CN1717483A - 人类人工染色体(hac)载体 - Google Patents

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Abstract

人类人工染色体(HAC)载体及其构建方法；通过使用所述人类人工染色体载体转移外源DNA的方法，表达外源DNA的细胞的构建方法；以及蛋白的制备方法。

Description

人类人工染色体(HAC)载体
技术领域
本发明涉及人类人工染色体(HAC)载体及其制备方法。本发明还涉及使用人类人工染色体载体引入外源DNA的方法，以及表达外源DNA的细胞的制备方法。此外，本发明涉及蛋白的制备方法。
背景技术
在哺乳动物细胞中引入和表达外源基因的载体，不仅是基础生命科学研究的必要工具，而且在工业(例如大规模生产药物)和临床实践(例如基因治疗)上的实际应用其成果方面起着重要作用。自从二十世纪七十年代后期，基因工程技术的进展促进了使用大肠杆菌(Escherichia coli)和酵母菌进行特定基因DNA片段的分离和扩增。已经常规使用克隆DNA向哺乳动物细胞进行基因转移。在常规实践中，已经制备了含有待表达基因的编码区(cDNA)并连接启动子和聚腺苷酸附加位点(它们在哺乳动物细胞中起作用)的人工表达单元，或者已经制备了环状或线状的大肠杆菌质粒(最大约为20kb，环状)、粘粒(最大约为40kb，环状)、细菌人工染色体(BAC，最大为200kb，环状)和酵母人工染色体(YAC，最大约为1Mb，线状)，它们含有基因组DNA片段，该片段含有原有的启动子和聚腺苷酸附加位点以及编码区，而且已经通过转染或注射将它们转移到细胞中。当引入的载体DNA没有来自哺乳动物的复制起点时，引入基因的表达将会是瞬时的，因为它在宿主细胞中不能复制，并且在细胞***中被遗漏。如果载体具有复制起点，则在细胞中暂时产生许多拷贝数；然而，它们在没有选择压力时仍会被逐渐遗漏，因为它们在细胞***中不均等地分配给子细胞。因此，在这种情况下，表达仍是瞬时的。可以选择以组成型方式表达引入基因的细胞系，即通过同时引入抗药性基因并施加药物选择压力，尽管引入基因掺入到宿主细胞染色体中(整合)。整合影响引入基因和宿主染色体两方面。宿主染色体中的基因可以被破坏(Pravtcheva等，Genomics(USA)，第30卷，第529-544页，1995)。对于引入基因，其拷贝数可能不受控制，其拷贝可能没有活性(Garrick等，Nature Genet.(USA)，第18卷，第56-59页，1998)或者受宿主染色体上控制序列的影响，其中所述基因已经整合在其上(Dobie等，P.N.A.S.(USA)，第93卷，第6659-6664，1996；Alami等，Hum.Mol.Genet，(UK)，第9卷，第631-636页，2000)。因此，需要开发引入给定基因拷贝数而又不破坏宿主染色体的方法。对此问题的解决方法是，构建在来自动物(包括人)的宿主细胞中能自主复制/分配的人工染色体，并且采用它作为载体，将基因导入动物细胞中。
(1)人类人工染色体(HAC)的构建
已经在动物细胞中尝试进行了人类人工染色体(在下文称为“HAC”)的构建，以便产生载体来表达外源基因，并且，在生物学方面，来鉴定在细胞中自主复制/分配所需的结构。有三种构建HAC的方法，即(A)自底向上(bottom up)法，(B)自发染色体片段的应用和(C)自顶向下(top-down)法(修剪天然染色体)。
(A)自底向上法
在大肠杆菌和酵母中已经鉴定了自主复制/分配所需的DNA序列，并且已经建立了在宿主细胞中提供给定拷贝数的人工染色体(BAC或YAC)。同样，也已经试图使用自底向上法来建立HAC，即通过将已知序列的克隆DNA片段导入动物细胞中并装配该DNA片段。加入来自YAC的抗药性基因(所述基因含有约100kb的白斑样(alphoid)序列，所述序列是人类染色体着丝粒的组分)和人端粒序列，并引入到人纤维肉瘤细胞系HT1080中(Ikenno等，Nature Biotech.(USA)，第16卷，第431-439页，1998)。对于抗药性细胞克隆，已经建立了能够自主复制/分配的人工染色体；然而，并不是引入的DNA序列自身在细胞中保留，而是发生了扩增后的重组，尚不清楚细胞所保留的序列结构。
此外，上述研究目的是建立HAC，还没有进行***外源基因的研究。
(B)自发染色体片段的应用
染色体本身是基因的聚集体，具有自主复制/分配所需的元件。使用染色体或其片段作为基因转移的工具，进行微细胞介导的染色体转移，以便引入Mb数量级的巨大基因，这超出了现有克隆载体例如YAC的容量。将含有抗体基因的14号、2号和22号人类染色体的片段转移到小鼠胚胎干细胞中，结果显示产生了嵌合体，所述抗体基因在小鼠中表达，在嵌合体中人类染色体的片段被稳定保留并且通过种系遗传给下一代(Tomizuka等，Nature Genet.(USA)，第16卷，第133-143页，1997；Tomizuka等，P.N.A.S.(USA)，第97卷，第722-727页，2000)。该实例证明了使用携带待表达基因的染色体作为载体的有效性。然而，对每个靶基因都修饰染色体是不现实的。最好是提供用作基础结构的染色体载体(靶基因容易***到其中)，以便采用染色体片段作为载体并增加它们的通用性。
这样，进行了使用天然染色体片段来表达外源基因的尝试。已经报道了使用来自1号人类染色体的经辐射染色体片段(5.5Mb)作为载体，引入IL-2基因(cDNA)或CFTR基因(人类基因组DNA)并进行功能性表达(参见例如Guiducci等，Hum.Mol.Genet.(UK)，第8卷，第1417-1424页，1999；Auriche等，EMBO Rep.(UK)，第2卷，第102-107页，2002)。用仓鼠成纤维细胞(CHO)作为宿主。在将靶基因引入到片段化微型染色体(minichromosome)中时，使用白斑样DNA，希望它能***到1号人类染色体的着丝粒结构域中；然而，没有鉴定出具体的***位点或拷贝数。IL-2依赖性小鼠原淋巴细胞以不依赖IL-2的方式成为可繁殖细胞，这是与保留IL-2微型染色体的CHO细胞融合的结果，表明功能性互补。此外，在保留了CFTR微型染色体的CHO细胞中观察到用cAMP刺激释放氯离子，而通过加入CFTR抑制剂可抑制氯离子的释放。这表明了用染色体片段作为载体的外源基因***/表达***，但是其结构尚不清楚，而且外源DNA的***不受控制。
来自经辐射的杂交细胞的染色体片段(2-3Mb)在仓鼠细胞中稳定保留，所述片段含有1号人类染色体的着丝粒和部分长臂以及SDHC(琥珀酸脱氢酶复合体，亚基C)基因。通过在SDHC区的同源重组，***G418抗性基因。用小鼠细胞(L和3T3)进行X-射线细胞融合，得到G418抗性杂交细胞(Au等，Cytogenet.Cell Genet，(Switzerland)，第86卷，第194-203页，1999)。该HAC的结构是未知的，因为它使用天然染色体片段。利用同源重组以位点专一方式将外源基因引入到HAC中，尽管该方法的***效率低而且对通用目的来说是不适合的。因为没有采用微核细胞融合法，所以除了靶染色体片段外，还存在宿主染色体。这仅仅说明采用染色体作为载体表达外源基因的想法。
此外，通过将loxP位点随机***到天然染色体片段(环状)中，用抗药性基因(hprt)作为指示物的重建，***外源基因(潮霉素抗性基因)(Voet等，Genome Res.(USA)，第11卷，第124-136页，2001)。该环状染色体包括20号人类染色体的着丝粒和部分1号染色体(p22区)；然而，其序列尚未鉴定出来，因为它是天然片段。通过与Cre/loxP***的位点专一重组引入外源基因，尽管不知道其组成，因为loxP***到染色体中是随机发生的。同时，通过微细胞融合，已经显示出向小鼠ES细胞的转移、嵌合体的产生和遗传到子代。尽管将靶基因***到人工染色体的方法是简单的，除了采用天然染色体片段以及loxP位点是随机***的以外，用来自患者(轻微智力低下)的异常染色体从安全方面来说是困难的并且是不切实际的。
(C)自顶向下法
当天然染色体片段转移到细胞中时，来自该转移染色体片段的许多基因(不是靶基因)将会同时表达。在小鼠ES细胞的实验中，已知其稳定性因所用的人类染色体不同而不同，细胞在嵌合体中保留引入的染色体片段的能力随染色体片段大小的增加而下降。这表明额外基因表达会破坏保留染色体片段的宿主细胞的繁殖。因此认为可以通过染色体修饰去除额外基因，以较高比率保留引入的染色体片段。
已经描述了通过引入克隆的端粒序列、通过同源重组(端粒截短)而缩短染色体的技术，作为缺失部分染色体的方法(Itzhaki等，NatureGenet.(USA)，第2卷，第283-287页，1992)。然而，大多数种类的动物的体细胞具有极低的同源重组频率，所以需要进行大量工作才能获得重组体。用具有高频同源重组的鸡细胞系DT40作为宿主，可以使染色体修饰更有效(Kuroiwa等，Nucleic Acids Res.(UK)，第26卷，第3447-8页，1998)。通过微细胞融合法，接着通过端粒截短，将人类X染色体转移到DT40细胞系中(Mills等，Hum.Mol.Genet.(UK)，第8卷，第751-761页，1999)。通过去除短臂和长臂，建立了2.4Mb的线状微型染色体。仓鼠细胞和人类细胞稳定保留微型染色体，尽管拷贝数不同。尽管证实了HAC的稳定性，但是没有引入外源基因而使它们成为载体。
此外，在仓鼠细胞中的人类Y染色体因端粒截短而缩短，构建约4Mb的微型染色体，该微型染色体在宿主细胞中稳定保留(Heller等，P.N.A.S.(USA)，第93卷，第7125-7130页，1996)。该微型染色体通过微细胞融合法转移到小鼠ES细胞中，但是不稳定。当产生嵌合小鼠时，因为通过染色体重建整合小鼠着丝粒序列的衍生微型染色体而在ES细胞中获得稳定性(Shen等，Hum.Mol.Genet.(UK)，第6卷，第1375-1382页，1997)，证实了种系遗传(Shen等，Curr.Biol.(UK)，第10卷，第31-34页，2000)。在小鼠中显示嵌合染色体被保留，但是因为染色体重建所以不清楚其结构，而且没有进行外源基因引入/表达的研究。
(2)将外源基因***到HAC中
与如上所述构建HAC作为载体同等重要的是：建立将靶基因引入HAC的方法。然而，如上所述，HAC自身的构建尚未完成，而且对于外源基因的引入，仅仅表明了抗药性基因的随机***；除此之外还没有进行详细分析。
已经证实来自14号人类染色体的自发片段SC20在小鼠和种系遗传中的稳定性，该片段经分离而产生保留人抗体重链基因的小鼠。通过相互易位，建立了Mb数量级的克隆染色体区(包括抗体轻链基因的2号和22号人类染色体的区域)的方法(染色体克隆)，其中利用Cre/loxP***(Kuroiwa等，Nature Biotech.(USA)，第18卷，第1086-1090页，2000)。该方法的目标是建立不含不必要基因的限定结构的HAC，而且当用于大小超过其它克隆载体(例如YAC)容量的巨大基因(例如抗体基因)时，它是有效的。
在各种情况下，迄今为止尚没有建立满足以下条件的HAC载体***：1)已经鉴定结构并去除不必要基因，2)在培养细胞和个体中可以稳定保留HAC载体，和3)可以容易地向其中引入外源DNA。
发明内容
本发明的目的是提供人类人工染色体载体及其制备方法，所述载体在细胞中稳定保留、允许大的外源基因***并可导入细胞中。
为了解决上述问题，本发明人已经进行了如下深入的研究：1)建立不含额外基因并且可以在动物细胞中稳定保留的染色体载体，和2)建立表达***，即通过提供所述染色体载体的克隆位点并且将靶基因***到该克隆位点作为表达盒。具体地讲，通过去除其长臂的已知基因，从21号人类染色体制备修饰染色体，证实在长期传代培养中保留修饰染色体的DT40杂交细胞的稳定性，以位点专一方式将loxP序列和hCMV启动子***到修饰染色体的长臂近侧区，利用Cre/loxP***将GFP基因引入修饰染色体中并证实GFP的表达。本发明人从结果中发现，通过建立基于来自21号人类染色体片段的HAC载体，可以解决上述问题，因而完成了本发明。
本发明概述如下。
在本发明的第一方面，本发明提供一种包含21号人类染色体片段或14号人类染色体片段的人类人工染色体载体，其中所述染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区已经缺失。
在本发明的一个实施方案中，21号人类染色体的片段大小约为2-16Mb，优选约为2-6Mb。
在本发明的另一个实施方案中，21号人类染色体的长臂远侧区例如在21q11区内缺失，优选在AL163204缺失。
在本发明的另一个实施方案中，21号人类染色体的短臂远侧区例如在21p区内缺失，优选在AL163201缺失。
在本发明的另一个实施方案中，14号人类染色体的片段大小约为20Mb，优选约为19Mb或更小，更优选18Mb或更小。
在本发明的另一个实施方案中，14号人类染色体的长臂远侧区例如在14q区内缺失，优选在AL157858缺失，更优选在AL512310缺失。
此外，14号人类染色体的短臂远侧区例如在14p区内缺失，优选在14p12区内缺失，更优选在选自以下的位置缺失：OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6和OR4M1。
在本发明的又一个实施方案中，本发明的人类人工染色体载体具有在21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区***的位点专一重组酶识别位点。在一个优选实施方案中，位点专一重组酶识别位点***到比21号人类染色体的长臂近侧区内的AL163203更近的区域或者是比14号人类染色体长臂近侧区内的AL157858更近的区域，更优选***到比AL512310缺失位点更近的区域或者比14号人类染色体短臂近侧区内的14p12区内缺失位点更近的区域。此外，在一个优选实施方案中，位点专一重组酶是Cre酶，且位点专一重组酶的识别位点是loxP序列。
在本发明的另一个实施方案中，长臂远侧区和/或短臂远侧区的缺失是通过被人工端粒序列取代。
在本发明的第二方面，本发明提供制备人类人工染色体载体的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；和
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区。
在本发明的一个实施方案中，在步骤(a)中，保留21号人类染色体或14号人类染色体的细胞具有高同源重组效率。在一个优选实施方案中，具有高同源重组效率的细胞来自鸡DT40细胞。
在本发明的一个实施方案中，在步骤(b)中，21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区的缺失是通过被人工端粒序列取代。在一个优选实施方案中，21号人类染色体的长臂远侧区在AL163204缺失，而短臂远侧区在AL163201被去除。在另一个优选实施方案中，14号人类染色体的长臂远侧区在14q区内被去除，而短臂远侧区在14p12区内缺失。在又一个优选实施方案中，14号人类染色体的长臂远侧区在AL157858缺失，更优选在AL512310缺失，而短臂远侧区在选自以下的位置缺失：OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6和OR4M1。
在又一个实施方案中，在步骤(c)中，位点专一重组酶是Cre酶，且位点专一重组酶的识别位点是loxP序列。
在又一个方面，位点专一重组酶的识别位点可以***到例如比21号人类染色体的长臂近侧区内的AL163203更近的区域或者***到比14号人类染色体的AL157858更近的区域，更优选***到比AL512310缺失位点更近的区域或者比14号人类染色体短臂近侧区内的14p12区内缺失位点更近的区域。
在本发明的第三方面，本发明提供一种通过上述方法获得的人类人工染色体载体。
在本发明的第四方面，本发明提供保留上述人类人工染色体载体的细胞。
在本发明的第五方面，本发明提供制备含有外源DNA的人类人工染色体载体的方法，所述方法还包括在上述方法中描述的下述步骤(d)：
(d)在位点专一重组酶存在下，将外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中。
在第六方面，本发明提供一种通过上述方法获得的含有外源DNA的人类人工染色体载体。
在第七方面，本发明提供保留包含外源DNA的人类人工染色体载体的细胞。
在第八方面，本发明提供一种药用组合物，所述组合物包含保留含外源DNA的人类人工染色体载体的细胞。上述外源DNA可以是编码以下蛋白的基因：红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、血管假性血友病因子(von Willebrandv factor，vWF)、肌营养不良蛋白、多巴胺合酶、胰岛素、***(IGF)、***结合蛋白(IGFBP)、抗体、端粒酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生长激素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配体、干扰素、腺苷脱氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生长抑制因子(GIF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M、Flt3配体(Flt3L)、基质衍生因子(SDF)、干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素(angiopoietin)、神经生长因子(NGF)、骨形态发生因子(BMP)、活化素、转化生长因子(TGF)和Wnt。
在第九方面，本发明提供将外源DNA导入受体细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶存在下，将外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；和
(g)证实所述外源DNA导入融合的受体细胞中。
在本发明的一个实施方案中，上述受体细胞是动物细胞，优选哺乳动物细胞。此外，上述受体细胞可以是多能细胞(例如胚胎干细胞(ES细胞))和间充质干细胞以及组织干细胞/前体细胞。
在第十方面，本发明提供制备表达外源DNA的细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶存在下，将外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；和
(g)在融合的受体细胞中选择表达所述外源DNA的细胞。
在本发明的一个实施方案中，上述受体细胞是动物细胞，优选哺乳动物细胞。此外，上述受体细胞可以是多能细胞(例如胚胎干细胞(ES细胞))和间充质干细胞以及组织干细胞/前体细胞。
在本发明的第十一方面，本发明提供蛋白的制备方法，所述方法包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶表达下，将编码蛋白的外源DNA***到上述21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；
(g)将所述融合的受体细胞在培养液中进行培养；和
(h)从所得培养物中收集所述蛋白。
在本发明的一个实施方案中，上述蛋白的实例可以包括红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、因子VIII、因子IX、血管假性血友病因子(vWF)、肌营养不良蛋白、多巴胺合酶、胰岛素、***(IGF)、***结合蛋白(IGFBP)、抗体、端粒酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生长激素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配体、干扰素、腺苷脱氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生长抑制因子(GIF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M、Flt3配体(Flt3L)、基质衍生因子(SDF)、干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、神经生长因子(NGF)、骨形态发生因子(BMP)、活化素、转化生长因子(TGF)和Wnt。
本文所用的术语定义如下。
本文所用的术语“人类人工染色体载体”或“HAC载体”是指基于人类染色体而产生的人工染色体。
本文所用的术语“人类染色体”是指来自人类细胞天然DNA和蛋白的复合体。通常有23种(男性有24种)共46条染色体，每条都含有约50-300Mb DNA。术语“人类染色体的片段”或“人类染色体片段”是指能作为独立染色体而稳定复制和分配的染色体部分，其片段大小通常为1Mb或更大，有时为1Mb或更小。
对于染色体来说，术语“长臂”和“短臂”是指染色体着丝粒两边的臂，按其长度称为长臂(q)和短臂(p)。此外，对于人类染色体来说，术语“长臂远侧区”或“长臂近侧区”是指相对于着丝粒而言在长臂上远端位置的区域(即在端粒一侧)或近端位置的区域。具体地讲，就21号人类染色体而言，长臂远侧区是指AL163204的端粒一侧，而长臂近侧区是指AL163203的着丝粒一侧；而就14号人类染色体而言，长臂远侧区是指AL132642的端粒一侧，而长臂近侧区是指AL157858的着丝粒一侧。此外，术语“短臂远侧区”或“短臂近侧区”是指相对于着丝粒而言在短臂上远端位置的区域或近端位置的区域。具体地讲，就21号人类染色体而言，短臂远侧区和近侧区是以AL163201为分界线；而就14号人类染色体而言，它们以核糖体RNA区为分界线。
本文所用的术语“位点专一重组酶”和“位点专一重组酶的识别位点”是用来描述这种现象的术语：其中酶识别专一识别位点并在该识别位点上以专一方式引起DNA重组，而且它们分别是指引起位点专一重组的酶和由该酶识别的位点。
本文所用的术语“人工端粒序列”是指人工添加的端粒序列。按照本发明，例如可以通过端粒截短来添加人工端粒序列。
本文所用的术语“外源DNA”是指从外面引入靶细胞内的DNA，也指基因编码DNA(希望所述DNA进行表达，用于制备材料、功能性修饰或功能性分析)，以及其他功能序列(例如启动子序列)，它可以是同源或异源的。
在描述人类人工染色体载体的转移或引入时，本文所用的术语“供体细胞”和“受体细胞”是指原来保持所述载体的细胞(供体细胞)和从供体细胞将所述载体转移到其中的细胞(受体细胞)。
附图简述
图1是一幅示意图，显示通过端粒截短而缺失21号人类染色体的长臂远侧区的方法。
图2显示PCR分析结果，表明在嘌呤霉素抗性DT40克隆中21号人类染色体的长臂远侧区的缺失。
图3是一幅照片，显示DNA印迹分析结果，表明在嘌呤霉素抗性DT40克隆中长臂远侧区的缺失，或者以位点专一方式引入的人工端粒序列。
图4a和图4b是照片，显示FISH分析结果，表明在嘌呤霉素抗性DT40克隆中长臂远侧区的缺失。图4a显示21号人类染色体(箭头)保留在DT40细胞中，而图4b显示21号人类染色体片段(箭头)中的长臂已经缺失。
图5是一幅示意图，显示以位点专一方式将loxP序列***到21号人类染色体的长臂近侧区的方法，其中所述长臂中远侧区已经缺失。
图6A和图6B是照片，显示DNA印迹分析结果(A)和PCR分析结果(B)，用于筛选杀稻瘟素抗性DT40克隆的同源重组体(其中loxP序列以位点专一方式引入到21号人类染色体中的克隆)。
图7a和图7b是照片，显示FISH分析结果，表明杀稻瘟素抗性CHO-K1克隆中保留了21号人类染色体(片段)。图7a显示在端粒截短前的全长(完整)21号人类染色体，而图7b显示21号人类染色体的片段，其中长臂远侧区已经缺失。
图8是一幅示意图，显示以位点专一方式将GFP构建体***到21号人类染色体的长臂近侧区的loxP序列中的方法。
图9是一幅荧光显微镜照片，显示GFP在G418抗性CHO-K1克隆中表达。
图10是一幅照片，显示DNA印迹分析结果，表明在G418抗性CHO-K1克隆的loxP序列发生了位点专一重组。
图11是一幅示意图，显示通过端粒截短而缺失21号人类染色体短臂远侧区的方法。
图12显示PCR分析结果，表明在潮霉素抗性DT40克隆中21号人类染色体短臂远侧区的缺失。
图13是一幅照片，显示DNA印迹分析结果，表明在潮霉素抗性DT40克隆中短臂远侧区的缺失，或者人工端粒序列以位点专一方式的引入。
图14是一幅照片，显示PCR分析结果，表明在潮霉素抗性DT40克隆中短臂远侧区的缺失，或者人工端粒序列以位点专一方式的引入。
图15a和图15b是照片，显示FISH分析结果，表明在潮霉素抗性DT40克隆中短臂远侧区的缺失。图15a显示缺乏长臂的21号人类染色体(箭头)保留在DT40细胞中，而图15b显示21号人类染色体的片段(箭头)中长臂和短臂都已缺失。
图16显示这样的结果：KH21E细胞培养物的上清液中产生的人EPO具有类似于重组人EPO蛋白(rhEPO)的细胞增殖活性。
图17是一幅照片，显示FISH分析结果，表明杀稻瘟素抗性HT1080细胞克隆中保留了21号人类染色体的片段(箭头)。
图18a和图18b是荧光显微镜照片(图18a)和相差显微镜照片(图18b)，显示GFP在G418抗性HT1080克隆中表达。
图19显示PCR分析结果，表明将来自21号人类染色体的HAC载体引入到G418或潮霉素抗性E14克隆中。
图20a和图20b是照片，显示FISH分析结果，表明在抗药性E14细胞克隆中保留了21号人类染色体的片段。图20a显示缺乏长臂远侧区的染色体片段(箭头)，而图20b显示染色体片段(箭头)中短臂远侧区也已缺失。
图21是一幅照片，显示FISH分析结果，表明在抗药性hiMSC细胞克隆中保留了21号人类染色体片段(箭头)。
图22a和图22b是荧光显微镜照片，显示当保留HAC的ES细胞在体外被诱导分化成神经细胞时，GFP的表达(图22a)和用抗β微管蛋白抗体的染色(图22b)。
实施本发明的最佳方式
下面将详细描述本发明。本发明要求于2002年10月4日申请的日本专利申请第2002-292853号的优先权，本发明说明书和/或其附图通过引用结合到本文中。
本发明涉及人类人工染色体载体(在下文也称为“HAC载体”)，所述HAC载体来自21号或14号人类染色体，并且包含21号人类染色体的片段或14号人类染色体的片段，其中所述染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区已经缺失。
对于21号人类染色体来说，在公用数据库中已经公开了完整长臂和不包含着丝粒区的部分短臂的核苷酸序列(例如参见http：//hgp.gsc.riken.go.jp/cbr21/index.html(Riken Genomic SciencesCenter，Human Genome Research Group))。通过运用这些序列信息，可以通过同源重组，以位点专一方式***下文所述的人工端粒序列或loxP序列。此外，约48Mb的21号染色体在缺失长臂远侧区后，将会减少三分之一，至约为16Mb；在长臂和短臂远侧区均缺失后，最终将构建不含未知基因的约2Mb的HAC载体。
在将21号人类染色体转移到小鼠ES细胞而形成嵌合小鼠的先前的实验中，转移的染色体片段遗传给下一代。人们认为，含有妨碍宿主细胞功能的转移染色体区的消除导致保持稳定(Kazuki等，J.Hum.Genet.，46，600，2001)。另一方面，就人类Y染色体而言，该染色体在小鼠ES细胞中是不稳定的，但是通过掺入来自小鼠染色体的白斑样DNA(该DNA是着丝粒的组分)，可以达到保持稳定(Shen等，Hum.Mol.Genet，.6：1375，1997)。这表明杂交细胞中人类染色体的稳定性随稳定性所涉及的染色体和着丝粒的不同而不同。因为先前的实验证明，21号人类染色体的着丝粒(大小约为2Mb：Triowell等，Hum.Mol.Genet.，2：1639-1649，1993；Wang等，Genome Res.9：1059-1073，1999)在小鼠细胞/个体中起作用，所以基于21号人类染色体片段制备的含有着丝粒区的本发明HAC载体有望在杂交细胞中稳定保留。
同样，在公用数据库中已经公开了14号人类染色体的部分核苷酸序列。此外，人们认为，类似于21号人类染色体，HAC载体中来自14号人类染色体的自发片段(SC20；Tomizuka等，P.N.A.S.97：722-727，2000)也可能降低大小。对于SC20，已经报道了缺乏14号人类染色体长臂大部分的远侧区和近侧区(Tomizuka等，P.N.A.S.97：722-727，2000；Kuroiwa等，Nature Biotech.(USA)，第18卷，第1086-1090页，2000)。具体地讲，SC20保留14号人类染色体长臂从端粒序列到AL137229(GenBank登记号)的区域以及在着丝粒一侧从AL121612(GenBank登记号)到AL157858(GenBank登记号)的端粒一侧的区域，包括24-26kb。此外，在AL137229(GenBank登记号)和AL121612(GenBank登记号)之间的区域以及在端粒一侧和着丝粒的AL157858(GenBank登记号)的位点24-26kb之间的区域缺失。另一方面，14号人类染色体的短臂区被保留。SC20在包括人类细胞和小鼠细胞在内的细胞系中被稳定保留(Shinohara等，Chromosome Res.，8：713-725，2000)，在其中loxP位点***到核糖体RNA区(位于14号人类染色体的短臂中)的修饰SC20中也被稳定保留(Kuroiwa等，Nature Biotech.(USA)，第18卷，第1086-1090页，2000)。此外，HAC(其中来自22号人类染色体片段的约10Mb不稳定染色体区易位到修饰SC20的loxP位点)在小鼠ES细胞和小鼠个体中可稳定保留。SC20的问题是，它含有来自14号染色体14q32区的许多基因，但是通过按照本文所述方法降低SC20的大小后，它可以在各种细胞类型中稳定保留，并且可以获得不含不必要基因的HAC载体。
下面描述本发明HAC载体的制备、将外源DNA***到所述载体中以及HAC载体的应用。
1.人类人工染色体(HAC)载体的制备
如上所述，本发明的HAC载体是基于21号人类染色体或14号人类染色体而产生的。本发明HAC载体的制备包括下述步骤(a)-(c)：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；和
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区。
在此，步骤(b)和(c)的顺序可以互换。
步骤(a)：保留人类染色体的细胞的制备
为了制备本发明HAC载体，制备保留人类染色体(例如21号人类染色体或14号人类染色体)的细胞。所述细胞最好是仅保留21号人类染色体或14号人类染色体的细胞，并且对于后面的操作来说具有高同源重组效率。因此，首先制备满足这些条件的细胞。
例如，可以通过筛选保留人类单条染色体的已知小鼠A9杂交细胞文库，得到保留21号人类染色体或14号人类染色体的克隆，并且将所述染色体转移到具有高同源重组效率的细胞中，来制备保留人类染色体的细胞。小鼠A9杂交细胞文库含有带抗药性基因标记的人类单条染色体，并且已经描述于例如WO00/10383，Tanabe，H.等，(Chromosome Res.，8：319-334，2000)中。此外，保留21号人类染色体和14号人类染色体的小鼠A9杂交细胞已经在日本研究生物资源保藏中心(the Japanese Collection of research Bioresources(JCRB))注册，注册号分别为JCRB2221(细胞名称：A9(Hygro21))和JCRB2214(细胞名称：A9(Hygro14))，一并提供可用的详细信息和培养条件。
将如上获得的小鼠A9杂交细胞中保留的人类染色体转移到具有高同源重组效率的细胞中。“具有高同源重组效率的细胞”是指当经历同源重组时，显示出高同源重组频率的细胞，所述细胞的实例包括鸡DT40细胞(Dieken等，Nature Genetics，12：174-182，1996)和小鼠ES细胞(Shinichi Aizawa，Biomanual Series 8，Gene Targeting，Yodo-sha Co.，Ltd.，1995)。为了容易操作，最好采用鸡DT40细胞用于本发明的方法。
通过本领域已知的染色体转移的方法，进行染色体的转移。例如，用于引入仅一个所需染色体的方法包括微细胞法，该方法描述于Koi等(Koi等，Jpn.J.Cancer Res.，80：413-418，1973)。该方法包括分离被化学物质诱导的微细胞(所述化学物质在某些细胞中抑制纺锤体的形成)，然后将这些微细胞与受体细胞融合，以引入若干染色体。对于采用该微细胞法转移人类染色体的具体程序，参见例如WO97/07671和WO00/10383。因此，可以制备保留21号人类染色体或14号人类染色体的细胞。
或者，在本发明的另一方面，可以使用保留自发片段化染色体(例如14号人类染色体片段(SC20))而不是完整21号人类染色体或14号人类染色体的细胞。保留SC20染色体片段的鸡DT-40细胞(SC20)已经于2001年5月9日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(the National Institute of Advanced Industrial Scienceand Technology，the International Patent Organism Depositary(Chuo 6，Higashi 1-1-1，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan))，保藏号为FERM BP-7583。
步骤(b)：人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区的缺失
为了从保留人类染色体的细胞制备HAC载体，使人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区缺失。可以进行染色体的缺失，即通过本领域已知方法，优选通过描述于WO00/10383的用人工端粒序列取代(端粒截短)的方法。用于缺失长臂远侧区和/或短臂远侧区的具体方法包括例如在保留人类染色体的细胞中构建携带人工端粒序列的打靶载体，获得其中人工端粒序列已经通过同源重组***到染色体上所需位点的克隆，而且通过端粒截短获得缺失突变体(参见例如Itzhaki等，Nature Genet.，2：283-287，1992；Brown，P.N.A.S.，93：7125，1996)。染色体上所需位点是指长臂远侧区或短臂远侧区有待缺失的切割位点，在该位点通过同源重组***人工端粒序列，并且用人工端粒序列取代长臂或短臂的远侧区(端粒截短)。当构建打靶载体时，并且当缺失长臂远侧区时，可以通过设计靶序列来设定所需位点，例如，按照21号人类染色体上21q11区内的核苷酸序列、优选在AL163204(GenBank登记号)的核苷酸序列，来设计靶序列，使得端粒截短将会在靶序列的端粒一侧发生，因此，在用于设计靶序列的位点切下长臂远侧区(参见例如Kuroiwa等，Nucleic Acid Research，26：3447，1998)。此外，当缺失短臂远侧区时，可以按照21号人类染色体上21p区内的核苷酸序列、优选在AL163201(GenBank登记号)的核苷酸序列，来设计靶序列。本领域技术人员可以设计靶序列，以便适当地产生所需HAC载体，而不限于上述区域。
此外，例如当14号人类染色体的长臂序列在靠近着丝粒的位点而不是在SC20的位点上缺失时，可以按照AL157858区内核苷酸序列来设计靶序列，以便让端粒截短发生在靶序列的端粒一侧，因此，在用来设计靶序列的位点上切下长臂远侧区。此外，例如当短臂远侧区缺失时，可以按照14号人类染色体的14p区内核苷酸序列、优选按照14p12区内核苷酸序列、更优选按照以下核苷酸序列来设计靶序列：OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6或OR4M1(在线基因组数据库( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi？ORG＝hum&CHR＝14&BEG＝0.00&ENI)由美国国立生物技术信息中心(NCBI)提供)。本领域技术人员可以设计靶序列，以便适当地产生所需HAC载体，而不限于上述区域。
此外，例如当缺失完整14号人类染色体长臂序列时，可以按照14q区内核苷酸序列、优选按照AL512310(GenBank登记号)的核苷酸序列，来设计靶序列，使得端粒截短将在靶序列的端粒一侧发生，因此，在用于设计靶序列的位点切下长臂远侧区。此外，例如当缺失短臂远侧区时，可以按照14号人类染色体的14p区内核苷酸序列、优选按照在14p12区的核苷酸序列，更优选按照以下核苷酸序列来设计靶序列：OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6或OR4M1(在线基因组数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi？ORG＝hum&CHR＝14&BEG＝0.00&ENI)由美国国立生物技术信息中心(NCBI提供)。本领域技术人员可以设计靶序列，以便适当地产生所需HAC载体，而不限于上述区域。
如上所述，已经形成了缺失长臂远侧区和/或短臂远侧区的人类染色体片段，并且提供了保留这些染色体片段的细胞。通过如上所述降低染色体的大小，达到在细胞中的稳定性。此外，染色体区可以缺失，估计它对保留HAC载体的细胞和下文描述的向其中导入HAC载体的细胞的功能/增殖具有副作用。
步骤(c)：位点专一重组酶识别位点的***
为了制备本发明HAC载体，将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体中。可以在步骤(b)之前或之后进行步骤(c)，其顺序并没有具体限制。在21号人类染色体或14号人类染色体中，可以在缺失长臂远侧区和/或短臂远侧区之后***位点专一重组酶识别位点，或者，可以在***位点专一重组酶识别位点之后缺失长臂远侧区和/或短臂远侧区。
在本领域中，已知某种酶识别特定识别位点并在所述识别位点上专一诱导DNA重组，本发明利用所述酶和识别位点***。所述***的实例包括Cre/loxP***(参见例如Sauer，B.等，P.N.A.S.，85：5166-5170，1988)。Cre是一种来自噬菌体P1的38KD蛋白，属于重组酶Int(整合酶)家族。该酶识别约34bp的识别位点loxP序列，并在该位点专一诱导DNA重组。此外，已知两个loxP序列之间的DNA缺失和易位的发生取决于该loxP序列的定位。专一识别序列和专一重组的其它***包括来自芽殖酵母的重组酶FLP(Broach等，Cell.21：501-508，1980)、来自噬茵体phiC31的整合酶(Thorpe等，P.N.A.S.，95：5505-5510，1998)和能够在哺乳动物细胞中诱导DNA重组的酶(Koch等，Gene，249：135-144，2000；Thyagarajan等，Mol.Cell.Biol.，21：3926-3934，2000)。
本领域已知用于基因重组的方法，例如同源重组方法，可以用于将位点专一重组酶识别位点***到人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区。本领域技术人员通过考虑不必要基因的位置，能适当地设计位点专一重组酶识别位点的***位置。例如，将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中的任何位置。***位置包括例如21号人类染色体长臂近侧区内的AL163203，以及比14号人类染色体长臂近侧区内的AL157858(GenBank登记号)更近的区域，更优选比14号人类染色体长臂近侧区内的AL512310(GenBank登记号)缺失位点更近的区域或者比14号人类染色体短臂近侧区内的14p12区内缺失位点更近的区域。
按照下面描述的用于引入外源DNA的方法，随后引入报道基因，可以检查所述基因的表达，以证实***人类染色体上识别位点的适当位置。
可以***上述类型之一的一个或多个识别位点，或者来自不同***的许多识别位点。如下所述，因为可以按位点专一方式引入外源DNA，可以通过将识别位点放在所需位点，来测定外源DNA的引入位置，既然HAC载体具有位点专一重组酶识别位点，所以外源DNA的引入位置将是稳定的，不受位置效应的影响。此外，引入外源DNA的方法既简单又容易。此外，随后可以通过***许多来自不同***的识别位点来顺序引入多种外源DNA。
除了位点专一重组酶识别位点以外，通常可以将***到构建载体(例如启动子和抗药性基因)中的序列或元件***到由如上人类染色体修饰而制备的HAC载体中。可以使用如上所述的同源重组方法，将所述序列或元件***到HAC载体的所需位点上。
此外，通过在不含任何选择药物的培养液中，在一段较长的时期内，传代培养保留如上所述制备的HAC载体(21号人类染色体或14号人类染色体)的细胞，并且通过FISH法连续检查HAC载体的保留率，本发明人已经证实，HAC载体可以在宿主细胞(例如DT40细胞和CHO细胞)中稳定保留。
2.将外源DNA引入到HAC载体中(步骤(d))
在上述HAC载体的制备中，在位点专一重组酶存在下，可以进行***外源DNA的步骤(d)，以将外源DNA引入到HAC载体中。步骤(d)应接在步骤(c)后面，但是也可以在步骤(b)前面或接在其后。因此，应该注意，本文中并没有限制步骤(b)-(d)的顺序。
外源DNA是指来自外面并导入细胞中的DNA，所述DNA编码基因和其它功能序列。在本发明的实施方案中，待引入的外源DNA可以是任何DNA，所述DNA编码用于表达所需材料生产、功能性修饰和功能性分析的基因或其它功能序列。其它功能序列是指起着表达基因作用的序列，例如启动子、增强子和信号序列。
利用位点专一重组酶***引入外源DNA。例如，构建保留loxP序列(所述序列是Cre酶的识别位点)和外源DNA的打靶载体。然后，通过在保留HAC载体(21号人类染色体或14号人类染色体)的细胞中表达Cre酶，可以将外源DNA***到HAC载体中，即通过与loxP序列和具有上述打靶载体的人工端粒序列相邻区域的位点专一重组(Kuroiwa等，Nature Biotech.，18：1086，2000)。
可以将保留位点专一重组酶识别位点(loxP序列)的环状DNA***到HAC载体中。因此，可以用现有载体(例如用于大肠杆菌的质粒、BAC和PAC和用于酵母的环状YAC)***克隆DNA。此外，因为HAC载体是基于人类染色体的，所以所引入的外源DNA的大小将增加100kb数量级，使得可以引入含有基因表达调节区基因的基因组DNA以及***到质粒载体的cDNA，所述质粒载体已经常规用于表达实验。
例如，在通过将外源DNA***到HAC载体中而产生的含有外源DNA的HAC载体中，它的稳定结构可以因***而改变，或者含有外源DNA的HAC载体的完整大小可以不利地增加，所以待引入(***)的外源DNA的大小通常约为10Mb至约1kb，优选约3Mb至约2kb，更优选约1Mb至约3kb。
因为使用载体以迫使cDNA表达的常规基因引入方法具有过量表达的副作用(例如细胞毒性和生长抑制)，所以在许多情况下没能得到允许稳定表达引入基因的细胞克隆。希望使用例如四环素的基因表达诱导***来克服所述问题，并且在保持生理表达模式时人工控制表达。可引入的***HAC载体是大载体，保持稳定拷贝数对于所述目的来说是合适的。
在从编码基因的基因组区转录、剪接转录产物、核外转运和翻译过程中，组织特异性/生理基因表达是受控的。一个基因具有许多启动子，已知在转录起始位点的差异和剪接的不同会导致组织特异性同种型。克隆cDNA是来自基因的唯一的转录变异产物。含控制序列的基因区最好是作为基因组DNA引入，以重现生理基因表达。利用HAC载体达到了该目的。
因为证实当从保留21号人类染色体片段的小鼠ES细胞产生嵌合体时，能遗传给下一代，所以人们认为21号人类染色体的着丝粒被复制、分配和保留在小鼠细胞和小鼠中(Kazuki等，J.Hum.Genet.，46：600，2001)。因此，很可能HAC载体同样也在小鼠中被稳定保留。
在人类基因组计划中，分离基因组DNA作为BAC克隆，然后测定其核苷酸序列。因此，所述核苷酸序列已在数据库(例如GenBank)中作为BAC注册。分析基因功能的技术之一是产生转基因小鼠。通过将BAC***到作为平台的HAC载体中，可以在恒定条件下分析基因表达，而不会受到位置效应的影响。因为许多BAC载体含有loxP序列，所以可以通过使用一个用于***HAC载体的负选择***，将已知核苷酸序列的BAC容易地***到HAC载体中作为一个盒。
也有其它用于将外源DNA引入到HAC载体中的方法和其它引入的优点，下面是一些实例。
(1)通过相互易位引入染色体片段
由Cre酶在loxP序列间的位点专一重组涉及在线状染色体和环状***序列(外源DNA)情况下的***反应，但是相互易位反应发生在线状染色体间。采用此法，可以将不能克隆到环状***序列中的Mb级或更大的染色体片段引入到HAC载体中(Kuroiwa，Gene Ther.9：708，2002)。
(2)携带***序列的重组体的选择方法
在本发明的实例描述的方法中，将外源DNA***到HAC载体中，采用了基于作为指示物的抗药性基因重组的正选择(参见WO00/10383关于重组体的正选择)。或者，可以采用胸苷激酶/更昔洛韦***等负选择，获得携带***序列的DNA(已***了外源DNA的DNA)。在此情况下，在待***的环状DNA中仅能包括loxP序列。因为用于基因组计划的BAC文库含有loxP序列，所以可以容易地将已知序列的基因组克隆***到HAC载体中，如果用于负选择的所述***能建立的话。
(3)多个***序列的***
本发明中优选使用的loxP序列是来自P1噬菌体的野生型序列，由Cre酶将环状***序列***到HAC载体的loxP序列中的***反应是可逆的。在本发明的一个实例中，Cre酶是瞬时表达的，并且根据获得的抗药性选择位点专一重组体，以得到携带***序列的组成型DNA。一旦***了环状***序列时，两个loxP序列保留在HAC载体中。因此，如果Cre酶再表达的话，可以发生可逆反应(环状***序列的切除)，这使得对于HAC载体的其它修饰(例如***第二***序列)难以进行。另一方面，可以限制反应方向和特异性，这取决于变异型loxP序列与核苷酸取代的组合(Hoess等，Nucleic Acids Res.，14：1986；Araki等，Nucleic Acids Res.，25：868，1997；Lee等，Gene，216：55，1998)。通过使用这些变异型loxP序列，可以序贯地构建***许多环状***序列的***，而不诱导如上所述的可逆反应。
(4)拷贝数依赖性表达控制
使用携带α-珠蛋白基因的转基因小鼠，分析随机***到宿主染色体中的基因拷贝数和mRNA表达水平之间的关系(Sharpe等，ProcNatl Acad Sci USA，90：11262，1993)，显示引入基因的表达水平和拷贝数之间没有关系。这可能是因为被称为位置效应的现象引起，其中引入基因的表达水平显著不同，它取决于所用的转基因动物品系，而与引入基因的拷贝数不成比例关系，该现象在转基因动物的基因转移中频繁发生。此外，将外源DNA***到预先确定的loxP位点(该位点是引入到宿主染色体内以排除引入基因的位置效应)，并且通过Cre-loxP重组反应，将靶DNA单元从质粒载体引入到转基因小鼠中(Garrick等，Nature Genet.，18：56，1998)；然而，没有得到拷贝数依赖性表达控制。
同时，尽管在使用引入酪氨酸酶基因组区的YAC产生的转基因小鼠中观察到酪氨酸酶在引入基因组区中的拷贝数依赖性表达(Schedl等，Nature，362：258-261，1993)，但是人们认为，位置效应是不同的，因为所采用的含有生理表达控制区的基因组不同于本发明，其中仅复制不含生理控制区的人工基因表达单元。此外，各种附加体载体是独立于宿主染色体之外的，外源DNA***位点是固定的，但是没有达到严格控制载体拷贝数(Morlino等，ppl Environ Microbiol，65：4808-4013，1999；Cooper等，Proc Natl Acad Sci USA，94：6450-6455，1997)。
在本发明中，如实施例9所述，通过平行排列多拷贝靶基因(EPO)表达单元，并将它们引入到HAC载体上预先确定的位置(loxP位点)，可以得到拷贝数依赖性表达控制，而不引起宿主染色体的变化。
因此，按照本发明的方法，可以将作为外源DNA的多拷贝靶基因引入到所需细胞中，并且在所述细胞中以拷贝数依赖性方式表达所述靶基因，在用所述细胞产生的转基因动物中达到先前困难的靶基因拷贝数依赖性表达，而没有位置效应。
3.将HAC载体转移到细胞中
可以将HAC载体或含有外源DNA的HAC载体从保留这些载体的细胞转移到其它细胞中。待转移这些载体的细胞包括但不限于动物细胞(哺乳动物细胞)。按照本发明，优选使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，该细胞已知可用于人类染色体的完整转移(参见WO00/10383)。已知CHO细胞有效形成微细胞(参见例如Koi等，SCIENCE 260：361，1993)，而HAC载体可进一步从CHO细胞转移到其它细胞(不是CHO细胞的细胞)。此外，按照本发明，可以将HAC载体转移到多能细胞中。术语“多能细胞”是指能通过特定过程分化成特定细胞或组织的细胞。多能细胞的实例包括能通过输注到宿主胚胎并形成综合胚(collective embryo)等操作，在嵌合动物中分化成两种或多种细胞或组织类型的细胞，例如胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)和胚胎癌性细胞(EC细胞)。也包括能够通过在补充了例如生长因子(不包括转化生长因子，TGF)的诱导物培养液中培养而分化成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞的细胞，更具体地讲，包括体干细胞(不包括间充质干细胞)。
本文所用的术语“胚胎干细胞”或ES细胞是指来自早期胚胎的培养细胞，其特征是能够繁殖并同时仍保持未分化特性(全能性)。胚胎干细胞是通过在内部细胞块中培养细胞而建立的细胞系，是存在于动物原始胚胎的胚泡内未分化干细胞，所述细胞不断繁殖并同时保持未分化状态。术语“胚胎生殖细胞”或EG细胞是指来自原始生殖细胞的培养细胞，其特征是能力几乎相当于以上胚胎干细胞。胚胎生殖细胞是通过培养得自受精后几天至几周(例如对于小鼠是在受精后约8.5天)的胚胎的原始生殖细胞而建立的细胞系，所述细胞不断繁殖并同时保持未分化状态。
此外，根据避免癌变的安全要求，用作人类基因和细胞治疗和组织再生治疗原料的细胞应该是正常细胞，而不是无限增殖化细胞。尽管有大量实例是将染色体转移到人类和其它动物的无限增殖化细胞和癌细胞中，但是迄今为止在美国国立生物技术信息中心(NCBI)在线参考文献数据库PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝PubMed)中搜索以下关键词，没有报道将染色体转移到正常体细胞中的实例：chromosome、transfer、human、normal、primary或somatic和cell；除了报道过转移到正常牛胎成纤维细胞中以外(Kuroiwa等，NatureBiotech，20：889，2002)。因此，通常认为，将染色体转移到人类正常体细胞中是困难的。
本发明的实施例13和实施例14首次证明，将来自14号人类染色体片段或21号人类染色体的HAC载体转移到人类正常成纤维细胞中的可行性。此外，按照本发明的方法，将来自14号人类染色体片段或21号人类染色体的HAC载体转移到人类正常体细胞(而不是成纤维细胞)中是可行的。此外，用本发明方法产生的来自人类染色体的任何HAC载体都可以转移到人类正常体细胞中，而不限于14号人类染色体或21号人类染色体。
可以用微细胞法将HAC载体转移到细胞中。所述微细胞法可以按照以上“1.人类人工染色体(HAC)载体的制备”描述的方法进行。
此外，为了将HAC载体转移到细胞中，可以在任何时期，在修饰人类染色体之前、期间或之后，将人类染色体(HAC载体)从起先保留人类染色体的细胞转移到其它细胞中。
4.HAC载体的应用
本发明的目的是提供载体作为基本工具并提供使用所述载体的技术，预期其在从科学研究到工业等众多领域中的作用。本发明HAC载体的特征为：(1)它不***到宿主染色体中而保持独立(不用担心宿主基因的变异或癌变)，(2)长期保持稳定的拷贝数(不用担心过量表达或表达不足)，和(3)有待引入的DNA长度不限(可以同时引入含有保证正常表达控制的DNA元件的基因和多基因)，这将使得用常规载体难以达到的大量工作能够完成。HAC载体的应用实例包括但不限于：(1)用于在培养动物细胞中进行基因功能分析的载体，(2)用于对人类疾病进行基因治疗的载体，(3)将基因转移到人类器官干细胞和胚胎干细胞(ES细胞)的载体，和(4)用于产生转基因动物(例如产生人类疾病模型动物和将与KO动物结合的特定基因人源化)的载体。下面描述使用HAC载体的实例：(1)将外源DNA导入受体细胞中，(2)产生表达外源DNA的细胞，(3)产生蛋白质，(4)用于基因功能分析的载体，(5)用于将基因转移到干细胞的载体，(6)用于产生培养饲养细胞的载体，和(7)用于治疗人类疾病的载体。
(1)将外源DNA导入受体细胞中
因为可以将外源DNA导入细胞中的HAC载体，而且带有***外源DNA的HAC载体可以转移到其它细胞，所以外源DNA可以导入所需受体细胞中。将外源DNA导入受体细胞中包括例如下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶存在下，将外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；和
(g)证实所述外源DNA导入融合的受体细胞中。
可以如上所述进行步骤(a)-(d)，而不限制它们的顺序。
在步骤(e)和(f)中，用微细胞法将染色体片段从保留人类染色体的供体细胞转移到受体细胞中。有待转移的人类染色体可以是在步骤(b)-(d)中修饰染色体之前、期间或之后的任何人类染色体。因此，在步骤(d)中，例如可以采用微细胞法，在将外源DNA***到人类染色体之前，将染色体从保留人类染色体的供体细胞转移到受体细胞中。随后，可以在受体细胞中进行步骤(d)的外源DNA***步骤，以使受体细胞保留***有外源DNA的人类染色体。这些步骤可以按任何其它顺序进行，步骤(d)-(f)的顺序并不限于上述顺序。
按照以上“1.人类人工染色体(HAC)载体的制备”描述的方法，进行微细胞法。本文所用的受体细胞包括但不限于动物细胞，优选哺乳动物细胞(例如小鼠细胞、人类细胞)。此外，如上所述，多能细胞，例如胚胎干细胞(ES细胞)和间充质干细胞和组织干细胞/前体细胞也可用作受体细胞。
步骤(g)是用来证实所述外源DNA是否已引入到(转移到)受体细胞中。可以通过本领域已知方法来进行证实这一点，例如DNA印迹分析法，所述方法使用了对应于外源DNA限制酶位点的探针。
HAC载体的应用使得可以将大的外源DNA导入细胞中并在细胞中稳定保留。
(2)表达外源DNA的细胞的产生
如上所述，因为可以将外源DNA导入细胞内的HAC载体中，而且携带***外源DNA的HAC载体可以转移到其它细胞，所以可以产生表达外源DNA的细胞。产生表达外源DNA的细胞的过程例如包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶存在下，将外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；和
(g)从融合的受体细胞中选择表达所述外源DNA的细胞。
可以如上所述进行步骤(a)-(f)，而不限制它们的顺序。
步骤(g)是用来证实所述外源DNA是否在受体细胞中表达并且选择表达所述外源DNA的细胞。可以通过本领域已知方法来证实所述外源DNA的表达，例如RNA印迹分析法，所述方法使用对应于外源DNA的探针。
HAC载体可以用于制备表达大的外源DNA的细胞。
(3)蛋白的制备
如上所述，因为可以将外源DNA导入细胞中，而且可以通过使用HAC载体来产生表达外源DNA的细胞，所以可以产生由所述外源DNA编码的蛋白。蛋白的制备过程例如包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶表达下，将编码蛋白的外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；
(g)将所述融合的受体细胞在培养液中进行培养；和
(h)从所得培养物中收集所述蛋白。
可以如上所述进行步骤(a)-(f)，而不限制它们的顺序。
步骤(g)是用来在培养液中培养步骤(f)中融合的受体细胞的。用于培养受体细胞的培养液可以是含有碳源、氮源和矿物质的任何天然或合成培养液(所述培养液能有效培养受体细胞)，本领域技术人员可以选择合适的培养液，并且如有必要，可对所述培养液进行适当改良。设置合适的需氧条件、温度、pH和培养时间，进行振荡培养或需氧旋动培养。
培养后，如步骤(h)所述，从所得培养物中收集蛋白。术语“培养物”是指任何培养细胞或破碎的细胞和培养上清液。培养后，可以采用常规的蛋白质纯化方法，从培养物中收集蛋白。例如，当蛋白是细胞内产生时，用超声破碎、研磨和加压粉碎等常规方法进行提取。必要时加入蛋白酶抑制剂。当蛋白是在上清液中产生时，可以使用培养肉汤本身。将该溶液过滤，离心去除固体物，并且如有必要，用鱼精蛋白处理，以去除核酸。
随后，可以向溶液中加入硫酸铵、乙醇和丙酮，将其进行分级分离，收集沉淀，得到粗制蛋白溶液。将蛋白溶液进行各种层析和电泳分析，以得到纯化的酶。例如，从所述分级分离方法中选用合适的方法，例如用交联葡聚糖、ultragel或生物胶的凝胶过滤、离子交换层析、采用例如聚丙烯酰胺凝胶的电泳、亲和层析和反相层析，或这些方法的组合，来得到纯化的靶蛋白。所提供的这些培养和纯化方法仅用于说明目的，并且不应认为是对本发明的限制。
本发明的靶蛋白可以是任何所需蛋白，包括例如红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、血管假性血友病因子(vWF)、肌营养不良蛋白、多巴胺合酶、胰岛素、***(IGF)、***结合蛋白(IGFBP)、抗体、端粒酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生长激素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配体、干扰素、腺苷脱氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生长抑制因子(GIF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M、Flt3配体(Flt3L)、基质衍生因子(SDF)、干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、神经生长因子(NGF)、骨形态发生因子(BMP)、活化素、转化生长因子(TGF)和Wnt。可以运用例如公用基因数据库，获得编码这些靶蛋白的基因(即外源DNA)的序列信息。
(4)用于基因功能分析的载体
***到HAC载体中的外源DNA以拷贝数依赖性和稳定方式在细胞内表达，所以可以用HAC载体来分析基因功能。
RNA干扰是通过表达双链RNA(dsRNA)来控制靶基因表达的已知方法，所述双链RNA包含编码所述靶基因的部分核苷酸序列的互补序列(有关短的干扰RNA(siRNA)，参见例如Elbashir等，Nature，411：494，2001；McCaffrey等，Nature，418：38，2002)。另外参见Shinagawa，T.等，Genes & Development，17：1340-1345，2003)。将编码dsRNA的DNA与基因表达诱导***一起引入到HAC载体中，可以对靶基因功能进行条件控制。通过利用基因组区来替代基因表达诱导***，可以在组织特异性/生理位点进行功能控制。
可以使用其剂量依赖性用作指标来分析靶分子效应的方法。在该方法中，通过将编码本发明靶分子的基因的表达单元引入到HAC载体中，通过改变拷贝数，然后转移到细胞(包括组织和个体)中，可以在细胞中进行基于拷贝数依赖性表达控制的剂量依赖性分析。此外，用于控制基因表达的表达诱导***或基因组区可以用于条件分析或组织特异性/生理功能分析。
(5)用于将基因转移到干细胞中的载体
如实施例20和实施例21所述，用本发明方法产生的HAC载体可以用作载体，用于将基因转移到胚胎干(ES)细胞或间充质干细胞(MSC)中。上述HAC载体可以在ES细胞或MSC中长期保持稳定。
如实施例20和实施例21所述，HAC载体在组织细胞中保持稳定，所述组织细胞来自保留用本发明方法产生的HAC载体的MSC。因为当从保留21号人类染色体片段的小鼠ES细胞产生嵌合小鼠时，所述染色体片段遗传给下一代和细胞，所述细胞从保留21号人类染色体片段的组织的ES细胞分化而来(Kazuki等，J.Hum.Genet.，46：600，2000)，用本发明方法产生的HAC载体在组织细胞中同样也可保持稳定，所述组织细胞从转移了HAC载体的ES细胞分化而来。
近年来，已经鉴定了来自各组织的干细胞和来自骨髓的多能细胞(Yokota等，Jikken Igaku(号外)，第19卷，第15期，2001，Yodo-sha；Okano等，Jikken Igaku(号外)，第21卷，第8期，2003，Yodo-sha；Li等，Nature Med.，online：2003年8月31日，doi：10.1038/nm925)。用本发明方法产生的HAC载体可以作为载体，用于将基因转移到组织干细胞/前体细胞，例如来自骨髓、血、神经、肌肉、肝、胰腺、皮肤和内耳的多能干细胞/前体细胞中。
此外，对于人类ES细胞、MSC和组织干细胞/前体细胞的临床应用，有必要扩增治疗所需的细胞数量，并且按所需的分化状态来提供。通常，仅大量繁殖干细胞同时又保持多能性并不容易(Hino，Jikken Igaku，第19卷，第15卷(号外)：10，2001，Yodo-sha)。例如，当从活组织收集造血干细胞和神经干细胞并进行培养时，不仅干细胞、而且前体细胞以及从干细胞分化而来的成熟细胞同时繁殖，使其难以用于临床(Okano，S.，Jikken Igaku，第19卷，第15期(号外)：80-90，2001，Yodo-sha)。
在本发明中，通过制备掺入编码涉及保持多能性的因子的DNA的HAC载体，并将其转移到干细胞，可以繁殖干细胞，同时又保持多能性，而不使宿主染色体发生突变；所述涉及保持多能性的因子例如转录因子，就小鼠ES细胞而论，例如活性Stat3、Oct-3/4和Nanog(Niwa等，Genes Dev.，12：2048，1998；Matsuda等，EMBO J.，18：4261，1999；Niwa等，Nature Genet.，24：373，2000；Mitsui等，Cell，113：631，2003；Chambers等，Cell，113：643，2003)。
此外，在控制干细胞分化中，对所涉及的分子表达水平的控制是一个重要因素。例如，在由上述Oct-3/4对小鼠ES细胞分化的控制中，当其生理表达水平保持在100％时，可保持未分化状态；而当其保持在50％或更低时，则分化成滋养外胚层；而当其保持在150％或更高时，则分化成原始内胚层(Niwa等，Nature Genet.，24：373，2000)。当通过改变表达水平来控制分化时，可以通过将基因表达开/关诱导***(例如基于四环素的表达诱导***)引入到用本发明方法产生的HAC载体中，来进行表达水平的严格控制。
此外，可以通过将基因表达开/关诱导***(例如基于四环素的表达诱导***)和分化诱导因子引入到用本发明方法产生的HAC载体中，来进行多能状态和诱导分化状态之间的转换。
当采用干细胞进行组织再生时，移植细胞或来自供体的再生组织将在延长的周期内(希望是终身)作为受体部分起作用。因此希望尽量避免可以成为背离生理控制的诱因(例如基因突变，例如在供体细胞中癌变)的操作。因为HAC载体可以独立于宿主染色体，所以可以进行基因转移，而不用修饰宿主染色体。此外，如实施例13、14、18和19所述，因为HAC载体在人类细胞中保持稳定，所以它可以长期稳定地表达靶分子。
通过制备其中已引入与靶基因融合的DNA的本发明HAC载体(所述DNA处于基因组序列控制下，所述基因组序列含有在分化组织中表达的基因组区或者组织特异性表达控制区)，并且通过使用其中转入了HAC载体的干细胞，可以在再生组织中以生理/组织特异性方式表达靶分子。
当诱导用本发明方法产生的保留HAC载体的干细胞分化后，HAC载体就不需要了，除非引入基因的表达需要的话。在采用例如但不限于抗药性在选择性培养液中作为指示物时，在诱导分化后，通过分选遗漏了HAC载体的克隆，即可去除已成为不必要的HAC载体。
(6)用于产生培养饲养细胞的载体
已知一种方法可作为细胞培养方法，所述方法包括将贴壁细胞铺在培养瓶床上并且向这些培养饲养细胞上接种靶细胞进行共培养(Ed.Japanese Biochemical Society，Shin-Seikagaku-Jikken-Koza 14-generation，differentiation and aging，1992，Tokyo Kagaku Dojin)。例如，当繁殖造血前体细胞时，制备必要的因子，例如SCF、Flt3L、TPO、IL-6和sIL-6R，作为例如重组蛋白，并加入到培养液中(Ueda等，J ClinInvest.，105：1013-1021，2000)。尽管可以通过常规方法，将加入到培养物中的基因引入到培养饲养细胞中，但是因为随机***到宿主染色体所引起的变异/位置效应、表达失活和因多拷贝表达单元的平行排列所致的下游基因表达衰减，所以很难通过控制每种因子所需水平的表达来供应它们。通过产生掺入编码本发明方法的这些必要因子的所有(或部分)DNA的HAC载体，并将其转移到培养饲养细胞，可以仅仅通过简单的共培养，容易地供应所有必要因子，而无需在其后加入重组蛋白。此外，使用基因表达诱导***能够对这些因子的表达进行条件控制。
(7)用于治疗人类疾病的载体
对于用于治疗人类疾病的载体，已经研究了各种病毒载体和非病毒载体，人们注意到，一些问题(例如引发免疫应答)限制了待引入的DNA的大小、宿主染色体的***突变、低引入/表达效率以及难以控制表达水平(Kaneta，Y.，Rinsho Menneki，第39卷：551-558，2003，Kagaku Hyoron-sha，Ozawa，T.，Idennshi Chiryo编著，1997，Yodo-sha)。对于所有载体，一个常见的问题是“在恰当的时间、以所需的水平来控制表达”。
利用HAC载体进行基因治疗和细胞治疗策略的实例包括：(i)补充原来缺乏的酶和蛋白，(ii)支持疗法以补充后来缺乏的代谢物，(iii)将新功能加给细胞以改善其活力的方法(例如在组织再生中利用修饰细胞，可以通过将基因组DNA引入其中，使HAC载体能进行生理/组织特异性基因表达控制。这有助于避免因过量表达或表达不足等副作用所带来的功能障碍)，和(iv)预防功能获得性(gain-of-function)变性性疾病的方法(例如帕金森病的GDNF替代疗法)。
HAC载体可以用作人类疾病治疗的载体，可以将掺入治疗性外源DNA的HAC载体转移到细胞，然后将其制备成药用组合物，给予患者。此外，用于治疗人类疾病的载体可以用来预防疾病以及治疗疾病。
下面提供用作治疗人类疾病的载体的实例，所述实例仅仅用于说明目的，而不是用来限制本发明的范围。
(A)端粒酶的应用
出于安全性的考虑，用作基因治疗、细胞治疗和组织再生治疗原料的细胞应该是正常细胞，而不是无限增殖化细胞。然而，当正常体细胞经历了一定***次数后，已知它们会老化，或在不久以后停止繁殖/***，导致死亡(Ide，T.，Jikken Igaku，第16卷，第18期号外：18-24，1998，Yodo-sha)。可以在一定周期内维持治疗性细胞，希望能维持到患者的终身，这样才能保证长期的治疗效果。已知正常细胞中端粒酶的过量表达将抑制细胞老化中发生的端粒缩短并延长细胞寿命，所述端粒酶是存在于染色体末端重复序列端粒的修复酶(Bodnar等，Science，279：349-352，1998)。此外，已经显示端粒酶过量表达并不会诱导细胞的无限增殖化或癌变(Shinkai，Y.，Jikken Igaku，第16卷，第18期号外：25-30，1998，Yodo-sha；Jiang等，Nature Gent.，21：111-114，1999)。因此，可以通过将携带编码人类端粒酶(hTERT)基因的本发明方法的HAC载体转移到靶细胞，延长保留HAC的细胞的寿命，并且提供长期治疗效果，而不会诱导无限增殖化或癌变。此外，用于控制基因表达的表达诱导***或基因组区的使用，将使端粒酶能够进行条件表达或组织特异性/生理表达。
(B)抑制自身抗体的产生
在开发重组蛋白制剂时，给药后自身抗体(活性中和抗体)的产生是一个障碍(Li等，Blood，98：3241-3248，2001)。尽管不想限制给予患者的给药方法，但是将用本发明方法产生的HAC载体(其中已引入编码靶蛋白的基因组)转移到在生产组织中的人类细胞(例如正常的人类细胞)，然后移植给患者。在患者体内，HAC载体可以按生理/组织特异性方式表达并供应靶蛋白，以抑制患者体内自身抗体的产生。
(C)在细胞治疗中参与免疫的基因的基因转移用载体
作为复发性白血病的疗法，已知供体淋巴细胞输注疗法(Kolb等，Blood，76：2462，1990)，所述疗法利用如下现象：移植淋巴细胞作为肿瘤特异性细胞毒T细胞，通过移植物-白血病反应，攻击白血病细胞。作为针对移植物抗宿主病的方法，其中移植细胞攻击和损害受体组织的上述疗法的副作用，通过使用药物、由逆转录病毒将药物诱导***基因转移到供体淋巴细胞，以去除供体淋巴细胞(Onodera等，Genome Medicine，第3卷：45，2003，Medical Review)。该方法可以影响供体淋巴细胞的染色体。
用本发明方法产生的HAC载体可以作为载体，用于细胞疗法中参与免疫的基因的基因转移，所述基因转移不会引起宿主染色体发生突变。HAC载体也可用作载体，用于在帮助启动抗肿瘤活性的疗法中的基因转移，所述疗法例如使用CD40配体并用于淋巴瘤的免疫激活疗法(Kato等，Genome Medicine，第3卷：53，2003，MedicalReview)。
(D)完全人类单克隆抗体的补充
近年来，人们一直在尝试使用产生人抗体的小鼠，来产生完全人类单克隆抗体药物(Ishida等，Bio Venture，第2卷：44，2002，Yodo-sha；Mori等，Cell Death and Differentiation，待出版，2003，Proceedingsof American Association for Cancer Research，第44卷，第2版，2003年7月，第1285页，#6422)。然而，因为使用它来治疗慢性病，需要不断去医院定期接受TPO，所以患者的QOL可以降低。此外，重组蛋白制剂生产所需要的成本高，导致昂贵的医疗费用。
通过将编码从产生靶抗体的杂交瘤中分离的靶抗体的基因组区引入到用本发明方法产生的HAC载体中，将所述HAC载体转移到例如患者的造血干细胞或B细胞中，然后将其再移植给所述患者，可以通过控制生理表达来补充/供应完全人类抗体。这将减少去医院的次数并改善患者的QOL。
(E)对单基因遗传疾病中缺陷的代偿
(E-1)血友病
血友病A和血友病B是分别由凝血因子VIII和凝血因子Ⅸ的突变所致的伴性隐性遗传性血液病。尽管利用因子VIII和因子Ⅸ的浓缩制剂进行的替代疗法是有效疗法，但是因为在出血后给药的情况下，它会引起严重并发症，并且还有其它问题，例如浓缩制剂污染病原体、因重复给药引起的自身抗体(活性中和抗体)的产生、必须持续为患者的出血而制备，从而降低患者的QOL，并且产生昂贵的医疗费用，所以仍需要采用基因疗法的方案。使用载体进行的临床基因治疗研究并未产生显著疗效，因为表达无法持续足够的时间。此外，在其中直接给予逆转录病毒载体和腺伴随病毒(AAV)载体的临床研究中，在患者***中检测到载体基因，表明具有将基因转移到生殖细胞的危险(Mochizuki等，Genome Medicine，第3卷：25，2003，Medical Review)。编码因子VIII基因的全长基因组长约1.5Mb，其cDNA长约7kb。在非病毒载体和腺病毒载体中表达水平可以降低，尽管可以引入全长cDNA，而不能将全长基因引入到AAV载体中，因为待引入DNA的长度仅限于约4.9kb或更短。
本发明的方法可以用于产生***编码凝血因子VIII或IX的DNA的HAC载体。虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将HAC载体转移到例如人类细胞中并移植给患者，以补充所述因子。虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将掺入编码凝血因子VIII或IX的基因组区的HAC载体转移到例如人类细胞中并移植给患者(所述细胞正是来自该患者)，以通过生理/组织特异性表达来补充所述因子。
(E-2)X-SCID(X连锁严重性联合免疫缺陷)
严重性联合免疫缺陷(SCID)是其中体液介导免疫和细胞介导免疫先天缺陷的一种疾病。近半数SCID病例是X连锁的X-SCID，已知是由γ链变异引起，γ链是白介素2家族受体共享的。已经进行了造血干细胞的治疗性移植，尽管体液免疫恢复不足，而且必须定期给予免疫球蛋白。因此，预期使用基因治疗和细胞治疗的方案包括将共同γ链导入造血干细胞中，然后再进行移植。自1999年进行的临床研究中，使用逆转录病毒进行其中导入了共同γ链的造血干细胞的移植，近年来，在法国已经报道一些用移植细胞进行白血病治疗进展的实例(Hacein-Bey-Abina等，N Engl J Med.，348：255，2003；Marshall等，Science，299：320，2003)。在各实例中，在LMO2基因观察到载体序列***突变，LMO2基因区是细胞染色体上的一个原癌基因，所述细胞中导入了所述基因，怀疑LMO2活化和致癌性之间有联系(Kume等，Genome Medicine，第3卷：9，2003，Medical Review)。
本发明的方法可用于产生掺入编码共同γ链的DNA的HAC载体。可以通过使用HAC载体作为基因转移的载体，以避免宿主染色体中载体序列***突变的危险。虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将所述HAC载体转移到人类细胞(例如来自骨髓的人类正常造血干细胞)中并移植到患者体内，通过生理/组织特异性表达来代偿共同γ链的缺乏。
(E-3)杜兴(Duchenne)型肌营养不良；DMD
杜兴型肌营养不良是X连锁隐性单基因疾病，是由肌营养不良蛋白基因突变所致肌营养不良蛋白功能障碍引起的(Hoffman等，Cell，51：919，1987)。因为肌营养不良蛋白是细胞骨架蛋白，不可以通过直接给予而补充，但预期基因治疗可用于治疗DMD。
肌营养不良蛋白基因的全长基因组约为2.3Mb，其cDNA为14kb。在非病毒载体和腺病毒载体中可以降低表达水平，尽管可引入全长cDNA(Liu等，Mol.Ther.，4：45，2001；Dello Russo等，Proc NatlAcad Sci USA，97：12979，2002)。此外，在AAV载体中，不能引入全长基因，因为待引入的DNA大小限制在约4.9kb或更小，在将基因转移到骨骼肌的实验中，因为免疫应答，所以引入基因产物的表达水平会下降(Yuasa等，Gene Therapy，9：1576，2002)。
在将基因转移到骨骼肌的实验中，利用掺入在CMV启动子(所述启动子诱导遍在表达)控制下的肌营养不良蛋白小基因的AAV载体，降低由引入基因产物表达水平引起的免疫应答，尽管通过使用作为启动子的对骨骼肌有特异性的MCK启动子改善了免疫应答(Yuasa等，Gene Ther.，9：1576，2002)。这表明，生理、组织特异性表达对肌营养不良蛋白的表达是必要的。
本发明的方法可用于产生掺入编码肌营养不良蛋白基因组区的HAC载体。虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将所述HAC载体转移到人类细胞(包括但不限于人类正常的自体成肌细胞)并且移植给患者，通过生理/组织特异性表达补充肌营养不良蛋白。
(E-4)虽然并不希望限制适应症，但是本发明的方法可用于产生其中已引入导致单基因疾病的基因的HAC载体，所述单基因疾病例如α-1抗胰蛋白酶缺陷、囊性纤维化(CFTR)、慢性肉芽肿病、家族性高胆固醇血症、范科尼贫血(Fanconi’s amemia)、戈谢病(Gaucher’sdisease)、亨特综合征(Hunter’s syndrome)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏、嘌呤核苷酸磷酸化酶缺乏、ADA-SCID、白细胞粘附缺陷、卡纳范病(Canavan disease)、胼胝体萎缩、法布莱病(Fabry′s disease)和肌萎缩性脊髓侧索硬化，虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以通过将HAC载体转移到例如人类细胞并且移植给患者，以补充缺乏的分子。有关致病基因的信息，参见在线参考文献数据库美国国立生物技术信息中心(NCBI)的PubMed(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝PubMed)或者OMIMTM-Online Mendelian Inheritance in ManTM( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ntrez/query.fcgi？db＝OMM)。
(F)其它疾病
(F-1)血小板生成素(TPO)是负责控制血小板产生和造血干细胞/前体细胞增殖的因子，血小板生成素有望应用于例如再生障碍性贫血等血液病，以及化疗之后造血细胞的恢复。然而，在给予TPO重组蛋白后产生活性中和抗体，是开发药物制剂的障碍(Li等，Blood，98：3241-3248，2001)。因此，因为将TPO应用于慢性病需要不断去医院定期接受TPO，所以降低了患者的QOL。此外，重组蛋白制剂生产所需要的成本高，导致昂贵的医疗费用。
本发明的方法可用于产生其中引入了TPO基因组区的HAC载体，虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将所述HAC载体转移到例如来自产生血小板的组织的人类细胞，按照生理/组织特异性方式表达/供应TPO，以控制自身抗体的产生。这同样可以减少去医院的次数并改善患者的QOL。
(F-2)红细胞生成素(EPO)是红细胞生长因子，现已上市，成为用于糖尿病和肾病相关肾贫血的药物。因为治疗慢性病(例如由糖尿病所致肾贫血)需要不断去医院定期接受EPO，所以降低了患者的QOL。此外，重组蛋白制剂生产所需要的成本高，导致昂贵的医疗费用。如本发明实施例14所述，通过将HAC载体(其中已引入EPOcDNA)转移到正常人类成纤维细胞，然后将其移植给患者，可以表达EPO并供应给该患者。本发明的方法可用于产生HAC载体(其中已导入EPO基因组区)，虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将所述HAC载体转移到例如来自产生红细胞的组织的人类细胞，按照生理/组织特异性方式表达/供应EPO。这同样可以减少去医院的次数并改善患者的QOL。
(F-3)帕金森病
帕金森病是一种神经病，其中运动功能因中脑黑质密部的多巴胺合成细胞的进行性变性而导致受损。一种涉及给予L-DOPA的疗法旨在取代缺乏的多巴胺，所述疗法的问题是，在中度到重度病例中疗效降低，而且降低了患者的QOL，并且因为有副作用，所以降低了剂量。因为这些问题是由以下事实产生：在纹状体中多巴胺浓度是不恒定的，而且给予L-DOPA的作用不是在纹状体的区域，所以需要在纹状体中恒定地生理表达多巴胺(Takeda等，Medical ScienceDigest，第29卷：20，2003，New Science)。尽管已经使用AVV载体(其中已引入了参与多巴胺合成的三种酶的每一种)进行了基因治疗研究，但是尚未达到生理表达的控制。对于GDNF(来自Grial cell的神经元因子)治疗，即一种旨在预防多巴胺合成细胞的变性/衰减的治疗来说，使用置留于壳核下的导管持续给药，产生疗效(Gill等，NatureMed.，9：589，2003)，尽管有感染的危险，而且限制了患者的QOL。用AAV载体进行的基因治疗的研究在动物模型中显示出一定疗效(Wang等，Gene Ther.，9：381，2002)，但是尚未达到对生理表达的控制。
本发明的方法可用于产生HAC载体，所述HAC载体中已掺入编码参与多巴胺合成的一组酶或GDNF的基因组区。虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将所述HAC载体转移到人类细胞(例如正常人类神经干细胞/前体细胞)并移植给患者，通过生理/组织特异性方式来补充引入基因产物。
(F-4)糖尿病
已经采用重组蛋白制剂治疗胰岛素依赖性糖尿病。因为治疗慢性病需要不断去医院接受定期给药，所以可降低患者的QOL。此外，重组蛋白制剂生产所需要的成本高，导致昂贵的医疗费用。因为血胰岛素浓度的最佳范围狭窄，浓度如过高或过低都会产生副作用，常常会危及生命。已经进行了在体内控制胰岛素浓度的基因治疗研究(Moriya等，Tanpakushitsu Kakusan Koso，第40卷：2764，1995，Kyoritsu Shuppan Co.，Ltd.)。
本发明的方法可用于产生其中已引入胰岛素基因组区的HAC载体，虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将所述HAC载体转移到人类细胞(例如在产生它的组织中的细胞)，按照生理/组织特异性方式来表达/供应胰岛素。这同样可以减少去医院的次数并改善患者的QOL。
(F-5)虽然并不希望限制适应症，但是本发明的方法可用于产生HAC载体，所述HAC载体中已引入编码被认为是治疗如下疾病所需的物质的基因：例如脑肿瘤、外周动脉病(局部缺血)、类风湿性关节炎、动脉再狭窄、肘管综合征、冠状动脉病、早老性痴呆(Alzheimerdisease)、溃疡、盆骨骨折、肾病和恶性肿瘤，而且，虽然并不希望限制给予患者的给药方法，但是可以将所述HAC载体转移到例如人类细胞并移植给患者，以补充缺乏的分子。
实施例
下面将通过以下实施例来详细描述本发明，而不应认为是对本发明范围的限制。
[实施例1]通过缺失21号人类染色体长臂远侧区来制备HAC载体
(1)构建用于端粒截短的构建体
采用PBS-TEL/Puro(Kuroiwa，Nucleic Acids Res.，26：3347，1998)作为端粒截短载体(打靶载体)，用于缺失21号人类染色体的长臂远侧区。根据得自GenBank数据库的21号人类染色体的长臂远侧区的核苷酸序列(登记号AL163204)，设计用于***端粒截短载体的靶序列。为了扩增所述序列，采用引物寡核苷酸。***了限制酶BamHI识别序列的所述引物寡核苷酸的序列如下所示：
#21telF1：5′-CGCGGATCCAGAGAGAGCCTGGAATGCCTGGTAGTGT(SEQ IDNo.1)
#21telR1：5′-CGCGGATCCCCAGTGCCCTGAGATCTTGTGATTTCTC(SEQ IDNo.2)
通过微细胞法，用保留21号人类染色体的小鼠A9杂交瘤细胞作为染色体供体细胞，制备保留21号人类染色体的DT40杂交瘤细胞(Shinohara，Hum Mol Genet，10：1163，2001)。由于染色体受体细胞DT40已经在日本研究生物资源保藏中心(JCRB)注册登记，保藏号为JCRB2221，因此该该细胞是可得到的。下面一般性地描述DT40杂交瘤的制备方法。
首先，制备约1×108A9(#21neo)细胞的微细胞。将A9(#21neo)细胞在12个25cm2的离心瓶(Coasters)中培养，直到细胞密度达到约60-70％饱和。这些A9(#21neo)细胞在含有秋水仙胺(0.05μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培养液(10％CS，0.05μg/ml，G418，DMEM)再培养72小时，诱导微核。在本实施例中，使用Invitroge生产的DMEM。倒出培养液之后，向每个离心瓶中加入预热(34℃)松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM，Sigma)中，使其恢复，然后经过滤纯化。如此纯化的微细胞重悬浮于补充了10μg/ml植物凝集素-P(Sigma)的4ml DMEM中。在50μg/ml聚-L-赖氨酸(Sigma)包被的6孔板(Nunc)中的2孔中接种DT40细胞(1×108细胞)，然后让其静置1小时。按此方式，让DT40细胞提前粘附在底部。向各孔中加入微细胞悬液，让其静置3分钟，然后弃去上清液。剩余物用50％w/v聚乙二醇1500(Roche Diagnostics)处理1分钟。由此获得的融合细胞悬浮于12ml无血清DMEM中，接种于6孔板中的4孔并培养24小时，然后在含有1.5μg/mlG418的培养液中进行选择性培养约2周。分离所形成的抗药性集落。
培养以上获得的DT40杂交细胞，然后通过使用Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System)，从所述细胞中提取基因组DNA。用该基因组DNA作为模板，使用上述引物，通过PCR法扩增用于重组的靶序列。按照Innis等(PCR experiment manual，HBJ publisher，1991)，使用大约0.1μg基因组DNA作为模板，通过热循环仪GeneAmp9700(Applied Biosystems)，进行PCR。通过使用LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)作为Taq聚合酶，进行反应，反应条件包括95℃反应2分钟，然后95℃变性30秒以及68℃退火/延伸6分钟的循环共35次。扩增产物用限制酶BamH I(Nippon Gene)消化，然后分离出具有粘端的约5kb的DNA片段，再经琼脂糖凝胶电泳纯化。该片段克隆到PBS-TEL/Puro质粒的BamH I位点。最终获得的PBS-TEL/Puro构建体的大小约为10.6kb。端粒截短载体、靶序列和经同源重组而得到的染色体等位基因示于图1。
(2)转染和Puro-抗性克隆的分离
PBS-TEL/Puro构建体用限制酶EcoR I消化后，得到线状DNA，将其导入保留21号人类染色体的DT40杂交细胞中。将DT40杂交细胞(1×107)悬浮于0.75ml PBS中，然后使用Gene Pulser(Biorad)，在25μg DNA存在下，进行电泳。将750V电压施加于电容为25μF的电容器，通过使用具有以4mm间距放置的电极的电穿孔细胞，让其放电。将电穿孔细胞悬浮于补充了10％胎牛血清(FBS)、1％鸡血清(ChS)和50μM 2-巯基乙醇的DMEM培养液(Invitrogen)中，然后接种到两个96孔板(Falcon)中。2天后，加入嘌呤霉素二盐酸盐(Sigma)，使其终浓度为0.3μg/ml。在2-3周内形成抗性集落。集落形成频率是每1×107个DT40杂交细胞中平均为17.8个集落。进行20次转染，共分离出356个抗药性集落。使所得集落增殖并进行以下分析。
(3)重组体的选择和端粒截短的证实
(3-1)PCR分析
用嘌呤霉素抗性株的基因组DNA作为模板，通过PCR法，检测21号人类染色体上的基因标记和STS标记(D21S265，CBR，SIM2，D21S268，D21S266，D21S1259)的存在。
通过进入以下在线数据库，可得到用于这些STS标记的引物寡核苷酸的序列：美国国立生物技术信息中心的UniSTS( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝unists)。上述6种STS标记的注册号依次为UniSTS：76223，45641，54124，22625，54266和53746。除此之外，用于所述基因的引物寡核苷酸序列如下所示，所述引物寡核苷酸序列是根据得自GenBank数据库的核苷酸序列而设计的：
PRED65F：5′-GCCTGGCATCTTCCTCAATA(SEQ ID No.3)；
PRED65R：5′-TTGCATGCCTGTGGTACTGT(SEQ ID No.4)；
PRED3F：5′-TCACAATCATGGGCTTTGAA(SEQ ID No.5)；
PRED3R：5′-CACGCAACCATTTGTTCATT(SEQ ID No.6).
使用约0.1μg基因组DNA作为模板，通过PCR扩增上述8种标记中的3种，即通过同源重组位于缺失位点近侧的PRED 3基因、位于其远侧区的D21S265标记和D21S266标记(Innis等，参见上文)。在长臂远侧区通过端粒截短而缺失的情况下，预期基因组DNA可具有PRED 3基因，但没有D21S265标记和D21S266标记。结果，可以如预期所述，对354个抗性克隆中的24个进行扩增。通过使用其余7种标记，对这24个克隆进行PCR扩增，以确定其中携带21号人类染色体的区域。代表性结果示于图2。在图2中，左手边的图给出了示意性的染色体图谱，该图谱是基于21号人类染色体的G带图像。此外，也显示了标记存在于哪个条带上。在3种嘌呤霉素抗性DT40克隆中，用■表示在预期PCR扩增产物中检测的标记，而□表示在预期PCR扩增产物中没有检测的标记。DT40(21#)代表在受到端粒截短之前的细胞。
(3-2)DNA印迹分析
设计的探针位于用于同源重组的靶序列内(图1)。用以下所示的寡核苷酸引物对作为探针。通过使用保留21号人类染色体的DT40杂交细胞的基因组DNA作为模板，进行PCR。然后，分离并纯化PCR扩增片段。
#21qtelF：5′-TCACAGCCAGCAGAGGATTC(SEQ ID No.7)
#21qtelR：5′-CACCTGCACAATGGCTCAAC(SEQ ID No.8)
通过初步筛选得到24个克隆，从这24个克隆提取约10μg基因组DNA，用限制酶Kpn I(Takara Shuao Co.，Ltd.)进行消化，然后按照下文描述的方法进行DNA印迹分析：Ausubel等(Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，1994)。用图像分析仪BAS2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)，检测与32P标记探针杂交的DNA信号。代表性结果示于图3。根据核苷酸序列预测限制酶片段的长度。在同源重组体的情况下为13.6kb，而在野生型(非同源重组体)的情况下为9.0kb。已证实24个候选克隆中有2个克隆是同源重组体。
(3-3)荧光原位杂交(FISH)
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。结果，在所观察的几乎所有的有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体。代表性FISH图像示于图4a和图4b。在图4a中，白色箭头指示端粒截短之前的全长21号人类染色体。在图4b中，白色箭头指示长臂远侧区缺失的21号人类染色体片段。根据与宿主DT40细胞的染色体大小进行相对比较，证实21号人类染色体被截短。
根据上述实验，证实2个嘌呤霉素抗性克隆保留缺乏长臂的截短的21号人类染色体。
[实施例2]将loxP序列***到HAC载体中的21号人类染色体近侧区
(1)构建用于***loxP的构建体
使用基础质粒pSF1(Lifetech)，用于将loxP序列***到实施例1制备的人类人工染色体(HAC)中。LoxP***位点的核苷酸序列，即21号人类染色体的长臂近侧区，得自GenBank数据库(登记号AL163203)。用于扩增同源重组的2个靶序列的引物寡核苷酸序列如下所示：
#21qEcoF：5′-CCGGAATTCCTCTGGGTTTCTGGTGAAGC(SEQ ID No.9)；
#21qEcoR：5′-CCGGAATTCTGTAGATCCTGCCATTGTGG(SEQ ID No.10)；
#21qBaF：5′-CGCGGATCCTTGGCTCCAAAAGGTACCAC(SEQ ID No.11)；
#21qBaR：5′-CGCGGATCCCTATCCTCGCCACTGTGTCC(SEQ ID No.12).
用从保留21号人类染色体的DT40杂交瘤细胞中提取的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增两个靶序列。它们分别用限制酶EcoRI(Nippon Gene)或BamH I(Nippon Gene)消化并进行琼脂糖凝胶电泳，因而分离并纯化具有粘端的约3kb DNA片段。所述片段各自连接pSF1质粒的EcoR I位点或BamH I位点。通过用限制酶Xho I(Nippon Gene)和Sal I(Nippon Gene)消化，从pCMV/Bsd(Invitrogen)切下约1.3kb片段的用于筛选同源重组体的杀稻瘟素抗性基因，然后克隆到以上获得的pSF1构建体的Xho I位点。
最终得到的pSF1构建体的大小约为12.4kb。打靶载体、靶序列和经同源重组而得到的染色体等位基因示于图5。
(2)转染和bsr抗性克隆的分离
pSF1构建体用限制酶Apa I(Nippon Gene)消化，得到线状DNA，将其引入到保留21号人类染色体(其长臂远侧区已缺失)的DT40细胞株(DT40(#21)puro-339)中。将DT40杂交细胞(1×107)悬浮于0.75ml PBS中，然后使用Gene Pulser(Biorad)，在10μg DNA存在下，进行电穿孔。将750V电压施加于电容为25μF的电容器，通过使用具有以4mm间距放置的电极的电穿孔细胞，让其放电。将电穿孔细胞悬浮于补充了10％胎牛血清(FBS)、1％鸡血清(Chs)和50μM 2-巯基乙醇的DMEM培养液(Invitrogen)中，然后接种到三个96孔板(Falcon)中。2天后，加入杀稻瘟素S盐酸盐(Funakoshi)，使其终浓度为8μg/ml。在2-3周内形成抗性集落。集落形成频率是每1×107个DT40杂交细胞中平均为5.8个集落。进行14次转染，共分离出82个抗药性集落。使所得集落增殖并进行以下分析。
(3)重组体的选择
(3-1)DNA印迹分析
进行DNA印迹分析，以筛选同源重组体。在靶序列外设计探针，用于同源重组。一对寡核苷酸引物如下所示，用作探针。通过使用保留21号人类染色体的DT40杂交细胞的基因组DNA作为模板，进行PCR。然后，分离并纯化PCR扩增片段。
21LOX4869F：5′-GTTGCAGAAAAGTAGACTGTAGCAA(SEQ ID No.13)
21LOX5682R：5′-TCTAAGGAACAAATCTAGGTCATGG(SEQ ID No.14)
从杀稻瘟素抗性克隆提取约10μg基因组DNA，用限制酶Xha I(Nippon Gene)进行消化，然后进行DNA印迹分析(图6A和图6B)。探针用32P标记，用图像分析仪BAS2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)检测信号。在图6A中，左起第一泳道显示引入loxP位点之前的保留21号人类染色体的DT40克隆；第二泳道显示宿主DT40细胞克隆；第三泳道和后面各泳道显示杀稻瘟素抗性DT40克隆。根据核苷酸序列预测限制酶片段的长度。在同源重组体的情况下为7.6kb，在野生型(非同源重组体)的情况下为8.5kb。已证实82个杀稻瘟素抗性克隆中有3个克隆是同源重组体(#60，#78，#79)。
(3-2)PCR分析
对于两个靶序列，即左序列和右序列(在图5中分别用A和B表示)，设计一对寡核苷酸引物，使之邻接每个靶序列。在染色体和打靶载体上设计这些寡核苷酸引物对。引物对的位置在图5中如箭头所指。引物对序列如下：
左455F：5′-GGGCTAGCCATTAAAGCTGA(SEQ ID No.15)；
左638R：5′-AAAGGGAATAAGGGCGACAC(SEQ ID No.16)；
右958F：5′-GGTTTGTCCAAACTCATCAATGTA(SEQ ID No.17)；
右1152R：5′-GTCAATTCACTAATTCCTATTCCCAGT(SEQ ID No.18).
从得自DNA印迹分析的候选克隆中提取基因组DNA，并进行PCR。证实在左边(A)的情况下扩增产物为3283bp，而在右边(B)的情况下扩增产物为3114bp，正如核苷酸序列所预测的。结果示于图6B。
根据上述实验(1)-(3)，证实所获得的82个杀稻瘟素抗性DT40克隆中有3个克隆保留21号人类染色体的部分片段(HAC载体)，该片段具有通过同源重组***其中的loxP序列。
[实施例3]将来自21号人类染色体的HAC载体转移到仓鼠细胞系
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
用得自实施例1和实施例2的DT40细胞(DT40(#21)bsd-79)作为染色体供体细胞，该DT40细胞(DT40(#21)bsd-79)保留来自通过缺失长臂远侧区并***loxP序列的21号人类染色体的HAC载体。用来源于中国仓鼠卵巢的细胞系CHO-K1(可得自ATCC，保藏号JCRB9018)作为染色体受体细胞。
首先，从约109DT40(#21)bsd-79细胞制备微细胞。将DT40(#21)bsd-79细胞在含有秋水仙胺(0.075μg/ml，Demecolcine，wako PureChemical Industries，Ltd.)的培养液(10％FBS，1％ChS，50μM 2-巯基乙醇，DMEM)中培养12-15小时，直到细胞密度相当于约60-70％饱和，以诱导微核。离心收集细胞，悬浮于无血清DMEM中，接种到12个25cm2的聚-L-赖氨酸预先包被的离心瓶(Coasters)中。让瓶子在37℃静置1小时。当细胞贴壁后，取出培养液。向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后经过滤纯化。将纯化的微核细胞加入到直径6cm的培养皿中，在该皿中培养CHO-K1细胞直到80％饱和。用PEG溶液使其融合。48小时后，融合细胞经胰酶处理而分散，然后在含有杀稻瘟素(8μg/ml)的选择性培养液(10％FBS，F12)中进行培养。选择培养进行约2周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合12次，共得到4个杀稻瘟素抗性CHO克隆。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR法
染色体是否转移，可通过PCR法加以证实。更具体地讲，检测标记基因PRED 65基因和PRED 3基因(参见实施例1，(3))，该基因位于21号人类染色体的长臂近侧区。证实在所有4个杀稻瘟素抗性CHO细胞克隆中有2个标记序列被扩增。
(2-2)荧光原位杂交(FISH)分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。当分析杀稻瘟素抗性CHO细胞克隆中有2个克隆(CHO(#21)bsd79-1和CHO(#21)bsd79-3)时，在几乎所有观察的有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体。代表性FISH图像示于图7a和图7b。图7a显示端粒截短之前的全长21号人类染色体。图7b显示长臂远侧区缺失后的21号人类染色体片段。根据与宿主CHO细胞的染色体大小进行相对比较，证实截短的21号人类染色体转移到CHO细胞中。
根据上述实验(1)和(2)，证实所得杀稻瘟素抗性CHO克隆保留缺失长臂远侧区并***loxP序列的21号人类染色体部分片段(HAC载体)。
[实施例4]将来自21号人类染色体的HAC载体转移到人类细胞系并且证实来自21号人类染色体的HAC载体在培养细胞中的稳定性
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
用得自实施例3的CHO细胞(CHO(#21)bsd-79-1)作为染色体供体细胞，该CHO细胞(CHO(#21)bsd-79-1)保留来自通过缺失长臂远侧区并***loxP序列的21号人类染色体的HAC载体。用人纤维肉瘤细胞系HT1080(可得自ATCC，保藏号CCL-121)作为染色体受体细胞。首先，从约109CHO(#21)bsd-79-1细胞制备微细胞。更具体地讲，将CHO(#21)bsd-79-1细胞在6个25cm2离心瓶(Coasters)中培养到细胞密度相当于约60-70％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.075μg/ml，Demecolcine，wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培养液(10％FBS，8μg/ml杀稻瘟素，F12)中再培养48小时，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后经过滤纯化。将纯化的微核细胞加入到盛有培养到至多80％饱和的HT1080细胞的直径6cm的培养皿中。用PEG溶液使其融合。48小时后，融合细胞经胰酶处理而分散，然后在含有杀稻瘟素(8μg/ml)的选择性培养液(10％CS，F12)中进行培养。选择性培养进行约2周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合2次，共得到12个杀稻瘟素抗性HT1080克隆。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR法
染色体是否转移，可通过PCR法扩增杀稻瘟素抗性基因加以证实。本文使用的寡核苷酸引物序列如下所示：
Bsd2687F：5′-CAACAGCATCCCCATCTCTG(SEQ ID No.19)；
Bsd2891R：5′-GCTCAAGATGCCCCTGTTCT(SEQ ID No.20).
证实在所有12个杀稻瘟素抗性HT1080细胞克隆中，抗药性基因序列均被扩增。
(2-2)染色体分析
按照Kuroki等(Cell engineering handbook，Yodosha，1992)描述的方法，通过吉姆萨(Giemsa)染色，进行染色体分析。分析了杀稻瘟素抗性HT1080细胞克隆中的4个克隆(HT1080(#21)bsd-79-1-3，6，11，14)的约20幅中期染色体图像。在杀稻瘟素抗性克隆中，观察到比内源21号染色体小且在亲代细胞系HT1080中未观察到的微型染色体。
根据上述实验(1)和(2)，证实所得杀稻瘟素抗性HT1080克隆保留缺失长臂远侧区并***loxP序列的21号人类染色体部分片段(HAC载体)。
(3)在非选择性培养条件下的长期传代培养
为了证实缺失长臂远侧区的21号人类染色体在培养细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。采用上述鸡细胞系(DT40(#21)bsd-79)和人细胞克隆(HT1080(#21)bsd-79-1-3，6，11，14)。对于鸡细胞系，应用补充了10％FBS、1％ChS和50μM 2-巯基乙醇的DMEM培养液作为非选择性培养液。通过向非选择性培养液中加入8μg/ml(在DT40(#21)bsd-79的情况下)杀稻瘟素，制备选择性培养液。对于人细胞克隆，应用补充了10％CS的DMEM培养液作为非选择生培养液。通过向非选择性培养液中加入4μg/ml杀稻瘟素，制备选择性培养液。就鸡细胞系而言，将1.5×107细胞接种到直径10cm的培养皿中。1天后，测定细胞数，然后再将1.5×107细胞接种到直径10cm的培养皿中。就人细胞克隆来说，将5.0×105细胞接种到直径10cm的培养皿中。3天后，测定细胞数，然后再将5.0×105细胞接种到直径10cm的培养皿中。培养开始后21天、42天、63天、84天、105天和126天，收集鸡细胞系；而在10天和20天后收集人细胞系。制备染色体制备物。
(4)染色体分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)对鸡细胞中的人工染色体进行检测。观察在500个中期核中是否存在人类染色体，并计算人类染色体的保留率。按照Kuroki等(Cell engineering handbook，Yodosha，1992)描述的方法，通过吉姆萨染色，对人类细胞中人工染色体进行检测。观察在20幅中期染色体图像中是否存在微型染色体，并计算微型染色体的保留率。求出4个克隆的平均值。结果见下表1。
           表1：#21ΔqHAC的稳定性
  宿主细胞   细胞群体倍增水平          HAC保留率(％)
  未经药物选择   经药物选择
  DT40HT1080   1182361022   999910097   1001009398
在非选择性培养条件下，当细胞***超过200次时，21号人类染色体的部分片段在DT40细胞中仍稳定保留。通过观察100幅中期染色体图像，统计每个细胞中人类染色体数目。在所有图像中，毫无例外地都观察到单个染色体。尽管仍在继续培养HT1080细胞克隆，但是在选择性培养条件下，在细胞***数为22次的时间点时，仍稳定地保留了21号人类染色体部分片段。此外，当观察中期染色体图像时，观察到每个细胞中有一个或两个染色体部分。
根据上述实验(3)和(4)，清楚地证明在非选择性培养条件下，缺失长臂远侧区的21号人类染色体部分片段在DT40细胞系和HT1080细胞克隆中稳定保留，并且保持每个细胞中的拷贝数。
[实施例5]将GFP基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中
图8显示将GFP基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中的方法。如实施例1-4所述，通过端粒截短而缺失长臂远侧区并且在其长臂近侧区引入loxP位点，制备来自21号人类染色体的HAC载体。另一方面，制备含有loxP序列的GFP表达质粒。通过采用由瞬时表达Cre重组酶在loxP序列之间进行的位点专一重组反应，将所述质粒引入到人工染色体中。根据G418抗性获得与否(因破坏启动子而重建neo基因表达单元)，来筛选具有***序列的重组产物。
(1)构建含有loxP序列的GFP表达质粒
GFP表达载体PEGFP-C1(Clontech)用限制酶GbLII和BamH I(Nippon Gene)消化，分离/纯化4.7kb的DNA片段，该片段通过使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo Co.，Ltd.)而自我连接成环状。通过转化大肠杆菌DH5α来分离重组质粒，获得缺乏多克隆位点内从GbL II到BamH I的51bp的质粒PEGFP-C1Δ。用PEGFP-C1Δ作为模板，通过PCR扩增EGFP基因表达单元。
根据得自GenBank数据库的核苷酸序列(登记号U55763)制备的引物寡核苷酸序列如下所示：
EcoGFP5：5′-GGCCGAATTCCGTATTACCGCCATGCAT(SEQ ID No.21)；
BamGFP3：5′-CCGGGATCCCACAACTAGAATGCAGTG(SEQ ID No.22).
如此扩增的EGFP基因表达单元的两端用限制酶EcoR I和BamHI(Nippon Gene)消化，产生粘端。将所得构建体克隆到具有loxP序列和hCMV启动子的质粒载体pBS226(Lifetech)的EcoR I/BamH I位点。
(2)转染和G418抗性克隆的分离
将实施例3中制备的保留来自21号人类染色体的HAC载体的CHO细胞(CHO(#21)bsd-79-1)用胰蛋白酶处理，将5×106细胞悬浮于0.8ml磷酸缓冲液(PBS)中。使用Gene Pulser(Biorad)，在10μgpBS226/EGFP质粒和20μg Cre酶表达载体pBS185(Lifetech)存在下，进行电穿孔。将750V电压施加于电容为25μF的电容器，通过使用具有以4mm间距放置的电极的电穿孔细胞，让其放电。将电穿孔细胞接种在装有补充了10％胎牛血清(FBS)的Eagle F12培养液(在下文称为“F12”，Invitrogen)的100mm塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有800μg/ml G418(GENETICIN，Sigma)和8μg/ml杀稻瘟素S盐酸盐(Funakoshi)的培养液。在2-3周内形成抗药性集落。集落形成频率是每5×106个CHO细胞为20个集落。所得集落进行分离、增殖并进行以下分析。
(3)***在来自21号人类染色体的HAC载体中的GFP基因的表达
通过荧光显微镜，观察所分离的G418/杀稻瘟素抗性CHO克隆。结果，证实在19个克隆中表达了GFP。代表性的荧光图像示于图9。
(4)同源重组体的证实
进行DNA印迹分析，以证实同源重组体。在DNA印迹中，部分G418抗性基因和GFP基因用作探针，约5μg基因组DNA用限制酶EcoR I或BamH I(Nippon Gene)处理。采用经限制酶Nhe I和GbL II(Nippon Gene)消化质粒PEGFP-C1(Clontech)而得到的849bp片段作为GFP探针。G418抗性基因探针是用限制酶GbL II和Sma I(Nippon Gene)消化质粒pSV2neo而得到的1000bp片段。探针用32P标记，用图像分析仪BAS2000(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)，检测信号。代表性结果作为实例示于图10。在图10中，用neo探针检测经EcoRI消化的DNA。第一泳道显示***之前的DT40系；第二泳道和后面各泳道显示G418抗性DT40克隆。在***前的等位基因中，检测来自5.7kb片段的信号；而在***后的等位基因中，检测来自6.9kb片段的信号。
根据上述实验(1)和(4)，在19个G418抗性克隆中有18个检测出了通过同源重组获得的等位基因。其中的5个克隆中，除了检测到同源重组后的等位基因外，还检测到重组前的等位基因，而且，在一个克隆中还检测到了随机***的等位基因。因此，得到所需重组体，其频率为12/19(63％)。
[实施例6]21号人类染色体短臂的缺失
(1)构建用于端粒截短的构建体
通过改变PBS-TEL/Puro，构建用于缺失21号人类染色体短臂远侧区的端粒截短载体(Kuroiwa，Nucleic Acids Res.，26：3347，1998)。从PBS-TEL/Puro取出嘌呤霉素抗性基因的1.7kb表达单元，作为NotI片段，用T4 DNA聚合酶(DNA平端试剂盒，Takara Shuzo Co.，Ltd.)形成平端，产生PBS-TEF载体。PGKhyrgo/ΔLT20用限制酶Cla I和Sma I(Nippon Gene)消化，分离/纯化潮霉素抗性基因的表达单元，该单元为1.8kb片段，且处于PGK启动子的控制之下。将该片段克隆到PBS-TEL载体中，得到PBS-TEL/hygro。
根据得自GenBank数据库的21号人类染色体长臂近侧区的核苷酸序列(登记号AL163201)，设计用于***端粒截短载体的靶序列。用于扩增靶序列的引物寡核苷酸序列如下所示，所述引物寡核苷酸中添加了限制酶Spe I或BamH I识别序列：
Spe31203：5′-GCACTAGTCTGGCACTCCTGCATAAACA(SEQ ID No.23)；
Bam36192：5′-CTAAGGATCCATTTCAGCCTGTGGGAATCA(SEQ ID No.24).
使用从保留21号人类染色体的DT40杂交细胞中提取的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增靶序列。扩增产物用限制酶Spe I或BamH I(Nippon Gene)消化。分离具有粘端的约5kb的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳纯化。将该DNA片段克隆到PBS-TEL/Hyrgo质粒的Xba I/BamH I位点。最终得到的PBS-TEL/Hyrgo构建体的大小约为5.8kb。端粒截短载体、靶序列和经同源重组而得到的染色体等位基因示于图11。
(2)转染和潮霉素抗性克隆的分离
PBS-TEL/Hyrgo构建体用限制酶BamH I(Nippon Gene)消化，得到线状构建体，将其导入保留其长臂远侧区已缺失并***loxP位点的21号人类染色体的DT40杂交细胞(DT40(#21)bsd79)中。将DT40杂交细胞(1×107)悬浮于0.75ml PBS中，使用Gene Pulser(Biorad)，在25μg DNA存在下，进行电穿孔。将750V电压施加于电容为25μF的电容器，通过使用具有以4mm间距放置的电极的电穿孔细胞，让其放电。将电穿孔细胞悬浮于补充了10％胎牛血清(FBS)、1％鸡血清(ChS)和50μM 2-巯基乙醇的DMEM培养液(Invitrogen)中，然后接种到五个96孔板(Falcon)中。2天后，加入潮霉素B(Wako Pure ChemicalIndustries.Ltd.)，使其终浓度为1.5mg/ml。在2-3周内形成抗性集落。进行2次转染，共分离出63个抗药性集落。使所得集落增殖并进行以下分析。
(3)同源重组体的筛选和端粒截短的证实
(3-1)PCR分析
进行PCR，用于从潮霉素抗性DT40克隆中初步筛选同源重组体。使用从潮霉素抗性克隆中提取的约0.1μg基因组DNA作为模板，扩增位于21号人类染色体短臂近侧区的STS标记(pCHB，D21S188，D21S275)。代表性结果示于图12。在图12中，左边给出的是根据21号人类染色体的G带图像的示意性染色体图谱。此外，显示出各标记存在于哪条带上。对于潮霉素抗性DT40克隆，检测到其预期PCR扩增产物的标记，用■表示；未检测到其预期PCR扩增产物的标记，用□表示。DT40(#21)代表经历端粒截短前的细胞。在短臂远侧区通过端粒截短而缺失的情况下，可以想像到，D21S275可能存在，而D21S188和pCHB可能不存在。因此，选择45个克隆(其中D21S188或pCHB都没有扩增)，进行DNA印迹分析。
(3-2)DNA印迹分析
设计的探针位于用于同源重组的靶序列内。采用以下所示的寡核苷酸引物对作为探针。通过使用保留21号人类染色体的DT40杂交细胞的基因组DNA作为模板，进行PCR。分离并纯化PCR扩增产物。
#21p91203：5′-CTGGCACTCCTGCATAAACA(SEQ ID No.25)
#21p91976：5′-TCTGTGTTCCCCTTCTCTGA(SEQ ID No.26)
从潮霉素抗性集落中提取的约10μg基因组DNA用限制酶HindIII(Nippon Gene)消化，然后进行DNA印迹分析。根据核苷酸序列预测限制性片段的长度。在同源重组体的情况下，长度为5.8kb，而在野生型(非同源重组体)的情况下，长度为1.9kb。已证实在初步筛选中，45个候选克隆中筛选出2个克隆是同源重组体(图13)。
(3-3)PCR法
邻接重组靶序列的序列经PCR扩增。根据21号人类染色体和打靶载体而设计的引物寡核苷酸序列如下所示：
Hyg968：5′-AAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC(SEQ ID No.27)；
#21p96705：5′-AGTTAGCCTACCTTTTGGCCATCC(SEQ ID No.28).
扩增产物的大小为5.9kb。扩增产物用限制酶Nsi I消化，预计会产生1.4kb、2.6kb和1.9kb的片段(图11)。证实PCR扩增发生在2个克隆中，其中用DNA印迹分析观察到同源重组等位基因，并且证实了产生用限制酶消化的部分片段。
(3-4)荧光原位杂交(FISH)
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。结果，在所观察的几乎所有的有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体(图15a和图15b)。
根据上述实验(1)-(3)，证实63个潮霉素抗性克隆中有2个保留了缺失短臂的截短的21号人类染色体。
[实施例7]将EPO基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中
按照与实施例5中描述的用于GFP基因的情况相同的方式，将人EPO基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中。如实施例1-4所述，制备来自21号人类染色体并通过端粒截短而缺失长臂远侧区且在其长臂近侧区引入loxP位点的HAC载体。另一方面，制备含有loxP序列的人EPO表达质粒。通过采用由瞬时表达Cre重组酶在loxP序列之间进行的位点专一重组反应，将所述质粒整合到人工染色体中。根据G418抗性获得与否(因破坏启动子而重建neo基因表达单元)，来筛选具有***序列的重组产物。
(1)用于构建含有loxP序列的人EPO表达质粒pLN1-EPO的引物寡核苷酸序列如下所示：
SV40polyANp1：5′-CGG GAT CCC TCG AGC GAG ACA TGA TAA GAT ACA TTGATG-3′(SEQ ID No.29)；
SV40polyARp1：5′-GGA AGA TCT TCC TAA TCA GCC ATA CCA CAT TTG TAG AGG-3′(SEQ ID No.30)，
根据质粒载体pSTneoB的核苷酸序列，制备这些引物(Kato等，Cell Struct Funct，12：575-580，1987)；
CMVNp3：5′-CGG AAT TCC GGA CAT TGA TTA TTG ACT AGT TAT TAA TAG-3′(SEQ ID No.31)；
CMVRp1：5′-CGG GAT CCC GGG TGT CTT CTA TGG AGG TCA AAA CAG-3′(SEQID No.32)，
根据pBS226的CMV启动子的核苷酸序列，制备这些引物；和
hEPONp1：5′-CGG GAT CCC GGC CAC CAT GGG GGT GCA CGA ATG TC-3′(SEQ IDNo.33)；
hEPORp1：5′-CGC TCG AGC GCT ATC TGT CCC CTG TCC TGC AGG-3′(SEQ ID No.34)，
根据得自GenBank的核苷酸序列(登记号I05397)，制备这些引物。
采用pSTneoB作为模板经PCR扩增的SV40聚腺苷酸附加单元的两端，以及SV40polyANp1(SEQ ID No.29)和SV40polyARp1(SEQID No.30)用限制酶BamH I和Bgl II(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。将所得构建体克隆到具有loxP序列和hCMV启动子的质粒载体pBS226(Lifetech)的BamH I位点。所得质粒称为pBS226-pA。
其次，采用pBS226作为模板经PCR扩增的CMV启动子单元的两端，以及CMVNp3(SEQ ID No.31)和CMVRp1(SEQ ID No.32)用限制酶EcoR I和BamH I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。将所得构建体克隆到pBS226-pA的EcoR I-BamH I位点。所得质粒称为pLN1。
最后，采用EPO cDNA作为模板经PCR扩增的EPO编码区的两端，以及hEPONp1(SEQ ID No.33)和hEPORp1(SEQ ID No.34)用限制酶BamH I和Xho I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。将所得构建体克隆到pLN1的BamH I-Xho I位点。所得质粒称为pLN1-EPO。
(2)转染和G418抗性克隆的分离
将实施例3中制备的保留来自21号人类染色体的HAC载体的CHO细胞(CHO(#21)bsd79-1)用胰蛋白酶处理，将5×106细胞悬浮于0.8ml Hank平衡盐溶液(HBSS)中，使用Gene Pulser(Biorad)，在10μgpLN1-EPO载体(按上节(1)制备)和10μg Cre酶表达载体pBS185(Lifetech)存在下，进行电穿孔。将450V电压施加于电容为500μF的电容器，通过使用具有以4mm间距放置的电极的电穿孔细胞，让其放电。将电穿孔细胞接种在装有补充了10％胎牛血清(FBS)的EagleF12培养液(在下文称为“F12”，Invitrogen)的4个48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有800μg/ml G418(GENETICIN，Invitrogen)和8μg/ml杀稻瘟素S盐酸盐(Funakoshi)的培养液。在2-3周内形成抗性集落。集落形成频率是每5×106个CHO细胞为28个集落。所得集落进行分离、增殖并进行以下分析。如此获得的细胞在下文称为“KH21E”细胞。
(3)***在来自21号人类染色体的HAC载体中的EPO基因的表达
按照酶联免疫吸附测定(ELISA)，通过定量测定培养上清液中产生的人EPO蛋白，确定人EPO基因的表达。
对于分离的19个G418/杀稻瘟素抗性KH21E细胞克隆中的6个，将每个克隆(1×105细胞)分别接种到装有2ml F12培养液的6孔塑料组织培养板(Falcon)中，所述培养液中补充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml杀稻瘟素。当细胞长满后，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了10％FBS的2ml F12培养液。培养6天，收集上清液。使用人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)，定量测定培养上清液中人EPO的含量。结果见下表2。
                  表2
  克隆编号   测量值(mIU/ml)      CM中EPO的浓度
  (IU/ml)   (μg/ml)
  C13C15C17C18C21C22   16.417.129.541.116.623.9   164017102950411016602390   8.28.514.720.58.311.9
根据上述结果，证实所有6个克隆中都表达人EPO。
(4)KH21E细胞产生的人EPO的生物学活性
根据人类白血病细胞系UT7-EPO细胞(得自Norio Komatsu教授，Jichi Medical School，该细胞以人EPO依赖性方式增殖)的增殖活性，分析所产生的人EPO的生物学活性。对于2个KH21E细胞克隆(#C2和#C18)，将培养上清液加入到补充了10％FBS的IMDM培养液(Invitrogen)中，根据表2的定量值使其终浓度为0.01、0.1、1、5、20和100mIU/ml EPO。向装有0.1ml所述IMDM培养液的96孔塑料组织培养板(Falcon)中，加入5×103UT7-EPO细胞。培养3天后，用细胞增殖测定试剂盒(Cell Titer 96 AQueous One Solution CellProliferation Assay，Promega)，分析细胞增殖。
结果示于图16。在2种情况下的每一种中，当加入2个克隆的培养上清液时，观察到吸光度以剂量依赖方式上升(图16，C2和C18)，与加入重组人EPO蛋白(rhEPO；Kirin brewery Co.，Ltd)的情况类似。
根据上述结果，证实培养上清液中产生的人EPO具有与重组人EPO蛋白相同的生物学活性。
[实施例8]证实在KH21E细胞中的转移染色体
在本实施例中，通过PCR和FISH分析，证实实施例7(2)中制备的每个KH21E细胞克隆中染色体是否转移。
(1)PCR分析
对于标记PRED 65基因和PRED 3基因以及D21S265标记，进行PCR扩增，其中PRED 65基因和PRED 3基因位于21号人类染色体长臂近侧区并位于loxP位点附近，而D21S265标记位于其远侧区(参见实施例1(3)和图2)。通过在loxP序列之间进行的位点专一重组而引入的人EPO基因***序列预计具有PRED 65基因和PRED 3基因，但没有D21S265标记。结果，在22个G418抗性CHO细胞克隆中有21个中得到预期的扩增产物。对于这21个克隆，通过PCR扩增位于21号人类染色体短臂近侧区的STS标记(pCHB，D21S187，D21S275)(参见实施例6，(3)，图12)。因为允许保留来自21号人类染色体的短臂的HAC载体，可以想像所有标记都会存在。结果，证实扩增与15个克隆中所预计的一样进行。
(2)荧光原位杂交(FISH)分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。分析了8个克隆，其中所有标记都如同以上(1)小节进行的PCR分析所预计的一样进行扩增；在进行分析时，在所观察的所有有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体。结果见下表3。请注意，表3中列出的克隆KH21代表如实施例3制备的保留来自21号人类染色体的HAC载体的CHO细胞(CHO(#21)bsd-79-1)。
                                   表3
  克隆名称   分析样本数有丝***图像/中期核   Cot-1信号数/细胞有丝***图像/中期核   保留率(中期核)％
  0       1        2      3      4＝＜
  KH21C1C2C3C4C11C12C13C18   50/10018/5050/10020/5050/10050/10050/10050/10017/41   6/12    43/87    0/1    0/0    0/00/21    18/40    0/7    0      0/14/4     45/96    0/0    0/0    0/04/2     16/43    0/5    0      00/1     12/37    37/58  0/3    0/14/2     40/85    6/13   0/0    0/02/2     12/36    33/58  3/2    0/20/1     13/35    32/58  0/2    5/41/0     6/14     10/25  0      0/2   8896969699989899100
根据上述结果，并与宿主CHO细胞的染色体大小进行相对比较，证实截短的21号人类染色体转移到CHO细胞中。
根据上述实验(1)和(2)，证实所获得的G418抗性CHO克隆(KH21E细胞)保留缺乏其长臂远侧区的截短的21号人类染色体。
[实施例9]将多个EPO基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中
在本实施例中，按照与实施例7描述的人EPO基因的情况相同的方式，将多个人EPO基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中。如实施例1-4所述，通过端粒截短而缺失长臂远侧区且在其长臂近侧区引入loxP位点，制备来自21号人类染色体的HAC载体。另一方面，制备含有loxP序列的人EPO表达质粒。通过采用由瞬时表达Cre重组酶在loxP序列之间进行的位点专一重组反应，将所述质粒引入到人工染色体中。根据G418抗性获得与否(因破坏启动子而重建neo基因表达单元)，来筛选具有***序列的重组产物。
(1)含有loxP序列的2拷贝EPO表达质粒(pLN1-EOP2)的构建
质粒构建中使用的引物寡核苷酸序列如下所示：
EPOnF：5′-GGA ATT CCG GGC CCA CGC GTG ACA TTG ATT ATT GA-3′(SEQID No.35)；
SVpAR：5′-GGA ATT CCT GAT CAT AAT CAG CCA TAC CAC ATT TG-3′(SEQID No.36).
EPOnF引物(SEQ ID No.35)自5′一侧起依次具有EcoR I、ApaI、Mlu I限制酶识别序列和CMV启动子5′一侧部分序列，根据pBS226中的CMV启动子核苷酸序列，制备EPOnF引物。SVpAR引物(SEQ ID No.36)自5′一侧起依次具有EcoR I、Bcl I限制酶识别序列和SV40聚腺苷酸附加单元3′一侧部分互补序列，根据质粒载体pSTneoB制备SVpAR引物(Kato等，Cell Struct Funct，12：575-580，1987)。
使用含有CMV启动子的DNA片段(所述片段是将实施例7中制备的质粒载体pLN1-EPO经EcoR I和Xba I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化而获得)、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加单元作为模板，通过使用EPOnF(SEQ ID No.36)和SVpAR引物(SEQ ID No.37)以及KOD-Plus-(Toyobo)，进行PCR扩增。使用GeneAmp9700(AppliedBiosystems)作为热循环仪。PCR循环包括94℃反应2分钟，再进行以下循环共30次：94℃变性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸90秒。所得DNA片段的两端用限制酶EcoR I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。将所得构建体克隆到质粒载体pLN1-EPO的EcoR I位点。如此克隆的DNA片段***序列的核苷酸序列用DNA测序仪(PRISM 3700，Applied Biosystems)分析，并证实与用作模板的pLN1-EPO的核苷酸序列相应部分是相同的。如此获得的克隆中，具有按正向排列由CMV启动子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加单元的***序列组成的2拷贝克隆，被称为质粒载体pLN1-EPO2。
(2)含有loxP序列的4拷贝EPO表达质粒(pLN1-EOP4)的构建
将以上(1)小节中制备的质粒载体pLN1-EPO2用Xba I(TakaraShuzo Co.，Ltd.)消化，得到线状载体，然后用KOD聚合酶(Toyobo)处理，产生平端。然后，将所述线状片段用Apa I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到DNA片段，用于***含有2拷贝的由CMV启动子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加单元组成的片段。将质粒载体pLN1-EPO2用Mlu I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，然后用KOD聚合酶(Toyobo)处理，产生平端。将该片段用Apa I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到Apa I-平端Mlu I位点。将用于如上获得的***的DNA片段克隆在该位点。所获得的含有4拷贝人EPO基因的质粒载体被称为pLN1-EPO4。
(3)转染和G418抗性克隆的分离
将实施例3中制备的保留来自21号人类染色体的HAC载体的CHO细胞(CHO(#21)bsd79-1)用胰蛋白酶处理，将5×106细胞悬浮于0.8ml Hank平衡盐溶液(HBSS)中。使用Gene Pulser(Biorad)，在在以上(1)小节或(2)小节中制备的10μg pLN1-EPO2载体或10μgpLN1-EPO4载体和10μg Cre酶表达载体pBS185(Lifetech)存在下，进行电穿孔。将450V电压施加于电容为500μF的电容器，通过使用具有以4mm间距放置的电极的电穿孔细胞，让其放电。将电穿孔细胞接种在5个装有补充了10％胎牛血清(FBS)的Eagle F12培养液(在下文称为“F12”，Invitrogen)的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有800μg/ml G418(GENETICIN，Invitrogen)和8μg/ml杀稻瘟素S盐酸盐(Funakoshi)的培养液。在2-3周内形成抗性集落。集落形成频率是每5×106个CHO细胞在pLN1-EPO2的情况下为14个集落，而在pLN1-EPO4的情况下为24个集落。所得集落进行分离、增殖并进行以下分析。用pLN1-EPO2制备的细胞在下文被称为“KH21E2细胞”，而用pLN1-EPO4制备的细胞在下文被称为“KH21E4细胞”。
(4)人EPO重组体***序列的证实
筛选具有***序列的重组体，也就是说，采用根据来自人EPO基因供体载体的序列和HAC载体而设计的引物(使之邻接loxP序列位点)，通过PCR扩增来证实***序列是否引入到来自21号人类染色体的HAC载体上的loxP序列位点中。采用根据质粒载体pBS226和HAC载体而设计的引物，通过PCR扩增来证实人EPO基因***序列的拷贝数。
PCR中所用的寡核苷酸引物序列如下所示：
SVpANp1：5’-TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA-3’(SEQ ID No.37)，
该引物是根据质粒载体pSTneoB的核苷酸序列制备的(Kato等，Cell Struct Funct，12：575-580，1987)；
Neo Rp2：5’-AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC-3’(SEQID No.38)，
该引物是根据质粒载体pSF1(Lifetech)的neo基因的核苷酸序列来制备的；
M13RV：5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’(SEQ ID No.39)，
该引物是根据质粒载体pBS226(Lifetech)的核苷酸序列来制备的。
通过使用SVpANp1引物(SEQ ID No.37)和Neo Rp2引物(SEQ IDNo.37)，进行PCR扩增；其中SVpANp1引物是根据来自pLN1-EPO2或pLN1-EPO4载体的SV40聚腺苷酸附加序列区而设计的，而NeoRp2引物是根据来自HAC载体的pSF1的新霉素抗性基因而设计的。在具有***序列的重组体的情况下，预计获得约1.0kb的片段，该片段包括从具有SV40聚腺苷酸附加序列的部分到来自pLN1-EPO2或pLN1-EPO4载体的loxP序列的区域，以及从loxP序列到来自pSF1的neo基因部分的区域。结果，扩增与在所有6个KH21E2细胞克隆和6个KH21E4细胞克隆中预测的一样进行。
根据上述结果，证实所有这12个克隆都是在loxP序列中引入***序列的重组体。
其次，对于6个KH21E2细胞克隆，通过使用来自质粒载体pBS226的Neo Rp2引物(SEQ ID No.38)和M13RV(SEQ ID No.39)，进行PCR扩增。在具有***序列的重组体的情况下，预计获得约3.8kb的片段，该片段包括具有从CMV启动子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的2拷贝部分，到来自pLN1-EPO2的loxP序列的区域，以及从loxP序列到来自pSF1的neo基因部分的区域。结果，扩增与在所有克隆中预测的一样进行。
根据上述结果，证实6个KH21E2细胞克隆含有包括CVM启动子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列在内的2拷贝DNA***片段。
(5)***在来自21号人类染色体的HAC载体中的EPO基因的表达
按照酶联免疫吸附测定(ELISA)，通过定量测定培养上清液中产生的人EPO蛋白，来确定人EPO基因的表达。
(5-1)EPO基因在KH21E2细胞中的表达
对于所分离的14个G418/杀稻瘟素抗性KH21E2细胞克隆中的6个，将每个克隆(1×105细胞)分别接种到装有2ml F12培养液的6孔塑料组织培养板(Falcon)中，所述培养液中补充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml杀稻瘟素。当细胞长满后，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了10％FBS的2ml F12培养液。培养6天后，收集上清液。通过人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)，按2×10-5的稀释度定量测定培养上清液中人EPO的含量。结果见下表4。
                     表4
  克隆编号   测量值(mIU/ml)       CM中EPO的浓度
  (IU/ml)   (μg/ml)
  C1C7C10C11C13C14平均值标准差   294027422539337.4   1450200013502100125019501683373   7.210.06.710.56.29.78.31.8
(5-2)EPO基因在KH21E4细胞中的表达
对于所分离的24个G418/杀稻瘟素抗性KH21E4细胞克隆中的6个，将每个克隆(1×105细胞)分别接种到装有2ml F12培养液的6孔塑料组织培养板(Falcon)中，所述培养液中补充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml杀稻瘟素。当细胞长满后，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了10％FBS的2ml F12培养液。培养6天，收集上清液。通过人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)，按2×10-5的稀释度定量测定培养上清液中人EPO的含量。结果见下表5。
                     表5
克隆编号   测量值(mIU/ml)        CM中EPO的浓度
  (IU/ml)   (μg/ml)
  C3C8C10C13C14C16平均值标准差   455267455048518.2   2250260033502250250024002558411   11.213.016.711.212.512.012.72.0
(5-3)EPO基因在KH21E细胞中的表达
在实施例7中分离的5个G418/杀稻瘟素抗性KH21E细胞克隆(所述克隆在来自21号人类染色体的HAC载体上具有单拷贝的人EPO基因)用作参比对照。对于这5个克隆，将每个克隆(1×105细胞)分别接种到装有2ml F12培养液的6孔塑料组织培养板(Falcon)中，所述培养液中补充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml杀稻瘟素。当细胞长满后，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了10％FBS的2ml F12培养液。培养6天，收集上清液。通过人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)，定量测定培养上清液中人EPO的含量。结果见下表6。请注意，C1和C4按1×10-4的稀释度来定量测定，而C9、C11和C21按1×10-5的稀释度来定量测定。
                   表6
克隆编号   测量值(mIU/ml)      CM中EPO的浓度
  (IU/ml)   (μg/ml)
  C1C4C9C11C20平均值标准差   114857.69.57.2--   1140850760950720884168   5.74.23.84.73.64.40.8
根据上表4-6所示结果，证实在所有6个KH21E2细胞克隆和6个KH21E4细胞克隆中都表达人EPO。此外，人EPO的表达与来自21号人类染色体的HAC载体中***的人EPO基因拷贝数有关。因此，说明可以根据***其中的基因拷贝数来控制来自21号人类染色体的HAC载体的表达。
[实施例10]将EPO基因***到来自缺失长臂远侧区和短臂近侧区的21号人类染色体的HAC载体中
按照与实施例7描述的人EPO基因相同的方式，将人EPO基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中。如实施例1-4和实施例6所述，通过端粒截短而缺失长臂远侧区、并在其长臂近侧区引入loxP位点、以及通过端粒截短而缺失短臂远侧区，制备来自21号人类染色体的HAC载体。另一方面，制备含有loxP序列的人EPO表达质粒。通过采用由瞬时表达Cre重组酶在loxP序列之间进行的位点专一重组反应，将所述质粒引入到人工染色体中。根据G418抗性获得与否(因破坏启动子而重建neo基因表达单元)，来筛选具有***序列的重组体。
(1)转染和G418抗性克隆的分离
将实施例17(下文有描述)中制备的保留来自21号人类染色体的HAC载体的2个CHO细胞克隆即CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8(在下文分别称为“H4”和“H8”)用胰蛋白酶处理。将每个克隆(5×106细胞)分别悬浮于0.8ml Hank平衡盐溶液(HBSS)中，并使用GenePulser(Biorad)，在10μg实施例7(1)中制备的pLN1-EPO载体和10μgCre酶表达载体pBS185(Lifetech)存在下，进行电穿孔。将450V电压施加于电容为500μF的电容器，通过使用具有以4mm间距放置的电极的电穿孔细胞，让其放电。将电穿孔细胞接种在5个装有补充了10％胎牛血清(FBS)的Eagle F12培养液(在下文称为“F12”，Invitrogen)的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有800μg/ml G418(GENETICIN，Invitrogen)和8μg/ml杀稻瘟素S盐酸盐(Funakoshi)的选择性培养液。在2-3周内形成G418和杀稻瘟素抗性集落。从每种宿主H4和H8细胞中分离出24个集落，使其增殖并进行以下分析。从H4制备的细胞在下文被称为“H4E细胞”，而从H8制备的细胞在下文被称为“H8E细胞”。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR分析
对于标记PRED 65基因和PRED 3基因，进行PCR扩增，其中PRED 65基因和PRED 3基因位于21号人类染色体长臂近侧区并位于loxP位点附近，而D21S265标记位于其远侧区(实施例1(3)，图2)。通过在loxP序列之间进行的位点专一重组而引入的人EPO基因***序列的产物预计具有PRED 65基因和PRED 3基因，但没有D21S265标记。结果，扩增与22个H4E细胞克隆中的21个中预测的一样进行。对于这21个克隆，通过PCR扩增位于21号人类染色体短臂近侧区的STS标记(pCHB，D21S187，D21S275)(参见实施例6，(3)，图12)。因为21号人类染色体的短臂远侧区在短臂近侧区上缺失，预测pCHB和D21S187标记不存在，而D21S275会存在。结果，证实扩增象15个克隆中所预计的一样进行。
(2-2)荧光原位杂交(FISH)分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。分析了其中的6个克隆，其中所有标记都如同以上(2-1)小节进行的PCR分析所预计的一样进行扩增。结果，在所观察的几乎所有有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体。结果见下表7。根据上述结果，并与宿主CHO细胞的染色体大小进行相对比较，证实截短的21号人类染色体转移到CHO细胞中。
                                      表7
  克隆名称   分析样本数有丝***图像/中期核         Cot-1信号数/细胞有丝***图像/中期核   保留率(中期核)％
  0      1       2     3      4＝＜
  H4EC10H4EC15H4EC16H4EC17H4EC18H4EC19   50/10050/10050/10050/10050/10050/100   4/1    45/98   1/1   0/0    0/017/6   33/87   0/6   0/1    0/05/11   45/-    0/-   0/-    0/-6/4    42/82   2/14  0/0    0/01/7    49/89   0/4   0      03/5    46/86   1/5   0/2    0/2   9994-969395
根据上述实验(2-1)和(2-2)，证实所获得的G418抗性和杀稻瘟素抗性CHO克隆保留来自21号人类染色体且通过缺失其长臂远侧区和短臂远侧区并***loxP序列而制备的HAC载体。
(3)***在来自21号人类染色体的HAC载体中的EPO基因的表达
按照酶联免疫吸附测定(ELISA)，通过定量测定培养上清液中产生的人EPO蛋白，来确定人EPO基因的表达。
(3-1)EPO基因在H4E细胞中的表达
对于所分离的24个G418/杀稻瘟素抗性H4E细胞克隆中的10个，将每个克隆(1×105细胞)分别接种到装有2ml F12培养液的6孔塑料组织培养板(Falcon)中，所述培养液中补充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml杀稻瘟素。当细胞长满后，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了10％FBS的2ml F12培养液。培养6天，收集上清液。通过人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)，定量测定培养上清液中人EPO的含量。结果见下表8。
                    表8
  克隆编号   测量值(mIU/ml)        CM中EPO的浓度
  (IU/ml)   (μg/ml)
  C6C10C11C15C16C17C18C19C20C21   57274655522649405453   11405409201100104052098080010801060   5.72.74.65.55.22.64.94.05.45.3
(3-2)EPO基因在H8E细胞中的表达
对于所分离的24个G418/杀稻瘟素抗性H8E细胞克隆中的6个，将每个克隆(1×105细胞)分别接种到装有2ml F12培养液的6孔塑料组织培养板(Falcon)中，所述培养液中补充了10％FBS并含有800μg/ml G418和8μg/ml杀稻瘟素。当细胞长满后，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了10％FBS的2ml F12培养液。培养6天，收集上清液。通过人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)，定量测定培养上清液中人EPO的含量。结果见下表9。
                   表9
  克隆编号   测量值(mIU/ml)        CM中EPO的浓度
  (IU/ml)   (μg/ml)
  C9C14C17C20C21C23   856268764562   17001240136015209001240   8.56.26.87.64.56.2
根据表8和表9的结果，证实在所有10个H4E细胞克隆和6个H8E细胞克隆中都表达人EPO。
[实施例11]将来自21号人类染色体的HAC载体转移到小鼠A9细胞中
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
用得自实施例17的CHO#21hyg4和CHO#21hyg8(在下文分别称为“H4细胞”和“H8细胞”)作为染色体供体细胞，“H4细胞”和“H8细胞”都保留来自通过缺失长臂远侧区并***loxP序列后又通过端粒截短并缺失短臂远侧区的21号人类染色体的HAC载体。采用小鼠A9细胞作为染色体受体细胞(Oshimura等，Environ.HealthPerspect.93：57，1991，保藏号JCRB0211)。首先，从约107H4细胞制备微细胞。更具体地讲，将H4细胞或H8细胞在24个25cm2的离心瓶(Nunc)中培养至细胞密度相当于约60-70％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.1μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培养液(20％FBS，800μg/ml G418，F12)中再培养5天，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后采用装有孔径为8μm、5μm和3μm滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)进行过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于2ml补充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中小鼠A9细胞已培养到至多90％饱和的25cm2培养瓶(Falcon)中加入纯化的微核细胞。让细胞混合物在37℃静置15分钟，然后细胞融合在如下制备的溶液中进行1分钟：将PEG 1000(终浓度为50％(w/v)，Sigma)和DMSO(终浓度为7％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并经孔径0.22μm的滤器(Saltrius)过滤。当细胞在含10％FBS的DMEM培养液中培养48小时后，细胞经胰酶处理而分散，然后接种在2个48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有杀稻瘟素(4μg/ml)或潮霉素(700μg/ml，Invitrogen)的选择性培养液(10％FBS，DMEM)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合7次，共得到22个抗药性集落。以上所获得的细胞在下文称为“A9Δ细胞”。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR法
分析了以上(1)小节所得集落中的21个克隆。对于标记PRED 65基因和PRED 3基因以及D21S265标记，进行PCR扩增；其中PRED65基因和PRED 3基因位于21号人类染色体长臂近侧区并位于loxP位点附近，而D21S265标记位于其远侧区(参见实施例1，(3)和图2)。预测具有***序列的HAC载体可具有PRED 65基因和PRED 3基因，但没有D21S265标记。结果，证实扩增与20个克隆中所预计的一样进行。
然后，对STS标记(pCHB，D21S187，D21S275)进行PCR扩增，所述标记位于21号人类染色体短臂近侧区(参见实施例6，(3)和图12)。因为在21号人类染色体短臂近侧区的位置缺失短臂远侧区，预计pCHB和D21S187标记不会存在，但D21S275标记会存在。结果，证实扩增与18个克隆中所预计的一样进行。
(2-2)在选择性药物存在下的培养
根据来自21号人类染色体的HAC载体上存在的抗药性基因(即潮霉素抗性基因(在短臂远侧区)和杀稻瘟素抗性基因(在长臂近侧区)在选择性药物存在下是否起作用的结果，证实是否存在含每种抗药性基因的区域。
将表现出与上(2-1)小节预计的扩增一样的9个克隆在6孔组织培养板(Falcon)中培养至细胞密度相当于约60-70％饱和，其中每孔装有含杀稻瘟素(4μg/ml)的选择性培养液(10％FBS，DMEM)。用PBS(Invitrogen)洗涤2次后，将克隆细胞在仅含潮霉素(700μg/ml)的培养液或者含杀稻瘟素(4μg/ml)和潮霉素(700μg/ml)的培养液中培养1周。结果见下表10。
                        表10
  克隆名称  杀稻瘟素(Bsd)   潮霉素(Hyg)   Bsd+Hyg
  A9Δ10A9Δ11A9Δ12A9Δ13A9Δ111A9Δ113A9Δ114A9Δ115A9Δ116  RRRRRRRRR   RR-RRRRRR   RRRRRRRRR
R；抗药性
-；没有实验数据
根据上述结果，证实所有克隆都是杀稻瘟素抗性和潮霉素抗性克隆。
(2-3)荧光原位杂交(FISH)分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。分析了2个克隆，其中所有标记都如同以上(2-1)小节进行的PCR分析所预计的一样进行扩增，并且所述克隆在以上(2-2)小节中都表现出杀稻瘟素抗性和潮霉素抗性。结果，在所观察的几乎所有有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体。结果见下表11。
                                  表11
  克隆名称   分析样本数有丝***图像/中期核   Cot-1信号数/细胞有丝***图像/中期核   保留率(中期核)％
  0         1        2        3
  A9Δ11A9Δ12   50/0050/100   11/31     36/65    3/2      0/22/11      47/87    0/2      1/0   6989
根据上述结果，并与宿主小鼠A9细胞的染色体大小进行相对比较，证实截短的21号人类染色体转移到小鼠A9细胞中。在下文中，2个细胞克隆分别被称为“A9Δ11”和“A9Δ12”。
根据上述实验(2-1)和(2-3)，证实2个杀稻瘟素抗性和潮霉素抗性克隆保留来自缺失其长臂和短臂的截短的21号人类染色体的HAC载体。
[实施例12]将具有人EPO基因的来自21号人类染色体的HAC载体转移到小鼠A9细胞中
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
用得自实施例10的具有高微核形成能力的CHO细胞克隆(H4EC10、H4E C15或H4E C16细胞)作为染色体供体细胞，该细胞克隆保留来自通过缺失长臂远侧区并***loxP序列后又通过端粒截短并缺失短臂远侧区再***单拷贝人EPO基因的21号人类染色体的HAC载体。用小鼠A9细胞作为染色体受体细胞(Oshimura等，Environ.Health Perspect.93：57，1991，保藏号JCRB0211)。首先，从约108H4EC15细胞或H4E C16细胞制备微细胞。将H4E C15细胞或H4E C16细胞在24个25cm2的离心瓶(Nunc)中培养至细胞密度相当于约60-70％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.1μg/ml，Demecolcine，Wako PureChemical Industries，Ltd.)的培养液(20％FBS，800μg/ml G418，F12)中再培养4天，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后采用装有孔径为8μm、5μm和3μm滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)进行过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于2ml补充了50μg/ml或100μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中小鼠A9细胞已培养至90％饱和的25cm2培养瓶(Falcon)中加入纯化的微核细胞。让细胞混合物在37℃静置15分钟后，细胞融合在如下制备的溶液中进行1分钟：将PEG 1000(终浓度为50％(w/v)，Sigma)和DMSO(终浓度为7％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并经孔径0.22μm的滤器过滤。当细胞在含10％FBS的DMEM培养液中培养48小时后，细胞经胰酶处理而分散，然后接种在2个48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有杀稻瘟素(6μg/ml)或G418(600μg/ml)的选择性培养液(10％FBS，DMEM)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合12次，共得到39个G418抗性集落。以上所获得的细胞在下文称为“AΔE细胞”。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR法
分析了以上(1)小节所得集落中的25个克隆。对于标记PRED 65基因和PRED 3基因以及D21S265标记，进行PCR扩增；其中PRED65基因和PRED 3基因位于21号人类染色体长臂近侧区并位于loxP位点附近，而D21S265标记位于其远侧区(参见实施例1(3)和图2)。预测通过在loxP序列之间的位点专一重组而***的人EPO基因可具有PRED 65基因和PRED 3基因，但没有D21S265标记。结果，证实扩增如同在24个克隆中预计的一样进行。对于STS标记(pCHB，D21S187，D21S275)进行PCR扩增，所述标记位于21号人类染色体短臂近侧区(参见实施例6，(3)和图12)。因为在21号人类染色体短臂近侧区的位置缺失短臂远侧区，预计pCHB和D21S187标记不会存在，但D21S275标记会存在。结果，证实扩增与19个克隆中所预计的一样进行。
(2-2)在选择性药物存在下的培养
根据来自21号人类染色体的HAC载体上存在的抗药性基因(即潮霉素抗性基因(在短臂远侧区)、杀稻瘟素抗性基因(在长臂近侧区)和新霉素抗性基因(在长臂近侧区)在选择性药物存在下是否起作用的结果，证实是否存在含每种抗药性基因的区域。
将表现出与上(2-1)小节预计的扩增一样的7个克隆在6孔组织培养板(Falcon)中培养至细胞密度相当于约60-70％饱和，其中培养板装有含G418(600μg/ml)或杀稻瘟素(6μg/ml)的选择性培养液(10％FBS，DMEM)。用PBS(Invitrogen)洗涤2次后，将细胞克隆在含杀稻瘟素、潮霉素(700μg/ml)和G418的培养液中培养1周或10天。结果见下表12。
                               表12
  克隆名称  杀稻瘟素(Bsd)   潮霉素(Hyg) Genecitin(G)   Bsd+Hyg+G
  AΔE1AΔE2AΔE4AΔE5AΔE8AΔE16AΔE18  RR-RR--   RR--RRR RRR-RRR   RRRRRRR
R；抗药性
-；没有实验数据
根据上述结果，证实7个克隆都是三药抗性克隆，即杀稻瘟素抗性、潮霉素抗性和G418抗性。
(2-3)荧光原位杂交(FISH)分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。分析了7个克隆，其中所有标记都如同以上(2-1)小节PCR分析所预计的一样进行扩增。结果，在所观察的几乎所有有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体。结果见下表13。
                                   表13
  克隆名称   分析样本数有丝***图像/中期核   Cot-1信号数/细胞有丝***图像/中期核   保留率(中期核)％
  0        1       2       3       4＝＜
  AΔE51AΔE52AΔE53AΔE54AΔE55AΔE4AΔE18   50/10050/10050/10050/10050/10048/10050/100   1/1      6/11    7/21    15/31   21/366/13     38/80   6/6     0/1     01/4      5/8     3/12    11/33   30/437/7      32/77   9/16    1/0     1/014/39    5/17    6/13    1/16    24/151/9      41/86   4/5     1/0     1/01/4      32/67   17/29   0       0   87999686729196
根据上述结果，并与宿主小鼠A9细胞的染色体大小进行相对比较，证实截短的21号人类染色体转移到小鼠A9细胞中。
根据上述实验(2-1)和(2-3)，证实以上所获得的AΔE细胞保留来自具有人EPO基因***序列并缺失其长臂和短臂的截短的21号人类染色体的HAC载体。
(3)具有人EPO基因***序列的重组体的证实
筛选具有***序列的重组体，也就是说，采用根据来自人EPO基因供体载体的序列而设计的引物和根据HAC载体而设计的引物(使之邻接loxP序列位点)，通过PCR扩增来证实***序列是否引入到来自21号人类染色体的HAC载体的loxP序列位点中。
对于AΔE细胞的12个克隆，通过使用Neo Rp2引物(SEQ ID No.38)(如实施例9(4)所述)和来自质粒载体pBS226的M13RV引物(SEQID No.39)，进行PCR。在具有***序列的重组体的情况下，预计扩增约2.3kb的片段，该片段包括从具有CMV启动子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的部分到loxP序列的区域，以及来自pSF1的loxP序列到neo基因部分的区域。结果，扩增与在所有12个克隆中预测的一样进行。
根据上述结果，证实所有AΔE细胞克隆都保留来自21号人类染色体的HAC载体，其中***了一个含有CMV启动子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的DNA***片段的拷贝。
(4)***在来自21号人类染色体的HAC载体中的EPO基因的表达
按照酶联免疫吸附测定(ELISA)，通过定量测定培养上清液中产生的人EPO蛋白，来确定人EPO基因的表达。
对于所分离的4个AΔE克隆，将每个克隆(1×105细胞)分别接种到装有2ml DMEM培养液的6孔塑料组织培养板(Falcon)中，所述培养液中补充了10％FBS并含有600μg/ml G418和6μg/ml杀稻瘟素。当细胞长满后，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了10％FBS的2ml F12培养液。培养4天或5天后，收集上清液。通过人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)，不用稀释即可定量测定培养上清液中人EPO的含量。结果见下表14。
                    表14
克隆编号   测量值(mIU/ml)   CM中EPO的浓度(pg/ml)
  AΔE51AΔE53AΔE4AΔE18   ＞200192＞200＞200   ＞1000910＞1000＞1000
AΔE51、AΔE4和AΔE18的培养上清液中人EPO浓度均高于人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)的检出限。
根据上述结果，证实AΔE细胞产生人EPO蛋白。
[实施例13]将14号人类染色体的片段(SC20)转移到正常人类成纤维细胞中
(1)将SC20转移到正常人类成纤维细胞(HFL-1)中
(1-1)微细胞融合(平板法)和抗药性克隆的分离
用含有14号人类染色体片段(SC20)的小鼠A9细胞(C11-SC20细胞，Tomizuka等，Nature Genet.(USA)，第16卷，第133-143页，1997)作为染色体供体细胞。用正常人类成纤维细胞HFL-1(得自RIKEN的细胞材料开发实验室，保藏号RCB0521)作为染色体受体细胞。首先，从约107细胞制备微细胞。具体地讲，将C11-SC20细胞在12个25cm2的离心瓶(Nunc)中培养至细胞密度相当于约80-90％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.05μg/ml，Demecolcine，Wako PureChemical Industries，Ltd.)的培养液(20％FBS，800μg/ml G418，DMEM)中再培养48小时，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后采用装有孔径为8μm、5μm和3μm滤器(Whatman)的WEINNEX-25(Millipore)进行过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于2ml补充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HFL-1细胞已培养至90％饱和的25cm2培养瓶(Falcon)中加入纯化的微核细胞。让细胞混合物在37℃静置15分钟后，细胞融合在如下制备的溶液中进行1分钟：将PEG1500(终浓度为45％(w/v)，Roche Diagnostics)和DMSO(终浓度为10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并经孔径0.22μm的滤器过滤除菌。当细胞在含15％FBS的DMEM培养液中培养48小时后，细胞经胰酶处理而分散，然后接种在1个胶原蛋白I包被的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有G418(300μg/ml)的选择性培养液(15％FBS，DMEM)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合3次，共得到21个G418抗性集落。
(1-2)微细胞融合(悬浮法)和抗药性克隆的分离
按照与以上(1-1)小节类似的方式，制备和纯化微细胞，并重悬于6ml DMEM中。将HFL-1在175cm2的培养瓶(Nunc)中培养至细胞密度到至多90％饱和。细胞经胰酶处理而分散后，用DMEM洗涤2次，然后悬浮于7ml DMEM中。将HFL-1细胞悬液覆盖在所获得的微细胞悬液上并进行离心。弃去上清液后，通过吹打使沉淀悬浮。向所得悬浮液中加入0.5ml PEG 1500(终浓度为50％(w/v)，RocheDiagnostics)，进行细胞融合达120秒。向所得溶液中按1ml/分钟的速率加入5m1 DMEM，然后再加入5ml DEME。让溶液在37℃静置10分钟后，进行离心，重悬于含有15％FBS的DMEM培养液中，并接种到2个胶原蛋白I包被的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有G418(300μg/ml)的选择性培养液(15％FBS，F12)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合1次，得到2个G418抗性集落。
(1-3)转移染色体的证实
(1-3-1)PCR法
通过SC20上存在的neo基因的PCR扩增，证实转移的染色体。此时所用的引物寡核苷酸序列如下所示：
421F：5′-TTT GCA TGT CTT TAG TTC TAT GAT GA-3′(SEQ ID No.40)；
778R：5′-AGG TCG GTC TTG ACA AAA AGA AC-3′(SEQ ID No.41).
根据质粒载体pSTneoB的核苷酸序列，制备这些引物(Kato等，Cell Struct Funct，12：575-580，1987)。
对于以上(1-1)小节和(1-2)小节所得G418抗性细胞的12个克隆，通过使用421F引物(SEQ ID No.40)和778R引物(SEQ ID No.41)进行PCR扩增。预计保留具有***序列的HAC载体的克隆可具有neo基因。结果，证实扩增如同在所有克隆中预计的一样进行。
(1-3-2)染色体分析
按照Kuroki等(Cell engineering handbook，Yodosha，1992)描述的方法，通过吉姆萨染色，进行染色体分析。分析了G418抗性HFL-1细胞中的2个克隆的约20幅中期染色体图像。在G418抗性克隆中，观察到在亲代细胞系HFL-1中未观察到的、比内源14号染色体小的微型染色体。
根据上述实验(1-3-1)和(1-3-2)，证实所得G418抗性HFL-1克隆保留SC20。
(2)将SC20转移到正常人类成纤维细胞HUC-F2中
(2-1)微细胞融合(平板法)和抗药性克隆的分离
用含有14号人类染色体片段(SC20)的小鼠A9细胞(C11-SC20细胞，Tomizuka等，Nature Genet.(USA)，第16卷，第133-143页，1997)作为染色体供体细胞。用正常人类成纤维细胞HUC-F2(得自RIKEN的细胞材料开发实验室，保藏号RCB0436)作为染色体受体细胞。首先，从约107细胞制备微细胞。更具体地讲，将C11-SC20细胞在12个25cm2的离心瓶(Nunc)中培养至细胞密度相当于约80-90％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.05μg/ml，Demecolcine，Wako PureChemical Industries，Ltd.)的培养液(20％FBS，800μg/ml G418，DMEM)中再培养48小时，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后采用装有孔径为8μm、5μm和3μm滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)进行过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于2ml补充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HUC-F2细胞已培养至90％饱和的25cm2培养瓶(Falcon)中加入纯化的微核细胞。让细胞混合物在37℃静置15分钟后，细胞融合在如下制备的溶液中进行1分钟：将PEG1500(终浓度为45％(w/v)，Roche Diagnostics)或PEG 1000(终浓度为45％(w/v)，Sigma)和DMSO(终浓度为10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并经孔径0.22μm的滤器过滤除菌。当细胞在含10％FBS的DMEM培养液中培养48小时后，细胞经胰酶处理而分散，然后接种在1个胶原蛋白I包被的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有G418(400μg/ml)的选择性培养液(15％FBS，DMEM)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合4次，共得到8个G418抗性集落。
(2-2)微细胞融合(悬浮法)和抗药性克隆的分离
按照与以上(1-1)小节类似的方式，制备和纯化微细胞，并重悬于6ml DMEM中。将HUC-F2细胞在175cm2的培养瓶(Nunc)中培养至细胞密度相当于90％饱和。细胞经胰酶处理而分散后，用DMEM洗涤2次，然后悬浮于7ml DMEM中。将HUC-F2细胞悬液覆盖在所获得的微细胞悬液上并进行离心。弃去上清液后，通过吹打使沉淀悬浮。向所得悬浮液中加入0.5ml PEG 1500(终浓度为50％(w/v)，Roche Diagnostics)，进行细胞融合达120秒。向所得溶液中按1ml/分钟的速率加入5ml DMEM，然后再加入5ml DEME。让溶液在37℃静置10分钟后，进行离心。沉淀重悬于含有10％FBS的DMEM培养液中，并接种到2个胶原蛋白I包被的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有G418(400μg/ml)的选择性培养液(10％FBS，DMEM)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合1次，得到6个G418抗性集落。
(2-3)转移染色体的证实
通过SC20上存在的neo基因的PCR扩增，证实转移的染色体。对于(2-1)和(2-2)小节所获得的G418抗性细胞的7个克隆，通过使用421F引物(SEQ ID No.40)和778R引物(SEQ ID No.41)进行PCR扩增。预计HAC载体中的***序列可具有neo基因。结果，证实扩增如同在所有克隆中预计的一样进行。根据上述结果，证实所获得的G418HUC-F2克隆保留SC20。
(3)将SC20转移到正常人类成纤维细胞HF-19中：微细胞融合和抗药性克隆的分离
用含有14号人类染色体片段(SC20)的小鼠A9细胞(C11-SC20细胞，Tomizuka等，Nature Genet.(USA)，第16卷，第133-143页，1997)作为染色体供体细胞。用正常人类成纤维细胞HF-19(得自RIKEN的细胞材料开发实验室，保藏号RCB0210)作为染色体受体细胞。首先，从约107细胞制备微细胞。将C11-SC20细胞在12个25cm2的离心瓶(Nunc)中培养至细胞密度相当于约80-90％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.05μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培养液(20％FBS，800μg/ml G418，DMEM)中再培养48小时，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后采用装有孔径为8μm、5μm和3μm滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)进行过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于2ml补充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HF-19细胞已培养至90％饱和的25cm2培养瓶(Falcon)中加入纯化的微核细胞。让细胞混合物在37℃静置15分钟后，细胞融合在如下制备的溶液中进行1分钟：将PEG 1500(终浓度为45％(w/v)，Roche Diagnostics)和DMSO(终浓度为10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并经孔径0.22μm的滤器过滤除菌。当细胞在含10％FBS的DMEM培养液中培养48小时后，细胞经胰酶处理而分散，然后接种在1个胶原蛋白I包被的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有G418(400μg/ml)的选择性培养液(10％FBS，DMEM)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合1次，得到1个G418抗性集落。
[实施例14]将来自21号人类染色体的HAC载体转移到正常人类成纤维细胞中
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
(1-1)通过使用保留来自21号人类染色体的HAC载体的CHO细胞作为染色体供体细胞来进行微细胞融合
将得自实施例10的CHO细胞中能高频形成微核的克隆(H4E C10细胞)作为染色体供体细胞，所述克隆保留来自21号人类染色体的并含有单拷贝人EPO基因的HAC载体，所述载体制备如下：缺失长臂远侧区并***loxP序列、随后又通过端粒截短而缺失短臂远侧区、并通过瞬时表达Cre重组酶在loxP序列之间进行位点专一重组反应而引入人EPO基因。用正常人类成纤维细胞HFL-1(得自RIKEN的细胞材料开发实验室，保藏号RCB0521)作为染色体受体细胞。首先，从约108H4E C10细胞制备微细胞。更具体地讲，将H4E C10细胞在48个25cm2的离心瓶(Nunc)中培养至细胞密度相当于约60-70％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.1μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemica1Industries，Ltd.)的培养液(20％FBS，800μg/ml G418，F12)中再培养4天，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后采用装有孔径为8μm、5μm和3μm滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)进行过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于2ml补充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HFL-1细胞已培养至90％饱和的25cm2培养瓶(Falcon)中加入纯化的微核细胞。让细胞混合物在37℃静置15分钟后，细胞融合在如下制备的溶液中进行1分钟：将PEG 1500(终浓度为45％(w/v)，Roche Diagnostics)和DMSO(终浓度为10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并经孔径0.22μm的滤器过滤除菌。当细胞在含20％FBS的DMEM培养液中培养48小时后，细胞经胰酶处理而分散，然后接种在1个胶原蛋白I包被的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有G418(300μg/ml)或杀稻瘟素(6μg/ml)的选择性培养液(20％FBS，DMEM)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合5次，共得到3个抗药性集落。所述细胞被称为“HCΔE细胞”。
(1-2)通过使用保留来自21号人类染色体的HAC载体的小鼠A9细胞作为染色体供体细胞来进行微细胞融合
将得自实施例12的小鼠A9细胞中能高频形成微核的克隆(AΔ51或AΔE5细胞)作为染色体供体细胞，所述小鼠A9细胞保留来自21号人类染色体的并含有单拷贝人EPO基因的HAC载体，所述载体制备如下：缺失长臂远侧区并***loxP序列、随后又通过端粒截短而缺失短臂远侧区、并通过瞬时表达Cre重组酶在loxP序列之间进行位点专一重组反应而引入人EPO基因。用正常人类成纤维细胞HFL-1(得自RIKEN的细胞材料开发实验室，保藏号RCB0521)作为染色体受体细胞。首先，从约107细胞制备微细胞。更具体地讲，将AΔ51或AΔE5细胞在12个25cm2的离心瓶(Nunc)中培养至细胞密度相当于约80-90％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.1μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培养液(20％FBS，600μg/mlG418，DMEM)中再培养72小时，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后采用装有孔径为8μm、5μm和3μm滤器(Whatman)的SWINNEX-25(Millipore)进行过滤纯化。将纯化的微细胞重悬于2ml补充了50μg/ml植物凝集素-P(Difco)的DMEM中。向其中HFL-1细胞已培养至90％饱和的25cm2培养瓶(Falcon)中加入纯化的微核细胞。让细胞混合物在37℃静置15分钟后，细胞融合在如下制备的溶液中进行1分钟：将PEG 1500(终浓度为45％(w/v)，Roche Diagnostics)和DMSO(终浓度为10％(w/v)，Sigma)溶于DMEM中并经孔径0.22μm的滤器过滤除菌。当细胞在含20％FBS的DMEM培养液中培养48小时后，细胞经胰酶处理而分散，然后接种在1个胶原蛋白I包被的48孔塑料组织培养板(Falcon)中。2天后，更换培养液，即弃去原培养液，加入含有G418(300μg/ml)或杀稻瘟素(6μg/ml)的选择性培养液(20％FBS，DMEM)。选择性培养约3周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。微细胞融合10次，共得到27个抗药性集落。所述细胞被称为“HΔE细胞”。
(2)转移染色体的证实
通过对于来自21号人类染色体的HAC载体上是否存在neo基因的PCR扩增，来证实转移的染色体。PCR扩增所使用的引物寡核苷酸序列如下所示：
1291F：5′-CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG-3′(SEQ ID No.42)；
1667R：5′-ATT TGC ACT GCC GGT AGA ACT-3′(SEQ ID No.43).
根据质粒载体pSTneoB的核苷酸序列，制备这些引物(Kato等，Cell Struct Funct，12：575-580，1987)。
使用1291F引物(SEQ ID No.42)和1667R引物(SEQ ID No.43)，进行PCR扩增。在来自21号人类染色体的HAC载体存在的情况下，预计扩增含有neo基因部分的0.4kb片段。结果，证实扩增如同在所有5个HΔE克隆中预计的一样进行。
根据上述结果，证实HΔE细胞保留了来自21号人类染色体的HAC载体。
(3)***在来自21号人类染色体的HAC载体中的EPO基因的表达
按照酶联免疫吸附测定(ELISA)，通过定量测定培养上清液中产生的人EPO蛋白，确定人EPO基因的表达。
对于分离的3个杀稻瘟素抗性HCΔE细胞克隆和8个G418或杀稻瘟素抗性HCΔE细胞克隆，将细胞接种到装有0.5ml DMEM培养液的48孔塑料组织培养板(Falcon)中，所述培养液中补充了20％FBS并含有300μg/ml G418或6μg/ml杀稻瘟素。当细胞培养2天、3天或4天后，收集上清液。通过人EPO ELISA试剂盒(Quantikine IVD人EPO免疫测定，R&D***)，无需稀释即可定量测定培养上清液中人EPO的含量。结果见下表15。
                   表15
克隆编号   测量值(mIU/ml)   CM中EPO的浓度(pg/ml)
  HΔE51-1HΔE51-2HΔE51-3HΔE51-4HΔE5-1HΔE5-2HΔE5-3HΔE5-4HCΔE1-1HCΔE1-2HCΔE3-1   ＞2004613062＞200＞200＞200＞200305746   ＞1000230650310＞1000＞1000＞1000＞1000150285230
在HΔE51-1、HΔE5-1、HΔE5-2、HΔE5-3和HΔE5-4克隆中，培养上清液中的人EPO浓度高于人EPO ELISA试剂盒(QuantikineIVD人EPO免疫测定，R&D***)的检出限。
根据上述结果，证实HCΔE细胞克隆和HΔE细胞克隆中都产生人EPO蛋白。
[实施例15]构建用于将EPO基因和人类端粒酶(hTERT)基因***来自21号人类染色体的HAC载体中的载体
(1)构建含有loxP序列的hTERT表达质粒pLN1-hTERT
人类端粒酶(hTERT)基因编码区为3399bp并且在其5’区含有富含G/C的序列。由于这个原因，预计难以通过设计在编码区两端的引物来扩增完整基因。因此，编码区分为3个区：1-800bp(在下文称为“5′hTERT”)、679-1993bp(在下文称为“M-XhTRET”)和1952-3339bp(在下文称为“3′hTERT”)。请注意，在核苷酸中的位置用起始密码子“ATG)的首字母“A”来表示。当通过PCR扩增各个区并克隆后，将这些区彼此连接。以此方式，进行hTERT基因的克隆。该方法将在下文进行详细描述。
(1-1)5′hTERT的克隆
用于构建质粒载体的引物寡核苷酸序列如下所示：
hTERT Fw6：5′-CTG CTG CGC ACG TGG GAA G-3′(SEQ ID No.44)
hTERT Rv6：5′-GGT CTG GCA GGT GAC ACC AC-3′(SEQ ID No.45)
hTERT Fw1：5′-GAA GAT CTT CAT CGA TCG GCC ACC ATG CCG CGC GC-3′(SEQ ID No.46)
hTERT Rv7：5′-TCA CTC GGT CCA CGC GTC CT-3′(SEQ ID No.47)
这些引物是根据得自GenBank的核苷酸序列(登记号NM003219)而制备。
用1ng HL-60 cDNA(Marathon-Ready cDNA，CLONTECH)作为模板，在50μl含有终浓度分别为0.4μM的hTERT Fw6(SEQ ID No.44)和hTERT Rv6(SEQ ID No.45)的反应液中，使用2.5单位LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，进行PCR扩增。使用GeneAmp9600(AppliedBiosystems)作为热循环仪。PCR扩增如下进行：首先置于98℃10分钟，然后重复以下循环：98℃变性30秒，72℃退火/延伸5分钟，共3次；98℃变性30秒，70℃退火/延伸5分钟，共2次；98℃变性30秒，68℃退火/延伸5分钟，共35次。此外，用2μl所得PCR产物作为模板，使用终浓度分别为0.4μM的hTERT Fw1(SEQ ID No.46)和hTERT Rv7(SEQ ID No.47)，使用2.5单位LA Taq(Takara ShuzoCo.，Ltd.)，在50μl反应液中，进行PCR扩增。PCR扩增如下进行：首先置于98℃10分钟，然后重复以下循环：98℃变性30秒，72℃退火/延伸5分钟，共3次；98℃变性30秒，70℃退火/延伸5分钟，共2次；98℃变性30秒，68℃退火/延伸5分钟，共35次。结果得到约0.8kb的DNA片段。
约0.8kb的DNA片段通过QIAQUICK PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化，其两端用KOD DNA聚合酶(Toyobo)消化，得到平端，然后用Bgl II(Takara Shuzo Co.，Ltd.)进一步消化，得到5’粘端。结果，得到用于5′hTERT***序列的DNA片段。当质粒载体pLN1-EPO用Xho I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化后，其两端用KOD DNA聚合酶(Toyobo)消化，得到平端。所得片段再用BamH I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)进一步消化后，去除人EPO基因。对于所得BamH I平端位点，克隆用于5′hTERT***序列的DNA片段。用大肠杆菌XL-10 Gold(Stratagene)作为宿主。用DNA测序仪(PRISM3700，Applied Biosystems)分析如此克隆的用于5′hTERT***序列的DNA片段的核苷酸序列，证实与得自GenBank的核苷酸序列相应部分相同。由上所述，所得质粒载体被命名为pLN1-5′hTERT。
(1-1)M-XhTERT的克隆
用于构建质粒载体的引物寡核苷酸序列如下所示：
hTERT Fw8-2：5′-AGT GCC AGC CGA AGT CTG CC-3′(SEQ ID No.48)
hTERT 5′XhoIRv3：5′-GCA GCT GAA CAG TGC CTT C-3′(SEQ ID No.49)
hTERT Fw8-1：5′-AGG ACG CGT GGA CCG AGT GA-3′(SEQ ID No.50)
这些引物是根据得自GenBank的核苷酸序列(登记号NM003219)而制备。
用0.25ng HL-60cDNA(Marathon-Ready cDNA，CLONTECH)作为模板，在25μl含有终浓度分别为0.4μM的hTERT Fw8-2(SEQ IDNo.48)和hTERT 5′XhoIRv3(SEQ ID No.49)的反应液中，使用2.5单位LA Taq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，进行PCR扩增。PCR扩增如下进行：首先置于98℃5分钟，然后重复以下循环：98℃15秒，55℃30秒，72℃90秒，共40次。此外，用1μl所得PCR产物作为模板，在25μl含有终浓度分别为0.4μM的hTERT Fw8-1(SEQ ID No.50)和hTERT 5′XhoIRv3(SEQ ID No.49)的反应液中，使用2.5单位LATaq(Takara Shuzo Co.，Ltd.)，进行PCR扩增。使用GeneAmp9700(Applied Biosystems)作为热循环仪。PCR扩增如下进行：首先置于98℃5分钟，然后重复以下循环：98℃变性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共40次。结果得到约1.2kb的DNA片段。
约1.2kb的DNA片段通过QIAQUICK PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化，其两端用Mlu I和Xho I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端，然后克隆到质粒载体pLN1-EPO2的Mlu I-Xho I位点。用大肠杆菌XL-10 Gold(STRATAGENE)作为宿主。用DNA测序仪(PRISM3700，Applied Biosystems)分析如此克隆的用于M-XhTERT***序列的DNA片段的核苷酸序列，证实与得自GenBank的核苷酸序列相应部分相同。由上所述，所得质粒载体被命名为pLN1-M-XhTERT。
(1-3)3′hTERT的克隆
用于构建质粒载体的引物寡核苷酸序列如下所示：
AP1：5’-CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3’(SEQID No.51)
该引物是用于与Marathon-Ready cDNA(CLONTECH)连接的一个引物。
hTERT 3′XhoIFw：5′-CCG AGC GTC TCA CCT CGA GGG TGA AGG CAC TGTTC-3′(SEQ ID No.52)
hTERT 3’XhoIFw2：5′-ATG GAC TAC GTC GTG GGA GCC AGA-3′(SEQ ID No.53)
hTERT Rv1：5′-GTC GAC GCT AGC TCA GTC CAG GAT GGT CTT GAA GT-3′(SEQ ID No.54)
这些引物是根据得自GenBank的核苷酸序列(登记号NM003219)而制备。
用0.1ng HL-60cDNA(Marathon-Ready cDNA，CLONTECH)作为模板，在25μl含有终浓度分别为0.3μM的hTERT 3′XhoIFw2(SEQID No.53)和AP1(SEQ ID No.51)的反应液中，使用0.5单位KOD-Plus-(Toyobo)，进行PCR扩增。使用GeneAmp9700(Applied Biosystems)作为热循环仪。PCR扩增如下进行：首先置于94℃2分钟，然后重复以下循环：94℃变性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸3分钟，共30次。此外，用1μl所得PCR产物作为模板，使用终浓度分别为0.3μM的hTERT 3′XhoIFw(SEQ ID No.52)和hTERT Rv1(SEQ IDNo.54)，使用0.5单位KOD-Plus-(Toyobo)，在25μl反应液中进行PCR扩增。PCR扩增如下进行：首先置于98℃5分钟，然后重复以下循环：98℃变性15秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共40次。结果得到约1.4kb的DNA片段。
约1.2kb的DNA片段通过QIAQUICK PCR纯化试剂盒(QIAGEN)进行纯化，其两端用Xho I和Sal I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端，然后克隆到质粒载体pLN1-EPO的Xho I位点。用大肠杆菌XL-10 Gold(STRATAGENE)作为宿主。用DNA测序仪(PRISM3700，Applied Biosystems)分析如此克隆的3′-hTERT***序列的DNA片段的核苷酸序列，证实与得自GenBank的核苷酸序列相应部分相同，并且证实其***方向与pLN1-EPO上的CMV启动子转录方向相反。所得质粒载体被命名为pLN1-3′hTERT。
(1-4)5′hTERT、M-XhTRET和3′hTERT的连接
用以上(1-3)小节得到的质粒载体pLN1-3′hTERT作为模板，在50μl含有终浓度分别为0.3μM的hTERT 3′XhoIFw(SEQ ID No.52)和hTERT Rv1(SEQ ID No.54)的反应液中，使用0.5单位KOD-Plus-(Toyobo)，进行PCR扩增。使用GeneAmp9700(Applied Biosystems)作为热循环仪。PCR扩增如下进行：首先置于94℃2分钟，然后重复以下循环：94℃变性15秒，60℃退火30秒，68℃延伸2分钟，共30次。结果得到约1.4kb的DNA片段。
约1.4kb的DNA片段通过QIAQUICK PCR纯化试剂盒(QLAGEN)进行纯化，然后用DNA测序仪(PRISM3700，ABI)测序，证实与得自GenBank的核苷酸序列相应部分相同。然后，将约1.4kb的DNA片段用Xho I和Sal I(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化，得到粘端。得自以上(1-2)小节的质粒载体pLN1-XhTERT与经Mlu I和Xho I消化所获得的M-XhTERT区一起克隆到质粒载体pLN1-EPO2的Mlu I-Xho I位点区(该区所含的人EPO基因已去除)。用大肠杆菌XL-10 Gold(STRATAGENE)作为宿主。
用DNA测序仪(PRISM3700，Applied Biosystems)分析如此克隆的DNA***片段的核苷酸序列。结果，证实该DNA***片段具有点突变和3′-hTERT区，所述点突变在M-XhTERT区内因核苷酸取代而引起，而3′-hTERT区与得自GenBank的核苷酸序列相应部分相同，并且证实该DNA***片段的方向与pLN1-EPO上的CMV启动子的转录方向相反。以上所获得的质粒载体用EcoR I和Xho I消化，去除M-XhTERT区。将CMV启动子、pLN1-5′hTERT区以及M-XhTERT区一起克隆到缺乏M-XhTERT区的区域；其中CMV启动子是由得自(1-1)小节的pLN1-5′hTERT经EcoR I和Mul I消化(使之具有粘端)而制备，而M-XhTERT区是由pLN1-M-XhTERT经Mul I和Xho I消化(使之具有粘端)而制备。用大肠杆菌XL-10 Gold(STRATAGENE)作为宿主。如此获得的质粒载体被命名为pLN1-hTERT。
(2)构建表达人EPO和hTERT并含有loxP序列的质粒pLN1-EPO-hTERT
将一段DNA片段、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加单元一起克隆到实施例11制备的质粒载体pLN1-hTERT的EcoR I位点；其中所述DNA片段含有CMV启动子，该CMV启动子是由实施例9中制备的质粒载体pLN1-EPO2经EcoR I消化而制备。该质粒被命名为pLN1-EPO-hTERT。
(3)构建表达2拷贝人EPO和hTERT并含有loxP序列的质粒pLN1-EPO2-hTERT
将一段DNA片段、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加单元一起克隆到以上(1)小节制备的质粒载体pLN1-hTERT的EcoR I位点；其中所述DNA片段含有2拷贝的CMV启动子序列，该CMV启动子是由实施例9(1)中制备的质粒载体pLN1-EPO2经EcoR I消化而制备。该质粒被命名为pLN1-EPO2-hTERT。
(4)构建表达4拷贝人EPO和hTERT并含有loxP序列的质粒pLN1-EPO4-hTERT
将一段DNA片段、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加单元一起克隆到以上(1)小节制备的质粒载体pLN1-hTERT的EcoR I位点；其中所述DNA片段含有4拷贝的CMV启动子序列，该CMV启动子是由实施例9(2)中制备的质粒载体pLN1-EPO4经EcoR I消化而制备；使得其中4拷贝按照转录方向相继排列。该质粒被命名为pLN1-EPO4-hTERT。
[实施例16]将EPO基因和hTERT基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中
按照与实施例7中描述的用于人EPO基因的相同的方式，将人EPO基因和hTERT基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中。如实施例1-4和实施例6所述，通过端粒截短而缺失长臂远侧区、并在其长臂近侧区引入loxP位点、以及通过端粒截短而缺失短臂远侧区，制备来自21号人类染色体的HAC载体。另一方面，制备含有loxP序列的人EPO和hTERT表达质粒。通过采用由瞬时表达Cre重组酶在loxP序列之间进行的位点专一重组反应，将EPO和hTERT表达质粒引入到人工染色体中。根据G418抗性获得与否(因破坏启动子而重建neo基因表达单元)，来筛选具有***序列的重组体。
(1)转染和G418抗性克隆的分离
将得自实施例11的保留来自21号人类染色体的HAC载体的小鼠A9细胞(A9Δ12细胞)在1个装有含杀稻瘟素(4μg/ml)的选择性培养液(10％FBS，DMEM)的6孔塑料组织培养板(Falcon)中培养至细胞密度相当于约60-70％饱和。在实施例15(2)所制备的pLN1-EPO-hTERT载体以及Cre酶表达载体pBS185(Lifetech)的存在下，按照所附的方案使用Fugene 6(Roche Diagnostics)，进行转染。培养48小时后，所得细胞用胰蛋白酶处理而分散。将6孔的细胞都悬浮于含G418(600μg/ml)的选择性培养液(补充了10％FBS的DMEM)中，并接种在5个48孔塑料组织培养板(Falcon)中。在2-3周内形成抗性集落。集落形成频率是每5×106个A9Δ12细胞为4个集落。分离所得集落并进行进一步培养。结果使单集落增殖。以上获得的细胞在下文称为A9ΔET1细胞。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR法
分析了A9ΔET1细胞。对于标记PRED 65基因和PRED 3基因，进行PCR扩增；其中PRED 65基因和PRED 3基因位于21号人类染色体长臂近侧区并位于loxP位点附近(参见实施例1，(3)和图2)。预测因在loxP序列之间位点专一重组而引入的人EPO基因***序列可具有PRED 65基因和PRED 3基因。结果，扩增与所预计的一样进行。然后，对STS标记D21S275进行PCR扩增，所述标记位于21号人类染色体短臂近侧区(参见实施例6(3)和图12)。因为在21号人类染色体短臂近侧区的位置缺失短臂远侧区，预计D21S275标记会存在。结果，证实扩增与所预计的一样进行。
(2-2)用药物进行选择性培养
根据来自21号人类染色体的HAC载体上是否有抗药性基因(更准确地讲是潮霉素抗性基因(短臂远侧区)和杀稻瘟素抗性基因)在选择性药物的存在下起作用，来证实含每种药物抗性基因的区域是否存在。
将A9ΔET1细胞在各孔装有含G418(600μg/ml)的选择性培养液(10％FBS，DMEM)的6孔培养板(Falcon)中培养至细胞密度相当于约60-70％饱和。用PBS(Gibco BRL)洗涤2次后，将细胞在仅含潮霉素(700μg/ml，Gibco BRL)的培养液、仅含杀稻瘟素(4μg/ml)的培养液或者含杀稻瘟素、潮霉素和G418的培养液中培养1周。结果见下表16。
                   表16
  克隆名称   杀稻瘟素(Bsd)   潮霉素(Hyg)
  A9ΔET1   R   R
根据上述结果，证实A9ΔET1细胞具有杀稻瘟素抗性、潮霉素抗性和G418抗性。
(2-3)具有人EPO基因***序列的重组体的证实
通过PCR扩增来证实具有***序列的重组体，也就是说，***序列是否引入到来自21号人类染色体的HAC载体的loxP序列中；在PCR中，引物构建在来自人EPO基因供体载体的序列和HAC载体上，使之邻接loxP位点。
通过使用来自示于实施例9(4)的质粒载体pBS226的Neo Rp2引物(SEQ ID No.38)和M13RV(SEQ ID No.39)，进行A9ΔET1的PCR扩增。预计获得具有***序列的重组体可获得约2.3kb的片段，该片段包括从含有来自pLN1-EPO载体的CMV启动子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的区域，到loxP序列的区域，以及从loxP序列到来自pSF1的neo基因部分的区域。结果，证实扩增与所预计的一样进行。
根据上述结果，证实A9ΔET1细胞保留来自21号人类染色体的HAC载体，其中引入了含有CVM启动子、人EPO基因和SV40聚腺苷酸附加序列的单拷贝DNA***片段。
根据上述实验(2-1)到(2-3)，证实A9ΔET1细胞保留来自缺乏长臂和短臂的21号人类染色体的HAC载体。
[实施例17]将来自缺乏短臂的21号人类染色体的HAC载体转移到仓鼠细胞系中
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
用实施例6中获得的DT40细胞(DT40(#21)hyg4)作为染色体供体细胞，其中该DT40细胞(DT40(#21)hyg4)保留来自缺失长臂远侧区、***loxP序列且缺失短臂远侧区的21号人类染色体的HAC载体。用来自中国仓鼠卵巢的细胞系CHO-K1(可得自ATCC，保藏号JCRB9018)作为染色体受体细胞。按照与实施例3(1)相同的方法，制备微细胞并与CHO细胞进行融合。细胞融合进行4次，从选择性培养开始约2周后，得到5个潮霉素抗性CHO克隆。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR法
转移的染色体是否存在，可通过PCR法加以证实。更具体地讲，检测是否存在位于21号人类染色体短臂近侧区的标记pCHB、D21S187和D21S275(实施例6(3-1)，图12)。证实在5个潮霉素抗性CHO细胞克隆中有2个克隆(CHO#21hyg4和CHO#21hyg8)扩增了位于从缺失位点起的近侧区D21S275。
(2-2)PCR法
扩增邻接重组靶位点的序列(参见实施例6，(3-3)，图12)。仅在2个CHO#21hyg4和CHO#21hyg8克隆中得到了扩增产物。此外证实，如预计的一样，从限制酶Nsi I消化中得到部分片段。
(2-3)荧光原位杂交(FISH)
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。分析了潮霉素抗性CHO克隆中的2个克隆(CHO#21hyg4和CHO#21hyg8)。结果，在几乎所有观察的有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体。根据与宿主CHO细胞的染色体大小进行相对比较，证实截短的21号人类染色体转移到CHO细胞中。
根据上述实验(1)和(2)，证实潮霉素抗性CHO克隆具有来自通过缺失长臂远侧区、***loxP序列且缺失短臂远侧区而获得的21号人类染色体的部分片段(HAC载体)。
[实施例18]将来自缺乏短臂远侧区的21号人类染色体的HAC载体转移到人类细胞系中并证实其稳定性
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
用得自实施例17的CHO细胞(CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8)作为染色体供体细胞，其中该CHO细胞(CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8)保留来自缺失长臂远侧区、***loxP序列且缺失短臂远侧区的21号人类染色体的HAC载体。用来自人纤维肉瘤细胞系HT1080(得自ATCC，保藏号CCL-121)作为染色体受体细胞。按照与实施例4(1)相同的方法，制备微细胞并与HT1080细胞进行融合。在CHO(#21)hyg4的情况下，将细胞融合进行1次，得到7个杀稻瘟素抗性HT1080克隆。在CHO(#21)hyg8的情况下，将细胞融合进行2次，共得到20个杀稻瘟素抗性HT1080克隆。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR法
染色体是否转移，可通过PCR扩增杀稻瘟素抗性基因(参见实施例4，(2-1))和潮霉素抗性基因加以证实。此时所用的寡核苷酸引物序列如下所示：
HygroF：5′-GCGAAGAATCTCGTGCTTTC(SEQ ID No.55)；
HygroR：5′-ATAGGTCAGGCTCTCGCTGA(SEQ ID No.56).
证实在所有杀稻瘟素抗性HT1080克隆中，扩增了杀稻瘟素抗性基因。另一方面，证实在7个CHO(#21)hyg4克隆中有5个、在30个CHO(#21)hyg8克隆中有27个都扩增了潮霉素抗性基因。
(2-2)染色体分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)来分析染色体。代表性FISH图像示于图17。在杀稻瘟素抗性克隆中，观察到比内源21号染色体小且在亲代细胞系HT1080中未观察到的染色体片段。
根据上述实验(1)和(2)，证实杀稻瘟素抗性HT1080克隆保留通过缺失长臂远侧区、***loxP序列且缺失短臂远侧区而制备的21号人类染色体部分片段(HAC载体)。
(3)在非选择性培养条件下进行长期传代培养
为了证实其中缺失长臂远侧区的21号人类染色体以及其中缺失短臂远侧区的21号人类染色体在培养细胞中的稳定性，采用实施例4中所用的人类细胞克隆(HT1080(#21)bsd-79-1-1，3，6，11，14；HT1080(#21)bsd-H4-1，3，6；HT1080(#21)bsd-H8-4，9，2)，在非选择性培养条件下，进行长期传代培养。应用补充了10％CS的DMEM作为人类细胞克隆的非选择性培养液。通过向非选择性培养液中加入4μg/ml杀稻瘟素，制备选择性培养液。对于人类细胞克隆，将5.0×105细胞接种到直径10cm的培养皿中。3天后，测定细胞数，然后再将5.0×105细胞接种到直径10cm的培养皿中。在每个细胞群体倍增水平时，即25、50、100水平，收集人类细胞系，制备染色体制备物。
(4)染色体分析
按照Kuroki等(Cell engineeing handbook，Yodosha，1992)描述的方法，通过吉姆萨染色，对人类细胞中人工染色体进行检测。观察在约20幅中期染色体图像中是否存在微型染色体，并计算保留率。得到5个克隆的微型染色体平均保留率。结果见下表17。
             表17：#21HAC在HT1080细胞中的稳定性
  HAC   细胞群体倍增水平              HAC保留率(％)
  未经药物选择   经药物选择
  #21ΔqHAC#21ΔpqHAC   501002550100   9895768583   9997798879
在第100次细胞***时，21号人类染色体部分片段在HT1080中仍稳定保留。此外，当观察中期染色体图像时，观察到每个细胞中有1-2个部分染色体。
根据上述实验(3)和(4)，证实在非选择性培养条件下，通过缺失长臂远侧区制备的21号人类染色体部分片段、以及通过缺失短臂远侧区制备的人类染色体部分片段在HT1080细胞克隆中可稳定保留，并且保持每个细胞中所述染色体的拷贝数。
[实施例19]将GFP基因***到来自21号人类染色体的HAC载体中进而***到人类细胞克隆中
(1)转染和G418抗性克隆的分离
在实施例18中制备的保留来自21号人类染色体的HAC载体的人类HT1080细胞克隆(HT1080(#21)bsd-79-1-6，14；HT1080(#21)bsd-H4-1，6；HT1080(#21)bsd-H8-2)用胰蛋白酶处理，并按4×105细胞/孔的密度接种到6孔板(Nunc)中，培养1天。将2μg含有loxP序列的GFP表达质粒(在实施例5(1)中制备的)和1μg Cre酶表达质粒pBS185(Lifetech)与7.5μl脂质体溶液(Lipofectamine2000，Invitrogen)混合。将所得溶液加入到培养液中，5小时后更换培养液。培养1天后，进行胰酶消化。将细胞悬浮于补充了10％CS的DMEM培养液中，并接种在2个10mm培养皿中。翌日，更换培养液，即弃去原培养液，加入含400μg/ml G418(GENETICIN，Sigma)的培养液。约2周内，形成抗性集落。集落形成频率是每4×105个HT1080细胞中为3-14个集落。对集落进行分离、增殖并进行以下分析。
(2)***在来自21号人类染色体的HAC载体中的GFP基因的表达
通过荧光显微镜，观察所分离的G418抗性HT1080细胞克隆。结果，证实在21ΔqHAC的情况下，21个克隆中有14个表达了GFP；而在21ΔpqHAC的情况下，31个克隆中有28个表达了GFP。代表性的荧光显微镜图像和光学显微镜图像示于图18a和图18b。
(3)同源重组体的证实
为了证实同源重组体，邻接重组靶位点的序列经PCR扩增。根据pBS226和pSF1质粒而设计的引物寡核苷酸序列如下所示：
CMVneo689：5′-GCCATCCACGCTGTTTTGAC(SEQ ID No.57)
CMVneo910：5′-GCATCAGAGCAGCCGATTGT(SEQ ID No.58)
尽管表达GFP基因，但是在所有G418抗性克隆中都观察到PCR扩增。因此，所有克隆均证实是同源重组体。
根据上述实验(1)到(3)，证实基因可以***到人类细胞克隆中来自21号人类染色体的HAC载体中，而且具有***序列的基因可以表达。
(4)长期传代培养后GFP基因的表达
从G418抗性HT1080细胞克隆中随机挑取7个克隆，在没有选择性药物的情况下进行传代培养。培养开始后1个月(细胞群体倍增水平：30)，在每个克隆中都观察到GFP基因的表达。
根据上述实验(4)，证实***在来自21号人类染色体的HAC载体的基因可以维持表达，而不会因***位点的位置效应而减少。更具体地讲，发现基因***在HAC载体的位点不在异染色质区。
[实施例20]将来自21号人类染色体的HAC载体转移到小鼠ES细胞系中并证实其稳定性
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
用得自实施例5的CHO细胞克隆(CHO(#21)ΔqGFP7-2)以及得自实施例17的CHO细胞克隆(CHO(#21)Hyg8)作为染色体供体细胞，其中CHO细胞克隆(CHO(#21)ΔqGFP7-2)保留来自缺失长臂远侧区并***loxP序列且***GFP基因的21号人类染色体的HAC载体，而CHO细胞克隆(CHO(#21)Hyg8)保留来自缺失长臂远侧区并***loxP序列且缺失短臂远侧区的21号人类染色体的HAC载体。用来自小鼠ES细胞系E14(Hooper等，Nature，326：292，1987)作为染色体受体细胞。按照文献(Shinichi Aizawa，biomanual series 8，gene targeting，Yodosha，1995)描述的方法，使用经丝裂霉素C处理的小鼠胚胎原代培养细胞(Invitrogen)作为饲养细胞，培养E14细胞。首先，从约108供体细胞制备微细胞，悬浮于5ml DMEM中。约107E14细胞用DMEM洗涤3次，悬浮于5ml DMEM中，然后与微细胞混合，以1250rpm离心10分钟。弃去上清液，将沉淀吹打至松散。向其中加入0.5ml的1∶1.4 PEG溶液(将5g PEG 1000(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.)和1ml DMSO(Sigma)溶于6ml DMEM中)，并将其在室温下静置1.5分钟。向所得混合物中小心加入10ml DMEM。将所得混合物立即于1250rpm离心10分钟。弃去上清液后，将沉淀悬浮于用于ES细胞的30ml培养液中，并接种在3个直径100mm的塑料组织培养板(Falcon)中。24小时后，在CHO细胞克隆CHO(#21)ΔqGFP7-2用作供体细胞的情况下，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了300μg/ml G418(GENETICIN，Sigma)的培养液；在CHO细胞克隆CHO(#21)Hyg8用作供体细胞的情况下，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了150μg/ml潮霉素(Wato PureChemical Industries，Ltd.)的培养液。此后，每天都用新鲜培养液更换原培养液。在1周至10天内，形成抗性集落。集落形成频率是每107个E14细胞为2-5个集落。所得集落进行分离、增殖，将每5×107个集落悬浮于1ml保存培养液(用于ES细胞的培养液+10％DMSO(Sigma))中，并且于-80℃冷冻。同时，从每个抗性克隆的约106个细胞制备基因组DNA(Puregene DNA分离试剂盒(Gentra System))。
(2)PCR分析
转移的染色体和所述染色体所含有的区域经PCR扩增加以证实。以下引物寡核苷酸是新设计的。
#21p76957：5′-ACACTTTTGACAAACACACCAG(SEQ ID No.59)
#21p77555：5′-TCAACAATGAAAGGGGATGTC(SEQ ID No.60)
这些引物是根据得自GenBank的核苷酸序列(登记号AL163201)而制备。分析中所用的寡核苷酸引物见下表18。
                              表18
  标记名称   寡核苷酸   SEQ ID No.   实施例
  pCHB   6(3-1)
  D21S187   6(3-1)
  #21p76957/#21p77555   39/40   本实施例
  HygroF/HygroR   35/36   18(2-1)
  Hyg968/#21p96705   27/28   6(3-3)
  #21p91203/#21p91976   25/26   6(3-2)
  Spe31203/Bam36192   23/24   6(1)
  D21S275   6(3-1)
  PRED65F/PRED65R   3/4   1(3-1)
  PRED3F/PRED3R   5/6   1(3-1)
  #21qEcoF/#21qEcoR   9/10   2(1)
  Left455F/Left638R   15/16   2(3-2)
  Right958F/Right1152R   17/18   2(3-2)
  #21qBaF/#21qBaR   11/12   2(1)
上述结果示于图19。所获得的抗药性克隆缺乏部分转移染色体区。
(3)荧光原位杂交(FISH)
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)进行FISH分析。结果，在所观察的几乎所有的有丝***图像中，都检测到截短的21号人类染色体。代表性FISH图像示于图20a和图20b。在5个来自CHO(#21)ΔqGFP7-2的G418抗性克隆中的1个(E14(#21)neo1)中，观察到人类染色体的片段；而在2个来自CHO(#21)Hyg8的潮霉素抗性克隆中，也观察到人类染色体的片段。其中，在E14(#21)Hyg1中观察到两个人类染色体的片段，而在E14(#21)Hyg2中观察到一个人类染色体的片段。观察到人类染色体的上述3个克隆经证实具有小鼠中所具有的正常染色体数(40条)。
根据上述(2)和(3)的结果，证实G418抗性克隆或潮霉素抗性E14克隆保留来自21号人类染色体的HAC载体。
(4)在非选择性培养条件下的长期传代培养
为了证实来自21号人类染色体的HAC载体在小鼠ES细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行选择性培养。采用上述(3)小节中制备的人类细胞克隆E14(#21)neo1、E14(#21)Hyg1、E14(#21)Hyg2。采用含有下列组分的DMEM培养液作为小鼠ES细胞的非选择性培养液：18.2％FBS(Invitrogen)、3.5g/l葡萄糖(Sigma)、0.125mM MEM非必需氨基酸(Invitrogen)、1000U/ml LIF(ESGRO，Wako PureChemical Industries，Ltd.)和0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma)。将小鼠ES细胞系的1×107细胞接种到直径10cm培养皿中的饲养细胞上。2天后，将细胞的1/15接种到直径10cm培养皿中的饲养细胞上。从培养开始后14天、28天和42天收集细胞，制备染色体制备物。
(5)染色体分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)对小鼠ES细胞中来自21号人类染色体的HAC载体进行检测。检查200幅中期图像中是否存在人类染色体的片段，并计算人类染色体的保留率。结果见下表19。对每个克隆，进行长期传代培养(一式三份)，所给出的保留率是其平均值。
                      表19
  细胞克隆   细胞群体倍增水平(累积)   HAC保留率％(2拷贝/1拷贝)
  E14(#21)neo1E14(#21)Hyg1E14(#21)Hyg2   025507502550750255075   80(0/80)57(0/57)51(0/51)48(0/48)98(73/25)95(60/35)92(57/35)8998(0/98)96(0/96)92(0/92)89(0/89)
在非选择性条件下，通过缺失21号人类染色体的长臂远侧区而制备的部分片段在进行长期传代培养的过程中往往会减少。相反，通过缺失21号人类染色体的长臂远侧区和短臂远侧区而制备的部分片段，甚至在细胞***超过75次时仍保持稳定，而不会减少。此外，当长期传代培养开始时，在每个细胞中染色体片段拷贝数为1的克隆中，其拷贝数也没有增加。在长期传代培养开始时，在每个细胞中主要具有2拷贝片段的克隆中，其拷贝数可能会略微减少。
根据上述实验(4)和(5)，证明在非选择性培养条件下，通过缺失21号人类染色体的长臂远侧区和短臂远侧区而制备的部分片段可以在小鼠ES细胞系中稳定保留，并且每个细胞中部分片段的拷贝数可以保持稳定。
[实施例21]将来自21号人类染色体的HAC载体转移到人类干细胞中并证实其稳定性
(1)微细胞融合和抗药性克隆的分离
用得自实施例17的CHO细胞克隆(CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8)作为染色体供体细胞，其中该CHO细胞克隆(CHO(#21)hyg4和CHO(#21)hyg8)保留来自缺失长臂远侧区、***loxP序列且缺失短臂远侧区的21号人类染色体的HAC载体。用源于人类骨髓的间充质干细胞系hiMSC(得自Junya Toguchida教授，KyotoUniversity，Okamoto等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，295：354，2002)作为染色体受体细胞，所述细胞是由人hTERT基因和人***瘤病毒E6/E7基因而建立的。应用补充了10％FBS的DMEM培养液来培养hiMSC细胞系。首先，从约107CHO(#21)hyg4/8细胞制备微细胞。更具体地讲，CHO(#21)hyg4/8细胞在6个25cm2的离心瓶(Coasters)中培养至细胞密度相当于约60-70％饱和，然后在含有秋水仙胺(0.075μg/ml，Demecolcine，Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的培养液(10％FBS，8μg/ml杀稻瘟素，F12)中再培养48小时，以诱导微核。取出培养液后，向每个离心瓶中加入预热(37℃)的松胞菌素B溶液(10μg/ml的DMEM，Sigma)，***到丙烯酸塑料离心管中，然后离心(34℃，8000rpm)1小时。通过将微细胞悬浮于无血清培养液(DMEM)中，使其恢复，然后进行过滤纯化。向其中hiMSC细胞已培养至80％饱和的直径6cm的培养皿(Falcon)中加入纯化的微核细胞。细胞用PEG溶液融合。48小时后，细胞经胰酶处理而分散，然后在含杀稻瘟素(8μg/ml)的选择性培养液(10％CS，DMEM)中培养。选择性培养约2周后，分离所形成的抗药性集落并进行以下分析。在CHO(#21)hyg4的情况下，得到1个杀稻瘟素抗性hiMSC克隆。在CHO(#21)hyg8的情况下，得到4个杀稻瘟素抗性hiMSC克隆。
(2)转移染色体的证实
(2-1)PCR法
通过杀稻瘟素抗性基因(参见实施例4(2-1)和潮霉素基因(参见实施例18(2-1)的PCR扩增，来证实转移的染色体。经证实在5个杀稻瘟素抗性HT1080克隆中都扩增了杀稻瘟素抗性基因和潮霉素基因。
(2-2)染色体分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，采用人类特异性探针Cot1(Gibco BRL)，通过FISH法，进行染色体分析。代表性FISH图像示于图21。在杀稻瘟素抗性克隆中，观察到比内源21号染色体小且在亲代细胞系hiMSC细胞中未观察到的染色体片段。
根据上述实验(1)和(2)，证实杀稻瘟素抗性hiMSC克隆保留通过缺失长臂远侧区、***loxP序列且缺失短臂远侧区而制备的21号人类染色体部分片段(HAC载体)。
(3)在非选择性培养条件下进行长期传代培养
为了证实来自21号人类染色体的HAC载体在具有多能性的体干细胞中的稳定性，在非选择性培养条件下进行长期传代培养。采用以上(1)和(2)小节制备的人类间充质细胞克隆(hiMSC(#21)bsd-H4-1、hiMSC(#21)bsd-H8-1，2，3，4)。采用含10％FBS的DMEM作为人类细胞克隆的非选择性培养液。通过向非选择性培养液中加入4μg/ml杀稻瘟素，制备选择性培养液。将人类细胞克隆(5.0×105细胞)接种到直径10cm的培养皿中。3天后，测定细胞数，然后再将5.0×105细胞的人类细胞克隆接种到直径10cm的培养皿中。从培养开始，在细胞群体倍增水平达到15、40和90的时间点，收集细胞，制备染色体样品。
(4)染色体分析
按照Matsubara等(FISH experimental protocol，Shujunsha，1994)描述的方法，通过FISH法，用来自21号人类染色体的白斑样特异性探针p11-4(得自Hiroshi Masumoto教授，Nagoya University，Ikeno等，Hum.Mol.Genet.，3：1245，1994)对人类间充质细胞中来自21号人类染色体的HAC载体进行检测。检查在50幅中期图像中是否存在微型染色体上的荧光信号，计算保留率。结果见下表20。
               表20：#21HAC在hiMSC细胞中的稳定性
  细胞克隆   药物选择                        保留率％
  0PDL   15PDL   40PDL   90PDL
  HiMSC(#21)-H4-1HiMSC(#21)-H8-1HiMSC(#21)-H8-2HiMSC(#21)-H8-3HiMSC(#21)-H8-4   +-+-+-+-+-   961008710089   92829875828089878775   94779873827794888877   88659584808090809080
在细胞***第90次时，21号人类染色体部分片段在hiMSC细胞中仍稳定保留。当观察中期染色体图像时，发现每个细胞中的单拷贝部分染色体片段。
根据上述实验(3)和(4)，证明在非选择性培养条件下，来自21号人类染色体的HAC载体可以在hiMSC细胞中稳定保留，并且每个细胞中的拷贝数可以保持稳定。
[实施例22]通过体外诱导分化证实保留了转移的来自21号人类染色体的HAC载体的人类体干细胞的多能性
按照Okamoto等(Biochem.Biophys.Res.Commun.，295：354，2002)描述的方法，诱导实施例21中制备的、其中转移了来自21号人类染色体的HAC载体的人类间充质干细胞的分化，然后证实干细胞分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的能力。在本实施例中，采用实施例21描述的人类间充质干细胞克隆(hiMSC(#21)bsd-H8-1)及其亲代细胞系(hiMSC)。
(1)诱导分化成骨细胞
将hiMSC细胞以3×103/cm2的密度接种并在含10％FBS并补充了100nM***(Sigma)、50μM抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)和10mMβ-甘油磷酸(Sigma)的DMEM培养液中培养21天。培养期间，每2天用新鲜培养液更换原培养液1次。
(2)诱导分化成软骨细胞
首先，将2.5×105hiMSC细胞收集在15ml聚丙烯管(Corning)中，在室温下以800rpm离心5分钟。将细胞沉淀重悬于高浓度葡萄糖的DMEM培养液(其中补充了10ng/ml人TGF-β3(Invitrogen)、100nM***(Sigma)、6μg/ml胰岛素(Roche)、100μM抗坏血酸2-磷酸酯(Sigma)、1mM丙酮酸钠(Sigma)、6μg/ml运铁蛋白(Sigma)、0.35mM脯氨酸(Sigma)和1.25mg/ml牛血清白蛋白(Invitrogen))中，然后离心。将细胞以细胞集合状态培养21天。培养期间，每2天用新鲜培养液更换原培养液1次。
(3)诱导分化成脂肪细胞
首先，以3×103/cm2的密度将hiMSC细胞接种在培养皿中。当细胞培养至长满时，重复3次诱导培养和维持培养。在含10％FBS并补充了1μM***(Sigma)、0.2mM吲哚美辛(Sigma)、10μg/ml胰岛素(Sigma)和0.5mM 3-异丁基-甲基黄嘌呤(Sigma)的DMEM诱导培养液中进行诱导培养达3天。在含10％FBS并补充了10μg/ml胰岛素(Roche)的DMEM培养液中进行维持培养达2天。
(4)组织染色
培养21天后，细胞用PBS洗涤2次并用10％***固定。在骨细胞分化的情况下，用5％硝酸银(Nakarai)进行染色。在脂肪细胞分化的情况下，用0.3％油红O(Nakarai)进行染色。在软骨细胞分化的情况下，固定的细胞聚集物用乙醇脱水，用二甲苯洗涤，用石蜡包埋并切片。将切片用爱茜蓝(Nakarai)染色。
当保留转移了来自21号人类染色体的HAC载体的间充质干细胞系hiMSC(#21)bsd-H8-1经历诱导分化时，对骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞特异性组织染色显示出阳性结果，与其亲代细胞hiMSC的情况类似。
根据上述实验结果(1)到(4)，证实其中保留转移了来自21号人类染色体的HAC载体的间充质干细胞系保持了分化成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的多能性。
[实施例23]将14号人类染色体片段导入猕猴(cynomolgus monkey)ES细胞中
用携带14号人类染色体片段SC20的小鼠A9细胞系(在下文称为“A9/SC20)作为染色体供体细胞(Tomizuka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，722-727，2000)。使用猕猴ES细胞系CMK6.4(Suemori等，Dev.Dyn.222，273-279，2001)作为染色体受体细胞。按照Suemori等(出处同上)描述的方法培养CMK6.4细胞。培养液是由补充了20％KSR(血清替代品(knock out serum replacement)，GIBCO BRL)的DMEM/F12(Sigma D-6421)、非必需氨基酸溶液(×100，Sigma，M7145)和L-谷氨酰胺溶液(×100，Sigma，M7522)组成。首先，按照Shimizu等(Cell engineering handbook，Yodosha，1992)描述的方法，从在24个25cm2瓶(Nunc 152094)中培养至约70-80％长满的A9/SC20细胞，制备微细胞。将所得全部微细胞悬浮于5ml DMEM(Sigma，D-5796)中。将1×106至5×106CMK6.4细胞用胰蛋白酶溶液(0.25％胰蛋白酶，20％KSR)分散后，用DMEM洗涤2次，悬浮于5ml DMEM中，与微细胞混合，以1500rpm离心7分钟，然后弃去上清液。用于细胞融合的溶液为1∶1.4的PEG溶液，所述溶液是通过将1g PEG(Sigma)溶于1.2ml DMEM、然后向所得溶液中加入0.2ml DMSO(Sigma)而制备。沉淀经吹打而松散。向其中加入1.0ml预热(37℃)的1∶1.4的PEG溶液，将所得溶液在室温下静置2分钟，然后向该溶液中小心加入10ml DMEM。所得混合物立即以1500rpm离心7分钟。弃去上清液后，将沉淀悬浮于用于ES细胞的4ml培养液中，并接种在2个直径35mm的塑料组织培养板(其中事先已经接种了G418抗性饲养细胞)并且在CO2培养箱(37℃，5％CO2)中孵育。24小时后，更换培养液，即弃去原培养液，加入补充了50μg/ml G418的培养液。此后，每天都用新鲜培养液更换原培养液1次。在1周至10天内，形成抗药性集落。挑取抗药性ES细胞集落，接种在4孔板(其中事先已接种了G418抗性饲养细胞)并且在50μg/ml G418存在下培养10天。再次挑取所得活的ES细胞集落，接种在4孔板(其中事先已接种了饲养细胞)并且在非选择性条件下再培养10天。证明增殖的ES细胞对碱性磷酸酶染色呈阳性反应(Suemori等，出处同上)并且保持未分化的能力。此外，按照标准方法提取基因组DNA，如下证实***的染色体是否存在。
用抗药性克隆的基因组DNA作为模板，通过PCR方法，检测14号人类染色体片段中所含有的Neo基因(pSTneoB，Tomizuka等，NatureGenet.16，133-143，1997)是否存在。此时使用的引物寡核苷酸的核苷酸序列如下所示。用约0.1μg基因组DNA作为模板，用Takara Ex Taq作为Taq聚合酶，如下进行PCR：94℃反应5分钟，然后重复以下循环：94℃反应15秒，59℃反应15秒，72℃反应20秒，共35次。
neoF：TGAATGAACTGCAGGACGAG(SEQ ID No.61)
neoR：ATACTTTCTCGGCAGGAGCA(SEQ ID No.62)
对所得G418抗性猴ES细胞克隆中的1个克隆，进行PCR分析。结果，检测到表明Neo基因存在的特异性扩增产物(pSTneoB)。由这些实验证明，14号人类染色体片段SC20通过微细胞法已转移到猕猴ES细胞系中。已知包括猕猴、恒河猴(Rhesus monkey)在内的灵长类ES细胞的特性与人类ES细胞非常类似(Suemori等，ExperimentalMedicine，第21卷，第8期，第46-51页，2003；Yodosha)。因此，该结果显示，带有抗药性标记的人类染色体和人类人工染色体(HAC)可以通过本实施例描述的方法导入包括猕猴ES细胞在内的灵长类ES细胞中。
[实施例24]证实保留了转移在其中的来自21号人类染色体的HAC载体的小鼠ES细胞克隆的分化潜力
进行了分化小鼠ES细胞的尝试，所述细胞按照实施例20、通过将具有***其中的GFP基因的来自21号人类染色体的HAC载体转移到神经细胞中而制备，并且检测了神经细胞的分化能力。用实施例20描述的小鼠ES细胞系E14(#21)neo1作为小鼠ES细胞。
(1)GFP表达细胞的制备性分离
将E14(#21)neo1细胞接种在直径100mm的塑料组织培养板中的经丝裂霉素C处理的小鼠胚胎原代培养细胞(Invitrogen)上，在含20％FBS且补充了2mM L-谷氨酸(Invitrogen)、0.2mM 2-巯基乙醇(Sigma)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)、0.1mM MEM非必需氨基酸和1000U/ml LIF(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)的DMEM中进行培养。细胞经0.1％胰蛋白酶和0.04％EDTA处理而分散，收集在培养液中，用PBS洗涤2次，悬浮于PBS中，得到密度为1×106细胞/ml，然后用细胞分选仪(EPICS ELITE，Beckman coulter)选择GFP表达细胞。
(2)诱导分化成神经细胞
用作诱导分化的饲养细胞的PA6细胞来自小鼠骨髓，将该细胞在含10％FBS并补充了2mM L-谷氨酸(Invitrogen)的DMEM培养液(Invitrogen)中进行培养。将选自(1)小节的1×103细胞的GFP表达ES细胞悬浮于既无血清也无LIF的诱导分化用培养液中，然后接种到玻片小室(Nunc)内的PA6细胞上。诱导分化用培养液是通过向含有10％血清替代品(Invitrogen)的G-MEM(Invitrogen)中加入以下成分而制备的：2mM L-谷氨酸(Invitrogen)、0.2mM 2-巯基乙醇(Sigma)、1mM丙酮酸钠(Invitrogen)和0.1mM MEM非必需氨基酸。细胞培养10天后，将其用4％低聚甲醛固定，用抗β微管蛋白(该蛋白在神经细胞中特异性表达)的抗体(TUJI，Berkeley Antibody Company)进行免疫染色，再通过聚焦荧光显微镜观察。所述细胞使神经细胞的形态呈现神经炎的形态。因此，证实被抗β微管蛋白抗体染色的细胞表达GFP。通过聚焦荧光显微镜观察的代表性图像示于图22a和图22b。
根据实验(1)和(2)，证实保留了转移在其中的来自21号人类染色体的HAC载体的ES细胞在神经细胞中保持分化潜力。
工业应用性
本发明提供了人类人工染色体(HAC)载体。因为HAC载体尺寸减小，从中缺失了不必要的基因，所以它在细胞中可以稳定存在。本发明的HAC载体是基于人类染色体来制备的。因此，可以通过HAC载体，***大的外源DNA。此外，本发明的HAC载体具有针对位点专一重组酶的识别位点。因此，外源DNA可以作为一个盒而容易地***。因为所述位点是为引入外源DNA而适当地设计的，所以HAC载体没有位置效应。通过使用本发明的HAC载体，可以将大的外源DNA导入细胞中并在其中表达。因此，本发明的HAC载体可用于通过高水平表达编码蛋白的基因而生产所需要的蛋白、用于功能不明基因或蛋白的体内功能分析以及用于克隆大的DNA。因此，本发明的HAC载体可用于基因工程等相关领域。
序列表的独立文本
SEQ ID No.1-62：合成寡核苷酸
                        序列表
<110>麒麟麦酒株式会社(KIRIN BEER KABUSHIKI KAISHA)
<120>人类人工染色体载体
<130>PH-1899-PCT
<150>JP 2002-292853
<151>2002-10-04
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<170>PatentIn version 3.1
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<223>合成寡核苷酸
<400>47
tcactcggtc cacgcgtcct                                                 20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>48
agtgccagcc gaagtctgcc                                                 20
<210>49
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>49
gcagctgaac agtgccttc                                                  19
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>50
aggacgcgtg gaccgagtga                                                 20
<210>51
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>51
ccatcctaat acgactcact atagggc                                         27
<210>52
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>52
ccgagcgtct cacctcgagg gtgaaggcac tgttc                                35
<210>53
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>53
atggactacg tcgtgggagc caga                                            24
<210>54
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>54
gtcgacgcta gctcagtcca ggatggtctt gaagt                                35
<210>55
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>55
gcgaagaatc tcgtgctttc                                                 20
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>56
ataggtcagg ctctcgctga                                                 20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>57
gccatccacg ctgttttgac                                                 20
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>58
gcatcagagc agccgattgt                                                 20
<210>59
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>59
acacttttga caaacacacc ag                                              22
<210>60
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>60
tcaacaatga aaggggatgt c                                               21
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>61
tgaatgaact gcaggacgag                                                 20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成寡核苷酸
<400>62
atactttctc ggcaggagca                                                 20

Claims (48)

1.一种包含21号人类染色体片段或14号人类染色体片段的人类人工染色体载体，其中所述染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区已经缺失。
2.权利要求1的人类人工染色体载体，其中所述21号人类染色体的片段或14号人类染色体的片段约为2-16Mb。
3.权利要求1或2的人类人工染色体载体，其中所述21号人类染色体的长臂远侧区在21q11区内缺失。
4.权利要求3的人类人工染色体载体，其中所述21号人类染色体的长臂远侧区在AL163204缺失。
5.权利要求1或2的人类人工染色体载体，其中所述21号人类染色体的短臂远侧区在21p区内缺失。
6.权利要求5的人类人工染色体载体，其中所述21号人类染色体的短臂远侧区在AL163201缺失。
7.权利要求1或2的人类人工染色体载体，其中所述14号人类染色体的长臂远侧区在14q区内缺失。
8.权利要求7的人类人工染色体载体，其中所述14号人类染色体的长臂远侧区在AL157858或AL512310缺失。
9.权利要求1或2的人类人工染色体载体，其中所述14号人类染色体的短臂远侧区在14p区内缺失。
10.权利要求9的人类人工染色体载体，其中所述14号人类染色体的短臂远侧区在至少一个选自以下的位置缺失：OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6和OR4M1。
11.权利要求1-10中任一项的人类人工染色体载体，其中位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区。
12.权利要求11的人类人工染色体载体，其中所述位点专一重组酶是Cre酶。
13.权利要求11或12的人类人工染色体载体，其中所述位点专一重组酶识别位点是loxP序列。
14.权利要求11-13中任一项的人类人工染色体载体，其中所述位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体的长臂近侧区内的AL163203。
15.权利要求11-13中任一项的人类人工染色体载体，其中所述位点专一重组酶识别位点***到比14号人类染色体长臂近侧区内的AL157858或AL512310缺失位点更近的位置。
16.权利要求11-13中任一项的人类人工染色体载体，其中所述位点专一重组酶识别位点***到比14号人类染色体短臂近侧区内的14p12区内缺失位点更近的位置。
17.权利要求1-16中任一项的人类人工染色体载体，其中所述长臂远侧区和/或短臂远侧区的缺失是通过被人工端粒序列取代。
18.一种制备人类人工染色体载体的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；和
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区。
19.权利要求18的方法，其中在步骤(a)中，保留21号人类染色体或14号人类染色体的细胞具有高同源重组效率。
20.权利要求19的方法，其中具有高同源重组效率的细胞来自鸡DT40细胞。
21.权利要求18-20中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述长臂远侧区和/或短臂远侧区的缺失是通过被人工端粒序列取代。
22.权利要求18-21中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述21号人类染色体的长臂远侧区在AL163204缺失。
23.权利要求18-21中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述21号人类染色体的短臂远侧区在AL163201缺失。
24.权利要求18-21中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述14号人类染色体的长臂远侧区在AL157858或AL512310缺失。
25.权利要求18-21中任一项的方法，其中在步骤(b)中，所述14号人类染色体的短臂远侧区在至少一个选自以下的位置缺失：OR4H12、OR4Q4、RNR2、OR4L1、RNU6C、FDPSL3、K12T、C14orf57、OR6S1、M195、OR4K14、MGC27165、LCH、OR10G3、OR4K3、OR4E2、H1RNA、ATP5C2、OR11H6和OR4M1。
26.权利要求18-25中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述位点专一重组酶是Cre酶。
27.权利要求18-26中任一项的方法，其中在步骤(c)中，所述位点专一重组酶的识别位点是loxP序列。
28.权利要求18-27中任一项的方法，其中所述位点专一重组酶的识别位点***到21号人类染色体的长臂近侧区内的AL163203。
29.权利要求18-27中任一项的方法，其中所述位点专一重组酶的识别位点***到比14号人类染色体长臂近侧区内的AL157858或AL512310缺失位点更近的位置。
30.权利要求18-27中任一项的方法，其中所述位点专一重组酶的识别位点***到比14号人类染色体短臂近侧区内的14p12区内缺失位点更近的位置。
31.通过权利要求18-30中任一项的方法而获得的人类人工染色体载体。
32.一种保留权利要求31的人类人工染色体载体的细胞。
33.一种制备包含外源DNA的人类人工染色体载体的方法，所述方法除包括权利要求18-30中任一项的方法之外，还包括下述步骤：
(d)在位点专一重组酶存在下，将外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中。
34.一种包含外源DNA的人类人工染色体载体，所述载体是通过权利要求33的方法获得的。
35.一种细胞，所述细胞保留权利要求34的包含外源DNA的人类人工染色体载体。
36.一种药用组合物，所述组合物包含权利要求35的细胞。
37.一种将外源DNA导入受体细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶存在下，将外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；和
(g)证实所述外源DNA导入融合的受体细胞中。
38.权利要求37的方法，其中所述受体细胞是动物细胞。
39.权利要求38的方法，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
40.权利要求37-39中任一项的方法，其中所述受体细胞是多能细胞。
41.权利要求40的方法，其中所述多能细胞是胚胎干细胞即ES细胞，或者是间充质干细胞或组织干细胞/前体细胞。
42.一种制备表达外源DNA的细胞的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶存在下，将外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；和
(g)在融合的受体细胞中选择表达所述外源DNA的细胞。
43.权利要求42的方法，其中所述受体细胞是动物细胞。
44.权利要求43的方法，其中所述动物细胞是哺乳动物细胞。
45.权利要求42-44中任一项的方法，其中所述受体细胞是多能细胞。
46.权利要求40的方法，其中所述多能细胞是胚胎干细胞即ES细胞，或者是间充质干细胞或组织干细胞/前体细胞。
47.一种制备蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：
(a)获得保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞；
(b)缺失21号人类染色体或14号人类染色体的长臂远侧区和/或短臂远侧区；
(c)将位点专一重组酶识别位点***到21号人类染色体或14号人类染色体的长臂近侧区和/或短臂近侧区中；
(d)在位点专一重组酶表达下，将编码蛋白的外源DNA***到21号人类染色体或14号人类染色体中；
(e)从保留21号人类染色体或14号人类染色体的供体细胞制备微细胞；
(f)使所述微细胞和受体细胞融合；
(g)将所述融合的受体细胞在培养液中进行培养；和
(h)从所得培养物中收集所述蛋白。
48.权利要求47的方法，其中所述蛋白选自红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、凝血因子、血管假性血友病因子(vWF)、肌营养不良蛋白、多巴胺合酶、胰岛素、***(IGF)、***结合蛋白(IGFBP)、抗体、端粒酶、粒细胞集落刺激因子、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子、免疫球蛋白、生长激素、白介素2、白介素3、白介素4、白介素5、白介素6、白介素7、白介素8、白介素9、白介素10、白介素11、白介素12、白介素15、CD40配体、干扰素、腺苷脱氨酶、α-1抗胰蛋白酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、嘌呤核苷酸磷酸化酶、生长抑制因子(GIF)、肿瘤坏死因子(TNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M、Flt3配体(Flt3L)、基质衍生因子(SDF)、干细胞生长因子(SCF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、神经生长因子(NGF)、骨形态发生因子(BMP)、活化素、转化生长因子(TGF)和Wnt。
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