固定化核苷磷酸化酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的应用
技术领域
本发明涉及固定化含核苷磷酸化酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的应用。
背景技术
核苷类化合物是许多重要的抗病毒抗肿瘤核苷药物和其它生化试剂的中间体。其中腺苷可用于合阿糖腺苷和腺苷三磷酸;2,6-二氨基嘌呤核苷DAPR可作为生化试剂用于分子生物学研究;2’-脱氧腺苷dAR是合成2-氯脱氧腺苷的重要中间体;2,6-二氨基嘌脱氧核苷DAPdR为合成2’-脱氧鸟苷的重要中间体。
核苷的制备一般可以由下列方法获得:
a.RNA或DNA水解法
最初获得脱氧或非脱氧核苷的方法是通过水解RNA或DNA等天然物质,得到多种核苷的混合物,然后从中分离出所需的核苷。例如,以小牛胸腺脱氧核糖核酸为原料,经脱氧核糖核酸酶(或磷酸二酯酶)和磷酸酯酶水解后,柱层析分离精制可得2’-脱氧腺苷,2’-脱氧鸟苷,2’-脱氧胞苷和胸苷;以酵母核糖核酸亦可以类似的方法获得四种天然的不脱氧核苷。但这种方法有许多缺点,因为,各种天然生物中含DNA或RNA的量非常有限,而且降解后为多种核苷的混合物,分离提取十分复杂,因此限制了大规模的工业化生产核苷,且所得的核苷仅为天然核苷。
b.发酵法
近年来有很多文献报道了发酵法生产不脱氧的五种天然核苷(腺苷,肌苷,尿苷,胞苷,鸟苷),并已经取得了很大的进展。其中肌苷和鸟苷已经能够实现工业化生产,但是对于腺苷,由于生产菌种存在严重的不稳定,极大的限制了工业中的应用。
c.化学合成法
大多数核苷均可以通过全化学合成来获得,如一些重要的抗艾滋病药物齐多夫定、司他夫定和一些抗肿瘤药物如氟铁龙等。化学合成法需要对碱基和核糖基的活性基团进行保护和去保护;并且存在光学异构体极难从最终产品中完全去除,影响最终收率;工艺过程中亦需要使用大量有毒有害的有机溶剂,对环境污染亦存在危险;某些嘌呤类脱氧核苷如2’-脱氧腺苷和2’-脱氧鸟苷等,还不能用现行的方法进行合成。
d.酶转化法
很多文献报道了利用核苷磷酸化酶或N-脱氧核糖转移酶酶法合成核苷类化合物,详情请见文献1:“Boorganic Chemistry,1999,27:135-154”、文献2:“Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic.1999,6(3):215-222”、文献3:“中国医药工业杂志,1999;30(10):474-478”等。
其中文献:“Biocatalysis and Biotransformation,2002,20(5):347-351”报道了用Escherichia coli BL21做催化剂催化合成2’-脱氧核苷,2’-脱氧腺苷的转化率在45℃下达到了94%,但是所用的尿苷和腺嘌呤的浓度分别为30mM和10mM,而且反应温度也不是很高,不利于底物的溶解,因此得到的目标产物的终浓度较低,亦即工业上的生产能力较低,另外其采用的是游离菌体,不适合于多次重复利用。在另一篇文献“Journal of MolecularCatalysis B:Enzymatic 10(2000)207-213”中也报道了2’-脱氧核苷的合成,用Enterobacter aerogenes做酶源,其中2’-脱氧腺苷能在较高的浓度下得到较高的转化率,但是由于使用游离菌体,存在酶易失活等不利因素。文献“Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic 30(2004)219-227”报道了用聚丙烯酰胺、海藻酸钙、琼脂和琼脂糖作为固定化微生物的载体,可以酶法高转化率合成得到各种嘌呤类核苷,其中聚丙烯酰胺固定化Citrobacteramalonaticus CECT863可以重复利用50次以上,但是因所用底物浓度太低,只有0.15mmol/L的尿苷和0.05mmol/L的腺嘌呤,几乎没有任何实用价值。
本发明需要解决的技术问题是公开一种固定化核苷磷酸酶微生物及其在合成嘌呤核苷中的应用,以克服以上技术存在的缺点。
本发明的构思是这样的:
采用具有高活力核苷磷酸酶微生物的湿菌体,然后用κ-卡拉胶等作为固定化载体,得到固定化菌体,再直接进行酶催化反应,得到目标产物。其原理是利用微生物产生的胞内嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶进行酶催化反应。将易得的核苷转化成目标核苷。
本发明的固定化核苷磷酸酶微生物由核苷磷酸化酶微生物和固定化载体构成,其中,核苷磷酸化酶微生物湿菌体的含量为相对于制备好的固定化颗粒的重量的10~30%;
所说的湿菌体是指将处于对数生长后期的微生物,在10,000r/min的转速下进行离心20min,倾去水份,下层的菌泥即可备用。
所说的核苷磷酸化酶微生物选自大肠杆菌、产气肠杆菌、胡罗卜软腐欧文氏菌、乙酰短杆菌或乳生分枝杆菌等,这些微生物可以购自各菌种保藏机构,或从自然界中按一定的程序得到,优选的微生物为乙酰短杆菌(Brevibacterium acetylium)QD96来自于中国微生物菌种保藏管理中心,保藏号为:CGMCC No.0472;
所用的固定化载体选自海藻酸钙、卡拉胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇或胶原蛋白等中的一种或一种以上,优选卡拉胶或聚丙烯酰胺,其中以卡拉胶效果最佳;
本发明的固定化核苷磷酸化酶微生物的制备方法非常简单,如采用卡拉胶,可采用包埋法,包括如下步骤:
将卡拉胶加入水,沸水浴中搅匀溶胀后,于40℃-45℃保温备用;
离心收集处于对数生长期后期的核苷磷酸化酶微生物湿菌体,加入等量的生理盐水混匀后,升温至40℃-45℃,然后与上述卡拉胶载体的备用液混合;搅拌均匀后,倒入盘中,铺成2-4mm的膜,再置于4℃冰箱冷却2h,之后切成2-4mm的小颗粒,浸泡于3%的KCl溶液2小时,再用3%的KCl洗两次,再浸泡于1%的戊二醛溶液1小时,用pH7.0、50mmol/L的磷酸盐缓冲液洗涤三次,沥去水份(以上操作均在10℃以下进行),然后密封储存于4℃冰箱中备用;
如采用聚丙烯酰胺,包括如下的步骤:
在29ml生理盐水中溶入4.5g丙稀酰胺和0.5g甲叉双丙稀酰胺,然后加入10g湿菌体,搅匀,再加入5%的β-二甲氨基丙睛和2.5%的K2S2O8各3ml,从而形成聚丙稀酰胺凝胶。用刀具将凝胶切成3mm的颗粒,用1%戊二醛浸泡30min,再用pH7.0、50mmol/L的磷酸钾缓冲液洗两次,沥去水份(以上操作均在10℃以下进行),然后密封储存于4℃冰箱中备用。
采用上述方法制备的固定化核苷磷酸酶微生物,可用于制备核苷类化合物,如腺苷、2,6-二氨基嘌呤核苷、2’-脱氧腺苷、2,6-二氨基嘌脱氧核苷。
采用所述及的固定化核苷磷酸化酶微生物制备核苷类化合物的方法包括如下步骤:
将上述固定化核苷磷酸化酶微生物与核糖供体和核糖受体在磷酸钾缓冲液中进行进行酶催化反应,pH为6.5~7.5,反应温度为45~55℃,反应时间为1~3h,10mL的反应液中含30~50mmol/L的核糖供体,30~50mmol/L的核糖受体,上述反应体系中,固定化核苷磷酸酶微生物的用量相当于0.5g湿菌体,磷酸钾缓冲液的用量为40~60mmol/L,然后从反应产物中收集核苷类化合物。
所说的核糖受体选自腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤或次黄嘌呤;
所说的核糖供体选自为肌苷、尿苷、胞苷、5-甲基尿苷、胸苷、脱氧尿苷或脱氧胞苷等。
本发明所述的固定化核苷磷酸酶微生物,可以得到较高的转化率和较好的酶稳定性。应用以上固定化方法固定的乙酰短杆菌QD96,其酶反应的转化率与游离乙酰短杆菌的相差不大。在底物浓度为40mmol/L,温度为50℃,pH7的磷酸钾缓冲液50mmol/L时,其转化率都能够达到60%以上。
固定化菌体反应达到平衡所需的时间需要两小时(游离菌体为1h),这可能存在传质障碍所致,但这并不影响其应用。固定化的乙酰短杆菌重复利用次数明显高于游离菌体,也即其酶稳定性明显得到改善。游离的乙酰短杆菌在重复利用3次后,其胞内的核苷磷酸化酶已基本失活,而且即使在上述3次重复利用过程中,每一次都比上一次的转化率降低,因此游离的乙酰短杆菌并不适合于多次重复利用。固定化的乙酰短杆菌基本上可以重复利用20次左右,而且每两次之间酶反应转化率降低较少。因此,这有利于节省培养乙酰短杆菌所需的成本。
所说的转化率是通过HPLC法测定。方法如下:
岛津液相色谱仪;柱YWG-C18(200mm×4.6mm);流动相:5%乙腈+50mmol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液;流速:1.0ml/min;波长:254nm。
附图说明
图1为卡拉胶固定化菌体合成2’-脱氧腺苷的重复反应曲线。
图2为聚丙烯酰胺固定化菌体合成2’-脱氧腺苷的重复反应曲线。
图3为应用固定化菌体合成DAPdR反应曲线。
图4为固定化细胞合成DAPR反应曲线。
图5为固定化细胞合成腺苷反应曲线。
具体实施方式
实施例1
将1.2g卡拉胶加入28.8mL去离子水中,再在沸水浴中溶胀,然后置于40℃水浴中保温。取10g乙酰短杆菌湿菌体,加入10mL生理盐水搅匀,然后在40℃水浴中加热升温,待温度达到40℃后,立即与上述卡拉胶保温液混合,搅匀。倒入盘中,铺成2-4mm的膜,放置于4℃冰箱中凝固2h,再切成3mm的颗粒,将这些颗粒在3%的KCl溶液中浸泡2h后,再用3%的KCl洗两次,再浸泡于1%的戊二醛溶液1小时,用pH7.0、50mM的磷酸盐缓冲液洗涤三次,沥去水份(以上操作均在10℃以下进行),固定好的菌体可以在4℃冰箱中保存备用。
取2.5g固定化的菌体(相当于0.5g湿菌体)进行酶催化反应,反应在下述条件下进行:10mL的反应液中含40mmol/L的胸苷(Thymidine)、40mmol/L的腺嘌呤和pH7.0的磷酸钾缓冲液50mmol/L,反应温度为50℃,时间为2h。反应完后用纱布过滤收集固定化菌体,再用上述磷酸钾缓冲液洗两次,然后重复上述反应。反应结束后于10000r/min离心出菌体,结果见图1。图中,曲线a为固定化细胞,曲线b为游离菌体。
实施例2
在29ml生理盐水中溶入4.5g丙稀酰胺和0.5g甲叉双丙稀酰胺,然后加入10g湿菌体,搅匀,再加入5%的β-二甲氨基丙睛和2.5%的K2S2O8各3ml,从而形成聚丙稀酰胺凝胶。用刀具将凝胶切成3mm的颗粒,用1%戊二醛浸泡30min,再用pH7.0的磷酸钾缓冲液洗两次,沥去水份(以上操作均在10℃以下进行),固定化好的固定化菌体可储存于4℃冰箱中备用。
取固定化菌体2.5g,按实施例1所述的方法进行反应。结果见图2。
实施例3
取实施例1和实施例2所制备的固定化细胞各2.5g,按下述反应配方进行反应:10mL的反应液中含40mmol/L的胸苷(Thymidine)、40mmol/L的2,6-二氨基嘌呤和pH7.0、50mmol/L的磷酸钾缓冲液,反应温度为50℃,时间为2h。反应完后用纱布过滤收集固定化菌体,再用上述磷酸钾缓冲液洗两次,然后重复上述反应。每次反应结束后,都取样测定生成的2,6-二氨基嘌呤脱氧核苷(DAPdR)。另取湿菌体0.5g,按同样反应,但是反应时间为1h,反应结束后于10000r/min离心出菌体,重复反应。结果见图3。
图中:曲线1为卡拉胶,曲线2为聚丙稀酰胺,曲线3为游离菌体。
实施例4
同实施例3,但是将胸苷换成肌苷。结果同图4。图中,曲线4为卡拉胶,曲线5为聚丙稀酰胺,曲线6为游离菌体。
实施例5
同实施例3,但将胸苷和2,6-二氨基嘌呤分别换成肌苷和腺嘌呤。结果如图5。图中,曲线7为卡拉胶,曲线8为聚丙稀酰胺,曲线9为游离菌体。