CN1703503A - 生产维生素b6的微生物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能够生产维生素B₆的中华根瘤菌属的重组微生物，所述微生物转化有含有5′－磷酸吡哆醇合成酶基因和D－赤藓糖4－磷酸脱氢酶基因的载体。

Description

生产维生素B6的微生物和方法

本发明涉新的重组微生物和用该微生物生产维生素B₆的方法。

本发明中所用的术语“维生素B₆”包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。维生素B₆是人类或其它动物不可缺少的维生素并被作为药物原料或食品添加剂。

维生素B₆在大肠杆菌(Escherichia coli)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)中的生物合成路径已经有了很好的阐明。5’-磷酸吡哆醇(PNP)被认为合成自两种前体，1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸酯(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate)(DXP)和4-(磷酸羟基)-L-苏氨酸(HTP)，期间通过HTP脱氢酶和由pdxJ基因编码的PNP合成酶两种酶催化。

在大肠杆菌中，HTP被认为由D-赤藓糖4-磷酸酯(D-erythrose4-phosphate)(E4P)经三步反应合成。第一步反应，E4P氧化成D-赤糖酸4-磷酸酯(D-erythronate 4-phosphate)(下文记为ENP)，该反应由epd基因编码的E4P脱氢酶催化。

但是，对苜蓿中华根瘤菌株1021的染色体组数据进行检索后却没有找到大肠杆菌epd基因的同系物。而且，迄今为止还没有有关苜蓿中华根瘤菌中E4P脱氢酶的报道。因此认为苜蓿中华根瘤菌具有区别于大肠杆菌的不同的HTP生物合成路径，另一方面，苜蓿中华根瘤菌IEO 14782积累了大量的可能合成自E4P的原儿茶酸(protocatechuate)(莽草酸的一种衍生物)。

上述发现提示了可通过在苜蓿中华根瘤菌中引入epd刺激E4P转化为ENP，从而形成维生素B₆的另一个生物合成路径，并且使得苜蓿中华根瘤菌中维生素B₆的产量得到提高。但是实际上，仅仅是epd基因的引入不能提高苜蓿中华根瘤菌中维生素B₆的产量，而当epd和pdxJ基因同时引入时，才能极大程度地改善苜蓿中华根瘤菌中维生素B₆的产量。

根据本发明，可以将包括含有epd和pdxJ的载体的重组质粒转化中华根瘤菌属(genus Sinorhizobium)的微生物，通过微生物的发酵来显著提高维生素B₆的产率。通过培养所述微生物，维生素B₆被分泌进培养上清液中，然后可以以所需的纯度将它们回收。

本发明提供了一种重组微生物，例如，能够生产维生素B₆的含有pdxJ和epd的质粒的中华根瘤菌属的微生物。

本发明还提供了一种生产维生素B₆的方法，该方法包括在培养基中培养所述微生物，生产的维生素B₆在培养上清液中积累，然后收集所生产的维生素B₆。

据报道，大肠杆菌的pdxJ基因编码PNP合成酶，催化DXP和3-磷酸氨基丙酮合成PNP。这里所述的“pdxJ”指天然基因本身及其任何功能等价物。PdxJ的功能等价物指任何一种编码PNP合成酶的基因。PdxJ的功能等价物可以分离自任何一种生物，例如但不局限于肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)和铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、其它的细菌、酵母和植物。本发明中使用的pdxJ优选来源于中华根瘤菌属的微生物，但任何其功能等价物也可以用于本发明。例如，来源于苜蓿中华根瘤菌(S.meliloti)IFO 14782的pdxJ的DNA可以通过下述方法克隆。

根据在苜蓿中华根瘤菌菌株1021的DNA数据库中的pdxJ的DNA序列，合成用于聚合酶链式反应(PCR)的引物，使每条引物的5’端含有一个限制性酶识别位点。基因pdxJ可利用引物和苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的基因组DNA通过PCR扩增得到。将扩增的pdxJ与能在大肠杆菌中复制的载体如可商购的pUC系列和pBR系列连接。对经核酸内切酶消化的质粒进行琼脂糖凝胶分析，选择***了pdxJ的质粒，扩增区域的序列可通过DNA序列仪测序确认。

在本发明中，大肠杆菌的epd指编码催化E4P氧化成ENP的E4P脱氢酶及其功能等价物的基因，因此它可以是编码任何编码活性E4P脱氢酶的基因。大肠杆菌epd的功能等价物可以分离自任一生物，例如但不局限于霍乱弧菌(Vibrio cholera)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、其它细菌、酵母和植物。例如，来源于大肠杆菌K12的epd可通过上述相似的方法经PCR克隆得到。

适合于在苜蓿中华根瘤菌中导入重组DNA的载体有两类，一类是可复制的、广宿主范围载体，例如pVK100、pRK290、pLAFR1或RSF1010，另一类是整合型载体，例如pSUP202。

为了获得在苜蓿中华根瘤菌中表达重组蛋白的载体，可通过在载体中***一种编码在苜蓿中华根瘤菌中起启动子功能的DNA片断以及pdxJ和epd基因中的任一个或其两者，所述启动子如ptac、plac、ptrc和pS1(苜蓿中华根瘤菌的小核糖体亚单位的启动子)或pNm(新霉素抗性基因的启动子)。

构建这种重组载体时可参照分子生物学、生物工程、遗传工程领域已知的标准技术。

例如，重组载体pVK601是通过将pdxJ置于pVK100中并在启动子ptrc控制之下构建而成，在另一技术方案中，重组载体pVK602是通过将epd置于pVK100中并与启动子ptac相连构建而成，和重组载体pVK611是通过将pdxJ和epd同时置于pVK100中并分别处于启动子ptrc和ptac的调控之下得以构建。

作为可用于本发明构建重组微生物的亲本菌株，它可以是任何属于中华根瘤菌属的菌株，和由天然来源分离的属于中华根瘤菌属的菌株，或购自培养物收集中心，如日本发酵研究所(IFO，Osaka)。本发明优选使用苜蓿中华根瘤菌IFO 14782(DSM 10226)，其于1995年9月4日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)。

导入含有pdxJ和epd的重组载体后能显著提高微生物生产维生素B₆的产率。例如，这种显示出能显著提高维生素B₆产率的源于苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的重组微生物可按下述方法制备。在经下述三亲本接合(tri-parentalmating)后，携带基因pdxJ和/或epd的重组载体被导入苜蓿中华根瘤菌IFO14782中，其中，苜蓿中华根瘤菌作为受体菌，提供辅助质粒的大肠杆菌作为辅助菌，提供重组载体的大肠杆菌作为供体菌，将它们分别培养后混合到一起。经平板培养后，获得了供体菌中重组载体的苜蓿中华根瘤菌株可在含有适当抗生素的琼脂平板上被选择出来。

为了选择携带质粒的重组菌株，可经由平板上生长的克隆制备质粒及用核酸内切酶进行消化来检测。在染色体上整合了重组DNA的重组菌株可通过经由平板上生长的克隆制备质粒并经DNA印迹杂交分析确定。

导入质粒中的PdxJ和epd在苜蓿杆菌中的表达可通过下述方法进行分析，在培养基中培养所得到的重组菌株，制备无细胞提取物，并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

这样获得的微生物培养于含有可同化碳源、可消化氮源、无机盐以及其它微生物生长必需营养成分的培养基中。可用作碳源的是例如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精或丙三醇。可用作氮源的是例如蛋白胨、豆粉、玉米浆、酵母提取液、肉浸汁、硫酸铵、硝酸铵或其混合物。可用作无机盐的是钙、镁、锌、锰、钴和铁的硫酸盐、盐酸盐或磷酸盐。并且，如果需要，还可以将传统的营养因子或磷酸盐离子的捕获剂或防沫剂如动物油、植物油或矿物油添加到发酵培养基中。

培养基的PH值可以约5.0-9.0，优选约6.5-7.5。培养温度约为10℃-40℃，优选约25℃-35℃。培养时间通常为约1-15天，优选约2-9天。培养期间通风和搅动通常带来有利的结果。

培养后，生产的维生素B₆可以从培养上清液中分离出来并经过纯化步骤。为此目的，可以使用一般用于从培养上清液提取特定产物的方法并适合于维生素B₆各种特性的方法。因此例如，将细胞从培养液中移出，滤液中所需的产品经活性碳吸收后被洗脱，后进一步经离子交换树脂纯化。

可选择地，培养物过滤液直接加载到离子交换树脂上，经洗脱后，从酒精和水的混合物中重结晶所需产品。在培养液中制备的维生素B₆可以通过高压液相色谱法(HPLC)定量。

本发明通过以下实施例得到更详细的说明；然而应该理解本发明并不限于这些特定实施例。

大肠杆菌K-12作为epd基因克隆实验中的基因组DNA的来源，苜蓿中华根瘤菌IF014782用作pdxJ基因克隆实验中的基因组DNA的来源以及作为评价重组细胞发酵生产维生素B₆的宿主菌株。

在含有1％Bacto胰蛋白胨(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)、0.5％Bacto酵母提取液(Becton Dickinson Microbiology systems，MD，USA)和0.5％NaCl的培养基(LB)中培养大肠杆菌菌株。

在LB培养基中加入Bacto-琼脂(1.5％)用于制备琼脂平板。

用QIAGEN Midi试剂盒(QIAGEN GmbH，Germany)或DNA自动分离***PI-50(Kurabo Industry Ltd.，Japan)从大肠杆菌或苜蓿中华根瘤菌中分离质粒DNA。用QIAGEN genomic-tips分离基因组DNA。

按照产家的用法说明使用下述产品：限制性酶、碱性磷酸酶、连接试剂盒、大肠杆菌JM109、HB101感受态细胞(Takara Bio.Inc，Shiga，Japan)、TOPOTA克隆试剂盒(Invitrogen Japan K.K.，Japan)。

质粒pKK223-3、pTrc99A和SureClone连接试剂盒购自AmershamBiosciences Corp.(NJ，USA)。为了进行限制性酶切分析，在1.0％的琼脂糖凝胶上电泳分离DNA片段，将含有所需片段的凝胶切下并使用一种可商购的仪器和QIAEXII(QIAGEN GmbH，Germany)提取DNA片段，然后通过ALF DNA序列仪(Amersham Biosciences Corp.，NJ，USA)确定DNA片段的序列。

实施例1 克隆苜蓿中华根瘤菌的pdxJ和大肠杆菌的epd

(a)来自苜蓿中华根瘤菌IFO 14782染色体的pdxJ

为了通过PCR方法扩增出苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的基因pdxJ，根据苜蓿中华根瘤菌株1021(Accession No.NC_003047)基因组数据库中pdxJ的基因序列设计合成了两条引物：引物A(SEQ ID NO：1)和引物B(SEQ IDNO：2)。

利用QIAGEN genomic-tips从培养基(LBMC)中生长的细胞中提取基因组DNA，该培养基含有1％Bacto胰蛋白胨(Becton Dickinson Microbiologysystems，MD，USA)、0.5％Bacto酵母提取液(Becton Dickinson Microbiologysystems，MD，USA)、0.5％NaCl、0.061％MgSO₄·7H₂O和0.036％CaCl₂·2H₂O。PCR中使用优等-HF PCR试剂盒(Clontech Laboratories Inc.CA USA)。100μl的反应混合物中含有10ng苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的基因组DNA，50pmol的两种引物，10μl的10x HF dNTP混合液，10μl的附加10x HF PCR反应缓冲液，和2μl的50x优等(advantage)-HF聚合酶混合液。反应条件按照下述进行：94℃维持3min，接着98℃30sec、53℃1min、72℃1min共4个循环，然后98℃30sec、68℃1min共20个循环，最后于72℃维持10min。10μl的反应混合物被加样至1％(w/v)的琼脂糖凝胶上，用QIAEXII从胶上回收770bp的DNA条带。

将片段与预先用SmaI消化和碱性磷酸酶脱去了磷酸的载体pUC18连接，其中使用了SureClone连接试剂盒。这样获得的连接混合物被转化进大肠杆菌JM109感受态细胞，然后将细胞涂铺在含有100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基板上。通过DNA自动分离***从平板上生长的克隆中制备得到质粒。

通过限制性酶切分析质粒，获得pdxJ以与lacZ基因相同方向存在于pUC18中的重组质粒pSHT56，可通过QIAGEN质粒Midi试剂盒从提供pSHT56的大肠杆菌JM109中制备得到pSHT56。质粒中pdxJ的DNA序列经由ALF DNA序列仪测序确定，结果表明该基因与苜蓿中华根瘤菌基因组数据库中的序列一样。

克隆自苜蓿中华根瘤菌IFO 14782的pdxJ基因的功能经由下述方法证实。为了在大肠杆菌中表达pdxJ，载体pUC 18被重新塑成pUC-trc2，该载体具有pTrc99A的trc启动子区并在其后连接NdeI识别序列。通过QIAGEN质粒Midi试剂盒由携带pUC-trc2的大肠杆菌JM109制备pUC-trc2。为了提供适于pdxJ在大肠杆菌中表达的质粒，pUC-trc2经NdeI酶切和琼脂糖凝胶电泳后，回收胶上的2.5-kb片段并由碱性磷酸酶脱去磷酸。

pSHT56经NdeI酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分离，使用QIAEXII从胶上回收1kb的片段。使用连接试剂盒将回收的1kb片段与上述2.5-kb的pUC-trc2连接，将获得的连接物转化大肠杆菌JM109后铺在含有100μg/mlAmp的LB板上。通过DNA自动分离***从在平板上生长的克隆中制备质粒。

通过限制性酶切分析质粒，可以获得pdxJ与trc启动子以相同方向连接的重组质粒pSHT57(图1)。通过QIAGEN质粒Midi试剂盒从携带pSHT57的大肠杆菌JM109中制备得到pSHT57。

(b)来自大肠杆菌K-12染色体的epd

使用优等-HF PCR试剂盒及加入10pmol的两种引物如引物C(SEQ ID：3)和引物D(SEQ ID：4)从100ng大肠杆菌K-12的基因组DNA中扩增出epd基因。

反应条件如下：94℃保持15sec，然后94℃15sec、68℃3min共25个循环。使用TOPO TA克隆试剂盒由pCRII-TOPO载体直接克隆扩增出1.0-kb片段。扩增区的序列与登录号为NC_000913的epd的CDS区(3070692-3071711，互补序列)相同，获得的质粒被命名为pCRepd。

实施例2 重组质粒的构建

(a)pVK601

pVK100用于构建苜蓿中华根瘤菌IFO 14782中的表达载体，其是一种广宿主范围载体，属于IncP-1型，可在苜蓿中华根瘤菌中复制。用QIAGEN质粒midi试剂盒从大肠杆菌HB101/pVK100中制备得到pVK100，然后将该质粒进行HindIII酶切消化，使用钝化试剂盒(blunting kit)使之形成平末端，以及经碱性磷酸酶去磷酸化。pSHT57经BamHI和KpnI酶切，从琼脂糖凝胶上回收含有trc启动子和pdxJ的875bp片段，将之平端化后使用连接试剂盒与上述的pVK100进行连接反应，将获得的连接混合物转化大肠杆菌HB101感受态细胞并涂铺在含有10μg/ml四环素(Tc)的LB平板上。通过DNA自动分离***从在培养基上生长的克隆中提取质粒。对重组质粒pVK601进行限制性酶切分析，获得其中trc启动子和pdxJ以相反方向存在且抗卡那霉素(Km)抗性基因的质粒(图1)。

(b)pVK602

为了扩增苜蓿中华根瘤菌中的epd，构建了由启动子tac调控epd的表达盒。来自pCRepd[实施例1-(b)]的1.0-kb PstI片段被平端化并被引入pKK223-3的SmaI位点，其中以允许自tac启动子到epd转录的方向排列，这样形成的质粒被命名为pKKepd(图2)。然后用BgIII消化可转移的粘粒pVK100，回收21.3-kb片段。在片段用细菌碱性磷酸酶处理后，来自pKKepd的1.3-kb BamHI片段与由BgIII消化的和经去磷酸化的片段连接形成质粒pVK602(图3)。

(c)pVK611

为了在苜蓿中华根瘤菌中共表达大肠杆菌的epd和苜蓿中华根瘤菌的pdxJ，采用实施例2-(b)相似的方法构建pVK611。用BgIII消化pVK601并回收22.2-kb片段。当片段用碱性磷酸酶处理后，来自pKKepd的1.3-kbBamHI片段与由BgIII消化的和经脱磷酸的片段连接形成质粒pVK611(图4)。

实施例3 重组质粒转化苜蓿中华根瘤菌IFO14782

在携带pRK2013(Km^r，IncP，tra⁺，ColEI ori(ATCC37159))的大肠杆菌HB101的帮助下，通过下述三亲本接合方法，质粒从大肠杆菌HB101转化进苜蓿中华根瘤菌IFO14782。苜蓿中华根瘤菌IFO14782作为受体菌在液体LBMC培养基中孵育，在30℃以140rpm震摇温育16个小时。

携带pRK2013的大肠杆菌HB101作为辅助菌，携带pVK601的大肠杆菌HB101作为供体菌，它们分别在含有50μg/ml Km的LB培养基和含有10μg/ml Tc的LB培养基上培养，并于37℃以140rpm震摇温育16个小时。每种菌株被转移进相同的培养基再培养6小时，然后离心收集细胞并悬浮于LB培养基中(终OD₆₀₀＝20)，以1∶1∶4(v/v/v)的比例混合受体细胞、辅助细胞和供体细胞。

将混合物添加到置于LBMC琼脂平板上的硝化纤维素滤器上。当这些平板在30℃温育了20小时后，滤器上的细胞被刮下并悬浮于灭过菌的0.85％的NaCl溶液中。悬浮液进行适当稀释后涂铺在含有20μg/ml萘啶酸(nalidixit acid)(用于苜蓿中华根瘤菌IFO14782的选择)和10μg/ml Tc(用于pVK601的选择)的LBMC平板上。这些平板在30℃温育了5天后，将在平板上的克隆挑出并进行培养，然后通过QIAGEN质粒mini试剂盒提取质粒。获得的质粒DNA经过限制性酶的处理进行确认，琼脂糖凝胶电泳的结果与pVK601的相同。获得的克隆经在相同选择平板上培养得到纯化并被用作苜蓿中华根瘤菌IFO 14782/pVK601重组质粒。与上述苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK601的构建方法相似，使用携带pVK602的大肠杆菌HB101和携带pVK611的大肠杆菌HB101作为供体菌株，获得了苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK602和苜蓿中华根瘤菌IFO 14782/pVK611。通过SDS-PAGE确定pdxJ和epd在重组菌株中的表达，细胞于30℃在含有10μg/ml Tc的LBMC培养基上生长18小时。然后通过离心收集生长的细胞，用盐溶液洗涤后悬浮于20mM冰冷的磷酸缓冲液(pH 8.2)中。将细胞悬浮液加载到超声波仪(Bioruptor，Cosmo Bio Co.Japan)上，之后形成的溶解产物于4℃以15,000rpm离心10分钟以除去细胞碎片。

上清液被用作无细胞提取物，接着经过12.5％的凝胶SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝(Rapid Stain CBB Kit，nacalai tesque Japan)染色。在含有重组质粒的苜蓿中华根瘤菌IFO 14782中检测到表达的预期大小的多肽(PdxJ 29.0kDa，Epd 37.2kDa)。

实施例4 含有重组质粒的苜蓿中华根瘤菌IFO 14782发酵生产维生素B₆

含有重组质粒的苜蓿中华根瘤菌IFO 14782和亲本苜蓿中华根瘤菌IFO14782于30℃在LBMC琼脂平板上培养48小时，一个菌环量的每种菌株被接种到含有8ml种子培养基(seed medium)的试管中，所述种子培养基含有1％葡萄糖，1％玉米浆(Nihon Syokuhin Kako Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)，0.2％Bacto酵母提取物，0.1％聚胨(polypeptone)S(Nihon Pharmaceuticals Co.Japan)，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.001％MnSO₄·5H₂O，和0.001％FeSO₄·7H₂O，PH值为6.8，然后在30℃往复式摇瓶机(275rpm)上振荡试管。

振荡19个小时后，将每份3ml的培养液转移到带有两个挡板且含有150ml生产培养基的500ml烧瓶中，所述培养基中含有6％葡萄糖，3％玉米浆(Nihon Syokuhin Kako Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)，0.8％Bacto酵母提取物，0.175％NH₄Cl，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.0025％MnSO₄·5H₂O，1％Allophosite(Shinagawa Chemicals Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)，和0.025％Actocol(TakedaChemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)，PH值为6.8，然后在30℃旋转振荡器(180rpm)上振荡。振荡2天后，在每个烧瓶中加入0.125％的消过毒的尿素溶液，并继续振荡5天。

培养7天后，经HPLC定量每瓶培养液的上清液中维生素B₆的量，并通过下述的4′-脱氧吡哆醇的内部标准方法计算得出所产生的维生素B₆的量。为了制备用于HPLC分析的样品，将400μl 500mg/l的4′-脱氧吡哆醇作为内标准物质9(internal substance)、50μl 60％的高氯酸和550μl的去离子水加到250μl吡哆醇的标准溶液或培养上清液中，然后将混合物置于冰上10分钟，经15,000rpm离心后，将上清液加装到下述柱子上。

分析条件如下：柱Capcell pak C18 SG120(4.6×250mm)(Shiseido Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)；移动相，0.1M高氯酸钠，0.1M磷酸钾，2％乙腈(pH 3.5)；柱温度，30℃；流速，1.0ml/min；检测器，紫外线辐射(292nm)。结果列于表1。

含有pdxJ表达质粒的苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK601的滴度比亲本菌株IFO14782高约两倍，而含有epd表达质粒的苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK602的滴度要低于亲本菌株。另一方面，同时含有epd和pdxJ基因的重组苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK611产生了每升1,300mg的吡哆醇，其高于亲本菌株约13倍。由此可见，同时导入epd和pdxJ基因显著提高了维生素B₆的产率。

      表1：重组苜蓿中华根瘤菌的PN产率

菌株	PN产率(mg/L)
		苜蓿中华根瘤菌IFO14782苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK601苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK602苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK611	103192841,300

实施例5 从培养液中分离和纯化维生素B₆

按照实施例4所述的培养条件培养苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK611，然后从培养液中回收维生素B₆。在每个纯化步骤时的维生素B₆和浓度由HPLC测定。以7,500rpm离心1升经168小时-培养的含有1300mg/L维生素B₆的培养液10分钟。用1N盐酸将生成的上清液的pH值调至3.1，然后将上清液加载到充满350ml安伯来特(Amberlite)CG 120(H⁺型，筛号100-200，Rohm and Haas Company，Philadelphia，Pennsylvania，USA)柱(5.5×15cm)上，然后用500ml去离子水冲洗并用5％氢氧化铵洗脱。减压浓缩维生素B₆级分。将由此获得的残留物溶解在10ml的去离子水中后加到装有380ml Dowex 1x4(OH^-型，筛号200-400，Dow Chemical Co.，Ltd.，Midland，Michigan，USA)的柱(5.5×16cm)上，然后用500ml去离子水洗柱。然后用0.1N HCI洗脱。含有维生素B₆的级分在减压下被浓缩成小体积。将固体残留物溶解于少量的热乙醇中，将所述溶液在4℃过夜保持。通过过滤收集所得的沉淀，真空干燥以得到1,090mg的粗晶体。将这些粗晶体从乙醇中再结晶以得到839mg熔点为160℃的白色结晶。产物的红外吸收值、UV吸收值和NMR谱与真正的吡哆醇一致。

                     序列表

<110>DSM IP资产公司(DSM IP ASSETS B.V.)

<120>生产维生素B₆的微生物和方法

<130>NDR5216

<140>PCT/EP03/10286

<141>2003-09-16

<150>EP02021621.4

<151>2002-09-27

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物A

<400>1

tcccatatgc ctgcaaagct ctcc                                           24

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物B

<400>2

tccctgcagt taagccgtct cgcc                                           24

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物C

<400>3

cctgcaggca ggagatctat                                                20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物D

<400>4

cctgcagacg ctgcttgcgt                                                20

Claims (16)

1、一种能够生产维生素B₆的中华根瘤菌属的重组微生物，所述微生物由含有5′-磷酸吡哆醇合成酶基因和D-赤藓糖4-磷酸脱氢酶基因的载体转化。

2、如权利要求1所述的微生物，其中5′-磷酸吡哆醇合成酶基因来源于大肠杆菌或苜蓿中华根瘤菌。

3、如权利要求1所述的微生物，其中5′-磷酸吡哆醇合成酶基因来源于大肠杆菌K12或苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。

4、如权利要求1所述的微生物，其中5′-磷酸吡哆醇合成酶基因来源于苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。

5、如权利要求1所述的微生物，其中5′-磷酸吡哆醇合成酶基因来源于大肠杆菌K12。

6、如权利要求1所述的微生物，其中D-赤藓糖4-磷酸脱氢酶基因来源于大肠杆菌或霍乱弧菌。

7、如权利要求1所述的微生物，其中D-赤藓糖4-磷酸脱氢酶基因来源于大肠杆菌K12。

8、如权利要求1所述的微生物，所述微生物为苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK611。

9、一种通过培养重组的中华根瘤菌属微生物生产维生素B₆的方法，所述的重组微生物由含有5′-磷酸吡哆醇合成酶基因和D-赤藓糖4-磷酸脱氢酶基因的载体转化，并适于生产维生素B₆，该方法包括在有氧条件下，在含有可同化的碳源、可消化的氮源、无机盐和其它生长必需养分的培养基中，在pH5.0-9.0、温度10℃-40℃时，培养所述重组微生物1-15天，并从培养液中回收生产和积累的维生素B₆。

10、如权利要求9所述的方法，其中5′-磷酸吡哆醇合成酶基因来源于大肠杆菌或苜蓿中华根瘤菌。

11、如权利要求9所述的方法，其中5′-磷酸吡哆醇合成酶基因来源于大肠杆菌K12或苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。

12、如权利要求9所述的方法，其中5′-磷酸吡哆醇合成酶基因来源于苜蓿中华根瘤菌IFO 14782。

13、如权利要求9所述的方法，其中5′-磷酸吡哆醇合成酶基因来源于大肠杆菌K12。

14、如权利要求9所述的方法，其中D-赤藓糖4-磷酸脱氢酶基因来源于大肠杆菌或霍乱弧菌。

15、如权利要求9所述的方法，其中D-赤藓糖4-磷酸脱氢酶基因来源于大肠杆菌K12。

16、如权利要求9所述的方法，其中所述的重组微生物为苜蓿中华根瘤菌IFO14782/pVK611。

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