有抗原。但该蛋白质可单独存在，或以多蛋白形式存在。
本发明的核酸序列也可借助于转化细胞而得以施用。这种细胞包括从被试者收获而得的细胞。本发明的裸多核苷酸或载体可被导入体外的上述细胞中，且该转化细胞可随后被返还给被试者。本发明的多核苷酸可通过同源重组被整合进已存在于细胞内的核酸中。如果需要，转化细胞可在体外生长，且所生成细胞中的一个或多个均可被应用在本发明中。通过已知的外科或显微外科技术(例如移植、微量注射等)，可将细胞提供在患者的合适部位。
合适的细胞包括抗原呈递细胞(APCs)，诸如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞及其它可被工程改造为有效APC的细胞。这种细胞可以，但不必须被遗传修饰，以提高呈递抗原的能力、促进T细胞应答的活化和/或维持、使本身具有抗肿瘤，例如抗***作用和/或在免疫学上与受体相容(即匹配HLA单倍型)。APCs通常可以从任意多种生物学流体和器官，包括肿瘤和肿瘤周围组织中分离获得，并可能是自体、同种异体、同源或异源细胞。
本发明的某些优选实施方案采用树突细胞或其祖细胞作为抗原呈递细胞，用于体外转化并返还给患者，或者作为疫苗中被送递核苷酸的体内目标，例如通过粒子介导DNA送递的核苷酸。树突细胞是高度有效的APCs(Banchereau and Steinman，Nature 392：245-251，1998)，并已被证实可作为生理学佐剂有效地引发预防或治疗性的抗肿瘤免疫性(参见Timmerman and Levy，Ann.Rev.Med.50：507-529，1999)。通常，根据树突细胞的典型形态(星状原位，具有显著的胞质突(树突)体外可见)、摄取能力、高效加工和呈递抗原的能力，以及它们活化幼稚T细胞应答的能力，可对树突细胞进行鉴定。树突细胞当然可以被工程改造，以表达通常未被发现存在于体内或来自体内的树突细胞上的特异性细胞表面受体或配体，例如被编码在本发明构建体中的抗原，且本发明设想了这种被修饰的树突细胞。
树突细胞和祖细胞可获得自外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周围组织浸润细胞、***、脾脏、皮肤、脐带血或其它任意合适的组织或液体。例如，通过将细胞因子，诸如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNF的组合加入从外周血收获的单核细胞培养物中，可使树突细胞体外分化。可选地，通过在培养基中加入GM-CSF、IL-3、TNF、CD40配体、脂多糖LPS、flt3配体(在专职性抗原呈递细胞，尤其是树突细胞的增殖方面具有重要作用的细胞因子)和/或其它可诱导树突细胞分化、成熟和增殖的化合物的组合，可使从外周血、脐带血或骨髓中收获的CD34阳性细胞分化为树突细胞。
通常，可采用编码抗原性HCV氨基酸序列的多核苷酸，诸如本发明所设想的密码子优化多核苷酸转染APCs。如此文所描述的，该转染可体外发生，且包含该转染细胞的组合物或疫苗可被随后用于治疗目的。可选地，可将以树突或其它抗原呈递细胞为目标的基因送递载体施用给患者，造成可体内发生的转染。树突细胞的体内和体外转染，例如通常可采用本领域已知的任何方法，诸如WO 97/24447所描述的方法，或Mahvi et al.，Immunology and cell Biology 75：456-460，1997所描述的粒子介导方法进行。
本发明的疫苗和药物组合物可与抗病毒剂，诸如α-干扰素，优选聚乙二醇化的α-干扰素，和病毒唑结合应用。疫苗和药物组合物可被置入单位剂量或多次剂量容器，诸如密封安瓿瓶或小瓶中。这种容器优选地被密封，以维持配方的无菌度，直至使用。通常，配方可以在油性或水性载体中形成的悬液、溶液或乳浊液形式被保存。可选地，疫苗或药物组合物可被保存在冻干条件中，仅需要在使用前立即加入无菌液体载体。含有核苷酸序列，并将借助于粒子介导送递施用的疫苗可以特定药筒形式出现，该药筒适合与压缩气体送递仪器一起应用，在该情况中，药筒可由内表面包被了特定粒子的中空管构成，该特定粒子任选地是在其它药学可接受成分存在的条件下负载了本发明疫苗核苷酸序列。
本发明的药物组合物可包括辅助化合物，或其它可用于调节或增强本发明DNA所编码蛋白质诱导的免疫应答的物质。这些物质可由DNA编码，为分离形式或与抗原融合的形式，或者可以作为非DNA元件被包括在配方中。可被包括在本发明配方中的辅助型物质的实例包括遍在蛋白质、溶酶体相关膜蛋白(LAMP)、乙型肝炎病毒核心抗原、flt3-配体及其它细胞因子，诸如IFN-γ和GMCSF。
其它合适的佐剂是商业可提供的，诸如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Imiquimod(3M，St.Paul，MN)；Resimiquimod(3M，St.Paul，MN)；Merck Adjuvant 65(Merckand Company，Inc.，Rahway，NJ)；铝盐，诸如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生多糖；聚磷腈；生物可降解微球体；单磷酰脂A和quil A。也可采用细胞因子，诸如GM-CSF或白细胞间介素-2、-7或-12作为佐剂。
在本发明的配方中，优选的是辅助组合物诱导主要为Th1型的免疫应答。因此，该佐剂可用来调节在应答DNA编码抗原时产生的免疫应答，使其从Th2主导型应答成为Th1主导型应答。高水平的Th1-型细胞因子(例如IFN-、TNF、IL-2和IL-12)倾向于帮助诱导针对被施用抗原并由细胞介导的免疫应答。在应答主要为Th1-型的优选实施方案中，Th1-型细胞因子的水平将提高，远高于Th2-型细胞因子的水平。这些细胞因子的水平可通过标准测定方法快速评估。对细胞因子家族的论述可参见Mosmann and Coffman，Ann.Rev.Immunol.7：145-173，1989。
相应地，适用于引发主要是Th1-型应答的佐剂包括，例如，单磷酰脂A，优选3-脱氧酰化单磷酰脂A(3D-MPL)与铝盐的组合。可优先诱导TH1型免疫应答的其它已知佐剂包括含有CpG的寡核苷酸。该寡核苷酸的特征在于CpG二核苷酸未被甲基化。这种寡核苷酸是众所周知的，并在例如WO96/02555中得到了描述。免疫刺激DNA序列也在例如，Sato et al.，Science 273：352，1996中得到了描述。含CpG的寡核苷酸和***状瘤抗原可以被分开编码在相同或不同的多核苷酸构建体中，或者二者可以紧邻，例如形成融合。可选地，含CpG寡核苷酸可被单独施用，即不作为包括了被编码抗原的组合物的一部分。CpG寡核苷酸可被单独应用，或者与其它佐剂结合应用。例如，增强体系包括了含CpG寡核苷酸与皂苷衍生物的组合，尤其是WO 00/09159和WO 00/62800公开的CpG与QS21的组合。优选地，本发明配方还包括水包油乳浊液和/或生育酚。
另一种优选佐剂为皂苷，优选QS21(Aquila BiopharmaceuticalsInc.，Framingham，MA)，可以被单独应用，或者与其它佐剂结合应用。例如，增强体系包括单磷酰脂A与皂苷衍生物的组合，诸如WO94/00153描述的QS21与3D-MPL的组合，或WO 96/33739描述的反应原性较低的组合物，其中的QS21受到胆固醇的抑制。其它优选配方包括水包油乳浊液和生育酚。WO 95/17210描述了一种尤其有效的佐剂配方，该配方为水包油乳浊液形式，包括了QS21、3D-MPL和生育酚。
其它优选的佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，France)、SAF(Chiron，California，United States)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、Detox(Ribi，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)及其它氨烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGPs)。
在疫苗包括佐剂的情况中，疫苗配方可被分为两部分施用。例如，配方中含有编码抗原的核苷酸构建体的部分可通过例如皮下或肌内注射，或通过皮内粒子介导送递被先施用，随后可立即或在适当时间段后施用的是配方中含有佐剂的部分，其中的适当时间段应是疫苗领域的熟练医师易于理解的。在这些情况下，佐剂可通过与抗原配方相同的施用途径施用，或通过替代途径施用。在其它实施方案中，配方中的佐剂部分应在抗原部分施用前被施用。在一种实施方案中，佐剂在其粒子介导的送递之前或之后，以体表接种配方形式被施用在皮肤的特定部位上，该部位是粒子介导送递编码抗原的核苷酸序列的部位。
本发明DNA疫苗优选地刺激了有效免疫应答，典型的是针对HCV抗原产生的CD4+和CD8+免疫性。这些有效免疫应答优选地针对广范围的表位。在治疗情况中，优选的是在疫苗接种后减少肝纤维样化和/或炎症的发生。
此处所用的术语“包括”应以其非限制性意义应用，因此，并不排除其它要素的存在。不过，术语“包括”也可按照其专有意义理解，与“构成”或“由...构成”同等意义。本发明通过下述实施例得到了例证，但不限于下述实施例。
实施例1，被导入抗原组的突变：
1).共有突变
对所有已知HCV分离物的完整基因组序列的比较已完成。J4L6多蛋白中的某些位点被认为异常/脱离了其它大部分HCV分离物。尤其重要的发现是这些位点脱离了更多与1b-型分离物交叉相关的共有残基，延伸出交叉型1a、2、3及其它交叉型，其中的1或2个可选氨基酸残基在等同位点上受控于其它方式。被选的共有突变均不干扰已知的CD4或CD8表位。NS3内的两处变化实际上恢复了免疫显性HLA-B35-限制性CD8表位[异亮氨酸(I)1365被替代为缬氨酸(V)，甘氨酸(G)1366被替代为丙氨酸(A)]。
由于无益变异性的存在，NS4B的前48个氨基酸已被移除。
核心
丙氨酸(A)52被替代为苏氨酸(T)
NS3
缬氨酸(V)1040被替代为亮氨酸(L)
亮氨酸(L)1106被替代为谷氨酰胺(Q)
丝氨酸(S)1124被替代为苏氨酸(T)
缬氨酸(V)1179被替代为异亮氨酸(I)
苏氨酸(T)1215被替代为丝氨酸(S)
甘氨酸(G)1289被替代为丙氨酸(A)
丝氨酸(S)1290被替代为脯氨酸(P)
异亮氨酸(I)1365被替代为缬氨酸(V)
甘氨酸(G)1366被替代为丙氨酸(A)
苏氨酸(T)1408被替代为丝氨酸(S)
脯氨酸(P)1428被替代为苏氨酸(T)
异亮氨酸(I)1429被替代为丝氨酸(S)
异亮氨酸(I)1636被替代为苏氨酸(T)
NS4B
苯丙氨酸(F)1760处的起始ORF
NS5B
异亮氨酸(I)2824被替代为缬氨酸(V)
苏氨酸(T)2892被替代为丝氨酸(S)
苏氨酸(T)2918被替代为缬氨酸(V)
注：编号取决于在J4L6分离物多蛋白中的位置。
实施例2，质粒DNA疫苗的构建
利用SynGene 2e软件，可将编码HCV核心、NS3、截短NS4B和NS5B的多核苷酸序列密码子优化为哺乳动物密码子使用。对各多核苷酸对应的密码子使用系数均被提高至大于0.7。
整合了密码子优化、酶失效突变和共有突变的每一个新多核苷酸序列的有义和反义链被分成若干区域，各区域含有40-60个核苷酸，并存在20个核苷酸的重叠部分。这些区域被商业合成，并可通过寡装配PCR法生成多核苷酸。
各多核苷酸的外正向和反向PCR引物被概括如下，并举例以克隆所用的独特限制性内切核酸酶位点：
HCV核心
正向引物
5′-GAATTCGCGGCCGCCATGAGCACCAACCCCAAGCCCCAGCGCAAGACCAAGCGGAACACC-3′
NotI 翻译起始密码子
反向引物
5′-GAATTCGGATCCTCATGCGCTAGCGGGGATGGTGAGGCAGCTCAGCAGCGCCAGCAGGA-3′
BamHI 终止密码子
HCV NS3
正向引物
5′-GAATTCGCGGCCGCCATGGCCCCCATCACCGCCTACAGCCAGCAGACCCGGGGAC-3′
NotI 翻译起始密码子
反向引物
5′-GAATTCGGATCCTCAGGTGACCACCTCCAGGTCAGCGGACATGCACGCCATGATG-3′
BamHI 终止密码子
HCV NS4B
正向引物
5′-GAATTCGCGGCCGCCATGTTTTGGGCCAAGCATATGTGGAACTTCA-3′
NotI 翻译起始密码子
反向引物
5′-GAATTCGGATCCTCAGCAAGGGGTGGAGCAGTCCTCGTTGATCCAC-3′
BamHI 终止密码子
HCV NS5B
正向引物
5′-GAATTCGCGGCCGCCATGTCCATGTCCTACACCTGGACCGGCGCCCTGA-3′
NotI 翻译起始密码子
反向引物
5′-GAATTCGGATCCTCAGCGGTTGGGCAGCAGGTAGATGCCGACTCCGACG-3′
BamHI 终止密码子
所有编码单个抗原的多核苷酸均借助于Not I和BamHI单克隆位点，被克隆进哺乳动物表达载体p7313ie中(参见图7)。
被编码的多蛋白如下(包括突变和密码子优化)：
HCV核心翻译：
MSTNPKPQRKTKRNTNRRPQDVKFPGGGQIVGGVYLLPRRGPRLGVRATRKTSERS
QPRGRRQPIPKARRPEGRAWAQPGYPWPLYGNEGLGWAGWLLSPRGSRPSWGPTDP
RRRSRNLGKVIDTLTCGFADLMGYIPLVGAPLGGAARALAHGVRVLEDGVNATGN
LPGCSFSIFLLALLSCLTIPASA
HCV NS3翻译：
MAPITAYSQQTRGLLGCIITSLTGRDKNQVEGEVQVVSTATQSFLATCINGVCWTVY
HGAGSKTLAGPKGPITQMYTNVDQDLVGWQAPPGARSMTPCTCGSSDLYLVTRHA
DVIPVRRRGDSRGSLLSPRPVSYLKGSVGGPLLCPSGHVVGIFRAAVCTRGVAKAVD
FIPVESMETTMRSPVFTDNSSPPAVPQTFQVAHLHAPTGSGKSTKVPAAYAAQGYKV
LVLNPSVAATLGFGAYMSKAHGIDPNIRTGVRTITTGAPITYSTYGKFLADGGCSGGA
YDIIICQECHSTDSTTILGIGTVLDQAETAGARLVVLATATPPGSVTVPHPNIEEVALSN
NGEIPFYGKAIPIEAIKGGRHLIFCHSKKKCDELAAKLSGLGLNAVAYYRGLDVSVIPT
SGDVVVVATDALMTGFTGDFDSVIDCNTCVTQTVDFSLDPTFTIETTTVPQDAVSRS
QRRGRTGRGRSGIYRFVTPGERPSGMFDSSVLCECYDAGCAWYELTPAETSVRLRAY
LNTPGLPVCQDHLEFWESVFTGLTHIDAHFLSQTKQAGDNFPYLVAYQATVCARAQ
APPPSWDQMWKCLIRLKPTLHGPTPLLYRLGAVQNEVTLTHPITKYIMACMSADLEV
VT
HCV NS4B翻译：
MFWAKHMWNFISGIQYLAGLSTLPGNPAIASLMAFTASITSPLTTQNTLLFNILGGWV
AAQLAPPSAASAFVGAGIAGAAVGSIGLGKVLVDILAGYGAGVAGALVAFKVMSGE
VPSTEDLVNLLPAILSPGALVVGVVCAAILRRHVGPGEGAVQWMNRLIAFASRGNH
VSPTHYVPESDAAARVTQILSSLTITQLLKRLHQWINEDCSTPC
HCV NS5B翻译：
MSMSYTWTGALITPCAAEESKLPINPLSNSLLRHHNMVYATTSRSASLRQKKVTFDR
LQVLDDHYRDVLKEMKAKASTVKAKLLSIEEACKLTPPHSAKSKFGYGAKDVRNLS
SRAVNHIRSVWEDLLEDTETPIDTTIMAKSEVFCVQPEKGGRKPARLIVFPDLGVRVC
EKMALYDWSTLPQAVMGSSYGFQYSPKQRVEFLVNTWKSKKCPMGFSYGTRCFG
STVTESDIRVEESIYQCCDLAPEARQAIRSLTERLYIGGPLTNSKGQNCGYRRCRASG
VLTTSCGNTLTCYLKATAACRAAKLQDCTMLVNGDDLVVICESAGTQEDAAALRAF
TEAMTRYSAPPGDPPQPEYDLELITSCSSNVSVAHDASGKRVYYLTRDPTTPLARAA
WETARHTPVNSWLGNIIMYAPTLWARMILMTHFFSILLAQEQLEKALDCQIYGACYS
IEPLDLPQIIERLHGLSAFSLHSYSPGEINRVASCLRKLGVPPLRVWRHRARSVRAKLL
SQGGRAATCGRYLFNWAVRTKLKLTPIPAASQLDLSGWFVAGYSGGDIYHSLSRAR
PRWFPLCLLLLSVGVGIYLLPNR
实施例3，免疫应答测定
采用WT或密码子优化+突变形式的4种HCV抗原使C57BL或BALB/c小鼠免疫，其中这4种抗原在p7313载体中被单独表达。小鼠是通过PMID采用标准剂量1.0μg/药筒免疫的，并于第21天接受加强接种(加强接种1)，第49天再次接受加强接种(加强接种2)。脾细胞收获自个体小鼠，并在ELISPOT中经过不同HCV抗原制剂的重新刺激。IL2和IFNγ应答均被测定。测定免疫应答所用的试剂是Mikrogen的纯化HCV核心、NS3、NS4和NS5B(基因型1b)蛋白，牛痘-核心和牛痘NS3-5(固有基因型1b)。
HCV核心
采用HCV核心蛋白再次刺激经由WT全长(FL-1-191)或截短(TR1-115)核心免疫的C57BL小鼠，采用纯化的核心蛋白时观测到良好应答(图8)。
HCV NS3
采用p7313 WT和密码子优化NS3，通过PMID使小鼠免疫。采用NS3蛋白和牛痘3-5，并通过ELISPOT检出应答，在C57B1小鼠中证实免疫接种和单次加强接种之后产生了对NS3的良好应答。IL2和IFNγ应答均得到检测。在该实验中未发现野生型与密码子优化(co+m)形式的构建体之间存在显著差异(图9)。但在瞬时转染后的体外表达方面，观测到野生型与密码子优化构建体之间存在差异。对较低DNA剂量的构建体或初次应答中的构建体进行比较的实验可表明质粒的效价存在差异。
HCV NS4B
对BALB/c小鼠PMID免疫接种后观测其对全长WT p7313 NS4B的应答。采用NS4B蛋白和牛痘3-5再次进行体外刺激后，通过ELISPOT观察IL2和IFNγ应答(图10)。
NS4B蛋白的N-末端被截短，除去了高变区，但在体外转染研究后未能检测到该蛋白质的表达，因为N-末端区已引起了有效抗血清的产生。为证实该区域的表达，将其与NS5B蛋白融合。最近有实验已证实，采用NS4B蛋白和NS3-5牛痘，可检测到针对以单独或与NS5B融合的形式存在的截短NS4B蛋白所产生的免疫应答。观测到了对WT和密码子优化NS4B的良好应答。
HCV NS5B
在采用WT和密码子优化(co+M)序列免疫接种后，研究PMID后对NS5B的免疫应答。采用NS3蛋白和牛痘3-5，并通过ELISPOT检出应答，在C57BL小鼠中证实免疫接种和单次加强接种之后产生了对NS5B的良好应答。与NS3的情况一样，未在该实验中观测到WT与co+m形式的构建体之间存在免疫应答方面的差异(图11)。
实施例4，HCV多蛋白的表达
将四种被选HCV抗原，即核心、NS3、NS4B和NS5B安排在p7313ie中，作为单个融合多蛋白表达。如下所示，这些抗原在不同构建体中的表达次序不同。(编码单个多蛋白的表达的构建体组经过设计，使氨基末端位点依次被四个抗原占据，以观察在该重要位点上，一种抗原的存在是否使表达水平显著提高或降低的程度大于其它抗原存在时的情况。)此外，生成了两种构建体，其中的核心蛋白被重新排列，成为2个片段，即核心66-191＞1-65和105-191＞1-104。
HCV 500
| 核心 | NS3 | NS4B | NS5B |
HCV 510
| NS3 | NS4B | NS5B | 核心 |
HCV 520
| NS4B | NS5B | 核心 | NS3 |
HCV 530
| NS5B | 核心 | NS3 | NS4B |
HCV 501
| 核心(66-191)-(1-65) | NS3 | NS4B | NS5B |
HCV 502
| 核心(105-191)-(1-104) | NS3 | NS4B | NS5B |
采用Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen/LifeTechnologies)，并遵循标准操作流程，将标准化量的DNA转染进HEK293T细胞中。转染后24小时收获细胞，并采用NuPAGE 4-12％Bis-Tris预制凝胶，以及MOPS或MES预制缓冲液(Invitrogen/LifeTechnologies)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。将分离的蛋白质印迹转移至PVDF膜上，并利用对NS5B全部蛋白质所引发产生的兔抗血清观察蛋白质表达。二级探针是与辣根过氧化物酶(hrp)偶联的抗兔免疫球蛋白抗血清，随后采用ECL试剂(Amersham Biosciences)进行化学发光检测。
该表达研究的结果如图12所示。结果显示所有多蛋白的表达程度相似，但表达水平均低于对表达NS5B的单个抗原所观测到的表达水平。HCV500的分子量稍低是HCV核心从N末端位点的切割造成的。在该实验中，因存在克隆差错，未检测到HCV502。在采用另一个克隆进行的重复实验中，HCV502的表达水平与其它多蛋白相似。
实施例5，对HCV多蛋白所引发免疫应答的检测
采用编码上述各多蛋白的DNA(1μg)，并通过PMID使C57BL小鼠免疫，随后如实施例4所述在3周后加强接种。利用ELISPOT或针对HCV抗原产生的胞内细胞因子，观察加强接种后7天的免疫应答。
对HCV基因产物所引发T细胞应答的ELISPOT测定
脾细胞的制备
对免疫动物加强接种后7天，从其体内获得脾脏。通过在载玻片之间研磨，对脾脏进行处理，以获得细胞悬液。通过氯化铵处理溶解红细胞，并除去碎片，保留脾细胞的微悬浮液。将细胞重新悬浮在RPMI完全培养基中，浓度为4×106/ml，应用在ELISPOT测定中，该浓度适用于小鼠仅接受过基础免疫接种的情况，在小鼠接受过加强接种的情况中，细胞重新悬浮的浓度则为2×106/ml。
ELISPOT测定
采用15μg/ml大鼠抗小鼠IFNγ或大鼠抗小鼠IL-2(Pharmingen)包被培养板(在PBS中)。在+4℃过夜包被培养板。使用前，采用PBS洗涤培养板3次。将脾细胞加入培养板中，密度为4×105个细胞/孔。重组HCV抗原获得自Mikrogen，被采用的浓度为1ug/ml。应用于测定的肽的最终浓度为1-10uM，可测定CD4或CD8应答。这些肽获得自Genemed Synthesis。各孔内的总体积为200μl。在湿润的37℃培养箱中温育含有抗原刺激细胞的培养板16小时。在一些实验中，ELISPOT测定采用经由可表达NS3-5的重组牛痘或牛痘野生型感染的细胞作为抗原。
ELISPOT测定培养板的显色
通过采用水洗涤1次(外加1分钟浸泡以确保细胞溶解)，采用PBS洗涤3次，从培养板中除去细胞。在PBS中加入生物素偶联的大鼠抗小鼠IFN-γ或IL-2(Phamingen)，浓度为1μg/ml。室温下温育培养板2小时，并伴以振荡。随后在加入1/1000稀释的链霉抗生物素蛋白碱性磷酸酶(Caltag)之前，采用PBS洗涤培养板3次。在PBS中洗涤3次后，通过采用BCICP底物(Biorad)温育15-45分钟，使斑点显现。采用水将底物洗去，并使培养板变干。利用图象分析***计数斑点。
检测T细胞应答肽刺激时所生成IFNγ和IL2的流式细胞术
等分脾细胞，使每只试管含有大约3×106个脾细胞，并通过离心使细胞沉淀。除去上清液，并对样品进行涡旋以分散沉淀。在各试管中加入0.5μg抗CD28+0.5μg抗CD49d(Pharmingen)，并于室温下温育10分钟。在仅含有培养基或培养基外加HCV抗原的合适试管内加入1ml培养基。随后在加热水浴中37℃温育样品1小时。在各试管中加入10ug/ml布雷非德菌素A，并于37℃继续温育5小时。随后将程序控制的水浴调至6℃，并维持该温度过夜。
随后，采用抗小鼠CD4-CyChrome(Pharmingen)和抗小鼠CD8生物素(Immunotech)对样品进行染色。洗涤样品，采用链霉抗生物素蛋白-ECD对其进行染色。洗涤样品，加入100μl来自“IntraprepPermeabilization Reagent”试剂盒(Immunotech)中的固定剂，室温下放置15分钟。洗涤后，将Intraprep试剂盒中的100μl透化剂以及抗IFN-γ-PE+抗IL-2-FITC加入各样品中。室温温育样品15分钟，并洗涤。在0.5ml缓冲液中重新悬浮样品，并在流式细胞仪中进行分析。
从每一样品中收集共计500,000个细胞，并随后门控CD4和CD8细胞，以测定在应答刺激时分泌IFNγ和/或IL-2的细胞群体。
结果显示以不同次序编码核心、NS3、NS4B和NS5B的所有多蛋白均能够刺激对NS3的免疫应答(即HCV 500、510、520、530)。结果如图13所示。当通过IL2(图13A)和IFNγ(图13B)ELISPOT观察时，发现各HCV多蛋白(HCV 500、510、520和530)对NS3蛋白的应答均相似。
通过ICS更具体地分析了应答细胞的表型。针对免疫显性NS3 CD4特异性肽引发了好的CD4+T细胞应答，该应答在HCV500、510、520、530中的情况相似。
表1经由HCV多蛋白免疫后生成IFNγ的NS3特异性CD4和CD8T细胞的频率
构建体 无 NS3蛋白 NS3 CD4肽 NS3 CD8肽
仅含NS3 0.05 0.29 0.24 4.4
HCV 500 0.09 0.27 0.38 5.54
HCV 510 0.1 0.17 0.29 3.95
HCV 520 0.1 0.14 0.28 3.32
HCV 530 0.07 0.15 0.21 4.89
HCV 501 0.1 0.05 0.08 0.16
脾细胞在抗原存在或缺乏条件下接受刺激6小时，后4小时在布雷非德菌素A存在条件下接受刺激，随后检测IFNγ特异性T细胞应。通过在CD4或CD8T细胞上的门控和采用IFNγFITC进行的染色，检测IFNg。
在采用HCV 500、510、520和530免疫后也产生了对免疫显性NS3特异性肽的强CD8应答，CD8+细胞的频率达2.5-6％。
采用HCV 500、510、520和530免疫也导致检测到同时针对NS4B和NS5B抗原的CD4和CD8应答，但对这些多蛋白的CD8应答比采用单一抗原免疫后产生的CD8应答弱。
表2经由HCV多蛋白免疫后生成IFNγ的NS5B CD4和CD8特异性T细胞的频率
质粒 无 NS5B蛋白 NS5B CD4肽 NS5B CD8肽
仅含NS5B 0.05 0.1 0.26 1.67
HCV 500 0.09 0.14 0.43 0.35
HCV 510 0.11 0.1 0.29 0.11
HCV 520 0.11 0.09 0.18 0.08
HCV 530 0.07 0.06 0.7 0.12
HCV 501 0.1 0.03 0.13 0.09
脾细胞在抗原存在或缺乏条件下接受刺激6小时，后4小时在布雷非德菌素A存在条件下接受刺激，随后检测IFNγ特异性T细胞应答。通过在CD4或CD8T细胞上的门控和采用IFNγFITC进行的染色，检测IFNg。
表3经由HCV多蛋白免疫后生成IFNγ的NS4B CD4或CD8特异性T细胞的频率
质粒 无 NS4B蛋白 NS4B CD4肽 NS4B CD8肽
NS4B 0.05 0.17 0.18 2.04
HCV 500 0.09 0.09 0.1 0.6
HCV 510 0.05 0.09 0.09 0.34
HCV 520 0.06 0.08 0.05 0.33
HCV 530 0.1 0.17 0.1 0.37
HCV 501 0.04 0.09 0.06 0.13
脾细胞在抗原存在或缺乏条件下接受刺激6小时，后4小时在布雷非德菌素A存在条件下接受刺激，随后检测IFNγ特异性T细胞应答。通过在CD4或CD8 T细胞上的门控和采用IFNγFITC进行的染色，检测IFNg。
所采用的肽具有下述序列：
| 蛋白质 | 肽 |
| NS3 | (C57B1)CD4 PRFGKAIPIEAIKGGCD8 YRLGAVQNEVILTHP |
| NS5 | (C57BL/6).CD4 SMSYTWTGALITPCACD8 AAALRAFTEAMTRYS |
| NS4B | (Balb/c)CD4 IQYLAGLSTLPGNPACD8 FWAKHMWNFISGIWY |
对内源加工抗原的识别
为确定采用HCV多蛋白进行的PMID免疫是否诱导了可识别内源加工抗原的应答，在ELISPOT测定中采用经由可表达NS3-5的牛痘重组病毒感染的目标细胞作为刺激物。结果显示在采用500、510、520和530免疫后通过ELISPOT检测到了好的IL2和IFNγ应答(图14)。
采用HCV多蛋白免疫诱导了功能性CTL活性。
采用仅编码NS3、HCV500、510和520的0.01μg DNA使C57BL小鼠免疫。在基础接种和单次加强接种后，采用NS3 CD8肽和IL2再次体外刺激各组脾细胞5天。针对经由相同肽刺激的EL4细胞测定CTL活性。在该试验中，经由所有构建体免疫的小鼠表现出相似的杀伤水平。
这说明采用HCV多蛋白进行PMID免疫接种可诱导功能性CD8应答。结果如图15所示。
实施例6，HCV抗原借助于双重启动子构建体的送递
双重启动子构建体是利用下述方法制备的。借助于单一限制性内切核酸酶位点ClaI和XmnI，将携带了表达盒1(包括Iowa-长CMV启动子、外显子1、编码被关注蛋白/融合蛋白的基因，外加兔球蛋白聚腺苷酸信号)的片段从其宿主载体，即p7313ie中切除。XmnI在被切除片段的3′末端生成了钝端。
受体质粒载体为含有表达盒2的p7313ie。该载体通过下述步骤制备，即采用单一限制性内切核酸酶Sse8387I消化，随后采用T4 DNA聚合酶温育，除去产生的3′突出端，从而在线型分子的5′和3′末端均生成钝端。采用单一限制性内切核酸酶ClaI切割，除去一个长为259bp的片段。
表达盒1借助于ClaI/钝性匹配末端被克隆进p7313ie/表达盒2中，生成p7313ie/表达盒1+表达盒2，其中表达盒1在表达盒2的上游。
生成了含有如图所示部分的p7313ie质粒
脚注：
箭头＝人类巨细胞病毒IE基因启动子(HCMV IE)
NS4B＝含有氨基酸49-260的截短NS4B---如上所述。
核心＝含有氨基酸1-191的核心蛋白。
如上所示的构建体组是完整的，并已通过蛋白质印迹法观察了它们在293T细胞中因瞬时转染产生的表达。蛋白质印迹分析的结果如图16所示：泳道检索：
1.p7313ie/核心 8.p7313ie/核心NS3+NS4B5B
2.p7313ie/NS3 9.p7313ie/NS4B5B+核心NS3
3.p7313ie/NS5B 10.p7313ie/NS3核心+NS4B5B
4.p7313ie/核心NS3 11.p7313ie/NS4B5B+NS3
5.p7313ie/NS4B5B 12.p7313ie/核心+NS34B5B
6.p7313ie/NS3核心 13.p7313ie/NS34B5B+核心
7.p7313ie/NS34B5B
每对构建体携带有两个独立的表达盒。表达盒被***载体时的次序将对各表达盒的表达产生何种影响尚未知。但这些结果指出了在NS4B5B或NS34B5B融合蛋白各自的表达盒位于核心、NS3核心或核心NS3表达盒下游时，对二者表达显著的不利情况。
表达水平比单一抗原构建体情况时的表达水平低，但某些降低被认为是由于大小的显著增加(175-228％)造成的，转而在DNA量相同的情况下，被送递至细胞的质粒拷贝数降低约50％。
由双重启动子构建体诱发的体内免疫原性
选择三种表达全部4种抗原的水平均最高的双重启动子构建体进行免疫原性研究。这些构建体为p7313ie NS4B/NS5B+核心/NS3、p7313ieNS4B/NS5B+NS3核心和p7313ie NS3/NS4B/NS5B+核心。采用1μg DNA通过PMID使C57BL小鼠免疫，并在7天后利用ELISPOT检测IL2，测定小鼠对显性NS3 CD8 T细胞表位的应答。结果(如图17所示)显示在单次免疫接种后(采用CD4和CD8 NS3 T细胞特异性肽刺激脾细胞)，可观测到对全部3种双重启动子构建体的应答。
实施例7，核心的缺失突变
通过逐次缺失，每次从3′末端缺失一个跨度为20个氨基酸的区域，生成大量编码核心ORF的基因，并对其完整测序。
| 核心组成 | 命名 |
| 15-1911-1911-1711-1511-1311-1111-911-711-51 | 核心Δ15核心191核心171核心151核心131核心111核心91核心71核心51 |
图18为DNA琼脂糖凝胶，显示了编码核心各片段的基因范围。通过293T细胞中的共同转染，检验了这些构建体的表达，以及它们对NS4B5B融合(p7313ie/NS4B5B)表达水平的影响。结果如图19所示。加有样品的泳道如下：
| 泳道 | 所加样品(均含0.5μg DNA) | |
| 1 | p7313ie/NS4B5B | p7313ie |
| 2 | p7313ie/NS4B5B | 核心191 |
| 3 | p7313ie/NS4B5B | 核心Δ15 |
| 4 | p7313ie/NS4B5B | 核心171 |
| 5 | p7313ie/NS4B5B | 核心151 |
| 6 | p7313ie/NS4B5B | 核心131 |
| 7 | p7313ie/NS4B5B | 核心111 |
| 8 | p7313ie/NS4B5B | 核心91 |
| 9 | p7313ie/NS4B5B | 核心71 |
| 10 | p7313ie/NS4B5B | 核心51 |
在采用抗-NS5B检测NS4B5B的表达后，采用抗核心探测蛋白质印迹时，清晰检测到核心191、核心Δ15、核心171、核心151和核心131的表达。未检测到其它截短形态的核心，可能是所用凝胶***在尺寸捕捉方面的限制性造成的。
结果证实在核心191和Δ15的存在条件下，NS4B5B的表达水平显著降低，该表达水平在采用核心171时恢复，采用核心151时也恢复，尽管两种核心种类均强表达。该观测结果在采用NS4B5B时被重复2次，采用NS3和NS5B时被重复1次。
实施例8，核心和核心151对NS3、NS5B、NS4B-NS5B融合和NS3-NS4B-NS5B三融合体的表达的影响
实验1反式表达
进行实验，观察核心反式表达或被编码在分离质粒上时，核心191和核心151二者的表达分别对非结构抗原表达的影响。实验流程与实施例7所描述流程相同。简言之，利用Lipofectamine 2000转染试剂，按照标准流程(Invitrogen/Life Technologies)，将下表所示的两种DNA质粒载体各0.5μg共同转染进HEK293T细胞中。(转染和蛋白质印迹法如实施例4所描述内容进行)
结果如图20所示，泳道所加样品如下表所示，并利用抗-NS3和抗-NS5B抗血清，进行蛋白质印迹分析，主要检测非结构蛋白的表达，通过采用抗核心作为二级探针探测相同的印迹，检测核心的表达。
| 泳道 | 非结构元件 | 核心元件 |
| 1 | NS3 | 空载体 |
| 2 | NS3 | 核心191 |
| 3 | NS3 | 核心151 |
| 4 | NS5B | 空载体 |
| 5 | NS5B | 核心191 |
| 6 | NS5B | 核心151 |
| 7 | NS4B-NS5B | 空载体 |
| 8 | NS4B-NS5B | 核心191 |
| 9 | NS4B-NS5B | 核心151 |
| 10 | NS3-NS4B-NS5B | 空载体 |
| 11 | NS3-NS4B-NS5B | 核心191 |
| 12 | NS3-NS4B-NS5B | 核心151 |
在所有情况中，当非结构蛋白或融合(NS3、NS5B、NS4B-5B)与核心151一起以反式生成时，相比较其与核心191一起反式表达时的表达水平，前一种情况中非结构蛋白或融合的量被证实显著增加了。
实验2-顺式表达
进行实验，观察核心以顺式表达，或者被编码在与非结构元件融合的相同质粒上时，核心191和核心151的表达分别对非结构抗原表达的影响。各情况中，在与特定非结构区融合的羧基末端中，核心191被替代为核心151。
利用Lipofectamine 2000转染试剂，按照标准流程(Invitrogen/LifeTechnologies)，将1μg下表所示的DNA质粒载体转染进HEK293T细胞中。(转染和蛋白质印迹法如实施例4所描述内容进行)
结果如图21所示。利用抗-NS3和抗-NS5B抗血清，在凝胶A中，进行蛋白质印迹分析，主要检测非结构元件的表达，采用抗核心作为二级探针，对相同印迹进行探测，检测核心的表达。加有样品的泳道如下表所示：
| 泳道 | 非结构元件 | 核心元件 |
| 1 | - | 核心191 |
| 3 | NS5B | - |
| 4 | NS3 | 核心191 |
| 5 | NS3 | 核心151 |
| 6 | NS5B | 核心191 |
| 7 | NS5B | 核心151 |
| 8 | NS4B-NS5B | 核心191 |
| 9 | NS4B-NS5B | 核心151 |
| 10 | NS3-NS4B-NS5B(HCV 510) | 核心191 |
| 11 | NS3-NS4B-NS5B(HCV 510c) | 核心151 |
结果表明在抗原均为多蛋白融合形式的顺式结构中，核心的截短提高了融合蛋白的表达。
核心191和核心151二者对NS3所引发免疫应答的影响的比较
分2次通过PMID，每次采用1.5ug总DNA，使C57BL小鼠免疫。经免疫的实验组包括空载体p7313ie本身，采用p7313ieNS3、p7313ieNS5B和p7313ie核心191或p7313ieNS3、p7313ieNS5B和p7313ie核心151共同包被的金珠。所采用的共同包被应将所有质粒送递至相同细胞，可模拟上述体外共转染研究。利用胞内细胞因子染色，测定IFNγ和IL2抗原特异性应答，以确定基础免疫接种后14天，对NS3来源的显性CD8和CD4 T细胞表位的免疫应答。结果(如图22所示)显示在核心151存在条件下，CD4和CD8 NS3应答比核心191存在条件下约高2倍。
在另一个实验中，采用经由可表达p7313ieNS3/NS4B/NS5B三融合体的质粒和核心191或核心151共同包被的金珠使C57BL小鼠免疫。进一步采用相同构建体对动物加强接种，并利用胞内细胞因子染色测定应答，在加强接种后7天观察对NS3的应答。结果如图23所示，显示在核心151存在条件下，NS3抗原特异性CD4和CD8应答比核心191存在条件下约高2倍。
总而言之，比较了核心存在条件下对NS3的应答的体内研究支持了体外表达数据，即FL核心和非结构蛋白的共同送递可降低非结构抗原的表达，并降低构建体的免疫原性。采用已除去C末端40个氨基酸的截短核心进行共同包被，则可以至少部分地克服该影响。
Claims (15)
1.一种包含编码HCV核心蛋白的多核苷酸序列和编码至少一种其它HCV蛋白的多核苷酸序列的多核苷酸疫苗，其中所述疫苗导致相同细胞内的蛋白表达，并且编码核心蛋白的多核苷酸序列的序列进行了突变或相对于编码至少一种其它HCV蛋白的多核苷酸序列进行定位，使得减少了核心蛋白表达对所述至少一种其它HCV蛋白表达的负面影响。
2.权利要求1的多核苷酸疫苗，其中的多核苷酸编码核心蛋白，该核心蛋白的羧基末端被截短，截短量足以降低核心对其它HCV蛋白表达的抑制作用。
3.权利要求2的多核苷酸疫苗，其中多核苷酸编码正常HCV感染过程中第二次天然存在的切割后的成熟形式的HCV核心。
4.权利要求2的多核苷酸疫苗，其中的截短核心蛋白缺失了C-末端至少10个氨基酸。
5.权利要求2的多核苷酸疫苗，其中的截短核心蛋白由核心1-151序列构成。
6.权利要求1的多核苷酸疫苗，其中的HCV蛋白由一种以上表达盒中的多核苷酸编码。
7.权利要求6的多核苷酸疫苗，其中编码核心蛋白的表达盒位于编码至少一种其它HCV蛋白的表达盒下游的顺式位置。
8.权利要求7的多核苷酸疫苗，其中编码核心蛋白的表达盒位于编码NS5B蛋白的表达盒下游。
9.权利要求1的多核苷酸疫苗，其中至少一种其它HCV蛋白包括HCV蛋白：NS3，NS4B和NS5B。
10.权利要求9的多核苷酸疫苗，其中多核苷酸不编码其它HCV蛋白。
11.权利要求1-10中任意一项的多核苷酸疫苗，其中的DNA序列为质粒形式。
12.权利要求1-11中任意一项的多核苷酸疫苗，其中的多核苷酸被密码子优化，用于在哺乳动物细胞中表达。
13.一种预防或治疗哺乳动物中HCV感染的方法，包括对哺乳动物施用权利要求1-12中任意一项的疫苗。
14.一种对个体免疫接种的方法，包括采用权利要求1-12中任意一项的多核苷酸疫苗，将该多核苷酸包被在金珠上，并将金珠送递进皮肤内。
15.权利要求1-12中任意一项的多核苷酸疫苗在制造用于治疗HCV的药物中的用途。
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