CN1660893A - 一种人心肌肌钙蛋白i合成肽段s28－42及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可用于人心肌损伤检测的合成肽段S28－42及其用途。该肽段具有强的免疫原性和免疫反应性，可代替人心肌肌钙蛋白I(cTnI)免疫各种脊椎动物产生高效价、高特异性的抗cTnI的抗体，用该肽S28－42免疫制备的抗体可检测到cTnI降解后残留在血清中相似的肽段，可用于制备人心肌损伤检测试剂盒。

Description

一种人心肌肌钙蛋白I合成肽段S28-42及其用途
技术领域
本发明涉及一种可用于产生和筛选针对人心肌肌钙蛋白I某一特殊抗原决定簇抗原表位的高效抗血清和高度特异性单克隆抗体的多肽，以及该多肽的应用。
背景技术
心肌缺血性损伤，特别是急性心肌梗塞(AMI)是威胁人类生命的主要疾病之一，人们一直在努力寻找对AMI诊断特异性好、灵敏度高的指标。随着对心肌标志物的深入研究，生化标志物已从早先的天冬氨酸转氨酶(AST)、血清乳酸脱氢酶(LD)及同工酶、肌酸激酶(CK)及同工酶发展到目前的多种早期标志物(如肌红蛋白等)和特异性标志物(心肌肌钙蛋白)，诊断的敏感性、特异性更趋增强。
心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌仅有的的特异抗原，作为心肌细胞损伤的标志，在血循环中的高度特异性和和敏感性，越未越受到人们的关注。1994～1995年cTnT、cTnI分别被美国FDA批准用于临床AMI诊断。cTnI已用于急诊室对胸痛的鉴别诊断，它的释放形式与CK-MB(胸痛4～6小时)相似，但cTnI水平升高持续时间(6～10天)比CK-MB明显要长，特别是那些在出现AMI症状后没有立即就诊的病人更为有用。
cTnI为一具有209个氨基酸的多肽，相对分子量为24000，预测的pI约为10。两种骨骼肌肌钙蛋白(ssTnI和fsTnI)的分子量约为20KD。利用计算机程序对cTnI蛋白质二级结构进行预测的结果显示，cTnI是一种含5个a螺旋的蛋白质。结合抗原表位实验结果，可以推测cTnI不是球蛋白，其蛋白质肽链可能采取一种更为伸展的构想，这种结构的蛋白质分子，其大部分序列都具有抗原性，可以被免疫***识别。cTnI全蛋白的免疫原性很弱，增加了利用cTnI蛋白制备多克隆和单克隆抗体的难度，而且利用全蛋白制备的单克隆抗体可以是针对很多表位的。cTnI本身生化性质的复杂性和在患者外周血的存在形式，使得cTnI检测试剂的测定值之间存在着差异，不同的cTnI分析方法对同一份标本的检测值最大可相差20余倍。美国临床病理学会(CAP)在1997年对检测cTnI的Access、OpusPlus和Stratus三个***进行调查，结果发现平均cTnI浓度由于使用的分析***差异而有实质性的不同。Access的测定值最低，有些甚至比OpusPlus结果低20倍。造成对同一份样品测量差异的原因之一是试剂盒中提供的抗体识别不同的决定簇，另一个更重要的因素就是试剂盒中的标准抗原存在很大的差异。Stratus和Opus抗体识别cTnI的N末端部分，而ACCESS的抗体识别cTnI的C末端部分。应用对cTnI的N末端部分和C末端部分特异的单抗，对加有重组cTnI的正常人血清和加有重组cTnI复合物的正常人血清，在37℃分别孵育2、4、6、24和48小时后，进行westerm blot分析的结果表明，cTnI的C末端部分更易被降解。这也可能是造成这三种测定方法之间变异的主要原因之一。美国临床化学学会最近研究分析了10种cTnI标准品，但是它们都不令人满意。这使得各种方法的参考范围、分析干扰、分析变异、诊断窗口期以及诊断和预后的临界值等出现不同程度的差别，给临床应用和评价带来一定困扰。在使用商品cTnI检测试剂盒时，必须研究商品试剂的特性。所以cTnI缺乏测定标准化是一个很重要问题。cTnI蛋白质大部分序列均具有抗原性，其中N末端和C末端的抗原性最强。cTnI与sTnI的氨基酸序列约有40％不同。另外人cTnI氨基末端有32个氨基酸残基为骨骼肌肌钙蛋白(sTnI)所不具有，因此抗原性有较大差异，有利于获得特异性cTnI抗体。
cTnI在血清中很不稳定，易被蛋白酶降解，在AMI病人中90％cTnI以上以cTnI-TnC复合物形式存在，并且N-端和C-端则对蛋白水解酶作用敏感易受蛋白水解酶作用，在体外实验中发现迅速降解。虽然人cTnl氨基末端和竣基末端是最强的抗原表位区，但这个区域对氧化、还原和磷酸化也较为敏感，还易被内源性蛋白水解酶水解，不同的状态具备不同的免疫活性。由于TnC的保护，最稳定区域在28～110氨基酸残基之间，能够识别这段稳定区的抗体可以提高cTnI检测的敏感性和可重复性，有助于提高cTnI检测的标准化。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可提高cTnI检测的敏感性和可重复性的心肌肌钙蛋白的合成肽段。
本发明的另一个目的是筛选针对该肽段的单克隆抗体杂交瘤细胞株，用于制备心肌肌钙蛋白检测试剂盒。
本发明的目的是这样实现的：
1.多肽序列的选择：
利用DNA-Star分析软件对cTnI蛋白序列分析其抗原性、疏水性、柔韧性、表面可及性，又结合cTnI蛋白的生化性质及其在血清中的存在状态，以及人心肌肌钙蛋白I(cTnI)与骨骼肌肌钙蛋白(ssTnI和fsTnI)序列的差异，人心肌肌钙蛋白I与小鼠的心肌肌钙蛋白I序列的差异，我们选择了第28-42AA的一段氨基酸序列，记为SEQ NO.1。序列如下：
AYATEPHAKKKSKIS
2.多肽合成方法：
考虑到多肽的稳定性，本发明在合成时使N-端Ala乙酰化，在C-端Ser后加上一个Cys，记为S28-42。序列如下：
CAYATEPHAKKKSKIS-NH2
该序列具有如下应用：
1)替代人天然心肌肌钙蛋白I作为免疫原，并具有比心肌肌钙蛋白I全抗原更高的免疫原性，有利于针对cTnI抗原决定簇的高效抗血清的产生。
2)有利于针对cTnI抗原决定簇的特异性单克隆抗体细胞株的产生。
3)用于筛选针对cTnI的单克隆抗体细胞株。
4)将多肽S28-42与其他蛋白质进行化学交连或基因工程表达而用作抗原，进行免疫动物以制备抗体以及作为检测cTnI的对照物。
本发明提供的特殊多肽序列S28-42与天然的人心肌肌钙蛋白I的抗原决定簇结构相似，具有强的免疫原性和免疫反应性，用该肽S28-42免疫制备的抗体可检测到cTnI降解后残留在血清中相似的肽段，以该肽段制备的试剂对心肌损伤所释放出的cTnI的检出水平更高、重复性更好，并且该肽段可以代替cTnI蛋白作为抗原，以避免cTnI全蛋白作为免疫原的弱免疫原性。
具体实施方式
1.采用合成肽S28-42和载体蛋白偶联的MBS(间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂)法，由于S28-42与人的骨骼肌肌钙蛋白以及小鼠心肌肌钙蛋白序列的差异，免疫BALB/c小鼠后取得较高的免疫效果。具体方法如下：
1)间-马来酰亚胺苯甲酸-N-羟基琥珀酰亚胺脂(MBS)配制成5mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)，用前一小时内配制。
2)匙孔戚血蓝蛋白(KLH)10mg溶解于1ml去离子水中。
3)1ml KLH溶液放入小试管中，加入溶有2mg MBS的DMF溶液140ul。室温搅拌30min。过G-25柱(PBS，PH7.4)，收集灰色产物。5mg多肽溶于不大于0.5ml的PH7.4的PBS(0.01mol/L)中。二者混合，室温搅拌2小时。4℃透析过夜，分装-20℃保存。用该合成肽S28-42免疫BALB/c小鼠，ELISA检测，得到的小鼠抗血清效价高达106。
2.由于S28-42与人骨骼肌肌钙蛋白序列的差异，用S28-42筛选得到的针对该段序列的单克隆抗体在试剂检测中可以很大程度的避免与骨骼肌肌钙蛋白的交叉反应。
用S28-42筛选得到的针对该段序列的单克隆抗体通过ELISA方法分别对心肌肌钙蛋白I与骨骼肌肌钙蛋白进行检测，交叉反应率小于0.01％。说明由S28-42筛选得到的单克隆抗体可以用于制备心肌肌钙蛋白检测试剂盒，在检测试剂盒的开发中具有应用价值。
3.用S28-42筛选得到的特异性单克隆抗体能够识别病人血清中心肌肌钙蛋白I稳定存在的区段，可以有助于分析病人发病阶段和程度。

Claims (2)

1.一段合成肽序列S28-42，其特征在于选自人心肌肌钙蛋白I的第28-44的氨基酸片断，其氨基酸序列为：CAYATEPHAKKKSKIS-NH2。
2.按权利要求1所述的合成肽段S28-42的应用，其特征在于：用于筛选针对上述肽段序列的单克隆抗体杂交瘤细胞株，并用于制备心肌肌钙蛋白检测试剂盒。
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