CN1701816A - 一种含白细胞介素23基因的抗肿瘤剂 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域，涉及以IL－23基因或者导入IL－23基因的细胞作为有效成分的抗肿瘤剂。具体包括以下述物质为有效成分的抗肿瘤剂：表达IL－23基因的病毒或者非病毒载体、导入IL－23基因并失去***能力的肿瘤细胞、导入IL－23基因的免疫细胞。本发明的抗肿瘤剂可以单独使用，也可以与手术、放射疗法、化学疗法等治疗手段相结合，用于提高机体的细胞免疫应答，从而达到缩小肿瘤体积、防止转移和预防肿瘤复发的目的。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及以IL-23基因或者导入IL-23基因的细胞作为有效成分的抗肿瘤剂。具体包括以下述物质为有效成分的抗肿瘤剂：表达IL-23基因的病毒或者非病毒载体、导入IL-23基因并失去***能力的肿瘤细胞、导入IL-23基因的免疫细胞。本发明的抗肿瘤剂可以单独使用，也可以与手术、放射疗法、化学疗法等治疗手段相结合，用于提高机体的细胞免疫应答，从而达到缩小肿瘤体积、防止转移和预防肿瘤复发的目的。
背景技术
已有的肿瘤治疗方法(如放射疗法、化学疗法、手术切除等)，由于具有极大的毒副作用、易引起机体的免疫机能下降，因此不利于病人的预后。化学疗法或者放射疗法损害骨髓机能，机体防御反应低下，一方面容易引起继发感染，另外一方面免疫***对肿瘤细胞的免疫应答也低下。手术本身引起对机体的创伤，也引起免疫抑制，因此，手术后往往发生微小转移灶的扩大。另外，由于种种原因，肿瘤患者本身的免疫***对肿瘤的攻击缺乏反应，即出现免疫耐受现象。因此，打破免疫耐受，改善各种治疗引起的免疫功能低下，加强机体对肿瘤的免疫应答，是肿瘤治疗中的重大课题。
为解决上述问题，利用作用于免疫应答各个阶段的细胞因子调控机体免疫功能的各种尝试正在进行中。一种方法是直接给予重组细胞因子，另外一种方法是给予细胞因子的基因进行基因治疗。(Rosenberg SA，J ClinOncol，10；180-199，1992。Tepper RI，Mule JJ，Hum Gene Ther，5；153-164，1994)。由于机体清除率高，导致一般细胞因子的半衰期很短，血液中细胞因子难以维持一定的浓度，而过量给予细胞因子又有毒性作用，因此，直接给予重组细胞因子具有一定的局限性。而随着利用脂质体、病毒或者超声、电击等物理手法将外源性基因导入细胞的技术日趋成熟，向肿瘤细胞导入细胞因子基因，使其分泌细胞因子、产生抗肿瘤作用是简便有效的方法，这正属于肿瘤基因治疗的范畴。
在这种治疗方法中，从肿瘤局部持续分泌的细胞因子直接引起向肿瘤聚集的免疫细胞群的活化，因此推测比直接向个体给予重组细胞因子具有更好的抗肿瘤效果和安全性。由于发挥抗肿瘤效应的关键因素是对肿瘤有特异性杀伤作用的细胞杀伤性T细胞(CTL)和具有非特异性杀伤作用的自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK细胞)，目前使用的细胞因子大多作用于上述两类细胞，促进其激活和/或增殖。
近年来有些肿瘤抗原多肽被发现，为利用免疫应答***进一步提供了切实的理论依据。经过适当的加工后，肿瘤抗原被抗原递呈细胞树状细胞递呈给效应细胞即细胞杀伤性T细胞，从而使其被激活并发挥特异性杀伤肿瘤细胞的作用(Banchereau J，Steiman RM，Nature 392；245-252，1998)。在历来发现的细胞因子中，由活化的树状细胞所分泌的白细胞介素12(IL-12)具有诱导I型辅助性T细胞(Th1)、诱导产生抗肿瘤效应的重要作用。最近又发现了由树状细胞分泌的一种新的细胞因子，被命名为白细胞介素23(Interlukine-23，IL-23)(Oppmann B et a1，Immunity 13；715-725，2000)。IL-23是由两个亚基(p19分子+p40分子)组成的二聚体，其中p40分子也是IL-12(p35分子+p40分子)的一个亚基。IL-23和IL-12二者除了都有p40亚基以外，IL-23的p19亚基和IL-12的p35亚基的氨基酸序列同源性也很高。
发明内容
本发明的目的是利用IL-23基因或者导入IL-23基因的细胞为有效成分制备抗肿瘤剂。
虽然已经有不少将重组细胞因子IL-2、IFN-α、TNF-α等用于***的实践，但疗效还没有明确的定论。另外，直接向肿瘤导入基因进行基因治疗的临床试验研究正处于初始发展阶段，因此上述细胞因子及其基因应用于临床治疗并未获得显著进展。
本发明与以往肿瘤基因治疗所用的细胞因子不同，使用新发现的，由活化的树状细胞产生的细胞因子IL-23。而树状细胞的活化在免疫应答初期具有关键作用，是诱导具有特异性抗肿瘤作用的细胞杀伤性T细胞激活所必须的过程。本发明将IL-23基因导入细胞中，观察到这些细胞引起较强的抗肿瘤效应。具体是，在体外，IL-23对记忆T细胞的增殖、活化及T细胞分泌IFN-γ具有促进作用；在体内，IL-23能引起肿瘤特异性获得免疫；向缺乏T细胞的免疫功能缺陷裸鼠移植人的肿瘤细胞，也观察到IL-23的抗肿瘤作用。
IL-23是由活化的树状细胞分泌的，由IL-12的p40亚基和与IL-12的p35亚基有高度同源性的p19组成的细胞因子。本发明所用的IL-23基因如序列表所示，序列表1所示碱基序列编码本序列表中所列氨基酸序列(即人p19分子)；序列表2所示碱基序列编码本序列表中所列氨基酸序列(即人p40分子)；
编码与IL-23具有同样药理作用的IL-23突变体的基因也可用于肿瘤的基因治疗。比如，在序列表1所列氨基酸序列(p19)基础上，缺失一到数个氨基酸、置换或者添加数个氨基酸，产生具有p19药理作用的突变体；又比如，在序列表2所示氨基酸序列(p40)基础上，缺失一到数个氨基酸、置换或者添加数个氨基酸，产生具有p40药理作用的突变体；另外还包括，通过在严格条件下与含有序列1所列碱基序列的基因杂交而获得的、所编码分子与p19(或p40)分子具有同样药理作用的p19(或p40)的突变体的基因。这里所指的严格条件，比如在下列条件下进行杂交：在含6×SSPE，2×Denharts溶液、0.5％SDS、0.1mg/ml鱼精DNA的杂交液中、65℃下，进行12小时Southern杂交。
上述基因，根据序列表所示人p19分子及p40分子的序列可以用众所周知的PCR等方法获得。这些方法，在冷泉港出版的《分子克隆实验指南》(第二版)等书的指导下方便易行。上述突变体的制作，利用PCR或者杂交的方法也简单易行。
为达到***的目的，本发明需要利用病毒或者非病毒载体表达IL-23蛋白。具有代表性的病毒载体有腺病毒、反转录病毒等，如无毒化的反转录病毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、辛德毕斯病毒、脊髓灰质炎病毒、脊髓灰质炎病毒、仙台病毒、 SV40、人类免疫缺陷病毒(HIV)等DNA病毒和一些RNA病毒。在上述病毒载体中，由于腺病毒载体具有较高的感染效率，因而使用较多。
非病毒载体指能在哺乳动物体内表达目的基因的一些载体，例如pcDNA3.1，pZeoSV，pBK-CMV(Invitrogene公司，Strategene公司)，pCAGGS(Gene 108，193-200，1991)等。
为制备本发明所包括的抗肿瘤剂，须向上述各类载体中以可表达的方式***上述基因或突变体。用于这些病毒载体或者非病毒载体的制备方法即给药方法都是利用已经公开的技术，有很多文献或者实验指导书可以参考，如《实验医学分册》，基因治疗的基本技术，羊土社，日本，1996；《实验医学分册》，基因导入和表达的实验方法，羊土社，日本，1997；基因治疗学会编《基因治疗开发研究手册》，1999等。
这些被***IL-23基因并能表达IL-23的病毒或者非病毒载体既可直接给药，也可以在医药容许范围内加入赋形剂，制成溶液、悬浊液、胶体等剂型。给药方式，可以向肿瘤患者的肿瘤病灶或者不同肿瘤相应易发生转移的部位进行局部给药，或通过静脉或者动脉进行***给药。给药的剂量根据患者的症状、年龄、性别、给药途径、剂型的不同而不同，以IL-23基因的质量计算，一般成人每日可以给予10微克到500毫克不等。
本发明还包括在体外向患者细胞导入上述基因使其表达IL-23，然后将这些细胞重新导入患者体内。这种细胞主要包括多种肿瘤细胞和免疫细胞。肿瘤细胞如大肠癌细胞、肺癌细胞、肾癌细胞、黑色素瘤细胞、乳腺癌细胞、扁平上皮癌细胞、移行上皮癌细胞、肉瘤细胞、神经胶质瘤细胞等。特别指出的是，用于治疗用途的肿瘤细胞最好是来源于同一肿瘤；另外，同种同系的肿瘤细胞也比较合适。免疫细胞则包括淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、细胞杀伤性T细胞(CTL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自然杀伤细胞(NK细胞)、NKT细胞、B细胞或者是外周血单核细胞。同种的免疫细胞更适用于治疗，即治疗人类肿瘤应使用人的免疫细胞。
可以利用含有IL-23基因的上述病毒或者非病毒载体向肿瘤细胞导入IL-23基因。如向LXSN(Miller AD，Rosman GJ，BioTechniques 7；980-990，1989)、MCF、α-SCG、PLJ、pEm(1994年6-503968号专利公告)等反转录病毒载体的多克隆位点，以可表达方式***目的IL-23基因，然后将构建过的反转录病毒载体导入包装细胞，培养被导入IL-23基因的包装细胞，取其上清感染肿瘤细胞，从而向肿瘤细胞导入IL-23基因。导入IL-23基因的肿瘤细胞通常经过放射线的照射，使其失去***能力后导入到机体内。
另外，可以利用含有IL-23基因的上述病毒或者非病毒载体，向免疫细胞导入IL-23基因。例如，向从人类5型腺病毒来源的Adexl(Saito，I.et a1.，J Viol.，54，711-719，1985)等的克隆位点以可表达方式***IL-23基因，然后将构建过的腺病毒载体以常规方法导入免疫细胞内。
这些导入IL-23基因的肿瘤细胞或者免疫细胞，可以在医药容许范围内加入赋形剂，制成溶液、悬浊液、胶体等剂型。给药方式，可以向肿瘤患者的肿瘤病灶或者不同肿瘤相应易发生转移的部位进行局部给药，或通过静脉或者动脉进行***给药。给药的剂量根据患者的症状、年龄、性别、给药途径、剂型的不同而不同，以给予的肿瘤细胞或者免疫细胞个数计算，一般成人每日可以给予从105个到109个不等。
依据本发明，给予IL-23基因或者被导入IL-23基因的肿瘤细胞、免疫细胞，通过激活抗肿瘤免疫应答发挥抗肿瘤作用、达到***、抑制肿瘤转移的作用。导入IL-23基因的肿瘤细胞能引起特异性抗肿瘤免疫应答，尤其有利于在免疫功能低下的患者发挥抗肿瘤作用。
附图说明
图1.CD40 Ligand(CD40L)激活树状细胞(DCs)引起P40亚基分泌。表达Fas L或者CD40L的小鼠肺癌A11与树状(DC)细胞共同培养后，测定树状(DC)细胞分泌的p40分子的量。
图2.CD40 Ligand(CD40L)激活树状细胞(DCs)引起细胞p19和p40亚基分泌的情况。用RT-PCR法检测树状(DC)细胞表达细胞因子的情况。Mig是IFNγ诱导的monokine.GAPDH用于标定所用cDNA的含量。
图3.活化树状细胞中p19和p35亚基mRNA的表达。用RT-PCR方法检测CD40L激活的DC细胞中p19和p35基因的表达情况。p19 mRNA表达水平显著高于p35 mRNA。
图4.导入IL-23基因的Colon26细胞中p19和p35亚基mRNA的表达。用反转录病毒载体向Colon 26导入IL-23基因(p19-IRES-p40)后，Colon26/IL-23#1和Colon 26/IL-23#9)表达IL-23基因的情况。
图5.导入IL-23基因的Colon26细胞的抗肿瘤效果(1)。转入IL-23基因的Colon 26细胞(Colon 26/IL-23#1和#9，分别为1×106个)产生的抗肿瘤效果。对照组为转入孔载体DNA的Colon 26细胞(1×106个)。细胞被接种到皮下。图中标准误已被标出。
图6.导入IL-23基因的Colon26细胞的抗肿瘤效果(2)。转入IL-23基因的Colon 26细胞(Colon 26/IL-23#4和#12，分别为5×105个)产生的抗肿瘤效果。对照组亲株Colon 26细胞(5×106个)。细胞被接种到皮下。图中标准误已被标出。
图7.导入IL-23基因的Colon26细胞的抗肿瘤效果(3)。混合亲株Colon 26(5×105)与转入IL-23基因的细胞(Colon 26/IL-23#9，1×105个，10％)产生的抗肿瘤效果。对照组亲株Colon 26细胞(1×106个，100％)。细胞被接种到皮下。图中标准误已被标出。
图8.导入IL-23基因的Colon26细胞的抗肿瘤效果(4)。向BALB/C小鼠腹部皮下一侧接种Colon 26/IL-23#9对另一侧同时接种的亲株Colon26肿瘤生长情况的影响。
图9.接种Colon26/IL-23细胞后肿瘤消退小鼠脾细胞分泌IFN-γ的量。排除Colon 26/IL-23肿瘤后小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ的情况。脾脏细胞预先经过抗CD4，抗CD8和/或抗ansialo GM1抗体进行处理，然后与照射处理过的Colon 26或者RL-male-1细胞共同培养。
图10.IL-23基因的Colon26细胞接种到裸鼠后的抗肿瘤效果。转入IL-23基因的Colon 26细胞(Colon 26/IL-23#9，1×106个)产生的抗肿瘤效果。细胞被接种到BALB/c裸鼠皮下。图中标准误已被标出。
图11.导入IL-23基因的ASPC-1细胞中p19和p35亚单位的表达。利用反转录病毒载体向人胰腺癌细胞AsPc-1转入IL-23基因(p19-internalribosomal rentry site-p40)后，p19、p35、p40等基因的表达。
图12.导入IL-23基因的ASPC-1细胞接种到裸鼠后的抗肿瘤效果。利用反转录病毒载体向人胰腺癌细胞AsPc-1转入IL-23基因，AsPc-1/IL-23细胞的抗肿瘤效应。细胞被接种到BALB/c裸鼠皮下。图中标准误已被标出。
图13.导入IL-23基因的ASPC-1细胞接种到SCID小鼠后的抗肿瘤效果。将AsPc-1/IL-23细胞接种到BALB/c严重免疫缺陷(SCID)小鼠皮下后，肿瘤的生长情况。图中标准误已被标出。
图14.裸鼠脾细胞的细胞杀伤活性。用51Cr释放法测定脾细胞的细胞杀伤活性。脾脏细胞来源为对照裸鼠(未接种肿瘤细胞)或者已经接种了亲株AsPc-1或转入IL-23基因的AsPc-1细胞(AsPc-1/IL-23)的裸鼠。将这些脾脏细胞与51Cr标记的AsPc-1细胞共同培养。
具体实施方式
下述关于本发明的实施举例，只是为更详细地说明发明的具体情况，并不对本发明构成任何限定。
实施例1
活化树状细胞分泌IL-23及IL-12量的比较
用抗体方法去除小鼠骨髓T细胞、B细胞和巨噬细胞后，在添加GM-CSF和IL-4(20ng/ml，PeproTech公司)的培液中培养非贴壁细胞10天，从而得到树状细胞。利用Cell Sorter分析所得细胞的表面标志，II型主要组织相溶性抗原和CD86等细胞活化标志表现出弱阳性，从而确定为未成熟的树状细胞。
在24孔培养板上将这些细胞(6×105个/孔)与已经导入CD40基因的肺癌细胞A11细胞(2×105个/孔)共同培养后，CD86等细胞活化标志增加，确定细胞发生活化。此时用ELISA法(BioSourse公司试剂盒)从培养上清中检测出p40，而作为对照，将树状细胞与导入FasLigand基因的A11细胞共培养后，上清未检测到p40。(图1)。用RT-PCR法检测细胞因子的表达，发现IL-23亚基p19和IL-12亚基p35的RNA都有表达。(图2)。IL-23亚基p19RNA的表达比IL-12p35的表达量高。(图3)。
活化树状细胞的功能活动是激发抗肿瘤效应细胞活性的关键因素。活化树状细胞分泌的IL-23的量显著多于IL-12，结果提示IL-23可能比IL-12更重要。
实施例2
IL-23基因导入细胞的建立
从BALB/c小鼠皮下移植肿瘤的细胞中提取总RNA，用RT-PCR法，获得p19(附序列3)和p40(序列4)全长序列cDNA，并将其***反转录病毒载体LXSN(Miller AD，Rosman GJ，BioTechniques 7；980-990，1989)的多克隆位点(EcoRI/Bam HI)，两种cDNA之间由内部核糖体进入位点(internal ribosome entry sites，IRES)连接(Duke GM等，J Virol 66：1602-1609，1992)。因此，反转录病毒可在位于长末端重复序列(LTR)的启动子的作用下，转录p19(位于IRES 5’端)和p40(位于IRES 3’端)，转录产物可以分别被独立翻译。
利用Lipofectin试剂(Invitrogen公司)将上述反转录病毒载体转染到包装细胞ψ2细胞中，然后用G418(400μg/ml、Invitrogen公司)加入培养液中进行筛选。含有反转录病毒培养上清中加入Polybrene(8mg/ml、Aldrich公司)，用于感染PA317细胞(ATCC)，添加G418(400μg/ml、Invitrogen公司)进行选择。具有G418抗性的PA317细胞培养上清中含有所需反转录病毒。
用上述反转录病毒感染大肠癌细胞(Colon 26)，将IL-23基因导入细胞中并进行经过克隆化筛选。建立细胞株Colon 26/IL-23#1，#4，#9，#12。用NorthernBlot确认这些已经导入外源基因的细胞株表达p19，p35，p40的情况(代表性克隆见图四)，另外用ELISA方法确认了培养上清中分泌p40的情况(分泌量为0.8-1.1ng/ml/1×106/48小时)。对肿瘤抗原递呈起重要作用的主要组织相容性抗原H-2K/H-2D的表达与野生株的肿瘤细胞没有显著差异。亲株及基因导入细胞株的体外增殖情况也相同。
实施例3
IL-23基因导入细胞的抗肿瘤效果
向同系BALB/c小鼠接种两种导入IL-23基因的Colon 26细胞(Colon26/IL-23#1，#9)，生成的肿瘤生长被推迟，经过一段时间后，肿瘤完全消退。而作为对照，接种导入空载体、及未导入基因的亲株细胞后，肿瘤生长迅速，，最终导致小鼠死亡。其他克隆也有相似的抗肿瘤效果。向同系小鼠腹腔内接种Colon 26细胞(1×106个)后20天以内，小鼠全部死亡。而接种同样量的Colon 26/IL-23#9或#12后，大多数小鼠存活超过40天(χ2＝3.5，df＝1，P＝0.037；log-rank test，P＝0.046)。
Colon 26/IL-23#1合和Colon 26/IL-23#9以1∶9的比例混合(总细胞数为1×106个)后接种于同系小鼠，肿瘤形成和生长的速度比单纯接种Colon 26亲株明显减慢(P＜0.05)。表明分泌IL-23的细胞在肿瘤接种部位能引起抗肿瘤作用。
[实施例4]
IL-23基因导入细胞的治疗效果
向同系小鼠腹部一侧皮下接种Colon 26细胞(1×106个)，腹部另一侧接种Colon 26/IL-23#9(1×106个)。Colon 26/IL-23#9肿瘤最终消失，对侧Colon 26肿瘤的生长比只接种Colon 26的小鼠肿瘤明显减慢。因此，接种IL-23基因导入细胞后，能引起针对远侧存在的亲株肿瘤细胞的免疫应答，从而达到治疗效果。
[实施例5]
接种IL-23基因导入细胞后肿瘤特异性获得免疫功能的建立
IL-23基因导入细胞接种后形成肿瘤并被小鼠拒绝，从最初接种肿瘤细胞后60日，再次接种致死量的Colon 26细胞，肿瘤不再形成，存活超过120日。而拒绝过Colon 26/IL-23肿瘤的小鼠，皮下接种致死量异种肿瘤RLmale-1后，肿瘤形成并生长迅速，大部分小鼠死亡。以上结果表明向肿瘤细胞导入IL-23基因后，引起以T介导的特异性免疫反应。表1是肿瘤特异性获得免疫的建立情况。
表1.
| 接种细胞1(细胞数)(day0) | 接种细胞1(1×106)(day 60) | 生存数2(day 120) |
| Colon 26(1×106)RL male-1(1×106)Colon 26/IL-23#1(1×106)Colon 26/IL-23#9(1×106)Colon 26/IL-23#4(5×105)Colon 26/IL-23#1(1×106)Colon 26/IL-23#12(5×105) | Colon 26Colon 26Colon 26RL male-1RL male-1 | 0/70/76/66/64/42/90/3 |
1为皮下接种
2为生存小鼠数/接种总小鼠数
实施例6
接种IL-23基因导入细胞后诱导IFN-γ产生
接种Colon 26/IL-23#9后肿瘤消退小鼠的脾脏细胞(1×107/m1)与经50Gy的放射线处理过的Colon 26细胞(1×106/m1)共同培养，培养上清中与抗肿瘤效果密切相关的细胞因子IFN-γ大量分泌。而与放射线处理过的RLmale-1共培养后，上清中只有少量IFN-γ分泌。从未接种过肿瘤的小鼠来源的脾脏细胞与上述细胞共培养后上清中基本不分泌IFN-γ。结果表明，接种能产生IL-23的肿瘤细胞后，可诱导产生针对肿瘤特异性细胞杀伤性T细胞。表2是BALB/c小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ的情况。
表2
| 批准脾脏细胞来源小鼠 | IFN-g(pg/ml±SE) | ||
| Colon 261 | RL male-11 | None | |
| 未处理未处理未处理Colon 26/IL-23肿瘤正在消退Colon 26/IL-23肿瘤正在消退Colon 26/IL-23肿瘤正在消退 | 0.0±0.00.0±0.01.6±1.67108.7±155.87810.4±93.9457980.8±235.1 | 0.1±0.00.9±0.714.3±14.3575.9±36.2458.5±21.8411.0±14.1 | 0.2±0.10.5±0.4n.d.2252.5±8.6n.d.n.d. |
1放射线处理
2未检测
为进一步确定上述结果，向小鼠皮下接种Colon 26/IL-23#9细胞，待肿瘤完全消退后，取脾脏细胞进行培养，用抗GM1抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体处理，分别去除自然杀伤(NK)细胞、CD4阳性T细胞、CD8阳性T细胞，检测IFN-γ的分泌情况(图9)。经过抗CD8抗体处理的脾脏细胞与放射线照射过的Colon 26共同培养后，其分泌IFN-γ的量显著下降。表明IL-23诱导的抗肿瘤效应主要由CD8阳性细胞杀伤性T细胞介导。
实施例7
免疫缺陷状态下，IL-23基因导入细胞的抗肿瘤效应
缺乏T细胞的BALB/c裸鼠皮下接种Colon 26/IL-23#9细胞(1×106个)，与免疫功能正常的BALB/c小鼠不同，肿瘤形成后持续生长。表明α/βT细胞的功能活动与IL-23的抗肿瘤效果密切相关。另外，Colon 26/IL-23#9肿瘤的生长速度仍比亲株Colon 26肿瘤减慢(P＜0.001，图10)。这一结果显示，在缺乏α/βT细胞的免疫缺陷状态下，向小鼠导入IL-23基因也能引起一定的抗肿瘤效果。
利用实施例2所示方法，将IL-23转入人类胰腺癌(AsPC-1)细胞，得到两个稳定表达IL-23的细胞克隆(AsPC-1/IL-23#6，#10)。这两个克隆的细胞表达p19和p40基因11)，培养上清中分泌p40的量为2ng//ml/5×105/48小时。通过测定这些细胞的35S OOO代谢水平并用抗p40抗体进行免疫共沉淀实验，确证了培养上清中存在p19+p40复合体即IL-23。体外细胞增殖和Class I主要组织相容性抗原(HLA-A，B，C)的表达与亲株AsPC-1细胞没有显著差异。
将AsPC-1/IL-23#6和#10(1×106个)分别接种于BALB/c裸小鼠皮下，肿瘤的生长比亲株AsPC-1(1×106个)明显减慢。而将AsPC-1/IL-23#10接种于缺乏T、B和NK细胞的严重免疫缺陷综合症(SCID)小鼠，没有观察到抗肿瘤效果(图13)。
上述结果提示γ/δT、B和NK细胞都参与IL-23的抗肿瘤作用。将接种了AsPC-1/IL-23#10的小鼠的脾细胞(2×107个)与用50Gy放射线照射过的亲株AsPC-1细胞(2×106)共同培养5大，细胞杀伤活性比接种过亲株AsPC-1小鼠脾脏细胞明显升高(图14)。另外，同样条件下共培养24小时，上清中检测出IFN-γ，而与50Gy放射线照射过的人肺癌细胞QG-56共培养的上清中只有少量IFN-γ分泌。总之，用人的肿瘤细胞进行实验，证实导入IL-23基因的细胞在缺乏γ/δT细胞的裸鼠中也能诱导细胞杀伤效应，起到抗肿瘤作用。表3是BALB/c裸小鼠脾细胞分泌IFN-γ的情况。
表3
| 脾脏细胞来源裸鼠 | IFN-γ(pg/ml±SE) | ||
| AsPC-11 | QG-561 | None | |
| 未处理未处理AsPC-1肿瘤接种AsPC-1肿瘤接种AsPC-1/IL-23#10肿瘤接种AsPC-1/IL-23#10肿瘤接种 | ＜20＜20＜20＜20129±72.2286±72.8 | ＜20＜20＜20＜20＜2074.6±16.9 | ＜20＜20＜20＜20＜20＜20 |
1放射线处理(50Gy)
本发明导入IL-23基因的肿瘤细胞能诱导肿瘤特异的免疫反应，从而达到显著的抗肿瘤效果。本发明中介绍了将IL-23导入技术及IL-23基因导入细胞在***方面的巨大应用潜力。本发明可以单独或者与其他疗法合用，达到安全有效治疗癌症的目的，具有重要的实用价值。
SEQUENCE LISTING
<110>复旦大学 日本国千叶县政府
<120>一种含白细胞介素23基因的抗肿瘤剂
<130>
<160>4
<210>1
<211>570
<212>DNA
<213>Homo sapience
<400>1
atg ctg ggg agc aga gct gta atg ctg ctg ttg ctg ctg ccc tgg aca 48
Met Leu Gly Ser Arg Ala Val Met Leu Leu Leu Leu Leu Pro Trp Thr
5 10 15
gct cag ggc aga gct gtg cct ggg ggc agc agc cct gcc tgg act cag 96
Ala Gln Gly Arg Ala Val Pro Gly Gly Ser Ser Pro Ala Trp Thr Gln
20 25 30
tgc cag cag ctt tca cag aag ctc tgc aca ctg gcc tgg agt gca cat 144
Cys Gln Gln Leu Ser Gln Lys Leu Cys Thr Leu Ala Trp Ser Ala His
35 40 45
cca cta gtg gga cac atg gat cta aga gaa gag gga gat gaa gag act 192
Pro Leu Val Gly His Met Asp Leu Arg Glu Glu Gly Asp Glu Glu Thr
50 55 60
aca aat gat gtt ccc cat atc cag tgt gga gat ggc tgt gac ccc caa 240
Thr Asn Asp Val Pro His Ile Gln Cys Gly Asp Gly Cys Asp Pro Gln
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gga ctc agg gac aac agt cag ttc tgc ttg caa agg atc cac cag ggt 288
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ctg att ttt tat gag aag ctg cta gga tcg gat att ttc aca ggg gag 336
Leu Ile Phe Tyr Glu Lys Leu Leu Gly Ser Asp Ile Phe Thr Gly Glu
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cct tct ctg ctc cct gat agc cct gtg ggc cag ctt cat gcc tcc cta 384
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ctg ggc ctc agc caa ctc ctg cag cct gag ggt cac cac tgg gag act 432
Leu Gly Leu Ser Gln Leu Leu Gln Pro G1u G1y His His Trp G1u Thr
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ctc cgc ttc aaa atc ctt cgc agc ctc cag gcc ttt gtg gct gta gcc 528
Leu Arg Phe Lys Ile Leu Arg Ser Leu Gln Ala Phe Val Ala Val Ala
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gcc cgg gtc ttt gcc cat gga gca gca acc ctg agt ccc taa 570
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<212>DNA
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gca gag aga gtc aga ggg gac aac aag gag tat gag tac tca gtg gag 570
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Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp
245 250 255
gag tac cct gac acc tgg agt act cca cat tcc tac ttc tcc ctg aca 816
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260 265 270
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gtc ttc acg gac aag acc tca gcc acg gtc atc tgc cgc aaa aat gcc 912
Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala
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agc att agc gtg cgg gcc cag gac cgc tac tat agc tca tct tgg agc 960
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325
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<212>DNA
<213>Mouse
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Met Leu Asp Cys Arg Ala Val Ile Met Leu Trp Leu Leu Pro Trp Val
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Thr Gln Gly Leu Ala Val Pro Arg Ser Ser Ser Pro Asp Trp Ala Gln
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Cys Gln Gln Leu Ser Arg Asn Leu Cys Met Leu Ala Trp Asn Ala His
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act aaa aat aat gtg ccc cgt atc cag tgt gaa gat ggt tgt gac cca 240
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Gly Leu Ala Phe Tyr Lys His Leu Leu Asp Ser Asp Ile Phe Lys Gly
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115 120 125
cta cta gga ctc agc caa ctc ctc cag cca gag gat cac ccc cgg gag 432
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195
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<211>1008
<212>DNA
<213>Mouse
<400>4
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Met Cys Pro Gln Lys Leu Thr Ile Ser Trp Phe Ala Ile Val Leu Leu
5 10 15
gtg tct cca ctc atg gcc atg tgg gag ctg gag aaa gac gtt tat gtt 96
Val Ser Pro Leu Met Ala Met Trp Glu Leu Glu Lys Asp Val Tyr Val
20 25 30
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35 40 45
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85 90 95
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Cys Lys Gly Gly Asn Val Cys Val Gln Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Asn
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tcc tca tgc agc aag tgg gca tgt gtt ccc tgc agg gtc cga tcc tag 1008
Ser Ser Cys Ser Lys Trp Ala Cys Val Pro Cys Arg Val Arg Ser Sto
325 330 335
Claims (9)
1.一种含白细胞介素23基因的抗肿瘤剂，其特征是以白细胞介素23(IL-23)基因为有效成分。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤剂，其特征为所述白细胞介素23基因是利用病毒或者非病毒载体表达的。
3.根据权利要求1和2所述的抗肿瘤剂，其特征是可直接向肿瘤内注射的剂型。
4.一种抗肿瘤剂，其特征是以表达IL-23基因的细胞作为有效成分。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤剂，其特征是所述细胞是丧失***能力的肿瘤细胞。
6.根据权利要求4所述的抗肿瘤剂，其特征是所述细胞是与靶肿瘤相同的肿瘤细胞。
7.根据权利要求4所述的抗肿瘤剂，其特征是所述细胞是免疫细胞。
8.权利要求1-7所述的抗肿瘤剂在制备激活抗肿瘤免疫应答制剂中的用途。
9.权利要求1-8所述的抗肿瘤剂，其特征是以与IL-23基因具有相同活性的IL-23基因突变体为活性成分。
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