CN1673347A - 一种腐霉属菌种及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种腐霉属菌种(Pyghiumguiyangense Su)及其用途，该菌形成的菌落在KPYG培养基上呈放射状与玫瑰花状的混合型，有大量气生菌丝；菌丝无隔分支，较细，孢子囊为球形、卵形或梨形，顶生，顶端有一乳突，泡囊形成于乳突顶端；每个孢子囊可产生8～24或更多的游动孢子，游动孢子双鞭毛、肾形；有孢子囊层出现象，孢子囊有时直接萌发产生芽管；卵孢子为球形、平滑、满器或几乎满器，有一个藏卵器内产两个卵孢子的现象，这两个卵孢子的发育可以不同步。该菌对自然环境条件的适应范围广，容易培养和保存，灭蚊效果好，不污染环境，不破坏生态平衡。
Description
技术领域
本发明涉及腐霉属菌种(Pythium guiyangense Su)及其在灭蚊方面的用途。
背景技术
农业害虫每年给人类的农业、林业生产带来严重的损失。卫生害虫不但骚扰人群，而且可以传播疾病，威胁人类健康。由于化学农药的发明，人们从虫口里夺回了粮食，也控制了媒介昆虫的数量，减少了虫媒传染病的流行。
然而长期大量使用化学杀虫剂带来了严重问题。1)环境污染：由于化学农药多数不溶于水，进入动、植物体内不易排除，越是高等的动物，农药成分越容易在体内富集(积累到很高的浓度)，对身体造成危害。农药中的重金属残留在土壤中，造成土地变质，农业减产；农产品残毒含量高，出口受阻；2)生态平衡被破坏：经过长期进化和相互适应，自然界各种生物的相对数量达到动态平衡。使用化学农药，把害虫和益虫全杀死，使自然界控制害虫的天敌大大减少，害虫数量反弹，造成更大的危害；3)害虫产生抗药性：昆虫基因有很强的突变能力。在化学农药的诱导下，昆虫很快就产生抵抗农药毒性的能力，使农药施用的剂量越来越大，甚至农药完全失效。一般来说，一种新农药使用2年，害虫就产生明显抗药性。而开发新的化学杀虫剂要花大量资金和时间(把统计，约1亿美元和10年时间开发一种新农药)。
生物防治是采用害虫天敌或可对害虫致病的微生物来控制或杀灭害虫。它有对害虫高度特异性，对非靶生物无毒无害，不污染环境，不破坏生态平衡，不易诱导害虫的抗药性的优点，所以，是很理想的害虫防治方法。无论国际国内，农业害虫的生物防治较之医学昆虫的生物防治要发达很多。医学昆虫的生物防治是薄弱环节。到目前为止，市场上尚没有灭蚊真菌的商品。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种新的腐霉属菌种-贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)。
本发明的另一目的在于提供该腐霉属菌种在灭蚊方面的用途。
一种腐霉属菌种，其形态特征：菌落在KPYG培养基上呈放射状与玫瑰花状的混合型，有大量气生菌丝；菌丝无隔分支，较细，孢子囊为球形、卵形或梨形，顶生，顶端有一乳突，泡囊形成于乳突顶端；每个孢子囊可产生8～24或更多的游动孢子，游动孢子双鞭毛、肾形；有孢子囊层出现象，孢子囊有时直接萌发产生芽管；卵孢子为球形、平滑、满器或几乎满器，有一个藏卵器内产两个卵孢子的现象，这两个卵孢子的发育可以不同步。该菌种已于2005年3月7日提交中国典型培养物保藏中心(地址：武汉大学)保藏。
(一)贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)的分离步骤：
(1)取贵医花园土壤1000克，加自来水10升，置塑料水桶中浸泡，加1000只白纹伊蚊卵于水中；
(2)约一周以后，卵孵化成幼虫，并发育至三龄，幼虫大量死亡悬浮于水面下，取死幼虫，用75％酒精体表消毒，无菌蒸馏水清洗3次，然后置于KPYG2(成分见后)琼脂培养基上，每平板中央放1只死幼虫，将接种后的平板置25℃培养；
(3)2～3天后有大量菌丝从幼虫体内长出，菌落在KPYG培养基上呈放射状与玫瑰花状的混合型。有大量气生菌丝；菌丝无隔分支，较细；孢子囊为球形、卵形或梨形，顶生，卵形和梨形的孢子囊，顶端有一乳突，泡囊形成于乳突顶端；每个孢子囊可产生8～24或更多的游动孢子，游动孢子双鞭毛、肾形；有孢子囊层出现象，孢子囊有时直接萌发产生芽管；卵孢子为球形、平滑、满器或几乎满器，有一个藏卵器内产两个卵孢子的现象，这两个卵孢子的发育可以不同步；
(4)无菌条件下，切取带菌丝的琼脂块转种至新KPYG2或SFE琼脂培养基上；
(5)反复从平板上切取纯的菌丝转种，最后就得到纯化的贵阳腐霉。
(二)培养贵阳腐霉采用的琼脂培养基：
KPYG2琼脂培养基：将1.5克蛋白胨、1.5克酵母粉、3.0克葡萄糖、0.025克胆固醇、0.11克无水氯化钙、1.0克玉米油加入水中，加水至1000毫升。
SFE(葵花籽培养基)：生葵花籽100克加水1000毫升，粉碎，6层纱布过滤，滤液再加水至2000毫升；分装冷冻于-20℃。用时，取出解冻，加水一倍即可
以上为液体培养基。固体培养基需按1.5％加琼脂。高温高压消毒后倒在培养皿中，冷却即可。
(三)菌种的保种和传代：
保种用的培养基为KPYG2或SFE两种培养基中的一种。
保存方法有3种：
(1)每周一次，从已长满的平板上切取一块带菌丝的琼脂培养基块转种到新的平板上。
(2)用15×200mm的试管，盛琼脂培养基5ml，做成斜面，接种真菌，25℃培养2～3天，倒10ml左右灭菌石蜡油覆盖其上，置25℃保存。3个月转种一次。
(3)水保存法。用10×100mm带盖试管，加蒸馏水3ml，亚麻籽3粒，高温消毒，冷却，无菌条件下取2带菌丝的琼脂块(约50mm2)加于其中，加盖，置25℃，半年转种一次。
(四)菌种的生态特征：
菌落在KPYG培养基上呈放射状与玫瑰花状的混合型。有大量气生菌丝；菌丝无隔分支，较细；孢子囊为球形、卵形或梨形，顶生，卵形和梨形的孢子囊，顶端有一乳突，泡囊形成于乳突顶端；每个孢子囊可产生8～24或更多的游动孢子，游动孢子双鞭毛、肾形；有孢子囊层出现象，孢子囊有时直接萌发产生芽管；卵孢子为球形、平滑、满器或几乎满器，有一个藏卵器内产两个卵孢子的现象，这两个卵孢子的发育可以不同步。
(五)菌种的培养特性
(1)培养温度5℃～35℃，最适温度25℃～27℃；
(2)培养pH5～12；最佳范围为9～11。
对照腐霉属的特征(《中国真菌志)》第55页)，本真菌按形态结构应该属于腐霉属。由于其综合特征与已经描述的腐霉属真菌有明显的不同，因此应该是尚未认识的新种，特根据首先发现的地名命名为贵阳腐霉(Pythiumguiyangense Su)。
本发明的贵阳腐霉对对温度、pH等自然环境条件的适应范围广，对不良环境的耐受力强，容易培养和保存及工业化生产，生产成本低，灭蚊效果好，经多种动、植物测试证实其无毒无害，对非靶生物是安全的。不污染环境，不破坏生态平衡。
具体实施方式
本发明的腐霉属菌种贵阳腐霉(Pythium guiyangense Su)的分离方法：
(1)取贵医花园土壤1000克，加自来水10升，置塑料水桶中浸泡，加1000只白纹伊蚊卵于水中；
(2)约一周以后，卵孵化成幼虫，并发育至三龄，幼虫大量死亡悬浮于水面下，取死幼虫，用75％酒精体表消毒，无菌蒸馏水清洗3次，然后置于KPYG2琼脂培养基上，每平板中央放1只死幼虫，将接种后的平板置25℃培养；
(3)2～3天后有大量菌丝从幼虫体内长出，菌落在KPYG培养基上呈放射状与玫瑰花状的混合型。有大量气生菌丝；菌丝无隔分支，较细；孢子囊为球形、卵形或梨形，顶生，卵形和梨形的孢子囊，顶端有一乳突，泡囊形成于乳突顶端；每个孢子囊可产生8～24或更多的游动孢子，游动孢子双鞭毛、肾形；有孢子囊层出现象，孢子囊有时直接萌发产生芽管；卵孢子为球形、平滑、满器或几乎满器，有一个藏卵器内产两个卵孢子的现象，这两个卵孢子的发育可以不同步；
(4)无菌条件下，切取带菌丝的琼脂块转种至新SFE琼脂培养基上；
(5)反复从平板上切取纯的菌丝转种，最后就得到纯化的贵阳腐霉。
取在SFE琼脂培养基上生长6天的贵阳腐霉，用打孔器(为了保证琼脂块的面积规范)取带菌丝琼脂块，每块面积约200mm2，取容积为200ml的白色塑料杯，每杯盛自来水100ml，加琼脂块2块，2～3龄蚊幼虫25只，4％兔肝粉悬液3滴。每一实验组设3～4杯，并设对照组(3～4杯)。对照组的杯中所加之物，除没有真菌外，其余与实验组同。
实验温度16～25℃。每天观察2次，取出死亡蚊幼虫，显微镜下观察有无菌丝从体内长出。有菌丝者为被感染。记录死亡数及感染数，计算死亡率和感染率。相关数据见表1-6。
表1 不同培养基上的贵阳腐霉培养物对致倦库蚊幼虫的感染率(％)
| 培养基 | 所测幼虫批数 | 平均 | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| KPYGPYGSFESDAYCMACZAPPDA | 27.0±21.015.0±11.066.0±37.05.0±2.08.0±4.611.0±8.28.0±3.3 | 28.0±5.710.0±4.095.0±2.03.0±2.020.0±8.67.0±3.814.0±7.7 | 16.0±5.79.0±5.083.0±21.02.0±2.32.0±2.34.0±3.34.0±3.3 | 23.7±13.0a11.3±7.2b81.3±25.5c3.3±2.3d10.0±9.4bd7.3±5.9bd8.7±6.3bd |
注：带有相同字母的数据间无显著性差异，检验水准α＝0.05。
表2 含不同碳源的培养基上的贵阳腐霉培养物对致倦库蚊幼虫的感染率(％)
| 碳源 | 所测幼虫批次 | 平均 | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| 葡萄糖果糖乳糖蔗糖麦芽糖甘露醇可溶性淀粉缺碳 | 12.0±5.717.0±11.915.0±6.014.0±5.214.0±9.512.0±3.38.0±5.713.0±3.8 | 19.0±2.020.0±12.510.0±2.315.0±3.89.0±2.012.0±3.314.0±5.28.0±3.3 | 38.0±9.526.0±15.542.0±26.427.0±6.837.0±20.031.0±6.832.0±8.633±14.4 | 23.0±12.9a21.0±10.9a22.3±20.4a18.7±7.9a20.0±17.2a18.3±10.3a18.0±12.2a18.0±13.8a |
注：带有相同字母的数据间无显著性差异，检验水准α＝0.05。
表3 不同pH值培养基上的贵阳腐霉培养物对致倦库蚊幼虫的感染率(％)
| 培养基pH值 | 所测幼虫批次 | 平均 | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| 56789 | 8.0±3.318.0±7.026.0±10.618.0±15.125.0±11.9 | 4.0±3.37.0±3.818.0±10.628.0±17.325.0±20.0 | 5.0±5.016.±10.316.0±7.313.0±3.816.0±7.3 | 5.7±4.0a13.7±8.4ab20.0±9.8bc19.7±13.8bc22.0±13.5bc |
| 101112 | 29.0±7.635.0±6.87.0±3.8 | 33.0±13.645.0±10.09.0±5.3 | 21.0±9.522.0±14.53.0±3.8 | 27.7±10.8c34.0±14.0c6.3±4.7a |
注：带有相同字母的数据间无显著性差异，检验水准α＝0.05。
表4 不同光照条件下贵阳腐霉培养物对致倦库蚊幼虫的感染(％)
| 光照周期 | 所测幼虫批次 | 平均 | ||
| 1 | 2 | 3 | ||
| 自然光连续光照连续黑暗紫外线 | 19.0±8.224.0±11.824.0±8.64.0±3.3 | 15.0±6.814.0±5.222.0±8.33.0±2.0 | 18.5±10.012.0±7.320.0±7.36.0±4.0 | 17.5±7.9a16.7±9.5a22.0±7.5a4.3±3.2b |
注：带有相同字母的数据间无显著性差异，检验水准α＝0.05。
表5 所采集的蚊幼虫分类鉴定情况及被贵阳腐霉感染情况(已鉴定到种的部分蚊虫)
| 鉴定结果 | 生物测定幼虫总数 | 受感染幼虫总数 | 感染率(％) |
| 台湾伊蚊 | 6 | 3 | 50.0 |
| 新雪伊蚊 | 19 | 1 | 5.2 |
| 天平库蚊 | 10 | 3 | 30.0 |
| 棘刺伊蚊 | 213 | 61 | 28.6 |
| 三带喙库蚊 | 25 | 18 | 72.0 |
| 希氏库蚊 | 25 | 7 | 28.0 |
| 小斑翅库蚊 | 105 | 27 | 25.7 |
表6 所采集的蚊幼虫分类鉴定情况及被贵阳腐霉感染情况(未能鉴定到种的部分)
| 鉴定结果 | 生物测定幼虫总数 | 受感染幼虫总数 | 感染率(％) |
| 簇角蚊亚属 | 25 | 9 | 36.0 |
| 阿蚊属 | 50 | 5 | 10.0 |
| 塞蚊亚属 | 15 | 5 | 33.3 |
| 按蚊 | 103 | 23 | 22.3 |
结论：已观察的七种天然或人工培养基(KPYG2、PYG、SFE、SDAY、CMA、CAP、PDA)都可以培养。其中按菌丝生长率和真菌对蚊虫的毒力综合考虑，SFE是最佳培养基；光照周期对真菌的生长和灭蚊能力没有明显影响，但紫外光对菌丝生长和游动孢子有抑制作用。菌丝生长对碳源要求不严格，在葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇及可溶性淀粉分别作为碳源的情况下，菌丝生长速度，产孢量和灭蚊能力没有显著差异；在七种氮源中：即蛋白胨、酵母浸膏、硝酸钠、硝酸钾、硫酸铵、磷酸二氢铵及尿素，用有机氮做氮源时，菌丝生长速度，产孢量和灭蚊能力明显优于无机氮做氮源的培养基。
用SFE培养基取得了较好的灭蚊效果，并且是针对库蚊，特别是对三带喙库蚊(流行性乙型脑炎的传播媒介)的杀灭效果好。用KPYG2培养基的灭蚊率比较低。
Claims (4)
1、一种腐霉属菌种(Pythium guiyangense Su)，其特征在于：菌落在KPYG培养基上呈放射状与玫瑰花状的混合型。有大量气生菌丝；菌丝无隔分支，较细，孢子囊为球形、卵形或梨形，顶生，顶端有一乳突，泡囊形成于乳突顶端；每个孢子囊可产生8～24或更多的游动孢子，游动孢子双鞭毛、肾形；有孢子囊层出现象，孢子囊有时直接萌发产生芽管；卵孢子为球形、平滑、满器或几乎满器，有一个藏卵器内产两个卵孢子的现象，这两个卵孢子的发育可以不同步。
2、如权利要求1所述的腐霉属菌种(Pythium guiyangense Su)，其特征在于：培养温度为5℃～35℃，培养pH5～12。
3、如权利要求1或2所述的腐霉属菌种(Pythium guiyangense Su)，其特征在于：培养温度为25℃～27℃，培养pH为9～11。
4、一种腐霉属菌种(Pythium guiyangense Su)在来灭蚊方面的用途。
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Effective date of registration: 20100802 Address after: 519060 Guangdong province Zhuhai Nanping Science and Technology Industrial Park sunrana industrial building Patentee after: Zhuhai Yingsheng Technology Co., Ltd. Address before: 550004 Department of scientific research, Guiyang Medical University, 4 Beijing Road, Guizhou, Guiyang Patentee before: Guiyang Medical College |
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| ASS | Succession or assignment of patent right |
Owner name: ZHUHAI YINGJIAXING TECHNOLOGY CO., LTD. Free format text: FORMER OWNER: ZHUHAI YINGSHENG TECHNOLOGY CO., LTD. Effective date: 20130219 |
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| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20130219 Address after: 519060 Guangdong province Zhuhai Nanping Science and Technology Industrial Park, Rainbow Road No. 1 Salana building room 105 Patentee after: Zhuhai Fortune Technology Co., Ltd. Address before: 519060 Guangdong province Zhuhai Nanping Science and Technology Industrial Park sunrana industrial building Patentee before: Zhuhai Yingsheng Technology Co., Ltd. |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20070912 Termination date: 20180318 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |