发明详述
这里引用的专利申请、专利和文献表明了那些本领域内具有普通技术的人员具备的知识,在这里以其整体引用作为参考。如果任何这里引用的参考与本发明公开的内容中某些特别的说明不一致,则以本发明公开的内容为准。
提供以下的详述以及相伴的实施例,目的是描述和解释本发明的某些优选实施方案,而并不是以任何方式意图限制本发明的范畴。除非有所说明,这里使用的所有技术和科学术语与本发明所属的领域内具有普通技术的人员通常理解的含义是相同的。
在详细解释本发明之前,先给出此后将要用到的某些术语的定义,对于本发明的理解可能是有所帮助的。
定义
“治疗”的意思是任何医学上的病症任何程度的减轻或者缓解,包括但是不要求疾病的完全治愈。
“预防”的意思是对疾病的发生进行防御或者保护,即其功能是预防用的。
“病症”的意思是任何疾病、功能障碍、综合征、身体不适、疼痛或者上述的组合。病症还包括由于任何疾病、功能障碍、综合征、身体不适、疼痛或者上述的组合引起的任何并发症。
“受治对象”的意思是任何哺乳动物,特别是人。
“接触”的意思是任何方式的给药,给药的结果是组合物和正在被接触的目标物(例如玻璃体、房水等等)之间的相互作用。组合物和被接触的目标物之间的相互作用可以在组合物给药的基本上同时出现,相互作用一段延续的时间,从给药时开始,或者从组合物给药的时间向后推迟。
“组合物”的意思是一种或者多种物质的联合或者混合。
“物质”的意思是具有质量且占据空间的东西。
“外源物质”的意思是任何由内科医生、临床医生、兽医或者研究者确定为对受治对象有害或者有毒的物质,和/或一般情况下在健康哺乳动物眼中不会找到的物质。
“眼科学上可以接受的载体”是一种物质,另一种物质(例如TPCD)可以与该物质组合在一起,而不会使第二种物质不适于(由内科医生、临床医生、兽医或者研究者确定)在受治对象的眼中使用。眼科学上可以接受的载体的非限制性实例包括平衡盐溶液(BBS)和BBS-PLUS。
“药学上可以接受的载体”包括,但不限于水、缓冲盐溶液、多聚醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)或者是这些物质适当的混合物。药学上可以接受的载体的其他实例和制备这些载体的方法和配方可以在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(第20版,A.Gennaro(ed.),Lippincott,Williams & Wilkins,2000)中找到。
“有效量”是指引起人或者其他哺乳动物眼中产生反应的物质或者组合物的量,所述的反应是研究者、兽医、内科医生或其他临床医生所努力获得的。
“诱导”是指引起或者促进所需结果的出现。
“降低”是指下降到任何程度。
“对眼的毒性作用”是指任何被研究者、兽医、内科医生或其他临床医生确定为对受治对象有害的对眼不利的影响。
“玻璃体”是指玻璃液,也指玻璃体,它占据了眼内晶状体和视网膜之间的空间。
“TPCD”是“包含纤溶酶催化结构域的截短的纤溶酶蛋白”的同义词。一个“截短的纤溶酶蛋白”的意思是任何通过缺失一个或者多个Val79-纤溶酶(即人纤溶酶原的79-791号氨基酸)中的氨基酸产生的纤溶酶蛋白,其中产生的蛋白具有丝氨酸蛋白酶的催化活性。这种氨基酸的缺失可以是位于SEQ ID NO:10所示的79-791号氨基酸的N末端(产生由例如SEQ ID NO:10中的444-791、543-791或562-791号氨基酸组成的TPCD)和/或C末端和/或内部的任意位置。应当理解如果来源于SEQ ID NO:10的截短的蛋白是以无酶学活性的形式制备出来的,则必须使用一种纤溶酶原活化剂将其转化为该截短的蛋白相应的活性形式。例如,如果一个由SEQ ID NO:10的543-791号氨基酸组成的蛋白质通过重组制备,很有可能该蛋白质不会以其具有酶学活性的形式出现。因此,需要使用纤溶酶原活化剂处理该蛋白,在Arg561和Val562之间的肽键进行切割以活化该蛋白。非限制性的TPCD的实例包括小纤溶酶、重组小纤溶酶、稳定化的小纤溶酶,稳定化的重组小纤溶酶、小纤溶酶变异体、微纤溶酶、重组微纤溶酶、稳定化的微纤溶酶、稳定化的重组微纤溶酶以及微纤溶酶变异体,其中微纤溶酶和小纤溶酶的变异体包括一个纤溶酶的催化结构域。
“纤溶酶蛋白”是指任何根据人纤溶酶原氨基酸序列(SEQ IDNO:10)制备的蛋白质或者来源于人纤溶酶原、在其Arg561和Val562之间的肽键处切断的蛋白质。可以使用纤溶酶原活化剂完成Arg561和Val562之间肽键的切割。非限制性的纤溶酶蛋白实例包括Lys-纤溶酶、小纤溶酶和微纤溶酶。
“纤溶酶的催化结构域”是指一段来自SEQ ID NO:10(人纤溶酶原)中543-791号氨基酸的氨基酸序列,长度约为130-240个氨基酸,包括纤溶酶的催化三元体,即His603、Asp646和Ser741,其中的氨基酸序列具有丝氨酸蛋白酶的活性。
“修饰的纤溶酶催化结构域”是指通过添加和/或缺失和/或替换一个或者多个氨基酸改变氨基酸序列从而对纤溶酶的催化结构域进行修饰。当然应当理解,对应于纤溶酶催化三元体的氨基酸,即His603、Asp646和Ser741是不被改变的。修饰会使蛋白质的类纤溶酶催化活性增加、降低或者不发生改变。例如,对微纤溶酶和小纤溶酶的催化结构域进行修饰可能使这些蛋白质的催化活性增加、降低或者不改变。
“修饰的TPCD”是指含有修饰的纤溶酶催化结构域的TPCD,其中的TPCD具有类纤溶酶的丝氨酸蛋白酶催化活性。
“另一药剂”是指任何可以自身使用或者与TPCD联合使用的物质,用于治疗或者预防受治对象的眼部病症或者眼部病症并发症。优选地,辅助药剂不妨碍TPCD的催化活性。
“稳定蛋白质”是指通过使用一种或者多种稳定剂保护蛋白质不发生降解和/或失活。
尽管可以在实践中或者检测本发明时使用与那些在这里描述的方法和材料相似或者等价的方法和材料,以下仍然描述优选的方法和材料。
药理玻璃体溶解术是一种方法,它使用一种或者多种蛋白质的和/或化学的和/或核酸的药剂治疗或预防受治对象眼部的病症或者病症并发症。本发明提供一些药理玻璃体溶解的方法,使用至少一种包含催化结构域(TPCD)的截短的纤溶酶蛋白。特别地,本发明提供一些方法,通过使玻璃体和/或房水与有效量的包含TPCD的组合物接触,治疗或者预防受治对象的眼部病症或者眼部病症并发症。这些方法产生不限于以下的结果,使玻璃体液化、诱导后玻璃体脱离、消除或者减少玻璃体和/或房水的出血,从玻璃体和/或房水减少或清除眼内外源物质,增加向玻璃体和/或房水给服的药剂或者组合物的扩散、减少视网膜外的新血管生成以及以上的任意组合。这些方法可以作为玻璃体切除术的辅助使用或者在没有玻璃体切除术时使用。
因此,第一方面,本发明提供治疗或者预防受治对象的眼部病症或者眼部病症并发症的方法,该方法包含使玻璃体和/或房水与有效量的包含TPCD的组合物接触。在一个实施方案中,一种TPCD的分子量小于大约40000道尔顿。在另一个实施方案中,一种TPCD在还原形式下的分子量是大约26500道尔顿,非还原形式下是29000道尔顿。在另一个实施方案中,一种TPCD的分子量在约20000到30000道尔顿之间。在另一个实施方案中,TPCD的分子量小于约20000道尔顿。
第二方面,本发明提供了治疗或者预防受治对象的眼部病症或者眼部病症并发症的方法,该方法包含使玻璃体和/或房水与有效量的包含至少两种TPCD的组合物接触。
第三方面,本发明提供了治疗或者预防受治对象的眼部病症或者眼部病症并发症的方法,该方法包含使玻璃体和/或房水与有效量的包含至少一个TPCD的第一种组合物和有效量的包含至少一种TPCD的第二种组合物接触。在本发明该方面的一个实施方案中,包含至少一种TPCD的第一种组合物和包含至少一种TPCD的第二种组合物,它们含有的TPCD是相同的TPCD。在本发明该方面的另一个实施方案中,包含至少一种TPCD的第一种组合物和包含至少一种TPCD的第二种组合物,它们含有的TPCD是不同的TPCD。在本发明该方面的另一个实施方案中,第一种和第二种组合物可以基本上同时或者在不同时刻给服受治对象。
第四方面,本发明提供了治疗或者预防受治对象的眼部病症或者眼部病症并发症的方法,该方法包含使玻璃体和/或房水与有效量的包含至少一种TPCD和至少一种另一药剂的组合物接触。在本发明的该方面中,另一药剂不意味着是TPCD。
第五方面,本发明提供了治疗或者预防受治对象的眼部病症或者眼部病症并发症的方法,该方法包含使玻璃体和/或房水与有效量的包含至少一种另一药剂的组合物接触之前、同时或者之后,使玻璃体和/或房水与有效量的包含至少一种TPCD的组合物接触。
第六方面,本发明提供了一种使玻璃体液化的方法,它包含使玻璃体和/或房水与有效量的包含至少一种TPCD的组合物接触。在本发明该方面的一个实施方案中,玻璃体的液化降低了玻璃体房水的粘度。在本发明的其他实施方案中,玻璃体的液化提高了从玻璃体腔和/或房水中清除血液、沉积物质、外源物质和/或对眼睛特别是对视网膜有害的物质的速率。在本发明该方面的另一个实施方案中,玻璃体的液化降低了视网膜外新血管的发生。在本发明该方面的另一个实施方案中,玻璃体的液化增加了施用给玻璃体或者房水的药剂或组合物的扩散。在本发明该方面的另一个实施方案中,玻璃体的液化在标准玻璃体切除术或使用25号手术刀(或者更小)进行的玻璃体切除术中有助于玻璃体的去除。
第七方面,本发明提供了一种诱导后玻璃体脱离的方法,该方法包含使玻璃体和/或房水与有效量的包含至少一种TPCD的组合物接触。
在以上描述的本发明的第一到第七方面中的任何一项中,使用包含TPCD的组合物与玻璃体和/或房水接触的步骤可以作为玻璃体切除术的辅助或者在没有玻璃体切除术时进行。
第八方面,本发明提供了进行玻璃体切除术的方法,它包含以下步骤:使玻璃体和/或房水与包含至少一种TPCD的组合物接触。接触步骤可以在玻璃体切除术进行的同时或者之前进行。
第九方面,本发明提供了包含至少两种TPCD的组合物。
第十方面,本发明提供了包含至少一种TPCD和至少一种另一药剂的组合物。
在本发明所有方面的一个实施方案中,TPCD选自由以下各项组成的组:小纤溶酶、重组小纤溶酶、稳定化小纤溶酶,稳定化的重组小纤溶酶、小纤溶酶变异体、微纤溶酶、重组微纤溶酶、稳定化的微纤溶酶、稳定化的重组微纤溶酶、微纤溶酶变异体以及以上的任何组合。在本发明所有方面的另一个实施方案中,治疗或者预防眼部病症或者眼部病症并发症的方法以及实施玻璃体切除术的方法,其结果是通过达到以下结果中的一个或者更多缓解眼部病症:降低玻璃体的粘度;使玻璃体液化;诱导后玻璃体脱离;从玻璃体、玻璃体腔和/或房水中清除或者减少出血;从玻璃体、玻璃体腔和/或房水中清除或者减少眼内外源物质或对视网膜有毒的物质;提高注射到玻璃体和/或房水中的药剂或组合物的扩散;或者减少视网膜的新血管生成。在本发明所有方面的另一个实施方案中,试图治疗或者预防的眼部病症或者眼部病症并发症选自由以下疾病组成的组:视网膜脱离、视网膜破裂、玻璃体出血、糖尿病性玻璃体出血、增殖性糖尿病性视网膜病、非增殖性糖尿病性视网膜病、与衰老有关的黄斑变性、黄斑破洞、玻璃体黄斑牵引、黄斑皱褶、黄斑渗出物、囊状黄斑点水肿、纤维蛋白沉积、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、视网膜下出血、弱视、眼内炎、早产儿视网膜病变、青光眼、视网膜色素变性以及以上任意的组合。
TPCD包括任何含有纤溶酶催化结构域的截短的纤溶酶蛋白。截短的纤溶酶蛋白包括任何通过缺失Val79-纤溶酶(即人纤溶酶原79-791号氨基酸)的一个或者多个氨基酸而得到的纤溶酶蛋白,其中得到的蛋白具有丝氨酸蛋白酶催化活性。因此,所有的TPCD都必须含有纤溶酶丝氨酸蛋白酶结构域的催化三元体,即His603,Asp646和Ser741。可以通过缺失SEQ ID NO:10(人纤溶酶原)的79-791号氨基酸中的一个或者多个氨基酸对Val79-纤溶酶进行截短的。这种缺失可以是位于SEQ ID NO:10所示的79-791号氨基酸的N末端、C末端或内部的任意位置。应当理解如果SEQ ID NO:10的79-791号氨基酸截短的后的蛋白是以无酶学活性的形式制备出来的,则必须使用一种纤溶酶原活化剂将其转化为该截短的蛋白相应的活性形式,它才能被认为是TPCD。纤溶酶原活化剂切割Arg561和Val562之间的肽键,这样就活化蛋白质。在一个实施方案中,TPCD包含主要由SEQ ID NO:10中444-791号氨基酸组成的蛋白。在另一个实施方案中,TPCD包括由人纤溶酶原的444-791号氨基酸经过一个或者多个氨基酸缺失后得到的蛋白,其中该所得蛋白具有丝氨酸蛋白酶催化活性。在另一个实施方案中,TPCD包含主要由SEQ ID NO:10中543-791号氨基酸组成的蛋白。在另一个实施方案中,TPCD包括由人纤溶酶原的543-791号氨基酸经过一个或者多个氨基酸缺失后得到的蛋白,其中产生的蛋白具有丝氨酸蛋白酶催化活性。在另一个实施方案中,TPCD包含主要由SEQ ID NO:10中562-791号氨基酸组成的蛋白。在另一个实施方案中,TPCD包括由人纤溶酶原的562-791号氨基酸经过一个或者多个氨基酸缺失后得到的蛋白,其中产生的蛋白具有丝氨酸蛋白酶催化活性。缺失可以分别在SEQ ID NO:10(人纤溶酶原)的444-791号氨基酸、543-791号氨基酸以及562-791号氨基酸的N端、C端或者内部的位置。在一个蛋白中进行氨基酸缺失对于本领域内具有普通技术的人员是众所周知的(例如Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel et al.(eds.),John Wiley & Sons,2001;和Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版,Sambrook和Russell,2000)。TPCD的催化活性可以使用显色底物S2403(Chromogenix,安特卫普,比利时)(参见实施例2)、任何其他显色底物,测定TPCD的酰胺水解活性来确定,或者通过本领域内已知的其他方法来确定。
本发明还包括了修饰的TPCD的应用。修饰的TPCD是具有纤溶酶催化结构域的修饰形式的TPCD,其中经修饰的TPCD具有类纤溶酶的丝氨酸蛋白酶催化活性。对于催化结构域的修饰包括在纤溶酶催化结构域中氨基酸的***和/或缺失和/或替代。但是,与纤溶酶丝氨酸蛋白酶结构域的催化三元体相对应的氨基酸,即组氨酸603、天冬氨酸646和丝氨酸741,没有改变。优选地,催化结构域的修饰涉及一个或者更多的保守氨基酸替代,这些氨基酸不属于催化三元体。保守氨基酸替代和制备这种保守氨基酸替代的方法对于本领域内具有普通技术的人员是众所周知的(例如Current Protocols in Molecular Biology,同上,John Wiley & Sons,2001;和Molecular Cloning:ALaboratory Manual,同上)。这些修饰可以提高、降低原来结构域的催化活性或者不使其发生变化。TPCD的催化活性可以使用显色底物S2403(Chromogenix,安特卫普,比利时)(参见实施例2)测定TPCD的酰胺水解活性来确定,或者通过本领域内已知的其他方法来确定。
TPCD包括,但是不止限于,小纤溶酶、重组小纤溶酶、稳定化的小纤溶酶,稳定化的重组小纤溶酶、小纤溶酶变异体、微纤溶酶、重组微纤溶酶、稳定化的微纤溶酶、稳定化的重组微纤溶酶以及微纤溶酶变异体。微纤溶酶和小纤溶酶变异体包括微纤溶酶和小纤溶酶的缩短形式,它们可以通过从这些蛋白质中缺失氨基酸来制备。所有的微纤溶酶和小纤溶酶变异体预计都具有丝氨酸蛋白酶催化活性,即使它们不具有分别与微纤溶酶和小纤溶酶相同水平的催化活性。因此所有的微纤溶酶和小纤溶酶变异体都需要含有SEQ ID NO:10中的603-741号氨基酸,这些氨基酸中含有纤溶酶丝氨酸蛋白酶结构域的催化三元体,即人纤溶酶原的His603、Asp646和Ser741。在一个实施方案中小纤溶酶的变异体包括的蛋白质含有一个或者多个氨基酸缺失的人纤溶酶原444-791号氨基酸,其中所得到的蛋白质具有丝氨酸蛋白酶催化活性。在另一个实施方案中,微纤溶酶的变异体包括的蛋白质含有一个或者多个氨基酸缺失的人纤溶酶原543-791号氨基酸,其中经缺失得到的蛋白质具有丝氨酸蛋白酶催化活性。在另一个实施方案中,微纤溶酶的变异体包括的蛋白质是含有一个或者多个氨基酸缺失的人纤溶酶原562-791号氨基酸,其中所得到的蛋白质具有丝氨酸蛋白酶催化活性。缺失可以分别出现在SEQ ID NO:10的444-791号、543-791号以及562-791号氨基酸的N端、C端或者一个内部位置;但是所有的微纤溶酶和小纤溶酶变异体都需要含有SEQ ID NO:10中的603-741号氨基酸。微纤溶酶和小纤溶酶变异体还包括,但是不止限于这些蛋白中的氨基酸***和/或替代。预计微纤溶酶或者小纤溶酶中的氨基酸替代优选是保守替代。可以通过重组方法制备任何微纤溶酶和小纤溶酶变异体或者其他TPCD,并且使用一种纤溶酶原活化剂将其活化为活性的纤溶酶形式。或者可以通过本领域内众所周知的其他方法,例如但是不止限于,使用弹性蛋白酶消化人纤溶酶原或者对纤溶酶、微纤溶酶和小纤溶酶进行部分还原和烷基化,来制备微纤溶酶和小纤溶酶变异体或者其他TPCD。可以使用显色底物S2403或者其他显色底物来检测这些微纤溶酶和小纤溶酶变异体,或者相关的任何TPCD的丝氨酸蛋白酶催化活性。此外,还可以检测微纤溶酶和小纤溶酶变异体或者任何其他TPCD诱导PVD的能力和/或使玻璃体液化的能力,这可以通过将溶解于平衡盐溶液中的不同剂量的变异体注射到猪、猫或者死亡以后的人眼中来实现。如果在这些眼中的任何一个中,某种TPCD能够诱导PVD和/或使玻璃体液化,则认为该TPCD在治疗哺乳动物的眼部病症方面是有用的。优选地,该TPCD不会导致对接受注射的眼的毒性。表1提供了微纤溶酶变异体的非限制性实例。
表1
微纤溶酶变异体的非限制性实例
以下列举的微纤溶酶变异体的实例对应于人纤溶酶原的氨基酸序列和编号,人纤溶酶原由氨基酸1-791组成(参见图1 SEQ ID NO:10)
542-741,542-742,542-743,542-744,542-745,542-746,542-747,542-748,542-749,
542-750,542-751,542-752,542-753,542-754,542-755,542-756,542-757,542-758,
542-759,542-760,542-761,542-762,542-763,542-764,542-765,542-766,542-767,
542-768,542-769,542-770,542-771,542-772,542-773,542-774,542-775,542-776,
542-777,542-778,542-779,542-780,542-781,542-782,542-783,542-784,542-785,
542-786,542-787,542-788,542-789,542-790,542-791;
543-741,543-742,543-743,543-744,543-745,543-746,543-747,543-748,543-749,
543-750,543-751,543-752,543-753,543-754,543-755,543-756,543-757,543-758,
543-759,543-760,543-761,543-762,543-763,543-764,543-765,543-766,543-767,
543-768,543-769,543-770,543-771,543-772,543-773,543-774,543-775,543-776,
543-777,543-778,543-779,543-780,543-781,543-782,543-783,543-784,543-785,
543-786,543-787,543-788,543-789,543-790,543-791;
544-741,544-742,544-743,544-744,544-745,544-746,544-747,544-748,544-749,
544-750,544-751,544-752,544-753,544-754,544-755,544-756,544-757,544-758,
544-759,544-760,544-761,544-762,544-763,544-764,544-765,544-766,544-767,
544-768,544-769,544-770,544-771,544-772,544-773,544-774,544-775,544-776,
544-777,544-778,544-779,544-780,544-781,544-782,544-783,544-784,544-785,
544-786,544-787,544-788,544-789,544-790,544-791;
545-741,545-742,545-743,545-744,545-745,545-746,545-747,545-748,545-749,
545-750,545-751,545-752,545-753,545-754,545-755,545-756,545-757,545-758,
545-759,545-760,545-761,545-762,545-763,545-764,545-765,545-766,545-767,
545-768,545-769,545-770,545-771,545-772,545-773,545-774,545-775,545-776,
545-777,545-778,545-779,545-780,545-781,545-782,545-783,545-784,545-785,
545-786,545-787,545-788,545-789,545-790,545-791;
546-741,546-742,546-743,546-744,546-745,546-746,546-747,546-748,546-749,
546-750,546-751,546-752,546-753,546-754,546-755,546-756,546-757,546-758,
546-759,546-760,546-761,546-762,546-763,546-764,546-765,546-766,546-767,
546-768,546-769,546-770,546-771,546-772,546-773,546-774,546-775,546-776,
546-777,546-778,546-779,546-780,546-781,546-782,546-783,546-784,546-785,
546-786,546-787,546-788,546-789,546-790,546-791;
547-741,547-742,547-743,547-744,547-745,547-746,547-747,547-748,547-749,
547-750,547-751,547-752,547-753,547-754,547-755,547-756,547-757,547-758,
547-759,547-760,547-761,547-762,547-763,547-764,547-765,547-766,547-767,
547-768,547-769,547-770,547-771,547-772,547-773,547-774,547-775,547-776,
547-777,547-778,547-779,547-780,547-781,547-782,547-783,547-784,547-785,
547-786,547-787,547-788,547-789,547-790,547-791;
548-741,548-742,548-743,548-744,548-745,548-746,548-747,548-748,548-749,
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602-786,602-787,602-788,602-789,602-790,602-791
使用纤溶酶原活化剂,例如,但不止限于,链激酶、葡激酶、组织型纤溶酶原活化剂或者尿激酶活化小纤溶酶原和微纤溶酶原而产生小纤溶酶和微纤溶酶。小纤溶酶原和微纤溶酶原来自于纤溶酶原,后者是一条单链的糖蛋白,是哺乳动物血液的重要组分。人纤溶酶原是791个残基组成的多结构域蛋白质(SEQ ID NO:10),由N端活化前结构域、5个同源的Kringle结构域(每个大约80氨基酸)、一个丝氨酸蛋白酶催化结构域和结构域间的连接序列组成。纤溶酶或者纤溶酶原活化剂切割人纤溶酶原N端Arg68-Met69,或Lys77-Lys78或Lys78-Val79之间的肽键,产生缩短的酶原,称为Lys-纤溶酶原(例如,由69-791或78-791或79-791号氨基酸组成的蛋白质)。由弹性蛋白酶进一步切割除去前4个Kringle结构域,产生另一个酶原,小纤溶酶原(通常是442-791号氨基酸)。进一步切掉第五个Kringle,得到微纤溶酶原(通常是543-791号氨基酸)。纤溶酶原的Kringle区含有赖氨酸结合位点,它们介导纤溶酶原与底物如纤维蛋白的特异性结合。在Arg561和Val562之间的肽键进行切割,使纤溶酶原的酶原形式活化为它们具有酶活性的形式,产生与相应蛋白质的由二硫键连接的双链形式。纤溶酶原蛋白活化的产物被称为纤溶酶。因此,Lys-纤溶酶原活化后的产物称为Lys-纤溶酶,而小纤溶酶原和微纤溶酶原活化后的产物被分别称为小纤溶酶和微纤溶酶。未糖基化的Lys-纤溶酶分子量大约为65000,完全糖基化的Lys-纤溶酶分子量大约为83000道尔顿;而小纤溶酶的分子量约为38000道尔顿,微纤溶酶的分子量约为26500道尔顿(还原形式)以及29000道尔顿(非还原形式)。同纤溶酶一样,小纤溶酶和微纤溶酶具有催化活性。与纤溶酶相比,小纤溶酶和微纤溶酶的优势在于它们的形状比纤溶酶小。因此预计在玻璃液内小纤溶酶和微纤溶酶都比纤溶酶的扩散速率快(Xu,J.et al.,Pharmaceutical Research 17:664-669,2000)。
在一个实施方案中,TPCD的分子量为小于约40000道尔顿。在另一个实施方案中,TPCD的分子量为约20000道尔顿到约30000道尔顿之间。在另一个实施方案中,TPCD的分子量为约26500道尔顿(还原形式)和约29000道尔顿(非还原形式)。在另一个实施方案中,TPCD的分子量为小于约20000道尔顿。
如美国专利4774087所述,可以在pH范围在9.5到11.5的高度碱性溶液中使纤溶酶和纤溶酶原发生自身水解反应来制备微纤溶酶。或者可以如PCT申请WO 02/50290中所述,用重组方法制备微纤溶酶和小纤溶酶。简而言之,编码微纤溶酶原和小纤溶酶原的DNA被分别克隆到酵母表达载体(例如pPICZα,一个来自Invitrogen的分泌型表达载体)中,用于在甲基营养酵母(例如汉逊酵母、毕赤酵母、假丝酵母和球拟酵母)中表达这些蛋白。挑选产生最高微纤溶酶和小纤溶酶活性蛋白的酵母克隆用于大规模生产。可以在任何规模培养这些克隆,但是通常是约20升到约500升的规模。分泌出的微纤溶酶原和小纤溶酶原经过含三个步骤的过程纯化:阳离子离子交换扩展床层析、疏水层析和亲和层析。通过该过程获得的纯化的微纤溶酶原和小纤溶酶原使用摩尔比例的纤溶酶原活化剂(例如尿激酶、链激酶、葡激酶、SY162葡激酶变异体等)进行活化。应当注意的是生产微纤溶酶和小纤溶酶的重组过程可以扩展用于制备任何TPCD。与使用自体纤溶酶相比,使用重组TPCD的优势在于重组蛋白可以从大批生产制备,得到的酶具有一致的活性。因为这些蛋白具有一致的活性,所以可以实施标准化的实验方案。另一个优势是这些蛋白可以随时获得,而没有与从每个患者身上分离和纯化纤溶酶的耽搁以及其他相伴问题。
通过以上描述的过程得到的TPCD可以进行浓缩、稳定化和/或冻干。浓缩蛋白质的方法对于本领域内具有普通技术的人员是众所周知的(参见例如Protein Purification Methods:A Practical Approach,Harris,E.L.V和Angal,S.(eds.),IRL Press,1989;A Guideto Protein Isolation(第二版),Clive Dennison,Kluwer AcademicPublications,2003;和Protein Methods(第二版),Daniel M.Bollag,Michael D.Rozycki,Stuart J.Edelstein(eds.),Wiley,1996)。
稳定化是保护蛋白质不发生降解和/或失活的一种方法,通过使用一种或者多种稳定剂(例如使TPCD与稳定剂接触或者在稳定剂存在的情况下纯化TPCD)达到这些目的。稳定剂包括,但不限于,氨甲环酸、己酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、谷胺酰胺、丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、多元醇、药物上可以接受的糖、葡萄糖胺、硫胺素、烟酰胺、任何包含柠檬酸、乙酸、盐酸、羧酸、乳酸、苹果酸、酒石酸或者苯甲酸的酸性缓冲液、以及盐例如氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙的盐,以及任何以上物质的衍生物或组合。与自体纤溶酶相比,使用稳定化的、重组产生的TPCD的一个优点是这些蛋白比自体纤溶酶稳定得多,自体纤溶酶通过收集血液获得,其纯化、制备和储存是一个患者一个患者分开进行的。自体纤溶酶在制备之后需要尽快使用,与此不同的是,稳定化的重组TPCD可以在纯化之后相当长的时间内使用。
可以在纯化的蛋白浓缩之后或者在稳定化后立即冻干本发明的TPCD。冻干蛋白质的方法对于本领域内具有普通技术的人员是众所周知的。冻干的TPCD可以以任意量储存在小瓶(例如玻璃瓶)中,但优选是可以方便迅速重溶使用的量。
冻干的微纤溶酶、小纤溶酶或任何其他TPCD可以在用于与玻璃体和/或房水接触之前,重溶于一种眼科学可以接受的载体中。在一个实施方案中眼科学可以接受的载体是一种无菌溶剂,它的pH和渗透压与受治对象玻璃液的pH和渗透压相匹配。眼科学可以接受的载体的非限制性实例有等渗盐溶液、平衡盐溶液(BSS)和BSS PLUS。平衡盐溶液通常含有:0.64%氯化钠,0.075%氯化钾,0.048%无水氯化钙,0.03%六水氯化镁,0.39%三水乙酸钠,0.17%二水柠檬酸钠,用氢化钠/盐酸调节pH,和水。
使用包含TPCD的组合物与玻璃体和/或房水接触的方法取决于特定的受治对象、被治疗的病情的严重性以及为达到治疗的效果所需的剂量,并且可以由内科医生根据每个患者的情况分别确定。任何接触玻璃体和/或房水的方法,只要向玻璃体和/或房水提供了有效量的TPCD,就可以使用。应该理解这种与玻璃体和/或房水的接触不需要与给服包含TPCD的组合物同时进行。接触可以被延迟或者甚至在给药之后相当长一段时间内进行。一种接触玻璃体和/或房水的方法是进行一次或者多次眼内注射,直接分别注射进入玻璃体和/或房水内。还可以通过结膜下、肌肉内或者静脉内注射的方式接触玻璃体和/或房水。可以使用一种包含TPCD的液体溶液,根据本领域内众所周知的步骤提供这些注射中的任意一种。但是也可以使用任何其他适宜的方法用TPCD接触玻璃体和/或房水,使用这些方法使TPCD向玻璃体和/或房水内充分分配,以治疗或者预防受治对象眼部病症或者病症并发症。还可以在玻璃体内植入特定的装置给服包含TPCD的组合物,这些装置包括但是不止限于OCUSERT(Alza Corp.,Palo Alto,Calif.)和VITRASERT(Bausch and Lomb,Inc.,Rochester,N.Y.)。本发明还涉及使用储备库、持续释放制剂或者任何可植入的装置连续不断地供应TPCD,使玻璃体和/或房水接触TPCD。
本领域内具有普通技术的人员可以很容易地确定TPCD的用药剂量,剂量根据患者和所要取得的效果有所不同。TPCD可以以任何达到合意治疗效果的剂量使用,治疗效果包括但是不止限于玻璃体液化、后玻璃体脱离、和/或从玻璃体腔中清除血液、毒性物质或者外源物质,而不会对眼部(特别是视网膜)或者相关的解剖结构产生显著的毒性。此外,可以以单一剂量或者多剂量给服TPCD。通常的TPCD剂量是每只眼约0.005毫克到0.2毫克。如果进行注射,给药的体积是每只眼约0.05毫升到约0.3毫升含有TPCD的无菌溶剂(例如无菌的BSS或BSS PLUS)。在那些要进行玻璃体切除术的实例中,在切除玻璃体之前,使TPCD留在玻璃体和/或房水中约15到120分钟。在本发明的一个实施方案中,每只眼0.125毫克剂量的TPCD用0.1毫升无菌的BSS或BSS PLUS输送。在另一个实施方案中,在玻璃体切除术之前约15到120分钟,每只眼0.125毫克剂量的TPCD用0.1毫升无菌的BSS或BSS PLUS输送。
本发明还涉及使用包含一种以上TPCD的组合物。因此,在本发明的一个方面,用包含第一种TPCD和第二种TPCD的组合物与玻璃体和/或房水接触。在本发明该方面的一个特别实施方案中,第一和第二种TPCD选自由以下物质组成的组:小纤溶酶、重组小纤溶酶、稳定化的小纤溶酶,稳定化的重组小纤溶酶、小纤溶酶变异体、微纤溶酶、重组微纤溶酶、稳定化的微纤溶酶、稳定化的重组微纤溶酶、微纤溶酶变异体以及任何以上的组合。在本发明的另一个方面,使用包含至少一种TPCD的第一种组合物与包含至少一种TPCD的第二种组合物与玻璃体和/或房水接触。TPCD可以是相同或者不同的,给药可以基本上同时进行或者在不同时刻进行。此外,也可以通过还包含至少一种另一药剂的组合物给服TPCD。而且,可以先使用包含至少一种TPCD的组合物,再使用包含至少一种另一药剂的组合物与玻璃体和/或房水接触;或者反过来进行。当对每种组合物所需的时间不同时,即当与另一种组合物相比,一种组合物起作用需要更多的时间,这样做可能就有必要了。另一药剂是在治疗或预防眼部病症或者眼部病症并发症中有用的任何蛋白质(但不是TPCD)、化学物质或者其他物质。这种另一药剂在美国专利4,820,516;5,292,509;5,866,120;6,051,698;6,462,071;6,596,725;和6,610,292中有所描述。在本发明中可以使用的另一药剂的非限制性实例包括葡萄糖胺聚糖酶,例如透明质酸酶、软骨素酶ABC、软骨素酶AC、软骨素酶B、软骨素4-硫酸酯酶、软骨素6-硫酸酯酶和B-葡萄糖苷酸酶;胶原酶、分散酶;含有RGD的肽,例如RGD,GRGDS,GRGDTP,蝮蝰血抑环肽和Falvoridin;抗粘合素抗体;P2Y受体拮抗剂;尿素、羟基脲、硫脲和抗血管生成药剂例如,但是不止限于,血管上皮生长因子(VEGF)抑制剂(例如抗VEGF抗体、VEGF适体、可溶性VEGF受体等等)以及胎盘生长因子(P1GF)抑制剂(例如抗P1GF抗体、P1GF适体、可溶性VEGF受体等等)。这些另一药剂中大部分自身就能够促进玻璃体的液化和/或诱导后玻璃体脱离。抗血管生成的辅助药剂对于阻止眼内新血管生成可能是有用的。缺氧视网膜表达VEGF和/或P1GF被认为导致了视网膜外血管新生的发展。因此,抑制VEGF和/或P1GF将有效阻止新血管生成。
包含TPCD的组合物有助于玻璃体的液化和/或玻璃体从视网膜和其他组织(例如视网膜前膜、视黄斑)上脱离。玻璃体液化和/或玻璃体脱离的结果是玻璃体在视网膜和其他组织上的牵引力被大大减小,并且玻璃体内液体的自然循环代谢速率提高。因此,包含TPCD的组合物对于治疗和预防眼部疾病是非常适宜的,具有病症疾病的眼睛受益于玻璃体液化、后玻璃体脱离、视网膜外新血管生成的降低和/或毒素或其他有害物质(例如,血管生成因子、水肿液体、出血的血液等)从眼后室和/或邻近眼后室的组织(如视网膜或者黄斑)中加速清除。这样的眼部病症包括,但是不止限于,视网膜脱离、视网膜破裂、玻璃体出血、糖尿病性玻璃体出血、增殖性糖尿病性视网膜病、非增殖性糖尿病性视网膜病、与衰老有关的黄斑变性、黄斑破洞、玻璃体黄斑牵引、黄斑皱褶、黄斑渗出物、囊状黄斑点水肿、纤维蛋白沉积、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、视网膜下出血、弱视、眼内炎、早产儿视网膜病变、青光眼和视网膜色素变性,以及其他临床症状对TPCD给药有反应的疾病。本发明设想了对眼部病症的治疗,这包含使玻璃体与包含TPCD的组合物接触。预计这种接触会使玻璃体液化和/或诱导后玻璃体脱离和/或清除玻璃体腔内的血液或其他有毒物质和/或降低视网膜外新血管生成,这样使病症得到预防和治疗。
本发明还针对预防或者抑制眼部多种不同病症的发作的方法,这些病症由于玻璃体粘附在视网膜上以及玻璃体收缩而产生或加剧。在一个实施方案中,本发明的方法能够预防或者抑制受治对象眼部病症或者病症导致的并发症,而无需从眼中去掉玻璃体。特别地,本发明针对治疗具有增殖性病症或者具有发生增殖性病症风险的患者(这样的患者包括,但是不止限于,糖尿患者)的过程,通过诱导后玻璃体脱离作为预防的步骤,预防或者延缓与玻璃体收缩有关或者与玻璃体内新血管生成有关的病症的发作。在本发明的一个实施方案中,向糖尿患者的眼中引入该组合物,以抑制糖尿病性视网膜病的发展。优选地,在增殖性病症出现以前向眼内引入组合物。在一个实施方案中,在增殖性疾病发作以前向眼内引入组合物,并且使组合物在眼内永久保留而不用从眼中去除玻璃体。在其他实施方案中,本发明针对抑制中央和分支视网膜静脉阻塞并发症的方法,这些并发症有视网膜新血管生成和黄斑水肿,该方法是通过诱导患者产生后玻璃体脱离实现的,作用的对象是需要进行这种治疗的患者。本发明提供了通过诱导后玻璃体脱离治疗即将出现的黄斑破洞或者全层皮黄斑破洞(不论是先天的还是外伤的)的方法。可以在由于玻璃体收缩导致的视网膜脱离、视网膜破裂和视网膜出血出现之前,诱导后玻璃体脱离,从而阻止或者降低这些疾病的发病,而无需从眼中去除玻璃体。
许多眼科疾病出现的原因都有血-视网膜不稳定化。这一不稳定使脉络膜毛细血管的多种不同组分(例如血清组分,脂类、蛋白质)进入到玻璃室内,破坏视网膜表面。这一不稳定还是玻璃室血管浸润的先兆,该现象被称为新血管生成。玻璃体的新血管生成取决与玻璃体的基质。因此,玻璃体的液化以聚合玻璃液的形式除去了基质,阻碍了新血管生成。在一个实施方案中,本发明提供了治疗和预防眼部病症的方法,该方法包含使玻璃体与包含TPCD的组合物接触从而阻止或者降低视网膜新血管生成的发病。
许多眼科学疾病,包括糖尿病性视网膜病和眼外伤导致视网膜血管破裂或渗漏,结果导致向玻璃体内流血(即玻璃体出血)。玻璃体出血通常表现为玻璃体混浊或者不透明,有时但不是总是伴随视网膜的破裂和剥离。当出现伴随有视网膜破裂或剥离的玻璃体出血时,迅速诊断并且手术修复这种视网膜破裂或剥离是很重要的。如果没有迅速诊断并且手术修复视网膜破裂或剥离,会导致破裂或剥离区域的视网膜感光细胞出现坏死。视网膜感光细胞的坏死会导致失明。此外,如果视网膜脱离在如此长的时间内没有进行修复则可能会导致出血位置发生进一步的玻璃体出血和/或纤维组织的形成。纤维组织会在玻璃体和视网膜之间形成不良的永久性的粘附。在没有任何治疗的情况下,玻璃体的出血性混浊需要6-12个月的时间才能有效清除而使得能够透过玻璃体观察视网膜。在这种情况下,当内科医生需要修复患者视网膜表面的任何部分或者需要观察视网膜表面时,这些操作都被玻璃体的混浊或者不透明所阻碍,这时可能需要进行玻璃体切除术这样一种微型手术步骤。该步骤包括用微型手术刀去除玻璃体的全部或者部分,并用清澈的液体或者其他物质代替玻璃体,这些物质使眼部空洞保持其形状。标准的玻璃体切除术手术步骤对本领域内具有普通技术的人员是众所周知的。在一个实施方案中,本发明涉及使玻璃体与包含至少一种TPCD的组合物接触,作为玻璃体切除术的辅助。在其他实施方案中,在没有实施玻璃体切除术的情况下,使玻璃体与包含至少一种TPCD的组合物接触。
还使用了以下的实施例进一步举例说明了本发明,这些实施例不应该被理解为本发明范畴或精神限制于实施例中描述的特异步骤。相反,应该清除地认识到,本领域的技术人员在阅读了这里的描述之后,在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求的范畴的条件下,可能需要寻求多种其他的实施方案、改动或者它们的等价物。
实施例1
在巴斯德毕氏酵母(Pichia pastoris)中表达人微纤溶酶原和人小纤溶酶原的载体构建
(a)pPICZαA载体
pPICZαA载体购自Invitrogen Corporation(Carlsbad,Calif.),用于重组人微纤溶酶原和人小纤溶酶原在巴斯德毕氏酵母中的直接表达和分泌。该载体的显著性质包括:(i)含有乙醇氧化酶1(AOX1)启动子的942bp的片段,其使得在毕氏酵母中重组蛋白的高水平表达可以被甲醇诱导,而且目标质粒整合到AOX1的染色体基因座上;(ii)来自AOX1基因的天然转录终止和多聚腺苷酸信号;(iii)使大肠杆菌和巴斯德毕氏酵母具有zeocin抗性的表达盒子;(iv)Co1E1复制起点,用于质粒在大肠杆菌内的扩增和维持;(v)c-myc表位和多聚组氨酸(6×His)标签,这可以用于蛋白质的检测和纯化;以及(vi)唯一的限制性酶切位点(例如Sac I,Pme I,BstXI),这可以使载体在AOXI基因座处线性化,而有效地整合进入毕氏酵母的基因组。
除了以上的特点外,该载体还含有啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)的分泌信号α-因子前多肽原,使表达出的异源蛋白分泌到培养基中。在pPICZα中对α因子交配信号序列的加工通过两个步骤进行:
1.由KEX2基因产物对信号序列进行初次切割,切割位置在序列Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala的精氨酸和谷胺酰胺之间,其中*表示了切割的位置。但是Glu-Ala重复对于Kex2的切割不总是必需的。
2.用STE13基因产物进一步切除Glu-Ala重复。在某些情况下当Ste13的切割效率低时,则Glu-Ala重复就留在被表达的目标蛋白的氨基端。
在pPICZαA载体中紧靠α因子信号序列的下游用基因工程的手段加入了多克隆位点,具有EcoR I,Sfi I,Kpn I,Xho I,Sac II andXba I的识别位点,有助于外源基因的克隆。除了多克隆位点中的XhoI位点外,在α因子分泌信号的羧基端也有一个XhoI识别位点,该位点紧靠Lys-Arg Kex2切割位点的上游。该XhoI限制位点可以用于克隆目标基因,使其恰好位于Kex2的切割位点,这可以通过PCR克隆方法和适当的正向引物,使XhoI位点直至精氨酸密码子部分的序列重新正确形成。这样表达出的重组目标蛋白就具有天然的氨基端了。
(b)微纤溶酶原的表达载体构建
编码人微纤溶酶原的核酸序列(SEQ ID NO:4的543-791号氨基酸)从Fmyc-μPli载体(Lasters et al.Eur.J.Biochem.244:946,1997)中扩增出来(PCR回收),使用来自Clontech(Palo Alto,Calif.)的Advantage cDNA聚合酶混合物。在DNA模板在94摄氏度变性3分钟后,进行30次以下的热循环:94摄氏度30秒,50摄氏度30秒,72摄氏度30秒,然后是最终的延伸步骤72摄氏度2分钟。在该反应中使用以下的寡核苷酸引物LY-MPLG1(有义引物)和LY-MPLG2(反义引物):
(SEQ ID NO:1)
LY-MPLG1:5′GGGGTATCT
CTC GAG AAA AGA GCC CCT TCA TTT GATTG
(SEQ ID NO:2)
LY-MPLG2:5′GTTTTTGT
TCT AGA TTA ATT ATT TCT CAT CAC TCCCTC
LY-MPLG1引物的退火区域对应于人纤溶酶原的543-548号残基(Ala-Pro-Ser-Phe-Asp-Cys),它的前面是非退火区的延伸,包括α因子交配信号序列的最后4个残基(Leu-Glu-Lys Arg)。在该延伸中,Leu-Glu密码子确定了XhoI限制位点(带有下划线的),使目的基因的克隆恰好位于Kex2切割位点处。LY-MPLG2引物的退火区域对应于纤溶酶原的最后7个残基,之后是TAA终止密码子和包含XbaI识别序列(带有下划线的)的非退火区域。
具有预期大小(约780bp)的扩增片段用XhoI和XbaI酶切,定向克隆到载体pPICZαA中。受体载体片段也使用XhoI和XbaI酶切,并用琼脂糖凝胶纯化,使用Qiaquick gel提取试剂盒(Qiagen GmbH,Germany)。用连接混合物转化大肠杆菌菌株TG1(DSMZ收集品#1208,德国),筛选zeocin抗性克隆。根据限制性酶切分析结果,保留含有预期大小***片段的质粒进行进一步鉴定。使用引物5′AOX和3′AOX对载体pPICZα-MPLG1(克隆#5)进行序列测定,两个引物是Invitrogen Corporation(Carlsbad,Calif.)的EasySelect Pichia表达试剂盒提供的,测序结果确证了微纤溶酶原编码区的准确***,与α因子交配信号融合,编码区没有不需要的突变。
所用的人微纤溶酶原经测序确定的核苷酸序列和由其导出的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4。与以前由
Forsgren et al.FEBS Lett.213:254,1987确定的序列相比,本核苷酸序列有10个位置不同。但是氨基酸序列是相同的。
(c)小纤溶酶原的表达载体构建
如下所述构建衍生自pPICZα的分泌载体,用于小纤溶酶原的表达,使用以上描述的pPICZα-MPLG1载体。
编码小纤溶酶原Kringle 5和部分催化结构域(SEQ ID NO:10的444到604号氨基酸)的500bpDNA片段从FdTet-SN-miniPlg载体(Lasters et al.,引用见上)中扩增出来(PCR回收)。DNA模板在94摄氏度变性3分钟后,进行30次以下的热循环:94摄氏度10秒,50摄氏度10秒,72摄氏度15秒,然后是最终的延伸步骤72摄氏度2分钟。在该反应中使用以下的寡核苷酸引物LY-MINPLG1(有义引物)和LY-MLNPLG2(反义引物):
LY-MINPLG1:5′GGGGTATCT
CTC GAG AAA AGA GCA CCT CCG CCTGTT GTC CTG CTT CC(SEQ ID NO:5)
LY-MLNPLG2:5′GCA GTG GG
C TGC AGT CAA CAC CCA CTC(SEQ IDNO:6)
LY-MINPLG1引物的退火区域对应于纤溶酶原的444-452号残基(Ala-Pro-Pro-Pro-Val-Val-Leu-Leu-Pro),它的前面是非退火区的延伸,包括α交配信号因子的最后4个残基(Leu-Glu-Lys Arg)。在该延伸中,Leu-Glu密码子确定了XhoI限制位点(带有下划线的),使目的基因的克隆恰好位于Kex2切割位点处。
LY-MINPLG2引物的退火区域对应于人纤溶酶原的596-604号残基(Glu-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-His-Cys)。催化结构域的退化区域,也出现在微纤溶酶原表达载体中,包含唯一的Pst I识别序列(带有下划线的)。
具有预期大小的扩增片段用XhoI和PstI酶切,且定向克隆到衍生自pPICZα-MPLG1(上述)的受体载体片段中。受体载体片段也使用XhoI和PstI酶切,用琼脂糖凝胶纯化,使用Qiaquick gel提取试剂盒(Qiagen GmbH,德国)。用连接混合物转化大肠杆菌菌株TG1(DSMZ收集品#1208,德国),筛选zeocin抗性克隆。根据限制性酶切分析结果,保留含有预期大小***片段的质粒进行进一步鉴定。使用引物5′AOX和3′AOX对载体pPICZα-KMPLG1(克隆#3)进行序列测定,测序结果确证了扩增片段的准确***,与α因子交配信号融合,克隆区域也没有任何突变。
EXAMPLE 2
实施例2
制备重组、稳定化的微纤溶酶的方法
(a)用pPICZα-MPLG1转化毕氏酵母
用Pme I消化10微克的载体pPICZα-MPLG1,在5′AOX1区域使载体线性化。将DNA沉淀,在无菌蒸馏水中浓缩至大约0.33微克每微升。
用5微升转化按照EasySelect Pichia表达试剂盒制备的感受态巴斯德毕氏酵母X33细胞。
(b)高表达菌株的筛选
如下进行高表达菌株的筛选。在YPDSZ平板(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,2%葡萄糖,1M山梨醇,2%琼脂,100微克每毫升zeocin)上筛选zeocin抗性转化子。将34个单菌落接种在10毫升的BMYZ-甘油培养基(1%酵母提取物,2%胰蛋白胨,1%甘油,100mM磷酸钾,pH6.0,1.34%酵母氮基础,4×10-5%生物素,100微克每毫升zeocin)中,在50毫升Falcon试管中培养,30摄氏度培养16小时。沉淀细胞,用2毫升BMYZ-甲醇培养基(与BMYZ-甘油培养基相同,但是用0.5%甲醇代替甘油)重悬,诱导AOX1启动子表达,并培养40小时。在这期间补充4次0.5%的甲醇(6,22,26和30小时之后)。在诱导结束时,根据Lijnen et al.Eur.J.Biochem.120:149,1981的描述检查培养物上清中微纤溶酶原的存在。简而言之,纯的或者10倍稀释的上清与尿激酶共同孵育30分钟,以使微纤溶酶原活化为微纤溶酶。在不同时刻由显色底物S2403(来自Chromogenix,安特卫普,比利时)确定产生的纤溶酶的酰胺水解活性,测得的纤溶酶活性与已知量的纯化的纤溶酶或微纤溶酶制品的活性相比。克隆X33-MPLG1#5在尿激酶活化之后显示出最高的微纤溶酶活性,选择该克隆进行接下来的大规模生产。根据布达佩斯协议的规定,将该克隆保存于比利时微生物协调保藏中心(BCCM-MUCL-COLLECTION),保存日期为2001年12月12日,登录编号为MUCL 43676。
(c)发酵
X33-MPLG1#5的50升规模发酵如下分4步进行。两升摇瓶细胞培养物在400毫升YSG+培养基(6g/l酵母提取物,5g/l of大豆蛋白胨,20g/l甘油)中,30摄氏度下培养23小时,使用0.7毫升接种物(细胞库冻存管编号甘油OOC17),270rpm振荡,(在预培养步骤结束时)OD600达到15。然后在30升的MRP80发酵装置中进行发酵,使用30升基础培养基(26.7ml/l H3PO4 85%,1.05g/l CaSO4.2H2O,18.2g/l K2SO4,14.9g/l MgSO4.7H2O,4.13g/l KOH,40g/l 100%甘油以及4.76ml/l PTM1盐溶液[包含6g/l CuSO4.5H2O,0.08g/l NaI,3.36g/l MnSO4.H2O,0.2g/l NaMoO4.2H2O,0.02g/l硼酸,0.82g/l CoCl2.6H2O,20g/l ZnCl2,65g/l FeSO4.7H2O,0.2g/l d-生物素和5ml/l HSSO4]),使用600毫升接种物于30摄氏度,以大气压下50升每分钟气流,溶解氧(DO)>20%,200-500rpm振荡,用12.5%氨水维持pH在5.8。在24小时以及OD600达到50时(批步骤结束),溶解氧的迅速增加表明甘油耗尽。补充甘油(632g/l甘油100%和12ml/l PTM1)使24小时的OD600达到258。然后开始补充甲醇,在6小时内将通气速率提高至250ml/l,使用988ml/l甲醇和12ml/l PTM1维持66小时,在培养结束时OD600达到352。使用X33-MPLG1#5进行350升规模的发酵得到成比例的相似结果。
(d)纯化
然后使用包含离子交换扩展床层析、疏水层析和亲和层析三个步骤的程序纯化收获物,如下:
i)离子交换扩展床层析
使用装在Streamline 200层析柱(Pharmacia Biotechnology目录号18-1100-22)中的Streamline SP(从PharmaciaBiotechnology获得,目录号17-0993-01/02)进行离子交换扩展床吸附层析,装柱床体积为5120立方厘米,用向上流动的方式加入两倍柱床体积的1M NaCl,25mM乙酸钠(CH3COONa.3H2O)缓冲液,pH6.0,进行扩展和平衡,然后是1倍柱床体积的25mM乙酸钠缓冲液,pH6.0。发酵培养物用水在线稀释7倍,向上流动至扩展的柱床内,流速为1000毫升每分钟。用向上流动的乙酸钠缓冲液pH6.0洗掉松散结合的物质,然后将柱接头降低到沉降柱床的表面,高度为16.3厘米。将流向逆转,被柱结合的蛋白由两体积的0.5M NaCl,25mM乙酸钠缓冲液pH6.0洗脱。向洗脱的Streamline级分中加入固体硫酸铵,达到30%饱和(每升洗脱的Streamline级分加入164克硫酸铵),且混合物在4-8摄氏度轻轻搅拌1小时。
ii)疏水层析
使用装在Vantage 180/500层析柱(从Millipore获得,目录号87018001)中的Hexyl TSK 650C(从Toso-Haas获得,目录号19027)于4-8摄氏度进行疏水层析,装柱床体积为2700立方厘米。将Streamline的洗脱级分上样于该层析柱上,流速为38升每小时。然后使用1.5倍柱体积的含有164g/l硫酸铵的25mM乙酸钠缓冲液pH6.0洗柱,且用7倍柱体积的25mM乙酸钠缓冲液pH6.0洗脱。
iii)亲和层析
使用装在Vantage 130/500层析柱(从Millipore获得,目录号87013001)中的Blue Sepharose 6 Fast Flow (从PharmaciaBiotechnology获得,目录号17-0948-02/03)于4-8摄氏度进行亲和层析,装柱床体积为3,186立方厘米。洗脱级分上样于亲和层析柱上,流速为20升每小时,用1柱体积的25mM磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)缓冲液pH7.0洗柱。用5倍柱体积0.5M氯化钠,25mM磷酸氢二钠缓冲液pH7.0从柱上洗脱微纤溶酶原蛋白级分,将其在-20摄氏度冷冻保存。由SDS凝胶电泳证明该物质的纯度大于98%。
(e)微纤溶酶的定量活化和稳定化
i)定量活化
微纤溶酶原到微纤溶酶的活化在23摄氏度下进行30分钟,使用0.5%摩尔比例的葡激酶变异体SY162,于0.5M氯化钠、25mM磷酸氢二钠Na2HPO4.12H2O缓冲液中,pH7.0。SY162是葡激酶的变异体,与野生型相比,免疫原性降低,包含12个氨基酸替代(K35A,E65Q,K74R,E80A,D82A,T90A,E99D,T101S,E108A,K109A,K130T和K135R),这在WO 99/40198中有所描述。在微纤溶酶中加入固体硫酸铵至终浓度为1M(132g/l),在4-8摄氏度搅拌混合物15分钟。
ii)疏水层析
使用装在BPG 100/500层析柱(从Pharmacia Biotechnology获得,目录号18-1103-01)中的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (从Pharmacia Biotechnology获得,目录号17-0965-03/05)于4-8摄氏度进行疏水层析,装柱床体积为1,738立方厘米。用4倍柱床体积的25mM磷酸氢二钠缓冲液pH7.0〔含有0.1M的稳定剂氨甲环酸(从Bournonville Pharma获得,Braine-L′Alleud,比利时)和1M硫酸铵pH7.0〕。将活化的微纤溶酶上样于层析柱上,线性流速为18升每小时。然后使用4.5倍柱体积的含有0.1M稳定剂氨甲环酸和1M硫酸铵的25mM磷酸氢二钠缓冲液pH7.0洗柱。使用5倍柱体积的含有0.1M稳定剂氨甲环酸和0.7M硫酸铵的25mM磷酸氢二钠缓冲液pH7.0将纤溶酶从柱上洗脱下来,线性流速为6升每小时,并用含有0.1M氨甲环酸的磷酸缓冲液pH7.0平衡。用含0.1M氨甲环酸的25mM的Na2HPO4.12H2O缓冲液,pH7.0从柱上洗脱葡激酶变异体SY162。特异性ELISA证明,该步骤从微纤溶酶洗脱峰中除去了99%以上的葡激酶。
iii)通过切向流超滤进行浓缩和渗滤
在这个步骤中,将步骤(ii)的洗脱液浓缩,并将缓冲液交换为低pH的柠檬酸缓冲液。在本步骤中将步骤(ii)的氨甲环酸除去,并用低pH的柠檬酸缓冲液使微纤溶酶稳定。
使用2 Pellicon 2 Biomax膜(5kDa,2.5微米,从Millipore获得,Bedford,Massachusetts,目录号P2B005A25)在2-8摄氏度进行超滤。将膜装到与Microgon Pump Cart System(来自Microgon,Laguna Hills,Calif.)相连的Pellicon 2 Process支架上。用纯水洗膜,并在操作前检查膜的完整性。用0.5M氢氧化钠连续循环60分钟,再用0.1M氢氧化钠连续循环60分钟对膜进行清洁。该清洁步骤深入清洁了滤膜,在上样前除去了任何残留在膜上的微量蛋白。然后使用5mM柠檬酸pH3.1润洗膜,直至超滤透过物的pH达到3.1。Phenyl Sepharose洗脱液的pH调节至3.1,并通过超滤将蛋白浓缩至4毫克每毫升。对5倍体积的5mM柠檬酸pH3.1进行渗滤60-90分钟。在50升发酵装置中的三次操作分别得到的产量(用克表示)总结于表2。
表2
操作1 操作2 操作3
发酵罐 220 240 ND
Streamline 50 79 130
Hexyl 36 37 ND
Blue 25 28 30
Phenyl 17 20 26
渗滤 - - 22
(图注:ND:未确定)
iv)无菌过滤(0.2微米)
进行这个步骤以保证没有微生物的污染。
在2-8摄氏度加入甘露醇至浓度为1.5克每克蛋白,在23摄氏度下,在Millipak 100滤膜(500厘米大小,从Millipore获得,目录号MPGL10CA3)上进行无菌过滤,然后用大约500毫升的5mM柠檬酸pH3.1润洗,蠕动泵的流速是500毫升每分钟。用无菌和无热源的袋子收集过滤产物,将其保存于-20摄氏度下。
实施例3
制备重组、稳定化的小纤溶酶的方法
在20微升的反应体系内用PmeI酶消化约15微克的载体pPICZα-KMPLG1,在5′AOX1区域内使载体线性化。线性的DNA(3微克)用于转化感受态的巴斯德毕氏酵母X33细胞,感受态细胞根据EasySelect Pichia表达试剂盒提供的方法制备。
高表达菌株的筛选基本上如下进行。在YPDSZ平板(在实施例2中详细说明的)上筛选Zeocin抗性转化子。50个分离出的克隆接种于15毫升BMYZ甘油培养基(如实施例2中详细说明的),在50毫升的Falcon管中于30摄氏度培养16小时。将细胞沉淀,重悬于1.5毫升BMYZ甲醇培养基(如实施例2中详细说明的)中,以诱导自AOX1
启动子的表达,并培养40小时。在这个过程中定期补充3或4次0.5%的甲醇。在诱导培养结束时,根据Lijnen et al.(同上引用)描述的方法检查小纤溶酶原在培养物上清中的存在。简而言之,将含有小纤溶酶原的上清稀释10倍,加链激酶孵育10分钟,使纤溶酶原形成有活性的复合物。产生的小纤溶酶活性,由显色底物S2403(参见实施例2)在不同时刻测定,与已知量的纯化的纤溶酶原制备物的活性相比较。在这些条件下,所有检测的克隆产生的小纤溶酶原产量在3到15毫克每升之间。两个克隆X33-KMPLG1 #6和X33-KMPLG1 #25,显示了最高的纤溶酶活性,选择它们用于接下来的大规模生产。这两个克隆根据布达佩斯协议,与2003年12月4日保存与比利时微生物协调保藏中心(BCCM-MUCL-COLLECTION),登录编号分别为MUCL 45309(克隆X33-KMPLG1 #6)和登录号MUCL 45308(克隆X33-KMPLG1 #25)。
实施例4
新型固定方法
通过本实验建立一种可靠的固定技术,以研究培养基和不同的药剂对于正常猪眼中后玻璃体脱离(PVD)的作用。
从屠宰场得到的新鲜分离的猪眼或者立即进行操作或者在室温放置直至6小时。除去角膜以有助于固定。在0摄氏度,Peter′s溶液(含有1.25%戊二醛/1%多聚甲醛的0.08M甲次砷酸盐缓冲液pH7.4)中使眼固定24到36小时,以终止酶反应。然后用0.1M甲次砷酸盐缓冲液pH7.4洗眼,并以逐步升高至100%的乙醇浓度,使眼逐步脱水。
新鲜处理的眼和室温放置6小时的眼没有出现视网膜超微结构的显著改变,且玻璃体仍然粘附在视网膜表面上。因此,本方法提供了一种非损伤性的眼组织固定步骤,并且使玻璃体从视网膜表面上脱离的可能性降到最小。而且通过这个方法可以对从视神经到视网膜外周的整个视网膜表面进行研究。
实施例5
微纤溶酶对死亡后猪眼玻璃体视网膜接触面的作用
进行本实验以确定微纤溶酶使后玻璃体皮质从视网膜表面的内界膜上脱离的能力。
使用以下剂量的微纤溶酶:0.0625,0.125,0.156,0.25和0.390毫克,分别溶于0.1毫升眼内冲洗溶液BSS PLUS。这些微纤溶酶溶液的pH从0.0625毫克剂量的7.92到0.390毫克剂量的6.52。
在室温(24摄氏度)下将以上公开的微纤溶酶溶液分别注射到新鲜宰杀的猪的玻璃液中。在微纤溶酶注射后的15、30、60或120分钟后根据实施例4中的描述固定猪眼。使用0.0625毫克微纤溶酶处理1小时后即观察到后玻璃体脱离(PVD),而对于0.125毫克微纤溶酶及以上所有剂量,30分钟处理后即可见到PVD。在注射后120左右这种剥离现象在除了靠近玻璃体基底(从视网膜外周延伸到锯齿缘的区带,这里与玻璃体的粘附最强)以外的所有视网膜切片中最为明显(图4,A)。除了后玻璃体脱离(图4,B-E)以外,电子显微镜检查显示玻璃体的结构被改变,纤维结构减少。纤维结构被改变为更为无定形的、毛玻璃状,显示玻璃液的液化(图4,F)。
大体检查或者组织病理检查,包括电子显微镜检查没有发现低于0.25毫克的剂量导致任何眼部或者视网膜毒性。特别的是,没有发现自溶的迹象。细胞空泡的形成通常认为是自溶的早期迹象,而低于0.390毫克的剂量没有观察到空泡形成。我们还通过电子显微镜检查了其他的眼部结构(图5,A和B)。低于0.390毫克的剂量没有观察到视网膜的结构改变。但是在一些使用0.25毫克微纤溶酶处理的眼中,在视网膜表面上稀疏地分布着视网膜隆肿和少量的炎性细胞。对最高剂量(0.390毫克)微纤溶酶处理的眼进行大体组织学检查,显示视网膜接触面呈现白色。对此眼用电子显微镜观察显示视网膜表面有许多小的隆肿,这提示局部的视网膜脱离。
这些实验显示0.06到0.2毫克剂量的微纤溶酶产生稳定的后玻璃体分离,而没有诱导视网膜出现任何超微结构的变化。后玻璃体分离不仅仅出现在视神经处,而且在玻璃体基底全部出现。后玻璃体分离的结果是清澈光滑的视网膜表面,使用高倍电子显微镜扫描(放大12000倍)没有观察到其上有任何胶原纤维的粘附。12000倍的放大倍数已经足以排除未发现的纤维的可能性。
实施例6
人死后眼的后玻璃体脱离
进行本实验以确定微纤溶酶是否能够有效地诱导人眼中玻璃体视网膜的分离。
方法
(a)剂量以及人死后眼的处理
从慕尼黑眼库获得26只没有已知眼病的人眼球。这些眼球是13个年龄在34到69岁的捐献者捐献的,眼球获得的时间在他们死亡之后19小时以内。使用14毫米直径的环钻去掉角膜后,在潮湿的孵育室内37摄氏度下孵育15分钟。向13只眼的玻璃体腔内注射0.2毫升微纤溶酶。特别地,用4毫升、2毫升或1.5毫升的眼内冲洗溶液BSSPLUS将1.25毫克的微纤溶酶分别稀释至0.3125毫克每毫升、0.625毫克每毫升和0.9375毫克每毫升。将0.2毫升的这些溶液注射到玻璃体腔内,使眼中的微纤溶酶量分别达到62.5微克、125微克和188微克。另外13只对应的眼作为对照,注射0.2毫升的平衡盐溶液(BSSPLUS)。
在13只使用微纤溶酶处理的眼中,9只眼仅使用玻璃体内微纤溶酶注射处理。62.5微克剂量的微纤溶酶(pH7.4)注射到两只眼的玻璃体腔中;125微克剂量的微纤溶酶(pH7.2)注射到五只眼的玻璃体腔中;188微克剂量的微纤溶酶(pH7.2)注射到两只眼中。余下的4只眼中,两只使用62.5微克的微纤溶酶和0.6毫升的六氟化硫(SF6)处理,另两只使用125微克的微纤溶酶和0.6毫升的六氟化硫(SF6)处理。使用SF6进行额外处理的原因是以前有报导说纤溶酶只在与玻璃体切除术或者气体注射共同使用时才诱导PVD。以上讨论的剂量和处理总结于表3。
表3
眼的数目 |
微纤溶酶的剂量(微克) |
处理 |
2 |
62.5 |
玻璃体内注射 |
5 |
125 |
玻璃体内注射 |
2 |
188 |
玻璃体内注射 |
2 |
62.5 |
玻璃体内注射和气体填塞(0.6ml SF6) |
2 |
125 |
玻璃体内注射和气体填塞(0.6ml SF6) |
处理以后,所有的眼在37摄氏度孵育30分钟。之后将眼球浸入到4%多聚甲醛溶液中,将0.1毫升的固定液(4%多聚甲醛)注射到玻璃体腔内终止眼内的酶反应。对于使用微纤溶酶和SF6处理的眼球的固定方式是使后极处于垂直的位置。
(b)扫描和透射电子显微镜检查
然后沿睫状环对眼球进行半切,弃掉前半部分。用12.5毫米直径的角膜环钻缓缓通过玻璃体,取出后极。然后使用4毫米直径的角膜环钻从后极上取得用于扫描和透射电子显微镜的视网膜样本。
用于扫描电子显微镜的视网膜盘使用2%四氧化锇(Dalton′s固定液)进行后固定,用乙醇脱水,干燥至临界点,用溅镀的方法镀金,用ISM-35 CF电子显微镜(JEOL,东京,日本)照相。
用于透射电子显微镜检查的样本用Dalton′s固定液后固定,脱水,包埋在EPONTM中。半薄切片用2%甲苯胺蓝染色。超薄切片用醋酸铀和柠檬酸铅形成对比,用Zeiss EM 9电子显微镜(Zeiss,Jena,Germany)进行分析。
两个观察者对电子显微镜照片进行独立评价。每一个观察者评价玻璃体视网膜分离的程度,评价指标是:连续还是不连续的胶原纤丝覆盖在内界膜(ILM)上,或者是单一还是稀疏的胶原纤丝在ILM上存在,或者是ILM没有任何的胶原纤丝(裸露的ILM)。
结果
(a)扫描电子显微镜观察
对注射62.5微克微纤溶酶的死亡后人眼进行扫描电子显微镜观察,发现出现了后玻璃体脱离,只留下不连续的胶原纤丝网络覆盖在ILM上(图6,A)。对分别注射125微克(图6,B)和188微克(图6,C)微纤溶酶的死亡后人眼进行扫描电子显微镜观察,发现出现了裸露的ILM,这与完全玻璃体视网膜分离是符合的。这两个高剂量都产生了相似的玻璃体视网膜接触面超微结构。
在注射了62.5微克微纤溶酶和SF6的眼中,观察到有残留的皮质玻璃体覆盖在ILM上(图6,D)。但是在注射125微克微纤溶酶和填塞气体的眼中,观察到完全的玻璃体视网膜分离,这与裸露的ILM相符合(图6,E)。
与以上讨论的微纤溶酶处理的眼不同,由SEM观察,对照眼没有表现出后玻璃体脱离(图6,F)。这些结果总结于表4。
表4
微纤溶酶的剂量(微克) |
处理 |
残留皮质玻璃体的程度 |
处理的眼 |
对照眼 |
62.5 |
玻璃体内注射 |
++ |
+++ |
125 |
玻璃体内注射 |
- |
+++ |
188 |
玻璃体内注射 |
- |
+++ |
62.5 |
玻璃体内注射和气体填塞 |
++ |
+++ |
125 |
玻璃体内注射和气体填塞 |
- |
+++ |
〔图注:+++胶原纤丝的连续网络;++胶原纤丝的不连续网络;+稀疏的胶原纤丝;-没有胶原纤丝,裸露的ILM〕
(b)透射电子显微镜观察
与对照眼相比,所有微纤溶酶处理的眼的视网膜内形态都没有发生改变。与对照眼(图7,B)相比,在微纤溶酶处理的眼中,ILM的超微结构保持完好(图7,A)。
结论
这些数据表明玻璃体内注射微纤溶酶可以在没有玻璃体切除术或任何其他手术干预的情况下诱导玻璃体皮质和内界膜之间的切割。125微克的纤溶酶在30分钟内切断人玻璃体视网膜连接。就酶的反应而言,125微克微纤溶酶等价于2u的纤溶酶(Sigma-Aldrich,Munich,Germany),这使猪尸体上的眼以及捐献者人眼出现完全的玻璃体视网膜分离。这些数据还显示在微纤溶酶处理的眼中通入气泡对切断玻璃体视网膜连接所需的剂量没有影响。
实施例7
微纤溶酶诱导的后玻璃体分离的体内分析
这些实验的目的是确定在体内用微纤溶酶针对PVD的效用
方法
(a)猫模型
解剖学家和生理学家已经对猫的视网膜进行了大量的研究,使其成为评价药理诱导PVD安全性的有用模型。与人视网膜一样,猫的视网膜中视杆细胞占优势,而且在视网膜中央凹以外有视网膜内循环。这与兔的视网膜不同,兔视网膜没有视网膜内血管。兔内视网膜布满脉管***,位于玻璃体表面,这限制了兔视网膜的实验研究价值,因为实验研究主要侧重的是兔的玻璃体视网膜接触面。多年来,猫模型已经为视网膜对脱离的细胞应答提供了高质量的数据。因此,我们使用猫模型研究纤溶酶在体内实现PVD的适用性。
用0.5毫升克他命(Ketaset,Park-Davis,Eastleigh,UK)和0.3毫升美托咪啶(Dormitor,Pfizer,UK)肌内注射麻醉五只年龄为12-23个月的成年家猫。对麻醉的家猫进行玻璃体内注射14.5微克或者25微克微纤溶酶,作为对照的猫眼注射平衡盐缓冲液(BSS-PLUS)。在本研究的五只猫中,三只通过玻璃体内注射途径注射了25微克微纤溶酶。这三只猫中,一只在接受注射后1天处死,第二只在注射后3天处死,第三只在3周后处死。剩余两只猫注射14.5微克的微纤溶酶,其中一只3天后处死,另一只3周后处死。
(b)扫描和透射电子显微镜观察
从处死的猫中取出眼球,固定并且处理用于电子显微镜观察,方法如实施例6中对人死后眼所述的方法相同。由两个观察者独立评价电镜照片各观察者评价玻璃体视网膜分离的程度,评价指标是:连续还是不连续的胶原纤丝覆盖在内界膜(ILM)上,或者是单一还是稀疏的胶原纤丝在ILM上存在,或者是否ILM没有任何的胶原纤丝。
(c)共聚焦显微镜观察
眼样本用磷酸盐缓冲液(PBS)润洗,在PBS制备的5%琼脂糖(Sigma,St Louis Mo.,USA)中定向。用振动切片机(Technical ProductsInternational,Polysciences,Warrington,Pa.,USA)切出100微米厚的切片,在含有正常驴血清(1∶20;Dianova,汉堡,德国)的含0.5%牛血清白蛋白(BSA;Fisher Scientific,Pittsburgh,Pa.,USA)、0.1%Triton X-100(Roche Boehr inger,曼海姆,德国)和0.1%叠氮钠(Sigma-Aldrich,慕尼黑,德国)的PBS(该PBS溶液含有BSA、Triton和叠氮盐,被称为PBTA)中4摄氏度在转动器上孵过夜孵育。除去封闭血清后,按照以下六对加入第一抗体:抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP;1∶500;DAKO,Hamburg,Germany)与抗胶原IV(1∶50;DAKO);抗波形纤维蛋白(1∶50;DAKO)与抗纤粘连蛋白(1∶400;DAKO);抗突触素(1∶50;DAKO)与抗神经纤维细丝蛋白(1∶25;DAKO);抗层粘连蛋白(1∶25;DAKO)与抗CD68(1∶50;DAKO);抗红/绿视蛋白(1∶100;Santa Cruz Biotechnology,USA)与抗视紫红质(1∶200;Santa Cruz Biotech);抗蓝视蛋白(1∶100;Santa Cruz Biotech,Santa Cruz,Calif.,USA)与抗视紫红质(1∶200;Santa Cruz Biotech)。本实验的共聚焦显微镜观察结果列于表5中。
表5
抗体 |
特异性 |
抗神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗波形纤维蛋白 |
Mueller细胞的中间细丝蛋白 |
抗神经纤维细丝蛋白 |
神经节细胞和水平细胞中的神经纤维细丝 |
抗突触素 |
视网膜丛状层中的突出小泡 |
抗红/绿视蛋白抗蓝视蛋白 |
视锥 |
抗视紫红质 |
视杆 |
抗纤粘连蛋白抗层粘连蛋白 |
纤粘连蛋白层粘连蛋白 |
抗胶原IV |
胶原类型IV |
抗CD68 |
巨噬细胞 |
在转动器中4摄氏度孵育过夜后,切片用PBTA润洗,然后再次在4摄氏度与第二抗体孵育。对于每一组第一抗体分别使用与Cy2或Cy3(Dianova,Hamburg,Germany)偶联的驴抗小鼠和驴抗兔二抗。所有的二抗1∶100稀释使用,所有的抗体都在PBTA中稀释。然后润洗切片,在含N-丙基没食子酸盐的甘油中封片,在激光扫描共聚焦显微镜(LSM510,Zeiss,Germany)下观察。
结果
(a)扫描电子显微镜
玻璃体内注射25微克微纤溶酶一天后,稀疏的胶原纤丝覆盖在ILM上(图8,A)。处理后三天,25微克的微纤溶酶产生完全的玻璃体视网膜分离(图8,B);在玻璃体视网膜接触面上没有残留的胶原纤丝。注射后三天,接受14.5微克微纤溶酶注射的眼中发现稀疏的胶原纤丝覆盖在ILM上(图8,C)。用14.5微克(图8,D)和25微克(图8,E)微纤溶酶处理21天后,观察到裸露的ILM。所有的对照眼都有密集的胶原纤丝网络,覆盖在视网膜上(图8,F)。这些数据总结于表6中。
表6
微纤溶酶剂量(微克) |
处理时间(天) |
皮质玻璃体残留程度 |
处理的眼 |
对照的眼 |
14.5 |
3 |
+ |
+++ |
14.5 |
21 |
- |
+++ |
25 |
1 |
+ |
+++ |
25 |
3 |
- |
+++ |
25 |
21 |
- |
+++ |
〔图注:+++胶原纤丝的连续网络;++胶原纤丝的不连续网络;+稀疏的胶原纤丝;-没有胶原纤丝,裸露的ILM〕
(b)光学和透射电子显微镜观察
微纤溶酶处理的眼(图9,A)和对照眼(图9,B)之间没有观察到视网膜细胞建构的区别。与对照眼的内视网膜和ILM(图9,D和F)相比,微纤溶酶处理眼的内视网膜的超微结构和ILM(图9,C和E)保持完好。
(c)激光共聚焦显微镜观察
在微纤溶酶处理的眼和对照眼中,Mueller细胞的外侧端部分清晰地被抗GFAP(图10,A和B)和抗波形纤维蛋白标记(图10,C和D)。Mueller细胞过程没有扩展染色超出内核层以外。使用抗胶原IV和抗纤粘连蛋白没有出现明显染色(数据未显示)。这可能与这些抗体的种属特异性有关。ILM被抗纤粘连蛋白染色。在处理的和对照眼中几乎都没有巨噬细胞。神经节细胞的轴突和树突,水平细胞以及内网和外网丛状层被抗神经纤维细丝蛋白和抗突触素清晰地标记(图10,E和F)。感光细胞层被抗神经纤维细丝蛋白标记。在研究中的任何时刻,对于使用的任何抗体,在微纤溶酶处理的眼(图10,A,C,E)和对照眼(图10,B,D和F)之间没有区别。
讨论
为了评价微纤溶酶在体内玻璃体视网膜接触面的切割效果,我们向五只成年猫的玻璃体腔内注射两个不同剂量。我们使用的第一个剂量是25微克微纤溶酶,这是在人死后眼中发现足以诱导完全PVD的剂量的五分之一。引人注意的是25微克的微纤溶酶等价于0.4U的纤溶酶(Sigma),在临床上0.4U的自体纤溶酶已经用于具有黄斑破洞和糖尿病性视网膜病的人眼玻璃体腔中。考虑到猫眼较小的玻璃体体积(大约是人眼玻璃体体积的60%),第二个剂量14.5微克纤溶酶相当于人眼中的25微克微纤溶酶。
在猫眼中玻璃体内注射25微克微纤溶酶后三天,出现完全的玻璃体视网膜分离,而处理后一天,在玻璃体视网膜接触面仍然存在一些胶原纤丝。这显示微纤溶酶的作用在24小时以后仍然在持续,这与纤溶酶在血液中被其天然拮抗剂α-2-抗纤溶酶迅速灭活形成鲜明对比。微纤溶酶活性长命的原因之一可能是α-2-抗纤溶酶被另外一个底物饱和,或者与纤溶酶相比,微纤溶酶对于抗纤溶酶拮抗剂有不同的亲和性。另一个可能的原因可能是微纤溶酶下游的代谢途径(例如胶原酶的活化或者基质金属蛋白酶的活化)在微纤溶酶被α-2-抗纤溶酶失活后仍然保持活性。
经微纤溶酶处理的眼的细胞建构与对照眼相比没有改变。从超微结构角度讲,微纤溶酶处理的眼和对照眼之间的解剖学没有差异。在所有样本中ILM和视网膜保持完好。此外我们没有观察到微纤溶酶注射后任何炎症反应的迹象。特别地,电子显微镜和激光共聚焦显微镜观察没有显示任何视网膜炎症性细胞浸润的证据。
在猫的模型中,视网膜脱离产生了显著的Mueller细胞增殖,以及Mueller细胞质中中间细丝蛋白的大量上调,例如神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和波形纤维蛋白。这种Mueller细胞应答被广泛称为神经胶质增生,据认为其在视网膜对脱离的复杂细胞应答中起到关键作用。在正常的视网膜中,Mueller细胞是沉默的,表达非常少量的GFAP和波形纤维蛋白。但是已经显示即使没有诱导视网膜脱离的玻璃体切除术也会导致GFAP的上调。最近我们小组的工作显示在试图剥离猫眼中的ILM之后,中间丝蛋白出现显著上调(未发表的数据)。这些数据显示Muller细胞对任何形式的手术性外伤的高反应性。
在本研究中,通过微纤溶酶诱导PVD后我们没有观察到任何的Muller细胞反应性的变化。而且,就使用的任何抗体而言,在处理的眼和对照眼之间没有区别。在研究中的任何时刻Mueller细胞的沉默状态以及视网膜未改变的超微结构和免疫反应性提供了使用微纤溶酶诱导PVD安全性的实验证据。
总之,这些研究显示微纤溶酶在体内诱导PVD是有效的。此外,这些研究表明,因为在超微结构水平没有观察到视网膜的改变所以微纤溶酶是安全的。
实施例8
通过使用动态光散射评价微纤溶酶对于猪玻璃体的作用
本研究的进行目的在于使用非侵入性的动态光散射(DLS)技术评价微纤溶酶(μPli)的作用,表征μPli对新鲜获得的死后猪玻璃体的体外和原位生物物理作用。DLS通过测量散射光强度的时间波动,提供了关于溶液和悬液中粒子和大分子动态的信息。
在一个DLS实验中,当光通过大量悬浮于液体中的小颗粒时,在远视野看到恒定的斑点振荡型式(参见Chu B.,Laser lightscattering:Basic priniclples and practice,Academic Press,NewYork,1991)。这种斑点型式是在光路中干涉的结果,且由于在散射介质中颗粒之间和与液体分子之间的碰撞(布朗运动)而出现的大于1微秒时间级的随机运动,斑点型式也出现波动。没有颗粒颗粒相互作用时(稀释色散),从小颗粒散射出的光振荡很快,而从大颗粒散射出的光振荡慢得多。
为我们的研究建造的DLS设备提供了例如扩散系数、大小、散射强度和多分散性(异质性的量度)的动态信息。一般来说,颗粒大小的增加(从几纳米到几微米)以及这些颗粒数目和密度的增加导致光散射强度的增加。多分散性是具有不同大小的不同物质组数目的量度。在DLS测量中可以鉴定多达三组大小不同的物质,这是由于它们扩散的时间级不同(小颗粒移动得快而大颗粒移动得慢)。因此,散射光强度和多分散性的改变与颗粒大小的数据可以彼此互相参证。如果在药物干涉后玻璃液颗粒变小,散射强度增加,则很可能在溶液中较小分子数目增加,这或者由于较大分子发生断裂,和/或在这些实验的情况下,本来被连续的玻璃液结构排除在外的20纳米多聚苯乙烯纳米球发生流入。如果多分散性降低,则最可能的解释是样品中分子种类群体的均质性增加,同样这也指示本来被排除在外的20纳米多聚苯乙烯纳米球发生流入。DLS最吸引人的特点是它是非侵入的并且是定量的,对于几纳米到几微米的颗粒都有效,只需要小的样品量,对于多分散性或者多重大小(多达2-3种组分)的分散系也能相当好地工作。使用从Brookhaven Instruments,NY获得的累积量和指数大小分布程序分析这里的数据。Stock和Ray(Stock R.S.和Ray W.H.,J.Polym.Sci.23:1393,1985)对这些方案进行了综述。作为一个实例,图11表示了一个典型的DLS测量,使用的是时间自相关函数或TCF,测量对象是整个猪玻璃液(多分散性***)和20纳米直径的多聚苯乙烯纳米球溶液(单分散性***)。
材料和方法
(a)用于玻璃液研究的DLS装置的构成
制作新型致密DLS光学纤维探头(美国专利5,973,779),用于这里描述的玻璃液研究。它包含一对0.25间距(pitch)Selfoc GRIN透镜,刺入深度为16毫米,散射角度为160度。包含两个单模光纤和两个GRIN透镜的光纤探头为研究眼中大分子的动态性质提供了简洁和遥控的手段。分别装在一个不锈钢金属环内的两个单模光纤,装到分开的不锈钢托架内。在纤维托架和透镜托架之间有意留出一段空气间隔,目的是在散射体积内产生紧密的聚焦点。位于托架上的两个光纤对齐,并固定在远离微透镜轴的位置。将两个托架放到第三个(外)不锈钢托架中,该托架的背端由热缩管覆盖。光纤的自由末端是FC/PC类型的凸起连接器,可以容易地与激光和光检测器组件相连接。
实验设置的主要组分是由DLS致密光纤探头(以上描述),含有数字相关器卡(BI-9000 Brookhaven Instruments NY)的电脑(Gateway PC 500S),和635纳米波长的1毫瓦固态激光发射器(OZOptics,Canada),以及一台雪崩光电二极管检测器(Perkin Elmer,Canada)。探头装在光学组件上,该组件通过手工控制的转换站连接,可以控制并将探头伸到眼内所需的位置。
每一个时间自相关函数(TCF)要20秒钟收集(除了过滤比色杯研究,这需要1分钟)。对于所有测量保持延迟时间5微秒恒定。在开始玻璃液研究之前,通过使用聚苯乙烯标准物的水分散系(20纳米直径的乳胶纳米球)全面检测仪器的稳定性、可靠性和重复性。
(b)玻璃液和粘性组织的动态光散射
DLS能够非侵入性地提供溶液中悬浮颗粒平均直径的客观定量,在这里的溶液是玻璃液。为精确计算颗粒大小,需要知道或者猜想溶剂的粘度。如以前提到的,现在还不能准确测量非牛顿流体的粘度,所以必需进行猜测。考虑到玻璃液中大约有99%的水,认为玻璃液的粘度由水产生是合理的。为检测这个猜想的正确性,对整个玻璃液胶体、不能通过滤器的玻璃液亚级分(凝胶)、能够通过滤器的玻璃液亚级分(非凝胶)、通过0.22微米Millipore滤膜的玻璃液亚级分(液体玻璃液)进行了DLS测定。这些研究在光学比色皿中进行,加入散射性20纳米多聚苯乙烯纳米球作为已知直径且高度均一的示踪剂。对于整个玻璃液以及所有不同亚级分的DSL测定给出相似的结果,表明玻璃液的微粘度的确非常接近纯水的微粘度。玻璃液中的微粘度是指被束缚的水的粘度,在水中透明质酸(HA)分子和胶原束悬浮。HA分子的布朗运动比胶原束要快得多,这是由于胶原束的形状比HA分子要大。在DLS光谱中,HA的分子信息体现在较快(短)的延迟时间中,而胶原的分子信息体现在较慢(长)的延迟时间中。得到的信息以颗粒大小的分布表示。
(c)试剂
所有的溶液使用BSS PLUS(ALCON Labs,Ft.Worth,Tex.)制备。使用浓度为4毫克每毫升的微纤溶酶的储液。悬浮于双蒸去离子水中的20纳米直径的多聚苯乙烯纳米球(Bangs Laboratories,Fishers,Ind.)以固定的比例加入到所有的样品中,保证所有样品中有一致数目的纳米球。
(d)空旷天空模式
新鲜未固定的猪眼(n=11)通过平坦部内切切割其前部,并从前玻璃体上精细地切下晶状体/虹膜之间的横隔膜。切片的位置尽可能地靠近后晶状体囊,而不切开这个组织。将眼放在固定器上,眼球后部分向下。
在室温下将含有60微升20纳米多聚苯乙烯纳米球的溶液(300微升)置于暴露的玻璃体的前表面上,而用对照和剂量分别为0.08,0.125,0.4,0.6和0.8毫克的μPli处理样本。在位于玻璃体/空气接触面以下1、2和4毫米沿中央光轴的单个点进行DLS。每15分钟记录一次DLS读数,记录时间为90到360分钟。
(e)闭眼模式
使用30G针将300微升含有多聚苯乙烯纳米球和剂量分别为0.0125、0.025、0.05、0.125、0.25、0.5、0.6和0.8毫克μPli的实验和对照溶液通过刺入方式注射到完整无缺的猪眼的平坦部(n=39)。在37摄氏度下将眼在固定器(角膜在上面,眼球后部分在下面,像平卧位置)上孵育30或者120分钟。在将眼放置于温控的水浴中之前(在任何时候要避免样本和水的任何接触),以及放到水浴中以后每15分钟,将眼沿光轴旋转10至15秒钟。水浴后,通过平坦部内切而切下眼前部。在沿光轴的几个不同的点(平均值=18.6,sd=11.8)以及沿水平轴在玻璃体/空气接触面后深4毫米处的点(平均值=30.8,sd=18.0)进行DLS。
结果
(a)猪玻璃液的分子形态学
对于完整(完好无缺)玻璃体在沿眼杯(eye cup)(已将前部分切掉)光轴的多个点进行DLS测定,在所有空气/玻璃体接触面下方1.25毫米到4.75毫米的点显示了非常相似的结果。这些发现与将全部玻璃液放到一个比色皿中的发现、以及在染色后保留的残余玻璃液中的发现以及在通过滤器的玻璃液亚组分的发现是相似的。所有的发现显示了几乎一致的颗粒大小分布。具有较大颗粒大小的组(靠右侧),其平均大小为约1000纳米,主要代表的是胶原。较小颗粒大小的分布(靠左侧)主要代表的是透明质酸(HA)。该颗粒大小分布型式与接受多聚苯乙烯纳米球注射的眼的颗粒分布是一致的。
(b)空旷天空模式
图12显示5只不同的猪眼中空气/玻璃体接触面下方4毫米处的点获得的TCF以及20纳米多聚苯乙烯纳米球溶液获得的TCF(用于对照)。可以看到随着μPli剂量的增加,TCF的斜率降低,慢组分(较大的分子)消失,使得TCF最终靠近纯20纳米纳米球的TCF,即全部为较小形状的分子。
在使用不同溶液在室温进行处理后,1毫米深度下DSL测定的结果(n=5):安慰剂和0.08毫克基本上相同。0.125毫克剂量在210分钟后整体平均颗粒大小降低了大约三分之一。使用0.6毫克剂量,60分钟后平均颗粒大小降低了80%,且几乎完全降低平均粒径(只检测到20纳米的多聚苯乙烯纳米颗粒)。
在空气/玻璃体接触面后2毫米深处,180分钟后整体平均颗粒大小下降了约三分之一(n=3)(数据未显示)。在两个不同的时刻,用0.5毫克μPli分别处理两只不同的眼60分钟,将样本在37摄氏度孵育并且在DSL测量中维持这个温度,导致整体平均颗粒大小降低了40%。对于所有这些样本的整体强度测量以及多分散性测量支持并且确证了颗粒大小的确定。
(c)闭眼模型
与从0.0125到0.8毫克剂量范围的μPli于37摄氏度孵育30分钟后,沿光轴和纵轴都出现显著的变化。在光轴中标准化的平均颗粒大小在最高剂量0.8毫克时出现7倍的下降。0.125毫克剂量在30分钟后使标准化的平均颗粒大小降低了约三分之一。最低剂量0.0125毫克看起来没有任何显著的效果。从整体剂量范围看来,颗粒大小的降低与μPli的剂量呈反比(相关系数为0.93)。将数据拟合到线性(直线)拟合程序中。标准化的总强度和多分散性曲线进一步支持了该数据的可靠性。颗粒大小分布证明了随着μPli剂量的升高,颗粒大小分布呈现显著的左移。这提示μPli在显著减弱或者断裂多种不同化学键中以及在降解玻璃液中大分子结构中是有效的。沿水平轴检测到相似的改变。
使用0.0125到0.6毫克剂量范围的μPli在37摄氏度孵育2小时也有显著的变化。在最高剂量时,沿光轴测量的标准化的平均颗粒大小降低了87.5%。标准化的散射强度和标准化的多分散性曲线确证了该数据。随着剂量的增加,颗粒大小分布显示了左移,在较高的剂量左移显著。沿水平轴在4毫米深处的DSL测定显示了相似的结果,标准化平均颗粒大小降低了大约85%,在标准化的散射强度和多分散性曲线中也有支持性的发现。
30分钟时和2小时时结果的比较表明随着孵育时间的延长,颗粒大小降低的程度更大。考虑到当剂量是0.6毫克时,在30分钟的孵育中标准化的平均颗粒直径是(原来的)约20%,且2小时孵育后是(原来的)约10%。因此,随着孵育时间的延长,颗粒大小有约两倍多的降低。
从DSL测量得到的主要参数是散射系数。散射系数的改变预示着玻璃液大分子结构对μPli处理的响应的改变。随着μPli剂量的升高,玻璃液的散射系数升高。在μPli剂量范围内,散射系数与μPli的剂量呈正相关。因此,随着μPli剂量的升高,散射系数降低,而且与颗粒大小确定相似的是,此相关性在统计上是显著的(相关系数r=0.93)。
讨论
在本实验中,使用DSL通过测量颗粒大小,散射强度和多分散性,非侵入性地估计了玻璃液的分子结构。结果显示,在整个玻璃液中不同的位置,DSL特征是相似的。在37摄氏度孵育整个玻璃液时微纤溶酶有最显著的影响,特别是在更高的剂量时。标准化平均颗粒大小显著下降,并且建立了统计显著的剂量-响应关系。这提示μPli在玻璃体-视网膜手术中是有用的辅助物,因为30分钟的时间范围对于一种不影响当前手术操作的药物作用是合理的。与前面实施例中提示μPli诱导玻璃体视网膜接触面断裂的数据相一致,此药物看起来可以获得药理玻璃体分离术所需要达到的两个结果:后玻璃体脱离和玻璃液大分子的分解,分解使得玻璃液的散射系数升高,最终使其液化。
实施例9
微纤溶酶作为玻璃体切除术的辅助物
具有玻璃体视网膜疾病,需要进行玻璃体切除术的患者在玻璃体切除术前使用微纤溶酶注射治疗。患者接受全面的眼科检查以确定眼部健康的基线。眼科检查包括间接检眼镜检查、裂隙灯生物显微镜检查、外周视网膜检查、眼内压力测定、视觉敏锐度(无矫正和最佳矫正)症候、眼底照相、荧光素血管造影术、电子视网膜照相和A-扫描测量。
在玻璃体切除术开始前多达30分钟或者前多达1天,使用0.025毫克到0.125毫克微纤溶酶(溶于0.2毫升眼内冲洗溶液BSS PLUS或者其他冲洗溶液)对将要治疗的眼睛进行注射,以促进玻璃液的液化和/或诱导后玻璃体脱离。
通过促进玻璃液的液化和/或诱导后玻璃体脱离,玻璃体切除术的进行可以更快捷简单,减少医疗引起的视网膜外伤以及手术并发症的风险。使玻璃体被更为完全地去除可以降低术后并发症,例如增殖性玻璃体视网膜病的风险。
实施例10
使用微纤溶酶治疗糖尿病性视网膜病
在本实施例中,一个表现出糖尿病性视网膜病的糖尿患者用玻璃体内注射微纤溶酶的方法进行治疗。
糖尿患者将要接受全面的眼科检查以确定眼部健康的基线。眼科检查包括间接检眼镜检查、裂隙灯生物显微镜检查、外周视网膜检查、眼内压力测定、视觉敏锐度(无矫正和最佳矫正)症候、眼底照相、荧光素血管造影术、电子视网膜照相和A-扫描测量。
在初步的检查后,向患者受疾病影响的眼玻璃体内注射微纤溶酶。如果双眼都受到疾病影响,它们可以分别接受治疗。使用从0.005毫克到0.125毫克剂量范围的微纤溶酶(纤溶酶溶解于0.05到0.2毫升的BSS PLUS或者其他冲洗溶液)注射要治疗的眼,以促进玻璃体的液化。
在治疗后,患者的眼睛要定期检查。该患者糖尿病性视网膜病的程度在定期的视网膜检查和荧光素血管造影中进行连续监测,以监测静脉出血(beading)、IRMA、视网膜缺血、牵引性视网膜脱离、玻璃体出血、是否需要玻璃体切除术或者其他糖尿病性视网膜病的并发症。
实施例11
在死后猪眼中比较微纤溶酶与纤溶酶对荧光素扩散速度的影响
微纤溶酶的分子量大约是全长纤溶酶分子量的三分之一。由于其形状小,预计在玻璃液中微纤溶酶比纤溶酶扩散的会更迅速(Xu,J.etal.,同以上的引用)。预计更为迅速的扩散会导致更迅速的药理效果。进行本研究的目的是既确证微纤溶酶比纤溶酶扩散得更迅速,又确证微纤溶酶能够改变玻璃液凝胶。
方法
使用从屠宰场获得的新鲜分离的猪眼。在第一个实验中,一只眼注射微纤溶酶(0.125mg),另一只眼注射载体对照(BSS-PLUS)。在室温维持两只眼两小时,使用荧光素注射两只眼,并继续孵育30分钟。在0、10、20和30分钟时拍摄照片。在第二个实验中,注射0.125毫克微纤溶酶(N=2)或者1U的纤溶酶(Sigma提供,N=2),并于37℃孵育两小时。然后向所有四只眼注射荧光素,继续孵育30分钟,在0、10、20和30分钟时拍摄照片。
结果
在第一个实验中,对照眼在玻璃体中几乎没有观察到荧光素的扩散(数据未显示)。而在微纤溶酶处理的眼中,可以观察到清晰的荧光素扩散(数据未显示)。
在第二个实验中,微纤溶酶处理的眼在20分钟后其荧光素扩散分别为14%和16%(图13),而纤溶酶处理的眼其荧光素扩散低于10%(图14)。
讨论
与载体对照相比,微纤溶酶清楚地显示出对荧光素扩散的促进。而且,正如根据对微纤溶酶分子量进行的预测,这种荧光素扩散比使用全长纤溶酶给药时观察到的荧光素扩散程度要大。这些发现支持了微纤溶酶扩散得比纤溶酶迅速的理论预测。这些发现可能具有临床益处,因为可以得到更迅速的药理作用。