CN1649496A - 改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法 - Google Patents

改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1649496A
CN1649496A CNA028234758A CN02823475A CN1649496A CN 1649496 A CN1649496 A CN 1649496A CN A028234758 A CNA028234758 A CN A028234758A CN 02823475 A CN02823475 A CN 02823475A CN 1649496 A CN1649496 A CN 1649496A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ghrh
expression
seqid
nucleic acid
equivalent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA028234758A
Other languages
English (en)
Other versions
CN100417419C (zh
Inventor
R·德拉格伊-埃克里
R·J·施沃茨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baylor College of Medicine
Original Assignee
Baylor College of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baylor College of Medicine filed Critical Baylor College of Medicine
Publication of CN1649496A publication Critical patent/CN1649496A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100417419C publication Critical patent/CN100417419C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/25—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0083—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the administration regime
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及降低个体身体脂肪比例、增加瘦体重(“LBM”)、增加骨密度或改善骨愈合速率或上述全部的方法。总的说来，本发明的实施方案可通过将编码GHRH的异源核酸序列或其功能性生物等价物送递入个体的细胞中，并当修饰的细胞在个体中时使得编码的基因发生表达而实现。例如，当将这种核酸序列送递入个体的特定细胞中时，可获得组织特异性组成型表达。此外，GHRH或其功能性生物等价物基因的外部调节可利用诱导型启动子来实现，该诱导型启动子是由给予个体的分子开关分子调节的。送递GHRH或其功能性生物等价物的组成型或诱导型核酸编码序列的优选方法为直接用体内电穿孔方法送递入个体的细胞中。个体身体脂肪比例的降低和瘦体重(“LBM”)的增加或上述两者是通过将如在此处所述的GHRH或其功能性生物等价物作为重组蛋白质送递入个体中而实现的。此外，也实现了骨密度的增加和骨愈合速率的改善。

Description

改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法
相关申请
[0001]本申请要求于2001年10月25日提交的名为“增加体重、降低身体脂肪比例、增加骨密度和改善骨愈合速率”的美国临时专利申请第60/357,808的优先权，将其全部内容在此处引入作为参考。
背景
[0002]本发明涉及质粒介导的基因补充的组合物和方法。本发明涉及在动物个体中降低身体脂肪比例和增加瘦体重(“LBM”)的方法。总的说来，本发明的实施方案可通过将编码GHRH或其功能性生物等价物的核酸表达构建体送递入个体的组织中，并使得编码的基因在个体中表达而实现。例如，当将这种核酸序列送递入个体的特定细胞中时，可获得组织特异性的组成型表达。此外，GHRH或其功能性生物等价物基因的外部调节可利用诱导型启动子来实现，该诱导型启动子是由给予个体的分子开关分子调节的。送递GHRH或其功能性生物等价物的组成型或诱导型核酸编码序列的优选方法为直接用体内电穿孔方法送递入个体的细胞中。此外，本发明也涉及在动物个体中增加骨密度和改善骨愈合速率的方法。更特定地，本发明涉及体内和离体方法，该方法用于将编码生长激素释放激素“GHRH”或其功能性生物等价物的异源核酸序列送递入个体的细胞中，并当修饰的细胞在个体中时使得编码的基因发生表达。本发明的另一个实施方案涉及用分子开关(如米非司酮(mifepistone)调节GHRH的表达。
[0003] 生长激素(“GH”)和免疫功能：生长激素(“GH”)在控制人和其它脊椎动物的躯体生长中的中心作用和调节GH从垂体分泌的生理学相关途径是众所周知的。GH产生途径包含一系列相互依赖的基因，其产物是正常生长所必需的。GH途径基因包括：(1)配体，如GH和***-I(“IGF-I”)；(2)转录因子如pit 1的前体(prophet)，或prop 1，和pit 1；(3)激动剂和拮抗剂，分别如生长激素释放激素(“GHRH”)和促生长素抑制素(“SS”)；和(4)受体，如GHEH受体(“GHRH-R”)和GH受体(“GH-R”)。这些基因在不同器官和组织中表达，包括下丘脑、垂体、肝和骨。GH途径有效和有调节的表达对于最适的线性生长以及糖类、蛋白质和脂肪代谢的稳态是重要的。GH从垂体前叶的合成和分泌由GHRH刺激而由促生长素抑制素抑制，两者均为下丘脑激素。GH主要在肝中及在其它目标器官中增加了IGF-I的产生。IGF-I和GH反过来对下丘脑和垂体进行反馈以抑制GHRH和GH释放。GH对外周组织引起了直接和间接的作用，其间接作用主要是由IGF-I介导的。
[0004]儿童中GH缺乏的主要特征是身材矮小。GH轴上不同点的遗传缺陷可产生相似的表型，以及非-GH-缺乏性身材矮小。非-GH-缺乏具有不同的病因学，如：(1)遗传疾病、先天性卵巢发育不全、季肋发育不全；和(2)慢性肾机能不全。GH轴未受影响的病例(即患者具有正常的激素、基因和受体)占生长迟缓总病例的超过50％。在这些病例中，GHRH和GH治疗已显示是有效的(Gesundheit和Alexander，1995)。
[0005]垂体前叶减少的GH分泌导致25岁到老的衰老期间骨骼肌重量的丧失。GHRH-GH-IGF-I轴随衰老发生巨大的变化，且在老年人中有降低的GH生产率和GH半衰期，对GH和GHRH刺激降低的IGF-I反应导致骨骼肌重量的丧失(sarcopenia)、骨质疏松症和脂肪增加及瘦体重的降低。以前的研究已显示在老年人中，GH分泌的水平比十几岁的水平显著减少了70-80％。已经证明sarcopenia的发展可由外源的GH治疗来弥补。然而，由于其成本和频繁的副作用，这仍然是有争议的治疗。
[0006]重组蛋白质的生产使得有了治疗这些状况的有用工具。尽管GH替代治疗广泛应用于生长不足的患者中并提供了满意的生长，且可对治疗的儿童具有积极的心理作用，但该治疗具有几个缺点，包括不切实际的需要频繁给予GH和不利的次级作用。
[0007]GH以特殊的脉冲模式释放，该模式对其生物活性是极度重要的(Argente等人，1996)。GH分泌由天然的GH促分泌素GHRH刺激，并由促生长素抑制素(SS)抑制，且两者均为下丘脑激素(Thormer等人，1990)。GH脉冲是GHRH分泌的结果，该GHRH分泌与促生长素抑制素分泌的减少或消退相关。此外，脉冲生成器机制是由GH-负反馈进行时控的。GH分泌的内源节奏可由外源GH给予强加的节奏引起。GH和***(“IGF-I”)途径有效和有调节的表达是最适的线性生长、糖类、蛋白质和脂肪代谢的稳态及对提供正氮平衡是重要的(Murray和Shalet，2000)。人、绵羊或猪中的许多研究显示用重组GHRH蛋白质连续的注入恢复了正常的GH模式，而不使GHRH受体脱敏或耗尽GH供应，这是因为该***能够反馈调节，而该调节在GH治疗中是完全破坏的(Dubreuil等人，1990a；Vance等人，1985b；Vance，1990；Vance等人，1985a)。因而，GHRH重组蛋白质治疗比GH治疗是更加生理相关。然而，由于GHRH在体内短的半衰期，所以频繁的(每日1-3次)静脉内、皮下或鼻内(需要高300-倍的剂量)给予是必需的(Evans等人，2001；Thorner等人，1986)。因而，作为长期治疗，重组GHRH蛋白质给予是不实际的。
[0008]颅外分泌的GHRH如完整肽或截短分子(如在胰岛细胞肿瘤和不同定位的类癌中看到的)通常是生物活性的，且甚至可产生肢端巨大症(Thorner等人，1984)。重组GHRH向GH-缺乏儿童或成年人的给予增加了IGF-I水平，与GHRH剂量成比例增加了GH分泌，且仍然引起对大剂量GHRH的反应(Bercu等人，1997)。因而，GHRH给予代表增加低于正常GH和IGF-I水平的生理选择(Corpas等人，1993)。
[0009]尽管GHRH蛋白质治疗产生并刺激了正常的周期性GH分泌且实际上无副作用，但GHRH在体内短的半衰期需要频繁的(每日1-3次)静脉内、皮下或鼻内(需要高300-倍的剂量)给予。因而，作为长期治疗，GHRH给予是不实际的。颅外分泌的GHRH如加工的蛋白质种类GHRH(1-40)羟基或GHRH(1-44)酰胺或甚至如较短的截短分子是生物活性的(Thorner等人，1984)。已报道血液供应中低水平的GHRH(100pg/ml)可刺激GH分泌(Corpas等人，1993)。直接的质粒DNA基因转移目前是许多出现的治疗策略的基础，从而不需要病毒基因或脂质颗粒(Aihara和Miyazaki，1998；Muramatsu等人，1998)。骨骼肌是目标组织，这是因为肌纤维具有长的寿命且可由环状DNA质粒转导，该质粒可在免疫活性宿主中于数月或数年内表达(Davis等人，1993；Tripathy等人，1996)。以前的报道证明人的GHRH cDNA可由小鼠中的注射型生肌表达载体送递入肌肉中，在肌肉中它可在2个星期的时期内短暂地刺激GH分泌达到模式水平(Draghia-Akli等人，1997)。
[0010]野生型GHRH在人(Frohman等人，1984)和农田动物两者的循环***中均具有相对短的半衰期。在血浆中温育60分钟之后，95％的GHRH(1-44)NH2将降解，该激素的较短(1-40)OH形式在相似条件下温育60分钟后仅显示77％的肽降解(Frohman等人，1989)。编码特定的蛋白酶抗性GHRH类似物的cDNA在治疗性核酸载体中的整合将导致具有较长的血清半衰期、增加的能力的分子并在质粒注射的动物中提供更大的GH释放(Draghia-Akli等人，1999，在此处引入作为参考)。通过对蛋白酶敏感性氨基酸的氨基酸替代进行诱变延长了GHRH分子的血清半衰期。此外，GHRH生物活性的增强可用超活性类似物来实现，该超活性类似物可增加其与特定受体的结合亲和力(Draghia-Akli等人，1999)。
[0011]已报道了为增加生长激素释放而给予新的GHRH类似物蛋白质(美国专利No.5,847,066、5,846,936、5,792,747、5,776,901、5,696,089、5,486,505、5,137,872、5,084,442、5,036,045、5,023,322、4,839,344、4,410,512、RE33,699)或GHRH的合成或天然存在的肽片段(美国专利No.4,833,166、4,228,158、4,228,156、4,226,857、4,224,316、4,223,021、4,223,020、4,223,019)。已报道了含有下面突变的GHRH类似物(美国专利No.5,846,936)：位置1上Tyr到His；位置2上Ala到Val、Leu或其它；位置8上Asn到Gln、Ser或Thr；位置15上Gly到Ala或Leu；位置27上Met到Ile或Leu；和位置28上Ser到Asn。GHRH类似物是美国专利申请序列号09/624,268(“第268号专利申请”)的主题，该申请讲授了含有突变的GHRH类似物的应用，该GHRH类似物可改善引起生长激素释放的能力。此外，第268号专利申请涉及治疗生长不足、改善生长特性、刺激动物中生长激素以比与正常生长相关的更高的水平产生及增强利用给予生长激素释放激素类似物的生长，并在此处引入作为参考。在第268号专利申请的实施方案和其中特定的实施方案中，突变的GHRH-编码分子缺乏位置8上Asn的Gln、Ser或Thr突变。
[0012]美国专利No.5,061,690涉及通过在10-20日中向怀孕的雌性哺乳动物提供有效量的人GHRH或其类似物之一而增加出生体重和乳汁产生。仅在哺乳期应用类似物。然而，提出了多种给予，且没有公开内容涉及将生长激素释放激素(或因子)作为DNA分子给予，如用质粒介导的补充技术。
[0013]美国专利No.5,134,120(“第120号专利”)和5,292,721(“第721号专利”)讲授了通过在妊娠的最后2周到3周的哺乳期中有意地增加猪中的生长激素可导致新生的小猪当在出生后禁食时具有显著增强的维持血浆葡萄糖和自由脂肪酸浓度的能力。此外，第120号和721号专利讲授了在哺乳期中对母猪的治疗导致初乳中增加的乳汁脂肪和增加的乳汁产量。这些作用在增强新生猪的存活力和断奶前的体重获得中是重要的。然而，第120号和721号专利未提供关于以DNA形式给予生长激素释放激素的讲授。
[0014]与蛋白质治疗相反，在一些实施方案中，核酸转移将多核苷酸以可校正天生的或获得的不足和失调的方式送递到躯体组织中。在其它的实施方案中，将载体如质粒用于补充表达的内源基因产物的基本水平。基于基因的药物送递提供了优于给予重组蛋白质的许多优点。这些优点包括天然蛋白质结构的保持、改善的生物活性、避免全身毒性及避免感染和毒性杂质。此外，为了治疗的目的，核酸转移和质粒介导的内源基因产物补充使得能够对治疗范围内蛋白质延长暴露，这是因为新分泌的蛋白质连续地存在于血液循环中。
[0015]应用重组蛋白质的主要局限是每一次给药后有限的蛋白质可用性。应用注射型DNA质粒载体的质粒介导的基因补充克服了该局限，这是因为向患者骨骼肌的单一注射可允许大范围时间段的生理学表达(WO 99/05300和WO 01/06988)。载体的注射促使动物中酶和激素以更接近地模拟天然过程的方式产生。此外，在用于体内基因转移的非病毒技术中，质粒DNA向肌组织的直接注射是简单、便宜且安全的。
[0016]在一个质粒介导的补充表达***中，非病毒核酸载体如质粒除编码补充的GHRH的核酸之外可包含合成的核酸送递***。这样，可避免与应用大多数病毒载体相关的危险。非病毒表达载体产物通常由于应用“物种特异性”成分进行核酸送递而具有低的毒性，这使得通常与病毒载体相关的免疫原性危险最小化。此外，迄今为止尚无质粒序列整合入宿主染色体中的体内报道，从而这类质粒介导的GHRH补充不应该活化癌基因或使肿瘤抑制基因失活。由于附加型***位于染色体外，所以质粒具有明确的药物代谢动力学和消除特征，从而导致目标组织中基因表达的有限持续时间。此外，可对质粒DNA进行加工，从而可将它以线形而不是环形送递入细胞中(这将进一步防止任何基因组整合事件)；可将质粒的抗生素抗性基因和细菌复制起点删除，从而使其对于体内治疗完全安全。
[0017]已通过物理方式包括电穿孔、声波穿孔(sonoporation)和压力进行了增强质粒DNA向细胞送递的努力。通过电穿孔的注射包括应用脉冲电场以在细胞膜中产生瞬时的孔而不导致永久的细胞损坏。因此这可允许外源分子进入(Smith和Nordstrom，2000)。通过调节由电穿孔***产生的电脉冲，核酸分子可穿过在该程序中产生的细胞中的通道或孔。美国专利No.5,704,908描述了将分子在患者体腔内所选位置送递入细胞中的电穿孔设备。这些脉冲电压注射设备也描述于美国专利No.5,439,440和5,702,304和PCT WO 96/12520、96/12006、95/19805和97/07826中。
[0018]最近，应用电穿孔增强体内质粒送递已获得了显著的进展。电穿孔已非常成功地用于在注射质粒后转染肿瘤细胞(Lucas等人，2002；Matsubara等人，2001)或将抗肿瘤药物博来霉素送递入人中的皮肤或皮下肿瘤中(Gehl等人，1998；Heller等人，1996)。电穿孔也已广泛应用于小鼠(Lesbordes等人，2002；Lucas等人，2001；Vilquin等人，2001)、大鼠(Terada等人，2001；Yasui等人，2001)和狗(Fewell等人，2001)中以送递编码各种激素、细胞因子或酶的治疗性基因。我们以前应用生长激素释放激素(“GHRH”)的研究显示利用电穿孔的质粒治疗是可升级的且代表了在大动物和人中诱导蛋白质产生和受控分泌的有希望的方法(Draghia-Akli等人，1999；Draghia-Akli等人，2002)。
[0019]如上所述，电穿孔增强质粒摄入到骨骼肌中的能力已得到了充分的证明。此外，已观察到用聚-L-谷氨酸(“PLG”)或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)制备的质粒可增加质粒的转染和随后所需的转基因的表达。阴离子的聚合物钠PLG可在低的质粒浓度下增强质粒的摄取，而减少由该程序导致的任何可能的组织损害。如上所述，电穿孔增强质粒摄入到骨骼肌中的能力已得到了充分的证明。PLG是稳定的化合物，且对相对高的温度有抗性(Dolnik等人，1993)。以前已将PLG用于增加疫苗制剂中的稳定性(Matsuo等人，1994)而不增加其免疫原性。它也已用作抗原吸入后或暴露于臭氧后的抗毒素(Fryer和Jacoby，1993)。此外，已观察到用PLG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)制备的质粒可在小鼠、大鼠和狗的骨骼肌中将基因的转染和随后基因的表达增加达10倍(Fewell等人，2001；Mumper等人，1998)。PLG已用于增加抗肿瘤药物的稳定性(Li等人，2000)和用作那些伤口的“粘合剂”，或用于在伤口和组织修复过程中防止组织流血(Otani等人，1996；Otani等人，1998)。
[0020]尽管不想受理论限制，PLG将增加电穿孔过程中质粒的转染，这不仅是通过稳定质粒DNA并促进通过细胞膜孔的细胞内转运，而且是通过一种活性的机制。例如，细胞上带正电荷的表面蛋白质将通过蛋白质-蛋白质相互作用与连接到质粒DNA上的带负电荷的PLG形成复合物。当应用电场时，表面蛋白质将颠倒方向并活跃地使DNA分子内化，该过程随后实质地增加转染效率。
[0021]直接注射型DNA质粒载体的应用在过去是有限的。单次直接注射后低效的DNA向肌纤维的摄入导致了相对低的表达水平(Prentice等人，1994；Wells等人，1997)。此外，转基因表达的持续时间短(Wolff等人，1990)。以前最成功的临床应用局限于疫苗(Danko和Wolff，1994；Tsurumi等人，1996)。
[0022]尽管本领域中有涉及用线形DNA对真核细胞进行电穿孔的参考文献(McNally等人，1998；Neumann等人，1982)(Toneguzzo等人，1988)(Aratani等人，1992；Nairn等人，1993；Xie和Tsong，1993；Yorifuji和Mikawa，1990)，但这些例子阐明了向细胞悬浮液、细胞培养物等的转染，且转染的细胞不存在于躯体组织中。
[0023]美国专利No.4,956,288涉及在外源DNA存在时通过对细胞群体进行电穿孔、培养细胞并杀死含低拷贝数目外源DNA的细胞而制备含有高拷贝数目外源DNA的重组宿主细胞的方法。
[0024]美国专利No.5,874,534(“第534号专利”)和美国专利No.5,935,934(“第934号专利”)描述突变的类固醇受体、其应用方法和一种用于核酸转移的分子开关，在此处将每一个专利的全部内容引入作为参考。用于在核酸转移中调节表达的分子开关和在人、动物、转基因动物和植物中应用分子开关(如基因开关)的方法描述于第534号专利和第934号专利中。分子开关描述为调节用于核酸转移的异源核酸盒表达的方法，且由修饰的类固醇受体构成，该受体包括与修饰的配体结合结构域结合的天然类固醇受体DNA结合结构域。修饰的结合结构域通常仅结合非自然的配体、抗激素或非天然的配体。本领域的技术人员易于认识到天然配体不易于与修饰的配体结合结构域结合，且随后即便对包含于核酸盒中的基因调节和/或表达有影响也是非常小的影响。
[0025]因而，本发明涉及一种新方法，该新方法通过质粒介导的GHRH补充在动物中增加瘦体重、降低身体脂肪比例、增加骨密度和/或增加骨愈合速率。
发明概述
[0026]本发明的一个实施方案涉及通过利用核酸序列而在个体中降低身体脂肪比例、增加瘦体重(“LBM”)、增加骨密度和增加骨愈合速率的方法，该核酸序列含有组成型启动子和生长激素释放激素(“GHRH”)或其类似物的编码序列。当将该核酸序列送递入个体的特定细胞中时(如体细胞、干细胞或生殖细胞)，可获得组织特异性的组成型GHRH表达。送递具有组成型启动子和GHRH或其类似物的编码序列的核酸序列的优选方法为直接用体内电穿孔方法送递入个体的细胞中。电穿孔可包括外部提供的电极，或在针的情况下包括内部提供的电极，以在该细胞位于个体组织中时辅助目的核苷酸序列进入个体细胞中。
[0027]本发明的另一个实施方案涉及通过利用调节GHRH或其类似物表达的能力而在个体中降低身体脂肪比例、增加LBM、增加骨密度和增加骨愈合速率的方法。该调节是通过将第一个核酸序列和第二个核酸序列和随后的分子开关送递入个体细胞中而实现的；其中第一个核酸序列含有诱导型启动子与生长激素释放激素(“诱导型-GHRH”)或其类似物，而第二个核酸序列具有组成型启动子与非活性的调节蛋白质的编码区。通过将分子开关分子(如米非司酮(mifepistone疑为mifepristone，译者))送递入个体中，失活的调节蛋白质变为活性的并可在个体中起始诱导型-GHRH的转录。个体中修饰的细胞的GHRH或其类似物表达及随即的释放将以可由外部分子开关分子(如米非司酮)调节的方式在个体中降低身体脂肪比例和增加LBM。使得能够体外调节GHRH或其类似物的核酸序列直接向个体细胞中的送递可通过体内电穿孔方法实现。
[0028]本发明进一步的实施方案涉及通过利用将特定的重组GHRH-类似物蛋白质引入到个体中的治疗而在个体中增加瘦体重、降低身体脂肪比例、增加骨密度、增加骨愈合速率或上述组合的方法。
附图简述
[0029]下面的附图形成了本说明书的一部分，并进一步阐明本发明的某些方面。本发明可通过参考这些附图的一个或多个及在此处提出的特定实施方案的详细说明而得到充分的理解。
[0030]图1显示GHRH或其功能性生物等价物的氨基酸序列。所有突变体序列均是通过对猪的野生型序列进行定点诱变而获得的。
[0031]图2显示用7.5微克pSP-GHRH突变体注射的SCID小鼠的体重。
[0032]图3显示用7.5微克质粒注射的SCID小鼠的身体组成，该质粒表达GHRH突变体之一或作为对照的pSP-β-半乳糖苷酶。
[0033]图4显示用7.5微克质粒注射的SCID小鼠的骨区域，该质粒表达GHRH突变体之一或作为对照的pSP-β-半乳糖苷酶。
[0034]图5显示用7.5微克质粒注射的SCID小鼠的IGF-I水平，该质粒表达GHRH突变体之一或作为对照的pSP-β-半乳糖苷酶。
[0035]图6显示体外原代成肌细胞中米非司酮-依赖性GHRH/基因开关***的示意图。阐明了质粒结构和基因开关***如何工作的示意。质粒p1633编码基因开关调节蛋白质，该蛋白质是酵母GAL4 DNA结合结构域(“GAL4”)、截短的人孕酮受体配体-结合结构域(“hPRLBD”)和来自人NF-κB的p65亚基的活化结构域(“p65”)的嵌合体。该蛋白质以无活性的单体合成的。米非司酮的结合触发了构象变化，该构象变化导致活化和二聚化。活化的同二聚体结合到诱导型启动子的GAL4位点并刺激GHRH基因的转录。
[0036]图7显示体外原代成肌细胞中米非司酮-依赖性GHRH/基因开关***的功能。诱导型GHRH构建体的RNA印迹分析。如以前所述获得原代鸡成肌细胞培养物并用4微克诱导型GHRH(“pGR1774”)和基因开关质粒(“pGS1633”)的10∶1混合物对其进行转染(Bergsma等人，1986；Draghia-Akli等人，1997)。将驱动编码大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶、□βgal构建体的肌特异性合成启动子(Li等人，1999)用作负对照。作为正对照，将细胞用组成型活性的pSP-GHRH构建体进行转染(Draghia-Akli等人，1999)。在图中，Nt＝非转染的细胞；β-gal＝用pSP-β-gal构建体转染的细胞；SP-GHRH＝用组成型活性的GHRH构建体转染的细胞；+MFP＝米非司酮添加入培养基中；及-MFP＝米非司酮不添加入培养基中。包括溴化乙锭凝胶作为加样对照。
[0037]图8显示给予米非司酮在接受了单次GHRH/基因开关质粒给予的SCID小鼠中诱导了血清IGF-I水平。该值表示为相对于对照水平的活化倍数。黑线下的区域代表成年动物中IGF-I水平的正常可变性。表含有诱导峰的p值。p值Cv.A表示用β-gal构建体注射的动物和用IS+MFP注射的动物之间的比较；Cv.B表示用IS加或不加MFP注射的动物之间的比较。
[0038]图9显示在MFP诱导的长149日中的体重增加。在注射的小鼠中随GHRH/基因开关***的长期活化平均体重增加(*p＜0.027)。
[0039]图10显示在MFP诱导的长149日中垂体重量的增加。在+MFP注射的动物中垂体重量/总体重(*p＜0.035)。
[0040]图11显示长期诱导的GHRH/基因开关小鼠中改善的身体组成。身体组成测量是在注射后149日(“PIXImus”)麻醉时或在死后(器官、尸体、身体脂肪、身体的直接解剖)进行的。无骨瘦体重显著增加了(*p＜0.022)。
[0041]图12显示长期诱导的GHRH/基因开关小鼠中改善的脂肪体重/总体重。脂肪体重/总体重测量是在注射后149日(“PIXImus”)麻醉时。或在死后(器官、尸体、身体脂肪、身体的直接解剖)进行的。脂肪体重/总体重在诱导的动物中显著降低了(*p＜0.05)。
[0042]图13显示长期诱导的GHRH/基因开关小鼠中增加的骨区域。骨区域测量是在注射后149日(“PIXImus”)麻醉时或在死后(器官、尸体、身体脂肪、身体的直接解剖)进行的。PIXImus增加了骨区域(*p＜0.0006)。
[0043]图14显示长期诱导的GHRH/基因开关小鼠中增加的矿物含量。骨矿物含量测量是在注射后149日(“PIXImus”)麻醉时或在死后(器官、尸体、身体脂肪、身体的直接解剖)进行的。骨矿物含量在诱导的动物中增加了(*p＜0.002)。
[0044]图15显示注射后0-7日猪分泌型胚胎碱性磷酸酶(“SEAP”)的血浆浓度。将质粒注射入肌肉中后对不同的针型电极与卡钳电极进行了比较。在图中，N6＝6-针阵列电极：21支计量针，在1cm直径的阵列上安放2cm的长度；N3＝3-针阵列设备：2支实心的针，1支中等皮下注射器针头，21支计量针，2cm的长度；及C＝卡钳电极：2个实心的正方形平板电极，1.5cm。也显示了电压和脉冲数目。注射后7日对于N3/200V/6个脉冲和N6/100V/6个脉冲的组p＜0.006，而对于N6/200V/6个脉冲组p＜0.0035。
[0045]图16显示在10日龄用3、1和0.1mg pSP-HV-GHRH或载体注射的猪的体重。最大的体重增加由注射最低剂量的猪实现，且与对照在所有检验的时间点均有显著的统计学差异(p＜0.02)。该值为平均数±s.e.m.。
[0046]图17显示在0、7、14和21日龄用2毫克pSP-HV-GHRH注射的猪的体重。在14日龄注射的动物显示最大的体重增加，且与对照在所有检验的时间点均有显著差异(p＜0.02)。该值为平均数±s.e.m.。
[0047]图18显示用不同量的pSP-HV-GHRH构建体进行直接的肌内注射后的血浆IGF-I浓度。该值为平均数±s.e.m.。
优选实施方案的详述
[0048]本发明的其它目的、特征和优点从下面的详细描述中将变得显而易见。然而，应该理解的是当显示本发明优选的实施方案时，详细的描述和特定的例子仅以阐明的方式给出，这是因为在本发明的精神和范围之内的各种改变和修饰从该详细的描述中将对本领域的技术人员变为显而易见的。
定义
[0049]如在此处用于说明书中的术语“一种”或“一类”可指一个或多个。如在此处用于权利要求中的，当与词“包含”一起应用时，词“一种”或“一类”可指一个或多于一个。如在此处所用的，“另一个”可指至少第二个或更多。
[0050]如在此处所用的术语“任何其中可推导的范围”指选自描述于说明书中的数字的范围，且“任何其中可推导的整数”指在该范围中的任何整数。
[0051]如在此处所用的术语“类似物”包括GHRH的任何突变体，或合成的或天然存在的GHRH肽片段，如HV-GHRH(Seq ID No：1)、TI-GHRH(Seq ID No：2)、TV-GHRH(Seq ID No：3)、15/27/28-GHRH(Seq ID No：4)、(1-44)NH2(Seq ID No：5)或(1-40)OH(Seq ID No：6)的形式，或不少于(1-29)氨基酸的任何更短的形式。
[0052]如在此处所用的术语“骨密度”定义为由本领域中的标准方法测量的骨中矿物的密度，该方法如X-射线、MRI、双重能量x-射线吸收比色计(dual energy x-ray absorbitometry)(DEXA)或本领域中任何先进的成像***。
[0053]如在此处所用的术语“盒”定义为一种或多种转基因表达载体。
[0054]如在此处所用的术语“细胞转染性脉冲”定义为力的传递，从而导致载体如线形DNA片段转染入细胞中。在一些实施方案中，该力来自电流，如在电穿孔中，或者该力来自血管压力。
[0055]如在此处所用的术语“编码区”指转录为信使RNA(mRNA)且然后翻译为具有特定多肽特征的氨基酸序列的DNA序列的任何部分。
[0056]如在此处所用的术语“送递”或“进行送递”定义为通过化学或生物方法、注射、混合、电穿孔、声波穿孔或其组合在压力下或无压力时将材料引入到组织、个体、细胞或任何受体中的方法。
[0057]如在此处所用的术语“供体细胞”指已获取并以有生活力的状态在供体个体外维持任何时间段的任何细胞。
[0058]如在此处所用的术语“供体个体”指动物界的任何物种，从其中获取了细胞并以有生活力的状态在个体外维持任何时间段。
[0059]如在此处所用的术语“DNA片段”或“核酸表达构建体”指基本上双链的DNA分子。尽管该片段可以通过本领域公知的任何标准生物方法生成，但在一些实施方案中，该DNA片段或表达构建体是通过对母体DNA分子进行限制酶切消化而生成的。术语“表达载体”、“表达盒”或“表达质粒”也可互换使用。尽管亲代分子可为任何标准的分子生物DNA试剂，但在一些实施方案中该母体分子是质粒。
[0060]如在此处所用的术语“电穿孔”指利用电脉冲将核酸序列送递入细胞中的方法。
[0061]如在此处所用的术语“电脉冲”和“电穿孔”指为了使核酸分子吸收入细胞中而给予组织或细胞电流。技术人员认识到这些术语与术语“脉冲的电场”、“脉冲电流设备”和“脉冲电压设备”相关。技术人员认识到电脉冲的量和持续时间依赖于受体个体的组织、大小和总体健康状况，且进一步知道如何根据实验确定这种参数。
[0062]如在此处所用的术语“编码的GHRH”是生物活性的GHRH多肽。
[0063]如在此处所用的术语GHRH“功能性生物等价物”是具有与野生型GHRH多肽不同的氨基酸序列而当与GHRH多肽比较时同时具有相似或改善的生物活性的多肽。功能性生物等价物可为天然存在的或可由个体进行修饰。技术人员认识到如在此处所用的相似或改善的生物活性指促进和/或释放生长激素或其它垂体激素。技术人员认识到在一些实施方案中，编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。本领域中公知的加工这种序列的方法包括定点诱变。
[0064]如在此处所用的术语“基因开关”(Valentis，Inc.(Burlingame，CA)的注册商标)指米非司酮-诱导型异源核酸序列的技术，该核酸序列编码调节蛋白质、GHRH、功能性生物等价物或其组合。这种技术在图1A中示意性地进行了图示。技术人员认识到米非司酮的抗孕酮试剂替代物是可用的，包括onapristone、ZK112993、ZK98734和5α孕烷-3，2-二酮。
[0065]如在此处所用的术语“生长激素”(“GH”)定义为涉及生长并充当化学信使以对目标细胞发挥作用的激素。在一个特定的实施方案中，生长激素是通过生长激素释放激素的作用释放的。
[0066]如在此处所用的术语“生长激素释放激素”(“GHRH”)定义为促进或刺激生长激素释放，及在较低程度上促进或刺激垂体激素如催乳素释放的激素。人们理解GHRH、重组GHRH或功能性生物等价物是生物活性的。
[0067]如在此处所用的术语“异源核酸序列”定义为包含不同调节和表达元件的DNA序列。
[0068]如在此处所用的术语“瘦体重”(“LBM”)定义为动物非脂肪组织如肌肉的体重。
[0069]如在此处所用的术语“修饰的细胞”定义为来自向细胞中引入了额外核酸序列的个体的细胞。
[0070]如在此处所用的术语“修饰的供体细胞”指含有编码GHRH的核酸序列的任何供体细胞。
[0071]如在此处所用的术语“分子开关”指送递入个体中且可调节基因转录的分子。技术人员认识到有许多本领域中公知的这种开关，如四环素开关、锌指开关、糖皮质激素开关等。
[0072]如在此处所用的术语“核酸表达构建体”指包含编码能够被转录的RNA的核酸的任何遗传构建体。术语“表达载体”也可在此处互换使用。在特定的实施方案中，核酸表达构建体包含：启动子；目标核苷酸序列；和3’非翻译区；其中启动子、目标核苷酸序列和3’非翻译区是可操作地连接的；且目标核苷酸序列的体内表达是由启动子调节的。
[0073]如在此处所用的术语“可操作地连接的”指通过可操作的能力而非物理位置在核酸序列中相连系的元件或结构。该元件或结构能够或者特征在于实现目的操作。本领域技术人员可认识到核酸序列中的元件或结构不必为串连或邻近的顺序而可操作地连接。
[0074]如在此处所用的术语“聚-L-谷氨酸(“PLG”)”指生物可降解的L-谷氨酸聚合物，该聚合物适合于用作利用或不用电穿孔将DNA转移入细胞中的载体或辅料。
[0075]如在此处所用的术语“注射后”指将核酸盒(含有编码GHRH或其功能性生物等价物的异源核酸序列)引入到个体细胞中且使得当修饰的细胞位于活生物中时能够发生编码基因的表达之后的时间段。
[0076]如在此处所用的术语“质粒”通常指包含染色体外遗传材料的构建体，该遗传材料通常为可独立于染色体DNA而复制的环状DNA双链体。质粒或其片段可用作载体。质粒是存在于或源自细菌和(极少的)其它微生物的双链DNA分子。然而，通常排除了线粒体和叶绿体DNA、酵母杀伤者和其它的情况。
[0077]如在此处所用的术语“质粒介导的基因补充”指通过利用体内核酸表达构建体使得个体对治疗范围的治疗性蛋白质具有延长的暴露的方法。
[0078]如在此处所用的术语“脉冲电压设备”或“脉冲电压注射设备”涉及通过向细胞发出定位的电脉冲而能够导致或导致了核酸分子摄入到生物的细胞中的设备。然后细胞膜将去稳定，从而形成通道或孔。将这类常规的设备进行校准以使得人们能够选择或调节目的电压振幅和脉冲电压的持续时间。脉冲电压设备的第一位重要性为该设备促进本发明组合物特别是线形DNA片段送递入生物细胞中的能力。
[0079]如在此处所用的术语“质粒骨架”指一般含有细菌复制起点和细菌抗生素选择基因的DNA序列，该抗生素选择基因是适当质粒转化的细菌特定生长所必需的。然而，缺乏抗生素抗性基因及复制起点的质粒，称为小环(Darquet等人，1997；Darquet等人，1999；Soubrier等人，1999)。体外扩增的表达质粒DNA(即非病毒表达***)的应用避免了与病毒载体相关的危险。非病毒表达***产物由于应用“物种特异性”成分进行基因送递而通常具有低的毒性，这使得与通常病毒载体相关的免疫原性最小化。本发明的一个方面是质粒骨架不含有病毒核苷酸序列。
[0080]如在此处所用的术语“启动子”指指导基因转录的DNA序列。启动子可指导原核或真核基因的转录。启动子可为“诱导型的”，从而对诱导剂起反应而起始转录，或者相反启动子可为“组成型的”，其中诱导剂不调节转录的速率。启动子可以以组织特异性或组织优选的方式进行调节，从而它仅仅在某个或许多特定组织类型中转录可操作地连接的编码区时是有活性的。
[0081]如在此处所用的术语“骨愈合速率”定义为修复骨折所需的时间。
[0082]如在此处所用的术语“受体个体”指动物界的任何物种，其中修饰的供体细胞可从供体个体中引入。
[0083]如在此处所用的术语“调节蛋白质”指增加或促进目标核酸序列转录的蛋白质。
[0084]如在此处所用的术语“残余的线形质粒骨架”包含在将核酸表达质粒变为线形的过程结束时剩余的任何质粒骨架片段。
[0085]如在此处所用的术语“个体”或“动物”指动物界的任何物种。在优选的实施方案中，它更特定地指人和家养的动物，该家养的动物用于：宠物(如猫、狗等)、畜力(如马等)、食物(母牛、鸡、鱼、羔羊、猪等)，以及本领域中公知的所有其它目的。
[0086]如在此处所用的术语“组织”指相似的细胞和围绕它们的细胞间物质的集合。技术人员认识到组织是用于发挥特定功能的相似特化细胞的聚集。对于本发明的范围，术语组织不指细胞系、细胞悬浮液或细胞培养物。在一个特定的实施方案中，将该组织在体内进行电穿孔。在另一个实施方案中，该组织不是植物组织。技术人员认识到身体中有四类基本组织：1)上皮组织；2)***，包括血液、骨和软骨；3)肌肉组织；和4)神经组织。在一个特定的实施方案中，该方法和组合物涉及将线形DNA通过电穿孔转移入肌肉组织中。
[0087]如在此处所用的术语“治疗性元件”包含将导致体内表达编码的基因产物的核酸序列。分子生物领域的技术人员将认识到治疗性元件可包括但不局限于启动子序列、转基因、聚腺苷酸序列或3’或5’UTR。
[0088]如在此处所用的术语“转染”指将核酸引入到真核细胞中。在一些实施方案中，该细胞不是植物组织或酵母细胞。
[0089]如在此处所用的术语“病毒骨架”指核酸序列，该核酸序列不含有启动子、基因和3’聚腺苷酸化信号或非翻译区，但含有如下元件，该元件包括但不局限于位点特异性基因组整合Rep和末端反向重复(“ITR”)或用于反转录的tRNA引物结合位点，或者核酸序列成分，该核酸序列成分当在体内***时可诱导病毒免疫原性反应、允许整合、影响组织特异性启动子的特异性和活性、导致转录沉默或对个体产生安全性危险。
[0090]如在此处所用的术语“血管压力脉冲”指来自大体积液体的压力脉冲以促进载体摄入到细胞中。技术人员认识到血管压力脉冲的量和持续时间依赖于受体动物的组织、大小和总体健康状况，并进一步知道如何根据实验确定这种参数。
[0091]如在此处所用的术语“载体”指包含遗传材料的构建体，该遗传材料设计为通过将核酸序列送递入该细胞而指导目标细胞的转化。载体可含有多个在位置和顺序上与其它必需元件适应的遗传元件，从而包括的核酸盒可在转染的细胞中转录并在需要时进行翻译。这些元件是可操作地连接的。术语“表达载体”指含有在异源细胞中产生重组蛋白质所必需的所有信息的DNA质粒。
[0092]本发明涉及在动物个体中降低身体脂肪比例、增加瘦体重(“LBM”)、增加骨密度、增加骨愈合速率或其组合的方法。通常，本发明可通过将编码GHRH或其功能性生物等价物的核酸序列送递入个体的细胞(如体细胞、干细胞或生殖细胞)中并当修饰的细胞位于活生物中时使编码的基因发生表达而实现。GHRH或其功能性生物等价物随后的表达由组织特异性启动子(如肌肉)和/或含有修饰的配体结合结构域的调节蛋白质(如分子开关)进行调节，该调节蛋白质仅当将正确修饰的配体(如米非司酮)给予个体时才有活性。活生物中修饰的细胞对GHRH或其功能性生物等价物的表达和随后的释放将降低个体身体脂肪比例、增加LBM、增加骨密度和/或增加骨愈合速率。
[0093]本发明的一个方面是利用由组成型启动子调节的核酸表达载体在个体中改变瘦体重的方法。该方法包含向个体的细胞中送递核酸表达构建体，该核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物。在一个特定的实施方案中，该核酸表达构建体是通过电穿孔送递入个体的细胞中的，其中该细胞包含体细胞、干细胞或生殖细胞。在另一个特定的实施方案中，该核酸表达构建体包含Seq IDNo：11、Seq ID No：12、Seq ID No：13、Seq ID No：14、Seq ID No：17、Seq IDNo：18、Seq ID No：19、Seq ID No：20或Seq ID No：21。核酸表达构建体的转染可利用转染促进多肽(如带电荷的多肽或聚-L-谷氨酸)进行加速。编码的GHRH或其功能性生物等价物是在个体的组织特异性细胞中表达的，包括肌肉细胞。编码的GHRH或编码的GHRH功能性生物等价物是生物活性多肽，对该多肽与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性。在一个优选的实施方案中，编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(Seq ID No：6)。此外，编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
[0094]本发明的第二个方面是通过利用由分子开关分子调节的核酸表达载体在个体中改变瘦体重的方法。该方法包含向个体的细胞中送递第一个核酸表达构建体(SeqID No：26)、第二个核酸表达构建体(SeqID No：27)和分子开关的步骤；其中第一个核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物；且其中第二个核酸表达构建体具有调节蛋白质的编码区；并将分子开关分子送递入个体中，其中分子开关分子控制调节蛋白质的活化，而调节蛋白质控制第一个核酸表达构建体的活化。在一些特定实施方案中，该核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽(如带电荷的多肽或聚-L-谷氨酸)。第一个核酸和第二个核酸表达构建体向个体细胞中的送递步骤是通过电穿孔的。本方法的特定实施方案包含核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的调节蛋白质的表达，但该调节蛋白质是失活的。然而，当将分子开关(如米非司酮)送递入个体中时，调节蛋白质变为有活性的，且有活性的调节蛋白质起始了在第一个核酸序列上编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(Seq ID No：6)。编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。在另一个特定的实施方案中，第一个核酸表达载体编码序列Seq ID No：1、Seq ID No：2、Seq ID No：3或Seq ID No：4的多肽。
[0095]本发明的第三个方面是在个体中改变瘦体重的方法，该方法包含以下步骤：向个体中送递重组的生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物，其中重组GHRH是生物活性的多肽。在特定的实施方案中，GHRH的重组功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。在另一个特定的实施方案中，重组GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)。重组GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
[0096]本发明的第四个方面是利用由组成型启动子调节的核酸表达载体在个体中改变骨特性的方法。该方法包含向个体的细胞中送递编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物的核酸表达构建体。在一个特定的实施方案中，该核酸表达构建体是通过电穿孔送递入个体的细胞中的，其中该细胞包括体细胞、干细胞或生殖细胞。在另一个特定的实施方案中，该核酸表达构建体包含Seq ID No：11、Seq IDNo：12、Seq ID No：13、Seq ID No：14、Seq ID No：17、Seq ID No：18、Seq IDNo：19、Seq ID No：20或Seq ID No：21。核酸表达构建体的转染可利用转染促进多肽(如带电荷的多肽或聚-L-谷氨酸)进行加速。编码的GHRH或其功能性生物等价物是在个体的组织特异性细胞中表达的，该组织特异性细胞包含肌肉细胞。编码的GHRH或编码的GHRH功能性生物等价物是生物活性多肽，对该多肽与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性。在一个优选的实施方案中，编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(Seq ID No：6)。此外，编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
[0097]本发明的第五个方面是利用由分子开关分子调节的核酸表达载体在个体中改变骨特性的方法。该方法包含向个体的细胞中送递第一个核酸表达构建体、第二个核酸表达构建体和分子开关的步骤；其中第一个核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物；且其中第二个核酸表达构建体具有调节蛋白质的编码区；并将分子开关分子送递入个体中，其中分子开关分子控制调节蛋白质的活化，而调节蛋白质控制第一个核酸表达构建体的活化。在一些特定实施方案中，该核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽(如带电荷的多肽或聚-L-谷氨酸)。第一个核酸和第二个核酸表达构建体向个体细胞中的送递步骤是通过电穿孔的。本方法的特定实施方案包含核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的调节蛋白质的表达，但该调节蛋白质是非活性的。然而，当将分子开关(如米非司酮)送递入个体中时，调节蛋白质变为有活性的，且有活性的调节蛋白质起始了在第一个核酸序列上编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(Seq ID No：6)。编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。在另一个特定的实施方案中，第一个核酸表达载体编码序列Seq ID No：1、Seq IDNo：2、Seq ID No：3或Seq ID No：4的多肽。
[0098]本发明的第六个方面是在个体中改变骨特性的方法，该方法包含以下步骤：向个体中送递重组的生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物，其中重组GHRH是生物活性多肽。在特定的实施方案中，GHRH的重组功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。在另一个特定的实施方案中，重组GHRH或其功能性生物等价物具有式(Seq ID No：6)。重组GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
[0099]在此处描述的质粒介导的GHRH补充方法提供了超越直接注射重组GHRH蛋白质的局限的优点。编码血清蛋白酶抗性的GHRH功能性新生物等价物的核酸序列的表达可由表达质粒指导，该表达质粒由合成的肌肉特异性启动子控制。在通过肌内注射和体内电穿孔进行送递之后，这种GHRH或其功能性生物等价物的表达在猪中引起了高的GH和IGF-I水平(Draghia-Akli等人，1999)。体内电穿孔方法可包括外部提供的电极，或者在针的情况下，包括内部提供的电极，以辅助目的核苷酸序列向活生物个体的细胞中注入。尽管体内电穿孔是将异源核酸编码***引入个体细胞中的优选方法，但存在其它方法且是本领域技术人员公知的(如电穿孔、脂质转染胺(lipofectamine)、磷酸钙、离体转化、直接注射、DEAE葡聚糖、超声处理加载、受体介导的转染、微弹轰击等)。例如，同样可以通过如下方式将编码GHRH或其功能性生物等价物直接引入到个体细胞中，即首先从个体或供体身体中获取细胞，将该细胞维持于培养物中，然后通过各种方法向其中引入核酸编码***(如电穿孔、脂质转染胺(lipofectamine)、磷酸钙、离体转化、直接注射、DEAE葡聚糖、超声处理加载、受体介导的转染、微弹轰击等)，最后将修饰的细胞再次引回到最初的个体或其它宿主个体中(离体方法)。可将GHRH序列克隆入腺病毒载体或腺伴随病毒载体中，并通过简单的肌内注射或静脉内或动脉内注射而送递。携带有GHRH序列的质粒DNA可以与阳离子脂质或脂质体复合并进行肌内、静脉内或皮下送递。
[0100]如在此处所用的给药指将载体或DNA载体引入身体中的途径。给药可直接到达目标组织或在全身给药后通过定向送递到达目标组织中。特别地，本发明可用于通过将载体如质粒给予身体而补充GHRH，以在组织中以某一有用的水平建立特定核酸序列受控的表达。
[0101]给予载体的优选方法和用于送递的制剂的应用在上文描述过。优选的实施方案是通过体内电穿孔。
[0102]任何选择的载体构建体的给予途径将依赖于表达载体的特定用途。通常，所用的每一个载体构建体的特定制剂将集中于特定目标组织对载体的摄入及随后功效的表现。摄入研究将包括用于估计载体的细胞摄入和选择的组织特异性DNA表达的摄入测定。这种测定也将确定摄入后目标DNA的定位，并确立维持表达的蛋白质稳定状态的浓度的必要条件。然后可检验功效和细胞毒性。毒性不仅包括细胞生活力，而且包括细胞功能。
[0103]在向肌肉中简单注射DNA颗粒如溶液、悬浮液或胶体后肌肉细胞具有从细胞外空间摄入DNA的独特能力。这种方法的DNA表达可维持数月。肌肉细胞中的DNA摄入可进一步利用体内电穿孔来增强。
[0104]制备的DNA载体的送递包括将DNA整合入大分子复合物中，该复合物可由目标细胞胞吞。这种复合物可包括脂质、蛋白质、糖类、合成的有机化合物或无机化合物。与载体形成的复合物的特征(大小、电荷、表面特征、组成)确定了身体中载体的生物可用性。制剂的其它成分发挥与细胞表面或内部特定受体相互作用的功能。制剂的其它成分的功能可以增强向细胞的进入、从内体的释放和进入核内。
[0105]送递也可通过应用DNA转运蛋白。DNA转运蛋白指与DNA载体结合并能够由表皮细胞摄入的分子。DNA转运蛋白含有能够与DNA非共价结合并有效地将DNA跨过细胞膜转运的分子复合物。优选转运蛋白也将DNA跨核膜转运。参见如下面的申请，在此处将它们全部(包括附图)引入作为参考：(1)Woo等人，美国专利No.6,150,168，题目为：“A DNA Transporter System and Method of Use”；(2)Woo等人，PCT/US93/02725，题目为：“A DNA Transporter System and Method ofUse”，于1993年3月19日提交；(3)Woo等人，美国专利No.6,177,554，题目为：“Nucleic Acid Transporter System and Methods of Use”；(4)Szoka等人，美国专利No.5,955,365，题目为：“Self-AssemblingPolynucleotide Delivery System”；和(5)Szoka等人，PCT/US93/03406，题目为：“Self-Assembling Polynucleotide Delivery System”，于1993年4月5日提交。
[0106]另一个送递方法包括DNA转运蛋白***。DNA转运蛋白***由含有几个独立的且与DNA非共价结合的元件的颗粒组成。每一个元件由配体组成，该配体识别特定的受体或其它功能基团，如与可结合DNA的阳离子基团复合的蛋白质。可应用的阳离子的例子为精胺、精胺衍生物、组蛋白、阳离子肽和/或聚赖氨酸。一个元件能够同时与DNA载体和目标细胞上的细胞表面受体结合。这种元件的例子为与脱唾液酸糖蛋白受体、叶酸受体、甘露糖-6-磷酸受体或肉碱受体相互作用的有机化合物。第二个元件能够同时与DNA载体和核膜上的受体结合。核配体能够识别并跨核膜转运转运蛋白***。这种配体的一个例子是来自SV40大T抗原或组蛋白的核导向序列。第三个元件能够同时与DNA载体和诱导附加体裂解的元件结合。该例子包括失活的病毒颗粒如腺病毒、与流感病毒血凝素相关的肽或描述于上文引用的Skoka专利中的GALA肽。
[0107]给药也可涉及脂质。该脂质可形成脂质体，该脂质体为中空的球状小泡，包含以单层、双层或多层模式排列的脂质和内部的水空隙以捕获水溶性化合物如DNA，大小范围为直径0.05到几微米。脂质可不形成脂质体而应用。特定的例子包括阳离子脂质和含有DOPE的复合物的应用，它们可以与DNA和目标细胞的膜相互作用以促进DNA进入细胞中。
[0108]基因送递也可通过移植遗传改造的细胞而进行。例如，称为成肌细胞的不成熟肌肉细胞可用于将基因携带入肌纤维中。遗传改造以表达重组人生长激素的成肌细胞可向动物血液中分泌生长激素。整合的基因的分泌可维持高达3个月的时间段。
[0109]成肌细胞最终进行分化并融合入现有的肌肉组织中。因为细胞整合入现有的结构中，所以它不仅是可耐受的，而且可得到营养。成肌细胞易于从需要补充GHRH的个体中通过获取肌肉组织而获得，且遗传改造的细胞也易于被放回，而不对患者肌肉造成损害。类似地，角质细胞可用于将基因送递入组织中。大量的角质细胞可通过培养小的活组织而生成。该培养物可制备为分层的片层，且当移植入人中时，可生成在许多年中继续改善组织型质量的表皮。当在培养物中时通过用适当的载体转染角质细胞来遗传改造角质细胞。尽管角质细胞通过划分表皮与真皮的基膜与循环隔离，但人的角质细胞可将产生的蛋白质分泌到循环中。
[0110]送递也可包括病毒载体的应用。例如，腺病毒载体可通过如下方法进行构建，即将病毒基因组的E1区用描述于本发明中的载体元件替代，该载体元件包括启动子、5’UTR、3’UTR和核酸盒，并将该重组基因组引入到293细胞中，该细胞可将该基因包装为感染性病毒颗粒。然后来自该细胞的病毒可用于来自体内的或在体内感染组织以将载体引入组织中，从而导致核酸盒中基因的表达。
[0111]尽管不想受理论限制，但人们相信为了提供在人中应用这种异源核酸序列的可接受的安全余地，应要求调节的基因表达***具有低水平的基本GHRH表达，而仍然保持高的诱导性。因而，目标基因表达可通过整合如在图1A中示意性图示的分子开关技术进行调节。配体依赖性诱导转基因表达的商业上可购得的基因开关***基于C-末端截短的孕酮受体，该受体不能与其天然激动剂孕酮结合，但相反可由抗孕酮如米非司酮(“MFP”)活化(Vegeto等人，1992；Xu等人，1996)。因而，引入到个体细胞中的异源核酸序列需要MFP转录活化。基因开关***的嵌合调节蛋白质由已与酵母GAL4蛋白质的DNA结合结构域(该结构域与特定的17bp识别序列结合)融合的截短的人孕酮受体的配体结合结构域及来自人NF-κB的p65亚基的转录激活结构域组成(Abruzzese等人，1999；Abruzzese等人，2000)。将基因开关调节蛋白质的基因整合入称为pSG1633的生肌表达载体中，该载体在肌肉特异性骨骼α-肌动蛋白(“SK”)启动子的控制下进行组成型表达。称为p6xGa14/TATA-GHRH或pGHRH1633的GHRH质粒含有诱导型启动子，该启动子由与最小的TATA盒启动子融合的6个拷贝的17-聚体Ga14结合位点组成。GHRH编码序列是超级猪(super-porcine)的突变GHRH cDNA的228-bp片段，称为HV-GHRH(Draghia-Akli等人，1999)。HV-GHRH分子在血清中显示高度的稳定性，具有6小时的半衰期，与具有6-12分钟半衰期的天然GHRH相对。肌肉特异性基因开关和诱导型GHRH质粒均具有含有合成的内含子的5’非翻译区和来自人GH基因的3’非翻译区/聚腺苷酸化位点。
[0112]重组GH替代治疗在临床上广泛应用且具有有利作用，但通常剂量是超生理水平的。这种升高的重组GH剂量与有害的副作用相关，如高达30％的重组GH治疗的患者报道有更高频率的胰岛素抗性(Blethen，1995；Verhelst等人，1997)，或者在儿科患者中有加快的骨骺生长和关闭(Blethen和Rundle，1996)。此外，循环的GH的分子异质性对生长和稳态具有重要的意义，这将导致具有降低的刺激催乳素受体能力的低能力GH；已经描述了GH的20kDa形式具有比22kDa形式低的引起尿潴留的能力(Satozawa等人，2000；Tsunekawa等人，1999；Wada等人，1998)。这些不利副作用由用重组外源GH蛋白质治疗升高了GH的基本水平并消除了天然的GH短暂脉冲的事实引起。相反，在重组GHRH治疗中未报道副作用。垂体入口循环中GHRH的正常水平为约150-800pg/ml，而激素的全身循环值达到约100-500pg/ml。一些患有由颅外肿瘤导致的肢端巨大怔的患者具有几乎10倍高的水平(如50ng/ml免疫反应性GHRH)(Thorner等人，1984)。在儿童和老年人中应用重组GHRH治疗的长期研究(1-5年)已显示不存在经典的GH副作用，如在禁食的葡萄糖浓度，或在儿科患者中加快的骨骺生长和关闭或主要股骨骺的滑动等变化(Chevalier等人，2000)(Duck等人，1992；Vittone等人，1997)。在人、绵羊或猪中的许多研究显示用重组GHRH蛋白质的连续注入可恢复正常的GH模式，而不使GHRH受体脱敏或耗尽GH供应(Dubreuil等人，1990b)。由于本***具有能够在GH治疗中被消除的一定程度的反馈，所以GHRH重组蛋白质治疗比GH治疗更为生理。然而，由于GHRH在体内短的半衰期，所以频繁的(每日1-3次)静脉内、皮下或鼻内(需要高300-倍的剂量)给予是必需的(Evans等人，1985；Thorner等人，1986)。因而，作为长期治疗，重组GHRH蛋白质给予是不实际的。然而，基因转移方法可克服GHRH应用的限制。此外，大的剂量范围可为治疗性的。选择GHRH进行基因治疗应用可由如下事实支持，即该基因、cDNA和天然的和几个突变分子已在猪和其它物种中得到表征(Bohlen等人，1983；Guillemin等人，1982)，且治疗功效的测量是直接且不含糊的。
[0113]在用于体内基因转移的非病毒技术中，质粒DNA直接注射入肌肉中是简单、便宜且安全的。简单的直接注射后DNA向肌纤维中的低效摄入导致相对低的表达水平(Prentice等人，1994；Wells等人，1997)。此外，转基因表达的持续时间短(Wolff等人，1990)。以前最成功的临床应用局限于疫苗(Danko和Wolff，1994；Tsurumi等人，1996)。最近，利用电穿孔技术已经获得了增强体内质粒送递和随后实现生理水平的分泌蛋白质的显著进展。最近，应用电穿孔增强体内质粒送递已获得了显著的进展。电穿孔已非常成功地用于在注射质粒后转染肿瘤细胞(Lucas等人，2002；Matsubara等人，2001)或将抗肿瘤药物博来霉素送递入人中的皮肤或皮下肿瘤中(Gehl等人，1998；Heller等人，1996)。电穿孔也已广泛应用于小鼠(Lesbordes等人，2002；Lucas等人，2001；Vilquin等人，2001)、大鼠(Terada等人，2001；Yasui等人，2001)和狗(Fewell等人，2001)中以送递编码各种激素、细胞因子或酶的治疗性基因。我们以前应用生长激素释放激素(GHRH)的研究显示利用电穿孔的质粒治疗是可升级的且代表了在大动物和人中诱导蛋白质的产生和有调节的分泌的有希望的方法(Draghia-Akli等人，1999；Draghia-Akli等人，2002)。电穿孔也已广泛应用于啮齿动物和其它小动物中(Bettan等人，2000；Yin和Tang，2001)。已观察到电极构型影响电场分布和随后的结果(Gehl等人，1999；Miklavcic等人，1998)。预备实验显示对于大的动物模型，针型电极可得到比外部的卡钳电极一致的可重复的较好结果。
[0114]有力的电穿孔送递方法与改善的质粒DNA载体***的组合于非常低的质粒剂量时在动物如大动物中产生了降低身体脂肪比例、增加瘦体重(“LBM”)或两者的显著变化。
I.载体
[0115]如在此处所用的术语“载体”指在其中可***核酸序列以引入到细胞中的载体核酸分子，其中在一些实施方案中它可以复制。该核酸序列对于动物可为天然的，或者它可为“外源的”，这意味着它对于载体所要引入的细胞是外源的，或者该序列与细胞内的序列同源，但位于宿主细胞核酸中该序列通常不存在的位置上。载体包括质粒、粘粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)、线形DNA片段和人工染色体(如YAC)，尽管在一个优选的实施方案中该载体基本不含有病毒序列。本领域技术人员可进行充分训练以通过标准重组技术构建载体(参见如Sambrook等人，1989)。
[0116]如在此处所用的术语“表达载体”指包含编码能够进行转录的RNA的核酸的任何类型的遗传构建体。在一些情况下，RNA分子然后翻译为蛋白质、多肽或肽。在另外的情况下，这些序列是不翻译的，如在产生反义分子或核酶时。表达载体可含有各种“控制序列”，该控制序列指在特定宿主细胞中可操作地连接的编码序列转录和可能的翻译所必需的核酸序列。除控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体可含有也发挥其它功能并在下文中描述的核酸序列。
II.质粒载体
[0117]在某些实施方案中，来自质粒载体的线形DNA片段预期可用于转染真核细胞，特别是哺乳动物细胞。通常，含有源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的质粒载体与这些宿主一起应用。载体一般带有复制位点，以及能够在转化的细胞中提供表型选择的标记序列。在非限制性的例子中，大肠杆菌通常用pBR322衍生物进行转化，该质粒源自大肠杆菌物种。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗性基因，从而提供了鉴定转化细胞的简便方法。pBR质粒或其它微生物质粒或噬菌体也必须含有或进行修饰以含有如可由微生物用于表达其自身蛋白质的启动子。技术人员认识到本领域中的任何质粒均可进行修饰以用于本发明的方法中。例如，在一个特定的实施方案中，用于治疗性应用的GHRH载体源自pBlueScript KS+并具有卡那霉素抗性基因。
[0118]此外，含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以与这些宿主一起用作转化载体。例如，噬菌体λGEM-11可用于形成重组噬菌体载体，该重组噬菌体载体可用于转化宿主细胞如大肠杆菌LE392。
[0119]进一步有用的质粒载体包括pIN载体(Inouye等人，1985)和pGEX载体，以用于生成谷胱甘肽S-转移酶(“GST”)可溶性融合蛋白质以进行随后的纯化和分离或切割。其它适当的融合蛋白质是与β-半乳糖苷酶、遍在蛋白质等融合的那些。
[0120]包含表达载体的细菌宿主细胞如大肠杆菌可在许多适当的培养基中生长，如LB。如本领域的技术人员所理解的，某些载体中的重组蛋白质的表达可通过使宿主细胞与对某些启动子特异性的试剂接触而进行诱导，如通过向培养基中添加IPTG或通过将温育调到较高的温度。在将细菌培养进一步的时间段后，通常为2-24小时，通过离心收集细胞并进行洗涤以去除残留的培养基。
III.启动子和增强子
[0121]启动子是控制序列，该控制序列是核酸序列上控制基因产物转录起始和速率的区域。它可含有遗传元件，调节蛋白质和分子如RNA聚合酶和其它转录因子可结合该遗传元件以起始核酸序列的特定转录。短语“可操作地定位的”、“可操作地连接的”、“在控制下”和“在转录控制下”指启动子位于相对于核酸序列正确的功能位置和/或方向以控制该序列的转录起始和/或表达。
[0122]启动子通常包含发挥确定RNA合成起始位点的功能的序列。该序列最熟知的例子是TATA盒，但在一些缺乏TATA盒的启动子中，如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，在起始位点上的不连续的元件自身可有助于确定起始位置。额外的启动子元件调节转录起始的频率。一般地，它们位于起始位点上游30-110bp的区域，尽管许多启动子也显示含有起始位点下游的功能元件。为了使编码序列在启动子的“控制下”，人们使转录读框的转录起始位点的5’末端位于选择的启动子的“下游”(即3’)。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
[0123]启动子元件之间的间隔通常是可变通的，从而当将该元件颠倒或相互进行移动时启动子功能得以保持。在tk启动子中，启动子元件之间的间隔在活性开始降低前可增加到50bp。依赖于启动子，可看出单个元件可协作地或单独地发挥作用以激活转录。启动子可以与“增强子”或不与“增强子”共同应用，该增强子指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调节序列。
[0124]启动子可为与核酸序列天然结合的，如可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列而获得的。这种启动子可称为“内源的”。类似地，增强子可为与核酸序列天然结合的，位于该序列的下游或上游。可选择地，通过将编码的核酸区段置于重组的、合成的或异源的启动子控制之下将获得某些优点，该启动子指在天然环境中正常不与核酸序列结合的启动子。重组的、合成的或异源的增强子也指在天然环境中正常不与核酸序列结合的增强子。这种启动子或增强子可包括其它基因的启动子或增强子，及从任何其它病毒或原核或真核细胞中分离的启动子或增强子，以及非“天然存在的”启动子或增强子，即含有不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变。例如，最常用于重组DNA构建中的启动子包括β-内酰胺酶(青霉素酶)、乳糖和色氨酸(trp)启动子***。除合成地产生启动子和增强子核酸序列之外，该序列也可用重组克隆和/或核酸扩增技术包括PCR与在此处公开的组合物一起产生(参见美国专利No.4,683,202和5,928,906，各自均在此处引入作为参考)。此外，预期也可应用指导非核的细胞器中序列转录和/或表达的控制序列，如线粒体、叶绿体等中。
[0125]自然地，重要的是应用在选择进行表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物中可有效指导DNA区段表达的启动子和/或增强子。分子生物领域的技术人员通常知道用于蛋白质表达的启动子、增强子和细胞类型组合的应用(参见如(Sambrook等人，1989))。应用的启动子可为组成型的、组织特异性的、诱导型的和/或在适当的条件下可用于指导引入的DNA区段高水平表达的，如在大规模生产重组蛋白质和/或肽中有利的。该启动子可为异源的或内源的。
[0126]此外可将任何启动子/增强子组合(按照如原核启动子数据库(Eukaryotic Promoter Data Base)EPDB，http：//www.epd.isb-sib.cn/)用于驱动表达。T3、T7或SP6细胞质表达***是另一个可能的实施方案。如果作为送递复合物的部分或作为额外的遗传表达构建体提供了适当的细菌聚合酶，那么原核细胞可从某些细菌启动子支持细胞质转录。
[0127]表1和2列出了元件/启动子的非限制性例子，该元件/启动子在本发明的情况下可用于调节RNA的表达。表2提供了诱导型元件的非限制性例子，该元件是对特定刺激起反应可进行活化的核酸序列区域。
                                  表1启动子和/或增强子
启动子/增强子 相关参考文献
免疫球蛋白重链
免疫球蛋白轻链
T-细胞受体
HLA DQα和/或DQβ
β-干扰素
白细胞介素-2
白细胞介素-2受体
II型MHC 5
II型MHC HLA-Dra
β-肌动蛋白 (Kawamoto等人，1988；Kawamoto等人，1989)
肌肉肌酸激酶(MCK) (Horlick和Benfield，1989；Jaynes等人，1988)
前白蛋白(运甲状腺素蛋白)
弹性蛋白酶I
金属硫蛋白(MT II) (Inouye等人，1994；Narum等人，2001；Skroch等人，1993)
胶原酶
白蛋白 (Pinkert等人，1987；Tronche等人，1989)
α-甲种胎儿球蛋白
γ-珠蛋白
β-珠蛋白 (Tronche等人，1990；Trudel和Costantini，1987)
c-fos
c-HA-ras
胰岛素 (German等人，1995；Ohlsson等人，1991)
神经细胞粘着分子(NCAM)
α1-抗胰蛋白酶
H2B(TH2B)组蛋白
小鼠和/或I型胶原
葡萄糖调节性蛋白质(GRP94和GRP78)
大鼠生长激素 (Larsen等人，1986)
人血清淀粉状蛋白质A(SAA)
肌钙蛋白I(TNI) (Lin等人，1991；Yutzey和Konieczny，1992)
血小板衍生的生长因子(PDGF) (Pech等人，1989)
杜兴氏肌营养不良 (Klamut等人，1990；Klamut等人，1996)
SV40
多形瘤
反转录病毒
***瘤病毒(papillomavirus)
乙型肝炎病毒(HepatitisB Virus)
人免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiency Virus)
巨细胞病毒(Cytomegalovirus)(CMV) (Boshart等人，1985；Dorsch-Hasler等人，1985)
长臂猿白血病病毒(GibbonApe Leukemia Virus)
合成的肌肉特异性启动子(c5-12，c1-28) (Draghia-Akli等人，1999：Draghia-Akli等人，2002；Li等人，1999)
                                  表2元件/诱导物
元件 诱导物
MT II 佛波酯(TFA)重金属
MMTV(小鼠乳癌病毒(mouse mammarytumor virus) 糖皮质激素
β-干扰素 Poly(rI)x/Poly(rc)
腺病毒5  E2 E1A
胶原酶 佛波酯(TPA)
溶基质素 佛波酯(TPA)
SV40 佛波酯(TPA)
鼠类MX基因 干扰素、新城疫病毒(NewcastleDisease Virus)
GRP78基因 A23187
α-2-巨球蛋白 IL-6
波形蛋白 血清
I型MHC基因H-2κb 干扰素
HSP70 E1A、SV40大T抗原
增殖蛋白 佛波酯-TPA
肿瘤坏死因子α PMA
促甲状腺素α基因 甲状腺激素
[0128]组织特异性启动子或元件的鉴定以及表征其活性的测定是本领域技术人员众所周知的。这种区域的非限制性例子包括人LIMK2基因(Nomoto等人，1999)、促生长素抑制素受体2基因(Kraus等人，1998)、鼠类附睾视黄酸结合基因(Lareyre等人，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等人，1998)、小鼠α2(XI)胶原(Liu等人，2000；Tsumaki等人，1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee等人，1997)、***II(Dai等人，2001；Wu等人，1997)和人血小板内皮细胞粘着分子-1(Almendro等人，1996)。
[0129]在一个优选的实施方案中，利用了合成的肌肉启动子，如SPc5-12(Li等人，1999)，该启动予含有来自骨骼α-肌动蛋白的接近的血清反应元件(“SRE”)、多个MEF-2位点、MEF-1位点和TEF-1结合位点，并大大超过了天然生肌启动子的转录能力。该合成的启动子的独特性是显著优于已授权的专利的改进，该专利涉及生肌启动子及其应用(如美国专利No.5,374,544)或用于核酸序列的生肌表达的***(如美国专利No.5,298,422)。在一个优选的实施方案中，本发明利用的启动子不被内源细胞机器或因子关闭或显著减少活性。其它元件包括反式作用因子结合位点和增强子可根据本发明的实施方案应用。在其它实施方案中，利用了天然的生肌启动子，且技术人员知道如何从数据库中获得这种启动子序列，该数据库包括国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(“NCBI”)GenBank数据库或NCBI PubMed站点。技术人员知道可利用这些数据库获得序列或与本发明有关的相关文献。
IV.起始信号和内部核糖体结合位点
[0130]编码序列的有效翻译也需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近的序列。需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域的技术人员很容易地能够对此进行确定并提供必需的信号。众所周知的是起始密码子必须与目的编码序列的读框“符合读框”以确保全部***物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可为天然的或合成的。表达效率可通过包括适当的转录增强子元件而增强。
[0131]在本发明的某些实施方案中，将内部核糖体进入位点(“IRES”)用于生成多基因或多顺反子信使。IRES元件能够忽视依赖5’  甲基化帽子的翻译的核糖体扫描模式而在内部位点开始翻译(Pelletier和Sonenberg，1988)。已经描述了来自细小RNA病毒(picornavirus)家族2个成员(脊髓灰质炎病毒(polio)和脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis))的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)以及来自哺乳动物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以与异源的可读框连接。多个可读框可以一起转录，各自通过IRES隔开，从而形成多顺反子信使。依靠IRES元件，每一个可读框可接近核糖体以进行有效转录。多个基因可用单个启动子/增强子进行有效表达以转录为单一的信使(参见美国专利No.5,925,565和5,935,819，各自均在此处引入作为参考)。
V.多克隆位点
[0132]载体可包括MCS，即含有多个限制酶位点的核酸区域，任何一个位点可与标准重组技术一起用于消化载体(参见如在此处引入作为参考的(Carbonelli等人，1999；Cocea，1997；Levenson等人，1998))。“限制酶消化”指用仅在核酸分子的特定位置发挥功能的酶催化切割核酸分子。这些限制酶中的许多是商业上可购得的。这种酶的应用广为本领域技术人员所理解。经常地，将载体用在MCS中切割的限制酶线性化或片段化以使得外源序列能够与载体连接。“连接”指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，该片段彼此接近或不接近。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域的技术人员众所周知的。
VI.剪接位点
[0133]大多数转录的真核RNA分子将进行RNA剪接以从初级转录物中去除内含子。含有基因组真核序列的载体需要供体和/或受体剪接位点以确保用于蛋白质表达的转录物正确的剪接(参见如在此处引入作为参考的(Chandler等人，1997))。
VII.终止信号
[0134]本发明的载体或构建体通常将包含至少一个终止信号。“终止信号”或“终止子”包含参与RNA聚合酶对RNA转录物的特定终止的DNA序列。因而，在某些实施方案中，预期有终止产生RNA转录物的终止信号。终止子对于体内实现想要的信使水平是必需的。
[0135]在真核***中，终止子区域也包含允许对新转录物进行位点特异性切割从而暴露聚腺苷酸化位点的特定DNA序列。这可对特定的内源聚合酶发出信号以向转录物的3’末端添加一段约200个的A残基(“聚腺苷酸”)。由该聚腺苷酸尾巴修饰的RNA分子显得更加稳定并更有效地翻译。因而，在其它涉及真核生物的实施方案中，优选终止子包含切割RNA的信号，且更优选终止子信号促进对信使RNA的聚腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可增强信使RNA水平并最小化从该盒到其它序列的连读。
[0136]预期用于本发明的终止子包括任何在此处描述的转录终止子或本领域技术人员公知的，包括但不局限于如基因的终止序列如牛生长激素终止子或病毒的终止序列如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可为可转录或可翻译的序列的缺失，如由于序列的截短。
VIII.聚腺苷酸化信号
[0137]在表达中，特别是真核表达中，人们一般将包括聚腺苷酸化信号以实现转录物的正确聚腺苷酸化。聚腺苷酸化信号的特性对于本发明的成功实践不是至关重要的，所以可以应用任何这种序列。优选的实施方案包括SV40聚腺苷酸化信号、骨骼α肌动蛋白3’UTR或人或牛生长激素聚腺苷酸化信号，均为方便且已知在各种目标细胞中发挥良好功能的信号。聚腺苷酸化可增加转录物的稳定性或促进细胞质转运。
IX.复制起点
[0138]为了使载体在宿主细胞中增殖，可使其含有一个或多个复制起点(通常称为“ori”)，该复制起点是复制起始的特定核酸序列。可选择地，如果宿主细胞是酵母则可应用自主复制序列(“ARS”)。
X.选择性和筛选性标记
[0139]在本发明的某些实施方案中，含有本发明的核酸构建体的细胞可通过在表达载体中包括一个标记而在体外或在体内进行鉴定。这种标记将赋予细胞可鉴定的变化，从而使得易于鉴定含有表达载体的细胞。通常，选择标记是可赋予使得可进行选择的性质的标记。正选择标记是当该标记存在时能够对其进行选择的标记，而负选择标记是当该标记存在时阻碍的对其进行选择的标记。正选择标记的一个例子是药物抗性标记。
[0140]通常包括药物选择标记可有助于克隆及鉴定转化体，如赋予对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和组氨醇抗性的基因是有用的选择标记。除了可赋予能基于执行条件而辨别转化体的表型的标记之外，也预期其它类型的标记，包括筛选标记如GFP，其基础是比色分析。可选择地，可以利用筛选性酶如单纯疱疹病毒(herpessimplex virus)胸苷激酶(“tk”)或氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)。本领域技术人员也知道如何应用免疫学标记，可能地是与FACS分析一起应用。所用的标记并不认为是重要的，只要它能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择性和筛选性标记进一步的例子是本领域技术人员众所周知的。
XI.电穿孔
[0141]在本发明某些实施方案中，核酸是通过电穿孔引入到细胞器、细胞、组织或生物中的。电穿孔涉及使细胞和DNA悬浮液暴露于高压放电中。在该方法的一些变体中，可应用某些细胞壁降解性酶如果胶降解性酶以使得目标受体细胞比未处理的细胞更加对通过电穿孔的转化易感(美国专利No.5,384,253，在此处将其引入作为参考)。可选择地，可通过机械损伤或本领域公知的其它方法使受体细胞对转化更加易感。
[0142]利用电穿孔对真核细胞的转染是相当成功的。利用这种方式，小鼠前-B淋巴细胞已用人κ免疫球蛋白基因进行转染(Potter等人，1984)，而大鼠肝细胞已用氯霉素乙酰转移酶基因进行转染(Tur-Kaspa等人，1986)。
[0143]人们认为电穿孔的根本现象在所有情况下都是相同的，但导致观察到的作用的确切机制尚未阐明。尽管不想受理论限制，但电穿孔作用明显的表现是在细胞暴露于电脉冲后细胞膜瞬时可透过大分子。跨过细胞壁有管道，该管道在正常情况下通过进行双向离子迁移而维持约(ca.)90mV的静息跨膜电位。
[0144]尽管不想受理论限制，但电穿孔通过强加高了离子流通过这些结构并开放或扩大该管道而利用该结构。在现有技术领域，使金属电极与组织接触放置，并在其上施加与电极间距离成比例的预定电压。用于电穿孔的规程根据公式E＝V/d在结果所得的术语场强中详细说明，其中(“E”)是电场、(“V”)是施加的电压而(“d”)是电极之间的距离。
[0145]当为了将药物或大分子送递入个体细胞中而确定电穿孔规程时，电场强度E是现有技术领域中非常重要的值。因此，可通过应用与电极间距离成比例的预定电压脉冲而计算各个过程中的任何电场强度。然而，一个告诫是电场可在具有绝缘电极的组织中生成(即离子流不是生成电场所必需的)。尽管不想受理论限制，但是本质上电流而非电场是成功的电穿孔所必需。
[0146]在电穿孔中，产生的热是电极间阻抗、电流的平方和脉冲持续时间的乘积。热是在组织中进行电穿孔过程中产生的，并可得自电极间电流、电压和脉冲持续时间的乘积。目前对电穿孔描述的规程以结果所得的场强E限定的，该场强依赖于未知电流的短电压脉冲。因此，不能确定组织电阻和生成的热，这导致利用预定电压的不同脉冲电压电穿孔规程的变化的成功。限制对电极间细胞加热的能力可增加任何给定的电穿孔电压脉冲规程的效力。例如，现有技术领域讲授了6-针电极阵列的应用，该电极在相对的电极对之间利用预定的电压脉冲。该情形在一个区域的电穿孔事件中确立了集中的模式，在该区域发展了适合的和交叉的重叠点。在电穿孔途径中对细胞和组织的过度加热将杀死细胞，并限制该规程的效力。然而，无相应配对的对称排列的针型电极可在一个区域的电穿孔事件中产生分散的模式，在该区域不发展适合的电穿孔重叠点。
[0147]对电极间电流的控制使得人们能够确定细胞相对的热量。因而，确定随后任何给定的脉冲规程的效力是电流而不是跨过电极的电压。预定的电压不产生预定的电流，且现有技术领域不提供确定电流的精确量的方法，这限制了该技术的有效性。因而，将组织中两个电极间的电流控制并维持在一个阈值以下将使得人们能够改变脉冲条件、减少细胞热量、产生较少的细胞死亡并当与预定的电压脉冲比较时更有效地将大分子整合入细胞中。
[0148]本发明的一个实施方案可克服上面的问题，这是通过精确控制在细胞膜管道上撞击的离子流而提供有效控制送递到电极间间隙细胞中的电量的方法实现的。组织的精确电量可计算为电流水平、脉冲长度和送递的脉冲数目的乘积。因而，本发明的一个特定实施方案可在许多途径中向一定体积的组织送递电穿孔电流，而不导致在任何一个位置累积电流过量的浓度，从而避免了由于组织过热而导致的细胞死亡。
[0149]尽管不想受理论限制，但生成的电压脉冲的特性由组织的特性、选择的组织的大小和电极间的距离确定。想要的是电压脉冲尽可能均一并具有正确的振幅。过度的场强导致细胞裂解，而低场强导致降低的电穿孔效率。一些电穿孔设备利用电极间的距离计算用于电穿孔的电场强度和预定的电压脉冲。对电极间距离信息的依赖是对电极设计的限制。因为可编程的电流脉冲控制器将确定一定组织体积中两个电极间的阻抗，所以电极间的距离对于确定适当的电流脉冲不是关键的因素。因此，针型电极阵列设计的另一实施方案是非对称型。此外，本领域技术人员可以设想不背离本发明的精神和范围的任何数目的适当对称和不对称针型电极阵列。每一个单独电极在阵列和在目的组织中的深度可进行改变而具有相似的结果。此外，可将大分子的多个注射位点添加到针型电极阵列中。
XII.限制酶
[0150]在本发明的一些实施方案中，线性DNA片段通过对母体DNA分子进行限制酶消化而生成的。限制酶的例子在下面提供。
名称        识别序列
AatII         GACGTC
Acc65 I      GGTACC
Acc I        GTMKAC
Aci I        CCGC
Acl I        AACGTT
Afe I        AGCGCT
Afl II       CTTAAG
Afl III      ACRYGT
Age I        ACCGGT
Ahd I        GACNNNNNGTC
Alu I        AGCT
Alw I        GGATC
AlwN I       CAGNNNCTG
Apa I        GGGCCC
ApaL I       GTGCAC
Apo I        RAATTY
Asc I        GGCGCGCC
Ase I        ATTAAT
Ava I        CYCGRG
Ava II       GGWCC
Avr II       CCTAGG
Bae I        NACNNNNGTAPyCN
BamH I       GGATCC
Ban I        GGYRCC
Ban II       GRGCYC
Bbs I        GAAGAC
Bbv I        GCAGC
BbvC I       CCTCAGC
Bcg I        CGANNNNNNTGC
BciV I       GTATCC
Bcl I        TGATCA
Bfa I        CTAG
Bgl I        GCCNNNNNGGC
Bgl II       AGATCT
Blp I        GCTNAGC
Bmr I        ACTGGG
Bpm I        CTGGAG
BsaA I       YACGTR
BsaB I       GATNNNNATC
BsaH I      GRCGYC
Bsa I       GGTCTC
BsaJ I      CCNNGG
BsaW I      WCCGGW
BseR I      GAGGAG
Bsg I       GTGCAG
BsiE I      CGRYCG
BsiHKA I    GWGCWC
BsiW I      CGTACG
Bsl I       CCNNNNNNNGG
BsmA I      GTCTC
BsmB I      CGTCTC
BsmF I      GGGAC
Bsm I       GAATGC
BsoB I      CYCGRG
Bsp1286 I   GDGCHC
BspD I      ATCGAT
BspE I      TCCGGA
BspH I      TCATGA
BspM I      ACCTGC
BsrB I      CCGCTC
BsrD I      GCAATG
BsrF I      RCCGGY
BsrG I      TGTACA
Bsr I       ACTGG
BssH II     GCGCGC
BssK I      CCNGG
Bst4C I     ACNGT
BssS I      CACGAG
BstAP I     GCANNNNNTGC
BstB I      TTCGAA
BstE II     GGTNACC
BstF5 I     GGATGNN
BstN I      CCWGG
BstU I      CGCG
BstX I      CCANNNNNNTGG
BstY I      RGATCY
BstZ17 I    GTATAC
Bsu36 I     CCTNAGG
Btg I       CCPuPyGG
Btr I       CACGTG
Cac8 I      GCNNGC
Cla I       ATCGAT
Dde I       CTNAG
Dpn I       GATC
Dpn II      GATC
Dra I       TTTAAA
Dra III     CACNNNGTG
Drd I       GACNNNNNNGTC
Eae I       YGGCCR
Eag I       CGGCCG
Ear I       CTCTTC
Eci I       GGCGGA
EcoN I      CCTNNNNNAGG
EcoO109 I   RGGNCCY
EcoR I      GAATTC
EcoR V      GATATC
Fau I       CCCGCNNNN
Fnu4H I     GCNGC
Fok I       GGATG
Fse I       GGCCGGCC
Fsp I       TGCGCA
Hae II      RGCGCY
Hae III     GGCC
Hga I       GACGC
Hha I       GCGC
Hinc II     GTYRAC
Hind III    AAGCTT
Hinf I      GANTC
HinP1 I     GCGC
Hpa I       GTTAAC
Hpa II      CCGG
Hph I       GGTGA
Kas I       GGCGCC
Kpn I       GGTACC
Mbo I       GATC
Mbo II      GAAGA
Mfe I       CAATTG
Mlu I       ACGCGT
Mly I       GAGTCNNNNN
Mnl I       CCTC
Msc I       TGGCCA
Mse I       TTAA
Msl I       CAYNNNNRTG
MspA1 I     CMGCKG
Msp I       CCGG
Mwo I       GCNNNNNNNGC
Nae I       GCCGGC
Nar I       GGCGCC
Nci I       CCSGG
Nco I       CCATGG
Nde I       CATATG
NgoMI V     GCCGGC
Nhe I       GCTAGC
Nla III     CATG
Nla IV      GGNNCC
Not I       GCGGCCGC
Nru I       TCGCGA
Nsi I       ATGCAT
Nsp I       RCATGY
Pac I       TTAATTAA
PaeR7 I     CTCGAG
Pci I       ACATGT
PflF I      GACNNNGTC
PflM I      CCANNNNNTGG
Ple I       GAGTC
Pme I       GTTTAAAC
Pml I       CACGTG
PpuM I      RGGWCCY
PshA I      GACNNNNGTC
Psi I       TTATAA
PspG I      CCWGG
PspOM I     GGGCCC
Pst I       CTGCAG
Pvu I       CGATCG
Pvu II      CAGCTG
Rsa I       GTAC
Rsr II      CGGWCCG
Sac I       GAGCTC
Sac II      CCGCGG
Sal I       GTCGAC
Sap I       GCTCTTC
Sau3A I     GATC
Sau96 I     GGNCC
Sbf I       CCTGCAGG
Sca I       AGTACT
ScrF I      CCNGG
SexA I      ACCWGGT
SfaN I      GCATC
Sfc I       CTRYAG
Sfi I       GGCCNNNNNGGCC
Sfo I       GGCGCC
SgrA I      CRCCGGYG
Sma I       CCCGGG
Sml I       CTYRAG
SnaB I      TACGTA
Spe I       ACTAGT
Sph I       GCATGC
Ssp I       AATATT
Stu I       AGGCCT
Sty I       CCWWGG
Swa I       ATTTAAAT
Taq I       TCGA
Tfi I       GAWTC
Tli I       CTCGAG
Tse I       GCWGC
Tsp45 I     GTSAC
Tsp509 I    AATT
TspR I      CAGTG
Tth111 I    GACNNNGTC
Xba I       TCTAGA
             CCANNNNNNNNNTG
Xcm I       G
Xho I       CTCGAG
Xma I       CCCGGG
Xmn I       GAANNNNTTC
[0151]如在此处所用的术语DNA的“限制酶消化”指用仅在DNA的某些位置作用的酶对DNA进行催化切割。这种酶称为限制性内切核酸酶，且每一个酶特异性的位点称为限制位点。在此处所用的各种限制酶是商业上可购得的，且应用由酶的供应商确定的反应条件、辅因子和其它必要条件。限制酶通常命名为包含代表最初获得该酶的微生物的一个大写字母附加其它字母以及指明特定酶的数字的缩写。通常，约1μg质粒或DNA片段在20μl缓冲液中应用约1-2单位的酶。特定限制酶的适当缓冲液和底物量是由生产商详细说明的。于37℃温育约1小时是通常应用的，但可根据供应商的说明书而进行改变。在温育后，蛋白质或多肽可通过用酚和氯仿提取而去除，而消化的核酸可通过用乙醇沉淀而从水级分中回收。用限制酶的消化可伴随以细菌碱性磷酸酶对末端5’磷酸的水解以防止DNA片段的两个限制切割的末端“环化”或形成闭合的环，这将阻止另一个DNA片段在限制位点的***。除非另有说明，对质粒的消化不伴随5’末端脱磷酸化。脱磷酸化的程序和试剂如本领域中所述是常规的。
                          实施例
[0152]下面的实施例是包括进来用于证明本发明优选的实施方案的。本领域技术人员将理解在下面实施例中公开的技术代表由本发明者发现的在本发明实践中发挥良好功能的技术，从而可认为组成了其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应该理解可对公开的特定实施方案进行许多变化并仍然获得同样或类似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
                        实施例1
               动物个体中载体的构建和方法
[0153]为了增加瘦体重、降低身体脂肪比例、增加骨密度及改善骨愈合速率，首先需要设计几个GHRH表达构建体。简言之，质粒载体含有连接于猪野生型GHRH或类似物的合成的肌肉特异性启动子SPc5-12(Li等人，1999)。该类似物GHRH序列是如在方法部分所述通过定点诱变生成的。将编码GHRH或类似物的核酸序列克隆入pSPc5-12质粒的BamH I/HindIII位点以生成pSP-GHRH。质粒中含有的其它元件如在方法部分所述包括生长激素的3’非翻译区(“3’UTR”)(SEQ ID No：8)和来自pSEAP-2基本载体的SV40 3’UTR。所用的构建体的独特核酸序列于图1显示。
[0154] DNA构建体：含有肌肉特异性合成性启动子SPc5-12(Seq IDNo：7)的质粒载体在以前描述过(Li等人，1999)。野生型和突变的猪GHRH cDNA通过对GHRH cDNA(Seq ID No：9)的定点诱变生成(AlteredSitesII in vitro Mutagenesis System，Promega，Madison，WI)，并克隆入pSPc5-12质粒的BamH I/HindIII位点以分别生成pSP-wt-GHRH(Seq ID No：15)或pSP-HV-GHRH(Seq ID No：11)。将生长激素的3’非翻译区(3’UTR)克隆入GHRH cDNA的下游。结果所得的质粒含有GHRH突变的编码区，且结果所得的氨基酸序列不天然存在于哺乳动物中。尽管不想受理论限制，但对动物中增加的骨密度和增加的骨愈合速率的作用最终通过突变的激素的循环水平确定。编码GHRH或其功能性生物等价物的不同突变氨基酸序列的几个不同质粒如下：
质粒                           编码的氨基酸序列
wt-GHRH       YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGERNQEQGA-OH(Seq ID No：10)
HV-GHRH       HVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(Seq ID No：1)
TI-GHRH       YIDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(Seq ID No：2)
TV-GHRH       YVDAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(Seq ID No：3)
15/27/28-GHRH YADAIFTNSYRKVLAQLSARKLLQDILNRQQGERNQEQGA-OH(Seq ID No：4)
[0155]通常，编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH(Seq ID No：6)
其中：X1是选自酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的氨基酸的D-或L-异构体；X2是选自丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的氨基酸的D-或L-异构体；X3是选自丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的氨基酸的D-或L-异构体；X4是选自甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的氨基酸的D-或L-异构体；X5是选自丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的氨基酸的D-或L-异构体。
[0156]所用的另一个质粒包括含有Sac I/HindIII SPc5-12片段、SEAP基因和来自pSEAP-2基本载体的3’UTR的pSP-SEAP构建体(Seq IDNo：16)(Clontech Laboratories，Inc.；Palo Alto，CA)。
[0157]上述质粒不含有多接头、IGF-I基因、骨骼α-肌动蛋白启动子或骨骼α肌动蛋白3’UTR/NCR。此外，这些质粒是如下文所述通过肌肉注射及随后的体内电穿孔引入的。
[0158]在术语“功能性生物等价物”中，本领域技术人员充分理解的是定义“生物功能等价物”蛋白质、多肽和/或多核苷酸中固有的是如下概念，即对保持具有可接受水平的等价生物活性的分子时在分子的特定部分进行改变的数目是有限的。因而功能性生物等价物在此处定义为对其中选择的氨基酸(或密码子)可进行替代的蛋白质(或多核苷酸)。包含GHRH功能性生物等价物的肽是与GHRH比较时同时已改造而含有不同的氨基酸序列但具有相似或改善的生物活性的多肽。例如，GHRH的一种生物活性是在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
[0159] 电穿孔设备。将BTX T820发电机(BTX，division ofGenetronics Inc.，CA)用于在所有实验中送递正方形波脉冲。应用100-200V/cm、6个脉冲、60毫秒每脉冲的电压条件。将卡钳和针型电极(BTX，division of Genetronics Inc.，CA)用于体内送递电脉冲。平板(卡钳)电极由在标尺上安装的1.5平方厘米金属块组成，从而平板间的距离易于估计；6-针设备由在非导体材料上安装的6个等间距实心21-号针环形阵列(直径1cm)组成。3-针设备由2个实心的和1个管状的针组成，最后一个同时用作电极和用于送递质粒。所有的针长度均为2cm。在所有注射中该针均完全***到肌肉中。
[0160]技术人员认识到任何相似的电穿孔设备和参数均可用于本发明中，只要该设备可将核酸序列送递入细胞、组织或器官中。
[0161] 猪中质粒DNA的肌内注射。将体重4-5kg的2-或3-周龄的杂交小猪(Yorkshir x Landrace x Hampshire x Duroc)(Huntsville，TX)或Yorkshire x Landrace猪用于分泌型胚胎碱性磷酸酶的研究中(n＝3/组)。对于GHRH质粒研究，将孕期母猪(Yorkshire x Landrace)在预定分娩日的3周前带到贝尔医学院(Baylor College of Medicine)的儿童营养研究中心(Children Nutrition Research Center)。小猪在实验室中出生。将小猪随机分配到一个实验(n＝2头猪/组/系列)或对照(n＝3)组。将所有实验重复3次。将动物在前21日进行哺乳，然后单独饲养，不限制用水。对于GHRH研究，在断奶后，每日用猪体重6％的24％蛋白质食物(Producers Cooperative Association，Bryan，TX)饲喂该猪。每周将这些动物在一天中的相同时间称重2次，并随后确定饲料的量。该动物根据NIH Guide、USDA and Animal Welfare Actguidelines维持，并获得了Baylor College of Medicine IACUC的批准。
[0162]将无内毒素的质粒(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA，美国)制剂在pH 7.4的PBS中稀释到1mg/ml。将质粒DNA用21号针跨过完整皮肤注射入半腱肌或背最长肌中。2分钟后，将外部卡钳电极或注射型电极(6-针阵列或3-针阵列)应用于注射后的肌肉，并应用200V/cm的60毫秒/脉冲的6个脉冲。脉冲的极性为恒定的或在两个电极间反转的。
[0163]在质粒注射前和注射后3、7、14、21、35和45日通过颈静脉穿刺收集血液。在注射后50日，将动物处死，将内部器官和注射的肌肉收集、称重、在液氮中冷冻并贮存于-80℃或置于10％缓冲的***中用于组织学。
[0164]尽管体内电穿孔是将核酸构建体送递入个体细胞中的优选方法，但人们相信用于核酸送递以转化用于本发明的细胞器、细胞、组织或生物的适当方法实际上可包括任何方法，通过该方法可将核酸(如DNA)引入到细胞器、细胞、组织或生物中，如此处所述或如本领域技术人员公知的。这种方法包括但不局限于直接的DNA送递，如通过离体转染(Nabel等人，1989；Wilson等人，1989)，通过注射(美国专利No.5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自均在此处引入作为参考)，包括显微注射((Harland和Weintraub，1985)美国专利No.5,789,215，在此处引入作为参考)；通过电穿孔(美国专利No.5,384,253，在此处引入作为参考；(Potter等人，1984；Tur-Kaspa等人，1986))；通过磷酸钙沉淀(Chen和Okayama，1987；Graham和van der Eb，1973；Rippe等人，1990)；通过应用DEAE-葡聚糖和随后的聚乙二醇(Gopal，1985)；通过直接超声处理加载(Fechheimer等人，1987)；通过脂质体介导的转染(Hafez等人，2001；Hamm等人，2002；Madry等人，2001；Raghavachari和Fahl，2002；Wiethoff等人，2001)和受体介导的转染(Wu和Wu，1988a；Wu和Wu，1988b)；通过微弹轰击(PCT申请No.WO 94/09699和95/06128；美国专利No.5,610,042、5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，各自均在此处引入作为参考)；通过用碳化硅纤维激发((Johnson等人，1992)；美国专利No.5,302,523和5,464,765，各自均在此处引入作为参考)；通过农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(美国专利No.5,591,616和5,563,055，各自均在此处引入作为参考)；通过PEG-介导的原生质体转化(Omirulleh等人，1993；美国专利No.4,684,611和4,952,500，各自均在此处引入作为参考)；通过干燥/抑制介导的DNA摄入(Potrykus等人，1985)及这种方法的任何组合。通过应用如这些技术，可将细胞器、细胞、组织或生物体稳定地或短暂地转化。
[0165] 猪血浆IGF-I和胰岛素浓度。猪IGF-I浓度是用异源人放射免疫(radio immunometric)测定进行测量的(Diagnostic SystemLab.，Webster，TX)。该测定的灵敏性为0.8ng/ml；测定内和测定间变异分别为3.4％和4.5％。猪胰岛素是用异源人放射免疫测定进行测量的(Linco Research Inc.，St.Charles，MO)。该测定的灵敏性水平为2μU/ml；测定内和测定间变异分别为3.2％和3.9％。
[0166] 身体组成数据。体重是在研究过程中每周两次在相同的校准天平(被证实具有达±0.2kg的准确性和0.3％的变异系数)上进行测量。身体组成测量是在出生后50日在体内进行的。将小猪用甲苯噻嗪(xylazine)(15mg/kg)和***(2mg/kg)的组合进行麻醉，且总身体脂肪含量、脂肪百分比、非骨的瘦组织重量和骨矿物含量通过双重能量x-射线吸收比色计(dual energy x-ray absorbitometry)(Hologic QDR-2000，Waltham，Massachusetts)(“DEXA”)进行测量(Toner等人，1996)。总的身体钾是用全身探测器在钾室(“K40”)中进行测量的(Cohn等人，1984)。
[0167] 统计学。数据是用STATISTICA分析软件包(StatSoft，Inc.Tulsa，OK)进行分析的。图中所示的值为平均数±s.e.m.。特定的P值是通过用ANOVA进行比较而获得的。将P＜0.05设置为统计学显著水平。
                             实施例2
                    体内的组成型GHRH***
[0168]为了检验体内组成型***，将7.5微克pSP-GHRH或其功能性生物等价物(图1)送递入SCID小鼠中。所有GHRH类似物均通过对猪野生型序列进行定点诱变而获得。将5只小鼠的组用7.5微克表达GHRH类似物之一或pSP-β-半乳糖苷酶作为对照的质粒进行注射。在注射后45日，将动物通过PIXImus进行分析(Draghia-Akli等人，2002)(对于小鼠为DEXA)，处死，将血液和器官收集并称重。在实验结束时，TI-GHRH和HV-GHRH动物显著比对照大(图2)。注射的SCID小鼠的身体组成也改变了。在注射后45日，用TI突变体注射的动物与对照相比瘦体重显著地增加了11％，p＜0.036。HV-GHRH注射的动物具有几乎5％的瘦体重显著增加(图3)。所有GHRH注射组均具有比对照动物大的骨区域，高达10.7％，在TI-GHRH注射组中，p＜0.027(图4)。在注射后14和28日，收集血液并测量IGF-I水平(图5)。所有GHRH注射组与对照动物相比均具有显著增高的IGF-I水平，高达p＜0.005。一些组产生了中和性抗体，且在这些情况下IGF-I水平在第二个时间点下降了。用TI-GHRH注射的动物不产生任何抗体，且其GHRH表达继续到45日，这与其身体组成的显著变化相关。
                          实施例3
                    体外诱导型GHRH***
[0169]为了检验体外诱导型***，将原代鸡成肌细胞如前文所述用4微克GHRH/基因开关质粒、pGR1774(诱导型GHRH)/pGS1633(基因开关)的10∶1w/w比例混合物进行转染(Bergsma等人，1986；Draghia-Akli等人，1997)，这在骨骼肌细胞中得到了最好的总表达，并使细胞分化为有丝***后的肌管。在转染后24和48小时，将细胞在PBS中洗涤，并且在需要时将MFP加入到培养基中。在分化后72小时收获培养基和细胞。将20μg总RNA用DNase I进行处理，在1.5％的琼脂糖-甲醛凝胶上进行大小分离并转移到尼龙膜上。使该膜与特定的GHRHcDNA探针进行杂交，该探针是通过随机引发进行32P-标记的。负对照为用基因开关和GHRH质粒转染但不用MFP处理的细胞，或者为仅用诱导型GHRH质粒转染的细胞。正对照为用组成型表达的GHRH质粒转染的细胞，该质粒由合成的肌肉特异性启动子(“SP-GHRH”)驱动的。预期的0.35kb大小的GHRH转录物仅在用基因开关/诱导型GHRH质粒转染并用MFP处理的细胞和用正对照转染的细胞中观察到(图7)。在未用MFP处理的细胞中或在仅用诱导型GHRH质粒转染的细胞中未观察到GHRH转录物。
                         实施例4
体内GHRH/基因开关 ***-改善的身体组成和脂肪体重/总体重
[0170]对于体内实验，将GHRH/基因开关***的质粒送递入SCID小鼠肌肉中。将左胫骨前肌用10μg pGR1774/pGS1633的10∶1混合物进行注射，随后进行卡钳电穿孔(Draghia-Akli，1999)。在注射后21日，将动物用250微克/kg的MFP在***间(inter preineum)(“i.p.”)注射3日。在第4日，使动物放血并将血清用于测量IGF-I水平。小鼠IGF-I是用异源的100％交叉反应性大鼠放射免疫测定测量的。该测定的灵敏性为0.8ng/ml；测定内和测定间的变异分别为3.4％和4.5％。在连续4日给予MFP后，IGF-I水平从1100.86±33.67ng/ml增加到1797.28±164.96ng/ml(p＜0.0005)。当将MFP组与对照组1086.78±65.34ng/ml，p＜0.0006(接受了对照β-半乳糖苷酶质粒的动物)、1171.79±42ng/ml，p＜0.001(接受了GHRH/基因开关质粒但未给予MFP的动物)比较时可看到IGF-I水平中显著的变化。在用相同的规程重复给予动物MFP并随后在149日中的7日中恢复到背景时，血清IGF-I水平重复地比未注射的对照升高了1.1-1.7倍(图8)。用MFP诱导的动物具有统计学显著较高的IGF-I水平。
[0171]在研究的前125日中所有组的体重均相似(图9)。然而，从125日到149日，每日对小鼠给予MFP。与β-gal对照29.62±0.98g和未用MFP诱导的动物30.53±0.59g相比，在长期MFP-诱导的GHRH/基因开关动物中观察到了增加了7.5％的体重，平均为31.84±0.12g(p＜0.027)。所有值均为平均数±SEM。将器官(肺、心、肝、肾、胃、肠、肾上腺、生殖腺、脑)收集并称重。在任何动物中未观察到器官巨大症或相关的病状。在死后第1分钟内将垂体腺解剖并称重。与β-gal对照(6.13±0.46×10-5)和未给予MFP的动物(6.3±0.22×10-5)相比，在GHRH/基因开关的长期刺激后垂体重量/总体重(图10)增加了20％(7.35±0.31×10-5)，p＜0.035。在β-gal注射动物和用基因开关***注射但未给予MFP的动物之间无显著地统计学差异。尽管不想受理论限制，但垂体重量的增加可能是由于促生长激素细胞过度生长，这是因为已知GHRH能够刺激GH从垂体前叶合成/分泌并对促生长激素细胞具有促进生长的特定作用(Morel等人，1999；Murray等人，2000)。在实验结束时，在体内用高分辨率PIXImus扫描仪通过双重能量x-射线吸收比色计(dual energy x-ray absorbitometry)(“DEXA”)对身体组成进行分析。通过PIXImus对身体组成的研究(总身体脂肪、非骨的瘦组织重量和骨的矿物区域、含量和密度)显示在长期MFP诱导的动物中有显著的变化，该动物是用基因开关***注射的。瘦体重(非骨的)(图11)在基因开关动物+MFP中增加了2.5％(87.44±0.65％，相对于β-gal 84.94±0.6％和无MFP的动物84.88±0.3％)，p＜0.022。脂肪重量(图12)在基因开关动物中降低了2％(12.59±0.62％，相对于β-gal 14.57±0.75％和无MFP的动物15.09±0.3％)，p＜0.05。
                        实施例5
       体内GHRH/基因开关 -增加的骨区域和矿物含量
[0172]本发明的一个方面涉及证明编码GHRH或其功能性生物等价物的米非司酮诱导型异源核酸序列向个体细胞中的引入可导致高水平的循环激素(Mir等人，1999)，而不导致与病毒载体送递或细胞器相关的缺点(如高生产成本、病毒骨架的安全考虑或离体处理)(Barr和Leiden，1991；Dhawan等人，1991；Draghia-Akli等人，1999)。此外，本发明必须证明在经过基因开关技术体内电穿孔(即编码GHRH或其功能性生物等价物的米非司酮诱导型异源核酸序列)进入个体的骨骼肌中之后米非司酮可有效调节动物生长和身体组成，如在图6中示意性的图示。在注射后149日中观察到了增强的生物能力、送递和正确的基因表达调节，并有效减少了与重组GHRH治疗相比获得生理水平的GH分泌所需要的GHRH理论量。在基因开关技术治疗中注射后的患者未经历任何副作用。例如，小鼠具有正常的生物化学特征，而无相关的病状或器官巨大症。从功能的观点看，在GHRH/Gene Switch***的长期诱导之后IGF-I水平增加了、生长增强了7.5％，并观察到了身体组成中的变化(如增加了2.5％的瘦体重和降低了2％的脂肪)。此外，骨矿物密度增加了6％，且GHRH对骨代谢的刺激是极其显著的。尽管不受理论限制，但观察到的垂体增长说明生肌GHRH质粒异位表达沿天然GH轴作用(刺激GH合成和在垂体水平的分泌)。该长效的受调节的治疗具有替代经典GH治疗法的潜力，并可以更加生理上适当的方式刺激GH轴。公知的是GHRH刺激骨形成(Dubreuil等人，1996)，且描述的基因开关治疗可用于促进骨折后的骨生长。
[0173]在GHRH/基因开关***的长期刺激后，在骨区域(图13)中发生了显著的变化，该区域增加了7％，(12.81±0.14cm2，相对于B＝Beta β-gal注射的对照，11.98±0.3cm2或无MFP的动物12.07±0.26cm2)，p＜0.0006；骨矿物含量(图14)增加了14.6％(0.755±0.012g，相对于β-gal注射的对照0.659±0.019g或无MFP的动物0.694±0.023cm2)，p＜0.002；且骨矿物密度增加了6％(0.059±0.0007g/cm2，相对于β-gal注射的对照0.056±0.0009g/cm2或无MFP的动物0.057±0.0007g/cm2)，p＜0.012。事实上，在β-gal注射的动物和用GHRH/基因开关注射但未给予MFP的动物之间无总体的差异，这支持不给予MFP时GHRH/基因开关质粒无GHRH的表达。
                         实施例6
       低电压电穿孔增加了质粒摄入和在成体猪中的表达
[0174]直接肌内注射质粒DNA后进行电穿孔是将质粒DNA向骨骼肌中进行局部和有控制的送递的方法。它具有应用低的质粒量的优点(在猪中低达0.1mg)，而不是被动送递形式中一般所用的高量。尽管不想受理论限制，但通过电穿孔增加质粒摄入的机制可能通过新生成的具有或不具有蛋白质活性转运的膜孔发生的。已显示肌肉细胞的透化程度依赖于电场强度、脉冲长度、电极的形状和类型(Bureau等人，2000；Gilbert等人，1997)和细胞大小(Somiari等人，2000)。经典的电极构型，间隔4mm放置的金属板或一对金属丝电极在啮齿动物中显示是有效的，但在大的哺乳动物如猪或人中，皮肤增加的电阻、皮下脂肪组织的厚度和如果电场强度将成比例增加时对组织损害的考虑使得这些类型的电极不实用。猪的肌纤维是相当大的，因此比啮齿动物肌肉更适合于进行电透化。在此处提供的数据显示最适剂量的质粒单一注射及伴随的应用肌内施用器的电穿孔足以在大哺乳动物中产生治疗性的血浆激素水平，这对个体的身体脂肪分配和瘦体重具有显著的生物影响。
[0175]对外部卡钳电极和注射型电极进行了估计以确定在4-5kg杂交猪中产生所选报道蛋白质生理相关水平所必需的电极类型。将表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(“SEAP”)的报道载体以2mg pSP-SEAP/动物的剂量用于这些研究中。将6-针和3-针阵列电极与标准的卡钳电极进行比较(图15)。将以前检验中对猪最有效的条件应用于所有检验中，该条件为6个脉冲、200V/cm、60毫秒/脉冲(Draghia-Akli等人，1999)。对于3-针电极，在一个方向应用3个脉冲，然后改变极性并在相反的方向送递后3个脉冲。在注射后第0日、第3日和第7日测量SEAP值。注射后7日，与载体注射的动物中SEAP水平0.02±0.005ng/(ml·kg)相比，质粒注射的和卡钳电穿孔的动物中为9.33±2.26ng/(ml·kg)。利用3-针和6-针阵列，与卡钳送递相比在SEAP值中获得了12.4和19倍的增加(分别为116.07±44.36ng/(ml·kg)和177.41±18.44ng/(ml·kg))。当应用相同脉冲数目但较低电压(100V/cm)和6-针电极时，平均SEAP在7日后增加到144.64±11.82ng/(ml·kg)。当背最长肌和半腱肌用相似条件进行注射时，半腱肌中的表达略高。在实验结束时(注射后50日)收集注射的猪中的皮肤和肌肉并进行组织学分析。在注射型电极实验中所用的100-200V/cm条件下，对于所用的任何针型电极均未观察到皮肤或肌肉损害。
                        实施例7
          用针型电穿孔送递治疗性蛋白质的效率增加
[0176]不想受理论限制，生长激素释放激素(“GHRH”)刺激生长激素(“GH”)从垂体前叶的产生和释放，这反过来刺激IGF-I从肝和其它目标器官中的产生(Frohman等人，1968)。在以前的研究中(Draghia-Akli等人，1999)，将重4-5kg的猪幼仔用10mg表达对蛋白酶稳定的突变GHRH形式(“pSP-HV-GHRH”)的生肌载体进行注射并用卡钳电极进行电穿孔。
[0177]本发明涉及确定对猪幼仔治疗的最佳年龄。将2只小猪的组利用6-针阵列电极在不同时间点用2mg pSP-HV-GHRH进行注射：7、14和21日龄(图16)。每一只动物接受一次注射。在14日龄注射的组显示最好的体重增加(在每一个时间点均为统计学显著的且与PBS对照(n＝3)不同(终体重：25.8±1.5kg对19.7±0.03kg，p＜0.013))。次好的组为在7日龄注射的组，且在50日龄时重21.9±1.5kg，p＜0.02。
[0178]在一个平行的研究中，研究了为实现猪改善的增长和代谢及激素特征所需的质粒量的减少。将每组2只小猪的组(Yorkshine xLandrace)在10日龄用pSP-HV-GHRH(3mg、1mg、0.1mg)进行注射，并用6-针阵列电极进行电穿孔(图17)。用0.1mg质粒注射的组具有最大的体重增加，其在50日龄与对照(n＝3)具有统计学显著的差异(22.4±0.8kg对19.7±0.03kg，p＜0.012)。在第21日注射的组中的一个动物和用最高质粒剂量(3mg)注射的一个动物产生了针对突变型HV-GHRH的中和性抗体并显示降低的体重增加率(与在相同处理组中配对的动物超过21kg相对，在注射后50日分别为15.6kg和15.95kg)。其它组均未产生中和性抗体。因而，最小的质粒剂量(0.1mg)和用6-针电极在最适年龄的注射导致最好的生长表现。应该注意的是在以前的研究中，本发明者以卡钳电极应用100-倍低的即10mgpSP-HV-GHRH以产生相似的变化。
[0179]增加的全身GHRH和GH水平的指示是血清IGF-I浓度的增加。血清IGF-I水平在接受了0.1和1mg剂量的pSP-HV-GHRH的猪中于注射后3日开始增加(图18)。在注射后35日(动物日龄：45日)，与对照相比，血清IGF-I浓度在用0.1mg质粒注射的猪中为约10-倍高，且在用1mg质粒注射的猪中为约7-倍高(分别为p＜0.007和p＜0.04)。
[0180]在最适条件下，pSP-HV-GHRH注射的猪中血清尿素降低了(与对照中11.14±1.9mg/ml相对，在pSP-HV-GHRH注射的猪中分别为8.36±1.33到9.67±1.27mg/ml，(p＜0.05))，从而显示降低的氨基酸分解代谢。血清葡萄糖水平在质粒pSP-HV-GHRH注射的猪和对照之间相似；胰岛素水平正常且在控制范围之内。
                          表1
           pSP-HV-GHRH注射的和对照的猪的血浆代谢特征
组         葡萄糖         尿素         肌氨酸       总蛋白
日龄       (mg/ml)        (mg/ml)      (mg/ml)      (g/dl)
第0天      125.82±5.64   8.36±1.33   0.85±0.05   4.81±0.11
                          p＜0.01
第7天      122.43±5.05   9.43±1.67   0.87±0.04   5.21±0.19
                          p＜0.03
第14天     129.54±6.39   9.62±1.72   1.00±0.04   5.22±0.20
                          p＜0.02
第21天     110.25±5.02   13.83±1.2   0.93±0.05   4.81±0.21
剂量
3mg        111.07±3.88   10.50±1.87  0.9±0.09    3.89±0.16
                          p＜0.05
1mg        121.63±2.93   9.44±1.07   0.81±0.06   4.11±0.11
                          p＜0.02
0.1mg      120.73±2.53   9.67±1.27   0.95±0.05   4.05±0.19
                          p＜0.02
对照       119.77±3.67   12.81±2.01  0.98±0.08   4.00±0.11
[0181]这些动物具有正常的糖类代谢的事实是非常重要的，这是因为重组GH治疗下的大多数牲畜和/或患者出现了消弱的葡萄糖代谢和胰岛素抗性。在所有动物中肌酸酐浓度(肾功能的测量)是正常的。产生了GHRH抗体的猪显示增加的尿素水平和降低的葡萄糖水平的趋势。
[0182]通过双重能量x-射线吸收比色计(总身体脂肪、非骨的瘦体重和骨矿物含量)、K40钾(瘦体重)和畜体中子活化分析(氮)的身体组成研究显示GHRH注射的动物中所有内部器官(心、肺、肝、脾、脑、肾上腺、胃、肾、胰、肠)成比例的增加。然而，最终的身体组成是不同的：在不同年龄用pSP-HV-GHRH注射的动物比对照获得了按比例减少的脂肪，且在研究结束时更瘦(与对照5.63±0.34g相对，对于在出生时注射的为4.34±0.04g获得的脂肪/kg每日获得的无脂肪重量，对于在7日注射的为4.4±0.04g，p＜0.05)。在出生后14日注射的动物中骨矿物密度更高，且与处理增加的效率相关：0.363±0.005g/cm2与对照中的0.329±0.003g/cm2相对，p＜0.004。
[0183]处理的猪不经受来自治疗的任何副作用、具有正常的生物化学特征且不具有相关的病状或器官巨大症。从功能的观点看，IGF-I水平中的增加和生长的增强和身体组成中的变化(减少了22％的脂肪沉积)程度是引人注目的。GHRH对骨代谢刺激的作用是更加显著的，其中骨矿物密度增加了10％。这些结果显示生肌HV-GHRH分子的异位表达具有替代经典GH治疗法的潜力，且可以生理更适合的方式刺激GH轴。在猪中产生高度稳定性和GH分泌活性的HV-GHRH也可用于人类临床医学中。然而，技术人员知道应该在有关的模型上确定最小的质粒剂量并应用以避免与抗体产生相关的不利病状，且本领域和/或在此处描述的常规方法讲授如何实现该目标。
[0184]用于在任何可能编码的核酸序列中产生改变的分子技术是充分确立的，且通过分子生物领域中大量科学出版物和专利进行示范。尽管生成独特核酸序列的技术有精确性，但技术人员认识到任何给定的核酸的表达将影响整个生物的复合物生物化学。因而，必须不将构建唯一核酸序列的高度可预测的特性与相关生物作用的未知因素搞乱。
[0185]在此处提供的本发明涉及几个不同的GHRH或类似物核酸序列的应用。基于目前对蛋白质-蛋白质相互作用的理解，精确推测含有点突变的GHRH序列的体内参数(如半衰期、功效、翻译后修饰等)既不是明显的也不是可能的，该点突变改变了多肽链中的单个氨基酸。如在此处提供的实施例中看到的，少数碱基对的突变产生了具有显著较长的生物可用性的GHRH突变体。内源GHRH在不同的物种中具有6-12分钟的半衰期。HV-GHRH具有6小时的半衰期。在进一步的分析中，TI-GHRH(与HV-GHRH仅具有2个碱基对的差异)已显示在体内对瘦体重具有比HV-GHRH更高的作用(从简单的到两倍的)。该性质在对垂体细胞的广泛体外研究中不是明显的。相应地，本领域的技术人员将知道如何进行质粒介导的GHRH补充或相关的重组蛋白质实验，从而对特定组织中独特核酸序列上的变异和变更进行表征以精确估计活生物中的体内作用。因此，利用编码GHRH或其功能性生物等价物或相应的重组蛋白质的不同核酸序列作为降低身体脂肪比例和增加瘦体重的方法不可基于推测进行预测。
[0186]尽管不想受理论限制，但人们相信GHRH或其功能性生物等价物中的增加将增加GH水平以降低身体脂肪比例和增加瘦体重。激素(如GHRH和GH)常含有复杂的反馈调节的途径。如果没有对用于基因或重组蛋白质治疗中的GHRH或类似物的直接实验，预计本领域的技术人员将不能确定非天然编码的序列的何种浓度将产生目的结果。编码GHRH或其功能性生物等价物的核酸序列的理想调节进一步由用于多核苷酸送递的组织复杂化，且如果没有在特定组织中用不同序列的实际实验则对本领域技术人员将不会显而易见。在此处描述的本发明含有研究不同核酸序列的组织特异性和诱导型调节的基本实验的描述和结果，该核酸序列编码GHRH或其功能性生物等价物，这基于现有技术是不明显的。本发明在对大动物包括人发展非病毒治疗中是一个显著前进的步骤。为了将基因治疗从啮齿动物转移到大哺乳动物中并最后到人类，令人惊讶的是非常低量的质粒即是有效的。在此处显示的是低达0.1mg的在适当的电穿孔条件下送递的质粒具有在个体中降低身体脂肪比例、增加瘦体重(“LBM”)或两者的重要生物影响。该质粒量比理论量低100倍，且不能从用于啮齿动物中的相关剂量(平均1mg/kg)来预测。尽管不想受理论限制，但与其它应用生长因子(GH和/或IGF-I)的治疗不同，GHRH刺激激素的内源分泌并增强动物自身的生物潜力，而无副作用。该实验结果不能由理论预测，这是因为该3种激素是相同生长轴的成员。
[0187]瘦体重的增加、身体脂肪比例的降低、骨密度的增加和/或骨愈合速率的增加是个体循环中存在GHRH分子的结果，而与送递的方法无关。例如，人们可通过经典的重组蛋白质治疗或核酸转移而送递适当量的GHRH或其类似物而获得相同的作用，如图1概述的。因此，成功的质粒介导的GHRH补充需要编码的序列向个体细胞中的精确送递，从而导致基因产物以适合于产生生物作用的水平进行表达。该处理的持续时间将延伸于疾病症状的过程，且尽可能为连续的。由于将核酸序列送递入个体细胞中的方法高度依赖于特定的疾病和编码的基因，所以如果没有艰苦和失败的实验，本领域的技术人员则不能预测何种方法和条件是适当的。因而，本发明概述的优选方法是体内电穿孔。
[0188]本领域的技术人员易于理解本发明非常适合于实现该目标并获得提及的以及在此处固有的结果和优点。在此处描述的方法、程序、技术和试剂盒目前代表优选的实施方案并意在示例而非范围限制。本领域的技术人员可想到本发明的精神包含的或由本发明范围限定的改变和其它应用。
[0189]在此处公开和申请专利的所有方法和组合物根据本公开内容均无需不适当的实验而进行制备和实施。尽管本发明的方法和组合物是根据优选的实施方案进行描述的，但对于本领域技术人员显而易见的是可对该***和组合物应用改变而不背离本发明的概念、精神和范围。更具体地，明显可将某些化学、结构和生理学相关的试剂替代此处描述的试剂，而将获得相同或相似的结果。所有这种对于本领域技术人员显而易见的替代物和组合物均被认为在由附加的权利要求所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
引用的参考文献
在此处以它们向那些在此处提出的提供示例性程序或其它详细补充的程度特定地将下面的参考文献引入作为参考。
                                       美国专利文件
U.S.Patent No.5,847,066 issued on December 8，1998 with Coy et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,846,936 issued on December 8，1998 with Felix et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,792,747 issued on August 11，1998 with Schally et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,776,901 issued on July 7，1998 with Bowers et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,756,264 issued on May 26，1998 with Schwartz et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,696,089 issued on December 9，1997 with Felix et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,486,505 issued on January 23，1996 with Bowers et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,292,721 issued on March 8，1994 with Boyd et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,137,872 issued on August 11，1992 with Seely et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,134.120 issued on July 28，1992 with Boyd et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,084,442 issued on January 28，1992 with Felix et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,061,690 issued on October 29，1991 with Kann et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,036,045 issued on July 30，1991 with Thorner listed as the inventor.
U.S.Patent No.5,023,322 issued on June 11，1991 with Kovacs et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,839,344 issued on June 13，1989 with Bowers et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,410,512 issued on October 18，1983 with Bowers et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.RE33,699 issued on September 24，1991 with Drengler listed as the inventor.
U.S.Patent No.4,833,166 issued on May 23，1989 with Grosvenor et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,228,158 issued on October 14，1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,228,156 issued on October 14，1980 with Momany et al.isted as inventors.
U.S.Patent No.4,226,857 issued on October 7，1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,224,316 issued on September 23，1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,223,021 issued on September 16，1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,223,020 issued on September 16，1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,223,019 issued on September 16，1980 with Momany et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.4,956,288 issued on September 11，1990 with Barsoum listed as inventor.
U.S.Patent No.5,704,908 issued on January 6，1998 with Hofmann，et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,702,384 issued on December 30，1997 with Umeyama，et al.listed as inventors.
U.S.Patent No.5,439,440 issued on August 8，1995 with Hofmann listed as inventor.
U.S.Patent No.5,874,534 issued on February 23，1999 with Vegeto，et al as inventors.
U.S.Patent No.5,935,934 issued on August 10，1999 with Vegeto，et al as inventors.
U.S.Patent No.5,789,215 issued on August 4，1998 with Berns，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,384,253 issued on January 24，1995 with Krzyzek，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,994,624 issued on November 30，1999 with Trolinder，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,981,274 issued on November 9，1999 with Tyrrell，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,945,100 issued on August 31，1999 with Fick as inventor.
U.S.Patent No.5,780,448 issued on July 14，1998 with Davis as inventor.
U.S.Patent No.5,736,524 issued on April 7，1998 with Content，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,702,932 issued on December 30，1997 with Hoy，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,656,610 issued on August 12，1997 with Shuler，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,589,466 issued on December 31，1996 with Felgner，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,580,859 issued on December 3，1996 with Felgner，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,610,042 issued on March 11，1997 with Chang，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,322,783 issued on June 21，1994 with Tomes，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,563,055 issued on October 8，1996 with Townsend，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,550,318 issued on August 27，1996 with Adams，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,538,877 issued on July 23，1996 with Lundquist，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,538,880 issued on July 23，1996 with Lundquist，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,302,523 issued on April 12，1994 with Coffee，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,464,765 issued on November 7，1995 with Coffee，et al.as inventors.
U.S.Patent No.5,591,616 issued on January 7，1997 with Hiei，et al.as inventors.
U.S.Patent No.4,684,611 issued on August 4，1987 with Schilperoort，et al.as inventors.
U.S.Patent No.4,952,500 issued on August 28，1990 with Finnerty，et al.as inventors.
WO 94/09699
WO95/06128；
参考文献列表
Abruzzese，R.V.，D.Godin，M.Burcin，V.Mehta，M.French，Y.Li，B.W.O′Malley，andJ.L.Nordstrom.1999.Ligand-dependent regulation of plasmid-based transgeneexpression in vivo.Hum.Gene Ther.10：1499-1507.
Abruzzese，R.V.，D.Godin，V.Mehta，J.L.Perrard，M.French，W.Nelson，G.Howell，M.Coleman，B.W.O′Malley，and J.L.Nordstrom.2000.Ligand-dependentregulation of vascular endothelial growth factor and erythropoietin expression by aplasmid-based autoinducible GeneSwitch system.Mol.Ther.2：276-287.
Aihara，H.and J.Miyazaki.1998.Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.Nat.Biotechnol. 16：867-870.
Almendro，N.，T.Bellon，C.Rius，P.Lastres，C.Langa，A.Corbi，and C.Bernabeu.1996.Cloning of the human platelet endothelial cell adhesion molecule-1 promoter andits tissue-specific expression.Structural and functional characterization.J.Immunol.157：5411-5421.
Aratani，Y.，R.Okazaki，and H.Koyama.1992.End extension repair of introducedtargeting vectors mediated by homologous recombination in mammalian cells.Nucleic Acids Res.20：4795-4801.
Argente，J.，J.Pozo，and J.A.Chowen.1996.The growth hormone axis：control andeffects.Hormone Research 45 Suppl 1：9-11.
Barr，E.and J.M.Leiden.1991.Systemic delivery of recombinant proteins by geneticallymodified myoblasts.Science 254：1507-1509.
Bercu，B.B.，R.F.Walker 1997.Growth Hormone Secretagogues In Children WithAltered Growth.Acta Paediatrica 86：102-106.
Bergsma，D.J.，J.M.Grichnik，L.M.Gossett，and R.J.Schwartz.1986.Delimitation andcharacterization of cis-acting DNA sequences required for the regulated expressionand transcriptional control of the chicken skeletal alpha-actin gene.Molecular &Cellular Biology 6：2462-2475.
Bettan，M.，F.Emmanuel，R.Darteil，J.M.Caillaud，F.Soubrier，P.Delaere，D.Branelec，A.Mahfoudi，N.Duverger，and D.Scherman.2000.High-level protein secretioninto blood circulation after electric pulse-mediated gene transfer into skeletalmuscle.Mol.Ther.2：204-210.
Blethen，S.L.1995.Complications of growth hormone therapy in children.Curr.Opin.Pediatr.7：466-471.
Blethen，S.L.and A.C.Rundle.1996.Slipped capital femoral epiphysis in childrentreated with growth hormone.A summary of the National Cooperative GrowthStudy experience.Horm.Res.46：113-116.
Bohlen，P.，F.Esch，P.Brazeau，N.Ling，and R.Guillemin.1983.Isolation andcharacterization of the porcine hypothalamic growth hormone releasing factor.Biochem.Biophys.Res.Commun.116：726-734.
Boshart，M.，F.Weber，G.Jahn，K.Dorsch-Hasler，B.Fleckenstein，and W.Schaffner.1985.A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene ofhuman cytomegalovirus.Cell 41：521-530.
Bureau，M.F.，J.Gehl，V.Deleuze，L.M.Mir，and D.Scherman.2000.Importance ofassociation between permeabilization and electrophoretic forces for intramuscularDNA electrotransfer.Biochim.Biophys.Acta 1474：353-359.
Carbonelli，D.L.，E.Corley，M.Seigelchifer，and J.Zorzopulos.1999.A plasmid vectorfor isolation of strong promoters in Escherichia coli.FEMS Microbiol.Lett.177：75-82.
Chandler，S.D.，A.Mayeda，J.M.Yeakley，A.R.Krainer，and X.D.Fu.1997.RNAsplicing specificity determined by the coordinated action of RNA recognitionmotifs in SR proteins.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94：3596-3601.
Chen，C.and H.Okayama.1987.High-efficiency transformation of mammalian cells byplasmid DNA.Mol.Cell Biol.7：2745-2752.
Chevalier，R.L.，S.Goyal，A.Kim，A.Y.Chang，D.Landau，and D.LeRoith.2000.Renaltubulointerstitial injury from ureteral obstruction in the neonatal rat is attenuatedby IGF-1.Kidney Int.57：882-890.
Cocea，L.1997.Duplication of a region in the multiple cloning site of a plasmid vector toenhance cloning-mediated addition of restriction sites to a DNA fragment.Biotechniques 23：814-816.
Cohn，S.H.，A.N.Vaswani，S.Yasumura，K.Yuen，and K.J.Ellis.1984.Improvedmodels for determination of body fat by in vivo neutron activation.Am.J Clin.Nutr.40：255-259.
Corpas，E.，S.M.Harman，M.A.Pineyro，R.Roberson，and M.R.Blackman.1993.Continuous subcutaneous infusions of growth hormone(GH)releasing hormone 1-44 for 14 days increase GH and insulin-like growth factor-I levels in old men.Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 76：134-138.
Dai，B.，H.Wu，E.Holthuizen，and P.Singh.2001.Identification of a novel cis elementrequired for cell density-dependent down-regulation of insulin-like growth factor-2P3 promoter activity in Caco2 cells.J.Biol.Chem.276：6937-6944.
Danko，I.and J.A.Wolff.1994.Direct gene transfer into muscle.[Reeview].Vaccine12：1499-1502.
Darquet，A.M.，B.Cameron，P.Wils，D.Scherman，and J.Crouzet.1997.A new DNAvehicle for nonviral gene delivery：supercoiled minicircle.Gene Ther.4：1341-1349.
Darquet，A.M.，R.Rangara，P.Kreiss，B.Schwartz，S.Naimi，P.Delaere，J.Crouzet，andD.Scherman.1999.Minicircle：an improved DNA molecule for in vitro and invivo gene transfer.Gene Ther.6：209-218.
Davis，H.L.，R.G.Whalen，and B.A.Demeneix.1993.Direct gene transfer into skeletalmuscle in vivo：factors affecting efficiency of transfer and stability of expression.Human Gene Therapy 4：151-159.
Dhawan，J.，L.C.Pan，G.K.Pavlath，M.A.Travis，A.M.Lanctot，and H.M.Blau.1991.Systemic delivery of human growth hormone by injection of geneticallyengineered myoblasts.Science 254：1509-1512.
Dolnik，V.，M.Novotny，and J.Chmelik.1993.Electromigration behavior of poly-(L-glutamate)conformers in concentrated polyacrylamide gels.Biopolymers 33：1299-1306.
Dorsch-Hasler，K.，G.M.Keil，F.Weber，M.Jasin，W.Schaffner，and U.H.Koszinowski.1985.A long and complex enhancer activates transcription of the gene coding forthe highly abundant immediate early mRNA in murine cytomegalovirus.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 82：8325-8329.
Draghia-Akli，R.，M.L.Fiorotto，L.A.Hill，P.B.Malone，D.R.Deaver，and R.J.Schwartz.1999.Myogenic expression of an injectable protease-resistant growthhormone-releasing hormone augments long-term growth in pigs.Nat.Biotechnol.17：1179-1183.
Draghia-Akli，R.，X.G.Li，and R.J.Schwartz.1997.Enhanced growth by ectopicexpression of growth hormone releasing hormone using an injectable myogenicvector.nature biotechnology 15：1285-1289.
Draghia-Akli，R.，P.B.Malone，L.A.Hill，K.M.Ellis，R.J.Schwartz，and J.L.Nordstrom.2002.Enhanced animal growth via ligand-regulated GHRH myogenic-injectable vectors. FASEB J.16：426-428.
Dubreuil，P.，T.Abribat，B.Broxup，and P.Brazeau.1996.Long-term growth hormone-releasing factor administration on growth hormone，insulin-like growth factor-Iconcentrations，and bone healing in the Beagle.Canadian Journal of VeterinaryResearch 60：7-13.
Dubreuil，P.，Y.Couture，G.Pelletier，D.Petitclerc，L.Delorme，H.Lapierre，P.Gaudreau，J.Morisset，and P.Brazeau.1990a.Effect of long-term administration of porcinegrowth hormone-releasing factor and(or)thyrotropin-releasing factor on growthhormone，prolactin and thyroxine concentrations in growing pigs.J.Anim Sci.68：95-107.
Dubreuil，P.，D.Petitclerc，G.Pelletier，P.Gaudreau，C.Farmer，Mowles，TF，and P.Brazeau.1990b.Effect of dose and frequency of administration of a potent analogof human growth hormone-releasing factor on hormone secretion and growth inpigs.Journal of Animal Science 68：1254-1268.
Duck，S.C.，H.P.Schwarz，G.Costin，R.Rapaport，S.Arslanian，A.Hayek，M.Connors，and J.Jaramillo.1992.Subcutaneous growth hormone-releasing hormone therapyin growth hormone-deficient children：first year of therapy.Journal of ClinicalEndocrinology & Metabolism 75：1115-1120.
Evans，W.S.，S.M.Anderson，L.T.Hull，P.P.Azimi，C.Y.Bowers，and J.D.Veldhuis.2001.Continuous 24-hour intravenous infusion of recombinant human growthhormone(GH)-releasing hormone-(1-44)-amide augments pulsatile，entropic，anddaily rhythmic GH secretion in postmenopausal women equally in the estrogen-withdrawn and estrogen-supplemented states.J.Clin.Endocrinol.Metab 86：700-712.
Evans，W.S.，M.L.Vance，D.L.Kaiser，R.P.Sellers，J.L.Borges，T.R.Downs，L.A.Frohman，J.Rivier，W.Vale，and M.O.Thomer.1985.Effects of intravenous，subcutaneous，and intranasal administration of growth hormone(GH)-releasinghormone-40 on serum GH concentrations in normal men.Journal of ClinicalEndocrinology & Metabolism 61：846-850.
Fechheimer，M.，J.F.Boylan，S.Parker，J.E.Sisken，G.L.Patel，and S.G.Zimmer.1987.Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading andsonication loading.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 84：8463-8467.
Fewell，J.G.，F.MacLaughlin，V.Mehta，M.Gondo，F.Nicol，E.Wilson，and L.C.Smith.2001.Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulatedplasmid delivered to muscle with electroporation.Mol.Ther.3：574-583.
Frohman，L.A.，T.R.Downs，E.P.Heimer，and A.M.Felix.1989.DipeptidylpeptidaseIV and trypsin-like enzymatic degradation of human growth hormone-releasinghormone in plasma.J.Clin.Invest.83：1533-1540.
Frohman，L.A.，L.L.Nemardis，and K.J.Kant.1968.Hypothalamic stimulation ofgrowth hormone secretion. Science 162：580-582.
Frohman，L.A.，J.L.Thominet，C.B.Webb，M.L.Vance，H.Uderman，J.Rivier，W.Vale，and M.O.Thorner.1984.Metabolic clearance and plasma disappearancerates of human pancreatic tumor growth hormone releasing factor in man.J.Clin.Invest.73：1304-1311.
Fryer，A.D.and D.B.Jacoby.1993.Effect of inflammatory cell mediators on M2muscarinic receptors in the lungs.Life Sci.52：529-536.
Gehl，J.，T.Skovsgaard，and L.M.Mir.1998.Enhancement of cytotoxicity byelectropermeabilization：an improved method for screening drugs.AnticancerDrugs 9：319-325.
Gehl，J.，T.H.Sorensen，K.Nielsen，P.Raskmark，S.L.Nielsen，T.Skovsgaard，and L.M.Mir.1999.In vivo electroporation of skeletal muscle：threshold，efficacy andrelation to electric field distribution.Biochim.Biophys.Acta 1428：233-240.
German，M.，S.Ashcroft，K.Docherty，H.Edlund，T.Edlund，S.Goodison，H.Imura，G.Kennedy，O.Madsen，D.Melloul，and.1995.The insulin gene promoter.Asimplified nomenclature.Diabetes 44：1002-1004.
Gesundheit，N.and J.K.Alexander.1995.Endocrine Therapy with RecombinantHormones and Growth Factors.In：B.D.Weintraub(Ed.)MolecularEndocrinology：Basic Concepts and Clinical Correlations.pp.491-507.RavenPress，Ltd.，New York.
Gilbert，R.A.，M.J.Jaroszeski，and R.Heller.1997.Novel electrode designs forelectrochemotherapy.Biochim.Biophys.Acta 1334：9-14.
Gopal，T.V.1985.Gene transfer method for transient gene expression，stabletransformation，and cotransformation of suspension cell cultures.Mol.Cell Biol.5：1188-1190.
Graham，F.L.and A.J.van der Eb.1973.Transformation of rat cells by DNA of humanadenovirus 5.Virology 54：536-539.
Guillemin，R.，P.Brazeau，P.Bohlen，F.Esch，N.Ling，and W.B.Wehrenberg.1982.Growth hormone-releasing factor from a human pancreatic tumor that causedacromegaly.Science 218：585-587.
Hafez，I.M.，N.Maurer，and P.R.Cullis.2001.On the mechanism whereby cationic lipidspromote intracellular delivery of polynucleic acids.Gene Ther.8：1188-1196.
Hamm，A.，N.Krott，I.Breibach，R.Blindt，and A.K.Bosserhoff.2002.Efficienttransfection method for primary cells.Tissue Eng 8：235-245.
Harland，R.and H.Weintraub.1985.Translation of mRNA injected into Xenopus oocytesis specifically inhibited by antisense RNA.J.Cell Biol.101：1094-1099.
Heller，R.，M.J.Jaroszeski，L.F.Glass，J.L.Messina，D.P.Rapaport，R.C.DeConti，N.A.Fenske，R.A.Gilbert，L.M.Mir，and D.S.Reintgen.1996.Phase I/II trial forthe treatment of cutaneous and subcutaneous tumors using electrochemotherapy.Cancer 77：964-971.
Horlick，R.A.and P.A.Benfield.1989.The upstream muscle-specific enhancer of the ratmuscle creatine kinase gene is composed of multiple elements.Mol.Cell Biol.9：2396-2413.
Inouye，C.，P.Remondelli，M.Karin，and S.Elledge.1994.Isolation of a cDNA encodinga metal response element binding protein using a novel expression cloningprocedure：the one hybrid system.DNA Cell Biol.13：731-742.
Inouye，S.，A.Nakazawa，and T.Nakazawa.1985.Determination of the transcriptioninitiation site and identification of the protein product of the regulatory gene xylRfor xyl operons on the TOL plasmid.J.Bacteriol.163：863-869.
Jaynes，J.B.，J.E.Johnson，J.N.Buskin，C.L.Gartside，and S.D.Hauschka.1988.Themuscle creatine kinase gene is regulated by multiple upstream elements，includinga muscle-specific enhancer.Mol.Cell Biol.8：62-70.
Johnson，N.F.，M.D.Hoover，D.G.Thomassen，Y.S.Cheng，A.Dalley，and A.L.Brooks.1992.In vitro activity of silicon carbide whiskers in comparison to otherindustrial fibers using four cell culture systems.Am.J.Ind.Med.21：807-823.
Kawamoto，T.，K.Makino，H.Niwa，H.Sugiyama，S.Kimura，M.Amemura，A.Nakata，and T.Kakunaga.1988.Identification of the human beta-actin enhancer and itsbinding factor.Mol.Cell Biol.8：267-272.
Kawamoto，T.，K.Makino，S.Orita，A.Nakata，and T.Kakunaga.1989.DNA bendingand binding factors of the human beta-actin promoter.Nucleic Acids Res.17：523-537.
Klamut，H.J.，L.O.Bosnoyan-Collins，R.G.Worton，P.N.Ray，and H.L.Davis.1996.Identification of a transcriptional enhancer within muscle intron 1 of the humandystrophin gene.Hum.Mol.Genet.5：1599-1606.
Klamut，H.J.，S.B.Gangopadhyay，R.G.Worton，and P.N.Ray.1990.Molecular andfunctional analysis of the muscle-specific promoter region of the Duchennemuscular dystrophy gene.Mol.Cell Biol.10：193-205.
Kraus，J.，M.Woltje，N.Schonwetter，and V.Hollt.1998.Alternative promoter usage andtissue specific expression of the mouse somatostatin receptor 2 gene.FEBS Lett.428：165-170.
Lareyre，J.J.，T.Z.Thomas，W.L.Zheng，S.Kasper，D.E.Ong，M.C.Orgebin-Crist，andR.J.Matusik.1999.A 5-kilobase pair promoter fragment of the murineepididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific，cell-specific，and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis oftransgenic mice.J.Biol.Chem.274：8282-8290.
Larsen，P.R.，J.W.Harney，and D.D.Moore.1986.Sequences required for cell-typespecific thyroid hormone regulation of rat growth hormone promoter activity.J.Biol.Chem.261：14373-14376.
Lee，S.H.，W.Wang，S.Yajima，P.A.Jose，and M.M.Mouradian.1997.Tissue-specificpromoter usage in the D1A dopamine receptor gene in brain and kidney.DNA CellBiol.16：1267-1275.
Lesbordes，J.C.，T.Bordet，G.Haase，L.Castelnau-Ptakhine，S.Rouhani，H.Gilgenkrantz，and A.Kahn.2002.In vivo electrotransfer of the cardiotrophin-1gene into skeletal muscle slows down progression of motor neuron degeneration inpmn mice.Hum.Mol.Genet.11：1615-1625.
Levenson，V.V.，E.D.Transue，and I.B.Roninson.1998.Internal ribosomal entry site-containing retroviral vectors with green fluorescent protein and drug resistancemarkers.Hum.Gene Ther.9：1233-1236.
Li，C.，S.Ke，Q.P.Wu，W.Tansey，N.Hunter，L.M.Buchmiller，L.Milas，C.Charnsangavej，and S.Wallace.2000.Tumor irradiation enhances the tumor-specific distribution of poly(L-glutamic acid)-conjugated paclitaxel and itsantitumor efficacy.Clin.Cancer Res.6：2829-2834.
Li，X.，E.M.Eastman，R.J.Schwartz，and R.Draghia-Akli.1999.Synthetic musclepromoters：activities exceeding naturally occurring regulatory sequences.naturebiotechnology 17：241-245.
Lin，H.，K.E.Yutzey，and S.F.Konieczny.1991.Muscle-specific expression of thetroponin I gene requires interactions between helix-loop-helix muscle regulatoryfactors and ubiquitous transcription factors.Mol.Cell Biol.11：267-280.
Liu，Y.，H.Li，K.Tanaka，N.Tsumaki，and Y.Yamada.2000.Identification of anenhancer sequence within the first intron required for cartilage-specifictranscription of the alpha2(XI)collagen gene.J.Biol.Chem.275：12712-12718.
Lucas，M.L.，L.Heller，D.Coppola，and R.Heller.2002.IL-12 plasmid delivery by invivo electroporation for the successful treatment of established subcutaneousB16.F10 melanoma.Mol.Ther.5：668-675.
Lucas，M.L.，M.J.Jaroszeski，R.Gilbert，and R.Heller.2001.In vivo electroporationusing an exponentially enhanced pulse：a new wavefonn.DNA Cell Biol.20：183-188.
Macejak，D.G.and P.Samow.1991.Internal initiation of translation mediated by the 5′leader of a cellular mRNA.Nature 353：90-94.
Madry，H.，R.Reszka，J.Bohlender，and J.Wagner.2001.Efficacy of cationic liposome-mediated gene transfer to mesangial cells in vitro and in vivo.J.Mol.Med.79：184-189.
Matsubara，H.，Y.Gunji，T.Maeda，K.Tasaki，Y.Koide，T.Asano，T.Ochiai，S.Sakiyama，and M.Tagawa.2001.Electroporation-mediated transfer of cytokinegenes into human esophageal tumors produces anti-tumor effects in mice.Anticancer Res. 21：2501-2503.
Matsuo，A.，I.Tooyama，S.Isobe，Y.Oomura，I.Akiguchi，K.Hanai，J.Kimura，and H.Kimura.1994.Immunohistochemical localization in the rat brain of an epitopecorresponding to the fibroblast growth factor recoptor-1.Neuroscienco 60：49-66.
McNally，M.A.，J.S.Lebkowski，T.B.Okarma，and L.B.Lerch.1988.Optimizingelectroporation parameters for a variety of human hematopoietic cell lines.Biotechniques 6：882-886.
Miklavcic，D.，K.Beravs，D.Semrov，M.Cemazar，F.Demsar，and G.Sersa.1998.Theimportance of electric field distribution for effective in vivo electroporation oftissues.Biophys.J 74：2152-2158.
Mir，L.M.，M.F.Bureau，J.Gehl，R.Rangara，D.Rouy，J.M.Caillaud，P.Delaere，D.Branellec，B.Schwartz，and D.Scherman.1999.High-efficiency gene transfer intoskeletal muscle mediated by electric pulses.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A96：4262-4267.
Morel，G.，R.Gallego，L.Boulanger，E.Pintos，T.Garcia-Caballero，and P.Gaudreau.1999.Restricted presence of the growth hormone-releasing hormone receptor tosomatotropes in rat and human pituitaries.Neuroendocrinology 70：128-136.
Mumper，R.J.，J.Wang，S.L.Klakamp，H.Nitta，K.Anwer，F.Tagliaferri，and A.P.Rolland.1998.Protective interactive noncondensing(PINC)polymers forenhanced plasmid distribution and expression in rat skeletal muscle.J.ControlRelease 52：191-203.
Muramatsu，T.，A.Nakamura，and H.M.Park.1998.In vivo electroporation：A powerfuland convenient means of nonviral gene transfer to tissues of living animals.Int.J.Mol.Med.1：55-62.
Murray，R.A.，H.G.Maheshwari，E.J.Russell，and G.Baumann.2000.Pituitaryhypoplasia in patients with a mutation in the growth hormone-releasing hormonereceptor gene.AJNR Am.J Neuroradiol.21：685-689.
Murray，R.D.and S.M.Shalet.2000.Growth hormone：current and future therapeuticapplications.Expert.Opin.Pharmacother.1：975-990.
Nabel，E.G.，G.Plautz，F.M.Boyce，J.C.Stanley，and G.J.Nabel.1989.Recombinantgene expression in vivo within endothelial cells of the arterial wall.Science244：1342-1344.
Nairn，R.S.，G.M.Adair，T.Porter，S.L.Pennington，D.G.Smith，J.H.Wilson，and M.M.Seidman.1993.Targeting vector configuration and method of gene transferinfluence targeted correction of the APRT gene in Chinese hamster ovary cells.Somat.Cell Mol.Genet.19：363-375.
Narum，D.L.，S.Kumar，W.O.Rogers，S.R.Fuhrmann，H.Liang，M.Oakley，A.Taye，B.K.Sim，and S.L.Hoffman.2001.Codon optimization of gene fragmentsencoding Plasmodium falciparum merzoite proteins enhances DNA vaccineprotein expression and immunogenicity in mice.Infect.Immun.69：7250-7253.
Neumann，E.，M.Schaefer-Ridder，Y.Wang，and P.H.Hofschneider.1982.Gene transferinto mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.EMBO J.1：841-845.
Nomoto，S.，Y.Tatematsu，T.Takahashi，and H.Osada.1999.Cloning andcharacterization of the alternative promoter regions of the human LIMK2 generesponsible for alternative transcripts with tissue-specific expression.Gene236：259-271.
Ohlsson，H.，S.Thor，and T.Edlund.1991.Novel insulin promoter-and enhancer-bindingproteins that discriminate between pancreatic alpha-and beta-cells.Mol.Endocrinol.5：897-904.
Omirulleh，S.，M.Abraham，M.Golovkin，L Stefanov，M.K.Karabaev，L.Mustardy，S.Morocz，and D.Dudits.1993.Activity of a chimeric promoter with the doubledCaMV 35S enhancer element in protoplast-derived cells and transgenic plants inmaize.Plant Mol.Biol.21：415-428.
Otani，Y.，Y.Tabata，and Y.Ikada.1996.Rapidly curable biological glue composed ofgelatin and poly(L-glutamic acid).Biomaterials 17：1387-1391.
Otani，Y.，Y.Tabata，and Y.Ikada.1998.Hemostatic capability of rapidly curable gluesfrom gelatin，poly(L-glutamic acid)，and carbodiimide.Biomaterials 19：2091-2098.
Pech，M.，C.D.Rao，K.C.Robbins，and S.A.Aaronson.1989.Functional identificationof regulatory elements within the promoter region of platelet-derived growth factor2.Mol.Cell Biol.9：396-405.
Pelletier，J.and N.Sonenberg.1988.Internal initiation of translation of eukaryotic mRNAdirected by a sequence derived from poliovirus RNA.Nature 334：320-325.
Pinkert，C.A.，D.M.Ornitz，R.L.Brinster，and R.D.Palmiter.1987.An albuminenhancer located 10kb upstream functions along with its promoter to directefficient，liver-specific expression in transgenic mice.Genes Dev. 1：268-276.
Potrykus，I.，J.Paszkowski，M.W.Saul，J.Petruska，and R.D.Shillito.1985.Molecularand general genetics of a hybrid foreign gene introduced into tobacco by directgene transfer.Mol.Gen.Genet.199：169-177.
Potter，H.，L.Weir，and P.Leder.1984.Enhancer-dependent expression of human kappaimmunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes byelectroporation.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 81：7161-7165.
Prentice，H.，R.A.Kloner，T.Prigozy，T.Christensen，L.Newman，Y.Li，and L.Kedes.1994.Tissue restricted gene expression assayed by direct DNA injection intocardiac and skeletal muscle.Journal of Molecular & Cellular Cardiology 26：1393-1401.
Raghavachari，N.and W.E.Fahl.2002.Targeted gene delivery to skin cells in vivo：acomparative study of liposomes and polymers as delivery vehicles.J.Pharm.Sci.91：615-622.
Rippe，R.A.，D.A.Brenner，and H.L.Leffert.1990.DNA-mediated gene transfer intoadult rat hepatocytes in primary culture.Mol.Cell Biol.10：689-695.
Sambrook，J.，E.F.Fritsch，and T.Maniatis.1989.Molecular Cloning-A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.
Satozawa，N.，K.Takezawa，T.Miwa，S.Takahashi，M.Hayakawa，and H.Ooka.2000.Differences in the effects of 20K-and 22K-hGH on water retention in rats.Growth Horm.IGF.Res.10：187-192.
Skroch，P.，C.Buchman，and M.Karin.1993.Regulation of human and yeastmetallothionein gene transcription by heavy metal ions.Prog.Clin.Biol.Res.380：113-28.：113-128.
Smith，L.C.and J.L.Nordstrom.2000.Advances in plasmid gene delivery andexpression in skeletal muscle.Curr.Opin.Mol.Ther.2：150-154.
Somiari，S.，J.Glasspool-Malone，J.J.Drabick，R.A.Gilbert，R.Heller，M.J.Jaroszeski，and R.W.Malone.2000.Theory and in vivo application of electroporative genedelivery.Mol.Ther.2：178-187.
Soubrier，F.，B.Cameron，B.Manse，S.Somarriba，C.Dubertret，G.Jaslin，G.Jung，C.L.Caer，D.Dang，J.M.Mouvault，D.Scherman，J.F.Mayaux，and J.Crouzet.1999.pCOR：a new design of plasmid vectors for nonviral gene therapy.Gene Ther.6：1482-1488.
Terada，Y.，H.Tanaka，T.Okado，S.Inoshita，M.Kuwahara，T.Akiba，S.Sasaki，and F.Marumo.2001.Efficient and ligand-dependent regulated erythropoietin productionby naked dna injection and in vivo electroporation.Am.J Kidney Dis.38：S50-S53.
Thorner，M.O.，L.A.Frohman，D.A.Leong，J.Thominet，T.Downs，P.Hellmann，J.Chitwood，J.M.Vaughan，and W.Vale.1984.Extrahypothalamic growth-hormone-releasing factor(GRF)secretion is a rare cause of acromegaly：plasmaGRF levels in 177 acromegalic patients.Journal of Clinical Endocrinology &Metabolism 59：846-849.
Thorner，M.O.，M.L.Vance，W.S.Evans，A.D.Rogol，J.Rivier，W.Vale，Blizzard，andRM.1986.CLINICAL STUDIES WITH GHRH IN MAN.Hormone Research24：91-98.
Thorner，M.O.，M.L.Vance，M.L.Hartman，R.W.Holl，W.S.Evans，J.D.Veldhuis，E.Van Cauter，G.Copinschi，and C.Y.Bowers.1990.Physiological role ofsomatostatin on growth hormone regulation in humans. Metabolism：Clinical &Experimental 39：4042.
Toneguzzo，F.，A.Keating，S.Glynn，and K.McDonald.1988.Electric field-mediatedgene transfer：characterization of DNA transfer and patterns of integration inlymphoid cells.Nucleic Acids Res.16：5515-5532.
Toner，M.S.，R.H.King，F.R.Dunshea，H.Dove，and C.S.Atwood.1996.The effect ofexogenous somatotropin on lactation performance of first-litter sows.J.Anim Sci.74：167-172.
Tripathy，S.K.，E.C.Svensson，H.B.Black，E.Goldwasser，M.Margalith，Hobart，PM，and J.M.Leiden.1996. Long-term expression of erythropoietin in the systemiccirculation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：10876-10880.
Tronche，F.，A.Rollier，I.Bach，M.C.Weiss，and M.Yaniv.1989.The rat albuminpromoter：cooperation with upstream elements is required when binding ofAPF/HNF1 to the proximal element is partially impaired by mutation or bacterialmethylation.Mol.Cell Biol. 9：4759-4766.
Tronche，F.，A.Rollier，P.Herbomel，I.Bach，S.Cereghini，M.Weiss，and M.Yaniv.1990.Anatomy of the rat albumin promoter.Mol.Biol.Med.7：173-185.
Trudel，M.and F.Costantini.1987.A 3′enhancer contributes to the stage-specificexpression of the human beta-globin gene.Genes Dev.1：954-961.
Tsumaki，N.，T.Kimura，K.Tanaka，J.H.Kimura，T.Ochi，and Y.Yamada.1998.Modular arrangement of cartilage-and neural tissue-specific cis-elements in themouse alpha2(XI)collagen promoter.J.Biol.Chem.273：22861-22864.
Tsunekawa，B.，M.Wada，M.Ikeda，H.Uchida，N.Naito，and M.Honjo.1999.The 20-kilodalton(kDa)human growth hormone(hGH)differs from the 22-kDa hGH inthe effect on the human prolactin receptor.Endocrinology 140：3909-3918.
Tsurumi，Y.，S.Takeshita，D.Chen，M.Kearney，S.T.Rossow，J.Passeri，J.R.Horowitz，J.F.Symes，and J.M.Isner.1996.Direct intramuscular gene transfer of nakedDNA encoding vascular endothelial growth factor augments collateraldevelopment and tissue perfusion[see comments].Circulation 94：3281-3290.
Tur-Kaspa，R.，L.Teicher，B.J.Levine，A.I.Skoultchi，and D.A.Shafritz.1986.Use ofelectroporation to introduce biologically active foreign genes into primary rathepatocytes.Mol.Cell Biol.6：716-718.
Vance，M.L.1990.Growth-hormone-releasing hormone.[Review][52 refs].ClinicalChemistry 36：415-420.
Vance，M.L.，D.L.Kaiser，W.S.Evans，R.Furlanetto，W.Vale，J.Rivier，and M.O.Thorner.1985a.Pulsatile growth hormone secretion in normal man during acontinuous 24-hour infusion of human growth hormone releasing factor(1-40).Evidence for intermittent somatostatin secretion.J.Clin.Invest.75：1584-1590.
Vance，M.L.，D.L.Kaiser，W.S.Evans，M.O.Thorner，R.Furlanetto，J.Rivier，W.Vale，G.Perisutti，and L.A.Frohman.1985b.Evidence for a limited growth hormone(GH)-releasing hormone(GHRH)-releasable quantity of GH：effects of 6-hourinfusions of GHRH on GH secretion in normal man.Journal of ClinicalEndocrinology & Metabolism 60：370-375.
Vegeto，E.，G.F.Allan，W.T.Schrader，M.J.Tsai，D.P.McDonnell，and B.W.O′Malley.1992.The mechanism of RU486 antagonism is dependent on theconformation of the carboxy-terminal tail of the human progesterone receptor.Cell69：703-713.
Verhelst，J.，R.Abs，M.Vandeweghe，J.Mockel，J.J.Legros，G.Copinschi，C.Mahler，B.Velkeniers，L.Vanhaelst，A.Van Aelst，D.De Rijdt，A.Stevenaert，and A.Beckers.1997.Two years of replacement therapy in adults with growth hormonedeficiency.Clin.Endocrinol.(Oxf)47：485-494.
Vilquin，J.T.，P.F.Kennel，M.Paturneau-Jouas，P.Chapdelaine，N.Boissel，P.Delaere，J.P.Tremblay，D.Scherman，M.Y.Fiszman，and K.Schwartz.2001.Electrotransferof naked DNA in the skeletal muscles of animal models of muscular dystrophies.Gene Ther.8：1097-1107.
Vittone，J.，M.R.Blsckman，J.Busby-Whitehead，C.Tsiao，K.J.Stewart，J.Tobin，T.Stevens，M.F.Bellantoni，M.A.Rogers，G.Baumann，J.Roth，S.M.Harman，andR.G.S.Spencer.1997.Effects of single nightly injections of growth hormone-releasing hormone(GHRH 1-29)in healthy elderly men.Metabolism：Clinical andExperimental 46：89-96.
Wada，M.，H.Uchida，M.Ikeda，B.Tsunekawa，N.Naito，S.Banba，E.Tanaka，Y.Hashimoto，and M.Honjo.1998.The 20-kilodalton(kDa)human growth hormone(hGH)differs from the 22-kDa hGH in the complex formation with cell surfacehGH receptor and hGH-binding protein circulating in human plasma.Mol.Endocrinol.12：146-156.
Wells，K.E.，J.Maule，R.Kingston，K.Foster，J.McMahon，E.Damien，A.Poole，and D.J.Wells.1997.Immune responses，not promoter inactivation，are responsible fordecreased long-term expression following plasmid gene transfer into skeletalmuscle.FEBS Lett.407：164-168.
Wiethoff，C.M.，J.G.Smith，G.S.Koe，and C.R.Middaugh.2001.The potential role ofproteoglycans in cationic lipid-mediated gene delivery.Studies of the interaction ofcationic lipid-DNA complexes with model glycosaminoglycans.J.Biol.Chem.276：32806-32813.
Wilson，J.M.，L.K.Birinyi，R.N.Salomon，P.Libby，A.D.Callow，and R.C.Mulligan.1989.Implantation of vascular grafts lined with genetically modified endothelialcells.Science 244：1344-1346.
Wolff，J.A.，R.W.Malone，P.Williams，W.Chong，G.Acsadi，A.Jani，Felgner，and PL.1990.Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.Science 247：1465-1468.
Wu，G.Y.and C.H.Wu.1988a.Evidence for targeted gene delivery to Hep G2 hepatomacells in vitro.Biochemistry 27：887-892.
Wu，G.Y.and C.H.Wu.1988b.Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo.J.Biol.Chem.263：14621-14624.
Wu，H.K.，J.A.Squire，Q.Song，and R.Weksberg.1997.Promoter-dependent tissue-specific expressive nature of imprinting gene，insulin-like growth factor II，inhuman tissues.Biochem.Biophys.Res.Commun.233：221-226.
Xie，T.D.and T.Y.Tsong.1993.Study of mechanisms of electric field-induced DNAtransfection.V.Effects of DNA topology on surface binding，cell uptake，expression，and integration into host chromosomes of DNA in the mammalian cell.Biophys.J.65：1684-1689.
Xu，J.，Z.Nawaz，S.Y.Tsai，M.J.Tsai，and B.W.O′Malley.1996.The extreme Cterminus of progesterone receptor contains a transcriptional repressor domain thatfunctions through a putative corepressor.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：12195-12199.
Yasui，A.，K.Oda，H.Usunomiya，K.Kakudo，T.Suzuki，T.Yoshida，H.M.Park，K.Fukazawa，and T.Muramatsu.2001.Elevated gastrin secretion by in vivo geneelectroporation in skeletal muscle.Int.J Mol.Med.8：489-494.
Yin，D.and J.G.Tang.2001.Gene therapy for streptozotocin-induced diabetic mice byelectroporational transfer of naked human insulin precursor DNA into skeletalmuscle in vivo.FEBS Lett.495：16-20.
Yorifuji，T.and H.Mikawa.1990.Co-transfer of restriction endonucleases and plasmidDNA into mammalian cells by electroporation：effects on stable transformation.Mutat.Res.243：121-126.
Yutzey，K.E.and S.F.Konieczny.1992.Different E-box regulatory sequences arefunctionally distinct when placed within the context of the troponin I enhancer.Nucleic Acids Res.20：5105-5113.
Zhao-Emonet，J.C.，O.Boyer，J.L.Cohen，and D.Klatzmann.1998.Deletional andmutational analyses of the human CD4 gene promoter：characterization of aminimal tissue-specific promoter.Biochim.Biophys.Acta 1442：109-119.
                           序列表
<110>Baylor College of Medicine
<120>改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法
<130>108328.00071-AVSI-0008
<160>27
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是生长激素释放激素(GHRH)，其以His1和Val2替代了Tyr1和Ala2，以Ala15
     替代Gly15，以及用Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。
<400>1
His Val Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly
            20                  25                  30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
        35                  40
<210>2
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是修饰的生长激素释放激素(GHRH)的氨基酸序列。通过将Gly15替换成Ala15
     增加了α-螺旋构象。这是TI-GHRH序列，所以它以Ile代替Ala2，用Ala15
     代替Gly15，并且用Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。
<400>2
Tyr Ile Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly
            20                  25                  30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
        35                  40
<210>3
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是生长激素释放激素，其以Val2替代了Ala2，以Ala15替代Gly15，以及用
     Leu27和Asn28替代了Met27和Ser28。
<400>3
Tyr Val Asp Ala Ile phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly
            20                  25                  30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
        35                  40
<210>4
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是生长激素释放激素(GHRH)，其以Ala15替代Gly15，以及用Leu27和Asn28
     替代了Met27和Ser28。
<400>4
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Ala Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Leu Asn Arg Gln Gln Gly
            20                  25                  30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
        35                  40
<210>5
<211>44
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>This is the artificial sequence for the(1-44)NH2
<400>5
Thr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Sar Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
            20                  25                  30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
        35                  40
<210>6
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是GHRH(1-40)OH的人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>位置1的Xaa可以是Tyr或His。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>位置2的Xaa可以是Ala，Val或Ile。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>位置15的Xaa可以是Ala，Val或Ile。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(27)..(27)
<223>位置27的Xaa可以是Met或Ile。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>位置28的Xaa可以是Ser或Asp。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(34)..(34)
<223>ARG可以是SER
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(38)..(38)
<223>Gln也可以是Arg
<400>6
Xaa Xaa Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Xaa Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Xaa Xaa Arg Gln Gln Gly
            20                  25                  30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
        35                  40
<210>7
<211>323
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是真核启动子c5-12的核酸序列
<400>7
cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg gtgaggaatg     60
gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt tggcgctcta    120
aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca aatatggcga    180
cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg cattcctggg    240
ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg cggcccacga    300
gctacccgga ggagcgggag gcg                                            323
<210>8
<211>190
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是人生长激素(hGH)聚腺苷尾的核酸序列
<400>8
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca     60
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc    120
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca    180
acctgtaggg                                                           190
<210>9
<211>219
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是猪生长激素释放激素的cDNA
<400>9
atggtgctct gggtgttctt ctttgtgatc ctcaccctca gcaacagctc ccactgctcc     60
ccacctcccc ctttgaccct caggatgcgg cggcacgtag atgccatctt caccaacagc    120
taccggaagg tgctggccca gctgtccgcc cgcaagctgc tccaggacat cctgaacagg    180
cagcagggag agaggaacca agagcaagga gcataatga                           219
<210>10
<211>40
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>这是猪生长激素(hGH)聚腺苷尾的氨基酸序列
<400>10
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
            20                  25                  30
Glu Arg Asn Gln Glu Gln Gly Ala
        35                  40
<210>11
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是操作性连接HV-GHRH质粒的成分的核酸序列
<400>11
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc     60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg    120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt    180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca    240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg    300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg    360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa    420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct    480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc    540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggcacgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa    600
ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg    660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg    720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag    780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct    840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa    900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc    960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt   1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg   1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt   1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga   1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg   1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca   1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct   1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc   1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt   1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc   1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg   1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct   1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca   1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga   1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc   1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg   1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat   1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt   2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc   2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg   2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg   2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg   2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg   2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca   2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga   2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa   2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca   2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa   2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat   2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct   2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc   2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca   2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca   2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa   3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct   3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc   3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt   3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt   3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc   3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag   3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca   3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg   3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac         3534
<210>12
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是操作性连接TI-GHRH质粒的成分的核酸序列
<400>12
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc     60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg    120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt    180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca    240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg    300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcg     360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa    420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct    480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc    540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa    600
ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg    660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg    720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag    780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct    840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa    900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc    960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt   1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg   1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt   1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga   1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg   1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca   1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct   1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc   1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt   1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc   1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg   1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct   1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca   1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga   1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc   1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg   1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat   1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt   2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc   2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg   2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg   2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg   2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg   2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca   2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga   2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa   2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca   2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa   2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat   2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct   2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc   2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca   2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca   2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa   3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct   3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc   3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt   3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt   3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc   3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag   3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca   3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg  3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac        3534
<210>13
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是操作性连接TV-GHRH质粒的成分的核酸序列
<400>13
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc     60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg    120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt    180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca    240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg    300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg    360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa    420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct    480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc    540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatgt agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa    600
ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg    660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg    720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag    780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct    840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa    900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc    960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt   1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg   1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt   1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga   1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg   1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca   1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct   1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc   1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt   1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc   1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg   1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct   1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca   1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga   1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc   1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg   1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat   1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt   2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc   2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg   2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg   2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg   2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg   2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca   2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga   2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa   2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca   2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa   2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat   2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct   2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc   2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca   2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca   2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa   3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct   3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc   3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt   3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt   3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc   3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag   3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca   3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg   3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac         3534
<210>14
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是操作性连接15/27/28 GHRH质粒的成分的核酸序列
<400>14
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc     60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg    120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt    180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca    240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg    300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg    360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa    420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct    480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc    540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatat cgatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa    600
ggtgctggcc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcctgaaca ggcagcaggg    660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg    720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag    780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct    840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa    900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc    960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt   1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg   1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt   1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga   1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg   1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca   1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct   1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc   1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt   1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc   1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg   1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct   1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca   1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga   1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc   1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg   1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat   1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt   2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc   2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg   2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg   2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg   2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg   2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca   2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga   2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa   2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca   2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa   2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat   2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct   2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc   2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca   2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca   2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa   3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct   3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc   3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt   3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt   3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc   3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag   3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca   3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg   3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac         3534
<210>15
<211>3534
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是野生型GHRH的全部质粒序列
<400>15
gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttggagctcc     60
accgcggtgg cggccgtccg ccctcggcac catcctcacg acacccaaat atggcgacgg    120
gtgaggaatg gtggggagtt atttttagag cggtgaggaa ggtgggcagg cagcaggtgt    180
tggcgctcta aaaataactc ccgggagtta tttttagagc ggaggaatgg tggacaccca    240
aatatggcga cggttcctca cccgtcgcca tatttgggtg tccgccctcg gccggggccg    300
cattcctggg ggccgggcgg tgctcccgcc cgcctcgata aaaggctccg gggccggcgg    360
cggcccacga gctacccgga ggagcgggag gcgccaagct ctagaactag tggatcccaa    420
ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct gtggacagct cacctagctg ccatggtgct    480
ctgggtgttc ttctttgtga tcctcaccct cagcaacagc tcccactgct ccccacctcc    540
ccctttgacc ctcaggatgc ggcggtatgc agatgccatc ttcaccaaca gctaccggaa    600
ggtgctgggc cagctgtccg cccgcaagct gctccaggac atcatgagca ggcagcaggg    660
agagaggaac caagagcaag gagcataatg actgcaggaa ttcgatatca agcttatcgg    720
ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt gccactccag    780
tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac taggtgtcct    840
tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt gggaagacaa    900
cctgtagggc ctgcggggtc tattgggaac caagctggag tgcagtggca caatcttggc    960
tcactgcaat ctccgcctcc tgggttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagttgt   1020
tgggattcca ggcatgcatg accaggctca gctaattttt gtttttttgg tagagacggg   1080
gtttcaccat attggccagg ctggtctcca actcctaatc tcaggtgatc tacccacctt   1140
ggcctcccaa attgctggga ttacaggcgt gaaccactgc tcccttccct gtccttctga   1200
ttttaaaata actataccag caggaggacg tccagacaca gcataggcta cctggccatg   1260
cccaaccggt gggacatttg agttgcttgc ttggcactgt cctctcatgc gttgggtcca   1320
ctcagtagat gcctgttgaa ttcgataccg tcgacctcga gggggggccc ggtaccagct   1380
tttgttccct ttagtgaggg ttaatttcga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc   1440
ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt   1500
gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc   1560
ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg   1620
ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct   1680
cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca   1740
cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga   1800
accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc   1860
acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg   1920
cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat   1980
acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt   2040
atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc   2100
agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg   2160
acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg   2220
gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg   2280
gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg   2340
gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca   2400
gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagaaga   2460
actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa   2520
gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca   2580
acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa   2640
agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat   2700
cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct   2760
gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc   2820
gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca   2880
gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca   2940
ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa   3000
cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct   3060
cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc   3120
cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt   3180
catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt   3240
caatcatgcg aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc   3300
agatccttgg cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag   3360
agggcgcccc agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca   3420
actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg   3480
gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgac         3534
<210>16
<211>4260
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是pSP-SEAP cDNA构建体的序列
<400>16
ggccgtccgc cttcggcacc atcctcacga cacccaaata tggcgacggg tgaggaatgg     60
tggggagtta tttttagagc ggtgaggaag gtgggcaggc agcaggtgtt ggcgctctaa    120
aaataactcc cgggagttat ttttagagcg gaggaatggt ggacacccaa atatggcgac    180
ggttcctcac ccgtcgccat atttgggtgt ccgccctcgg ccggggccgc attcctgggg    240
gccgggcggt gctcccgccc gcctcgataa aaggctccgg ggccggcggc ggcccacgag    300
ctacccggag gagcgggagg cgccaagctc tagaactagt ggatcccccg ggctgcagga    360
attcgatatc aagcttcgaa tcgcgaattc gcccaccatg ctgctgctgc tgctgctgct    420
gggcctgagg ctacagctct ccctgggcat catcccagtt gaggaggaga acccggactt    480
ctggaaccgc gaggcagccg aggccctggg tgccgccaag aagctgcagc ctgcacagac    540
agccgccaag aacctcatca tcttcctggg cgatgggatg ggggtgtcta cggtgacagc    600
tgccaggatc ctaaaagggc agaagaagga caaactgggg cctgagatac ccctggccat    660
ggaccgcttc ccatatgtgg ctctgtccaa gacatacaat gtagacaaac atgtgccaga    720
cagtggagcc acagccacgg cctacctgtg cggggtcaag ggcaacttcc agaccattgg    780
cttgagtgca gccgcccgct ttaaccagtg caacacgaca cgcggcaacg aggtcatctc    840
cgtgatgaat cgggccaaga aagcagggaa gtcagtggga gtggtaacca ccacacgagt    900
gcagcacgcc tcgccagccg gcacctacgc ccacacggtg aaccgcaact ggtactcgga    960
cgccgacgtg cctgcctcgg cccgccagga ggggtgccag gacatcgcta cgcagctcat   1020
ctccaacatg gacattgacg tgatcctagg tggaggccga aagtacatgt ttcgcatggg   1080
aaccccagac cctgagtacc cagatgacta cagccaaggt gggaccaggc tggacgggaa   1140
gaatctggtg caggaatggc tggcgaagcg ccagggtgcc cggtatgtgt ggaaccgcac   1200
tgagctcatg caggcttccc tggacccgtc tgtgacccat ctcatgggtc tctttgagcc   1260
tggagacatg aaatacgaga tccaccgaga ctccacactg gacccctccc tgatggagat   1320
gacagaggct gccctgcgcc tgctgagcag gaacccccgc ggcttcttcc tcttcgtgga   1380
gggtggtcgc atcgaccatg gtcatcatga aagcagggct taccgggcac tgactgagac   1440
gatcatgttc gacgacgcca ttgagagggc gggccagctc accagcgagg aggacacgct   1500
gagcctcgtc actgccgacc actcccacgt cttctccttc ggaggctacc ccctgcgagg   1560
gagctccatc ttcgggctgg cccctggcaa ggcccgggac aggaaggcct acacggtcct   1620
cctatacgga aacggtccag gctatgtgct caaggacggc gcccggccgg atgttaccga   1680
gagcgagagc gggagccccg agtatcggca gcagtcagca gtgcccctgg acgaagagac   1740
ccacgcaggc gaggacgtgg cggtgttcgc gcgcggcccg caggcgcacc tggttcacgg   1800
cgtgcaggag cagaccttca tagcgcacgt catggccttc gccgcctgcc tggagcccta   1860
caccgcctgc gacctggcgc cccccgccgg caccaccgac gccgcgcacc cgggttactc   1920
tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca gacatgataa gatacattga tgagtttgga   1980
caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt   2040
gctttatttg taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat   2100
tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac   2160
aaatgtggta aaatcgataa ggatccgtcg accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt   2220
cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt   2280
tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc agcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact   2340
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac   2400
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa   2460
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg   2520
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa   2580
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc   2640
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac   2700
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac   2760
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg   2820
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt   2880
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga   2940
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct   3000
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga   3060
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg   3120
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct   3180
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt   3240
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc   3300
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg   3360
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag   3420
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt   3480
tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag   3540
ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt   3600
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca   3660
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg   3720
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat   3780
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta   3840
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca   3900
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct   3960
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat   4020
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa   4080
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt   4140
gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa   4200
ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gcgccctgta   4260
<210>17
<211>2710
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
     这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对小鼠的密码
<223>
     子优化
<400>17
tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct     60
cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt    120
ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg    180
gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg    240
tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct    300
cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag    360
cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac    420
agctcaccta gctgccatgg tgctctgggt gctctttgtg atcctcatcc tcaccagcgg    480
cagccactgc agcctgcctc ccagccctcc cttcaggatg cagaggcacg tggacgccat    540
cttcaccacc aactacagga agctgctgag ccagctgtac gccaggaagg tgatccagga    600
catcatgaac aagcagggcg agaggatcca ggagcagagg gccaggctga gctgataagc    660
ttatcggggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc    720
actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag    780
gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcaagttggg    840
aagacaacct gtagggctcg agggggggcc cggtaccagc ttttgttccc tttagtgagg    900
gttaatttcg agcttggtct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc    960
ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag   1020
gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa   1080
aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc   1140
gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc   1200
ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg   1260
cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt   1320
cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc   1380
gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc   1440
cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag   1500
agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg   1560
ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa   1620
ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag   1680
gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggctagc gcttagaaga actcatccag   1740
cagacggtag aatgcaatac gttgagagtc tggagctgca ataccataca gaaccaggaa   1800
acggtcagcc cattcaccac ccagttcctc tgcaatgtca cgggtagcca gtgcaatgtc   1860
ctggtaacgg tctgcaacac ccagacgacc acagtcaatg aaaccagaga aacgaccatt   1920
ctcaaccatg atgttcggca ggcatgcatc accatgagta actaccaggt cctcaccatc   1980
cggcatacga gctttcagac gtgcaaacag ttcagccggt gccagaccct gatgttcctc   2040
atccaggtca tcctggtcaa ccagacctgc ttccatacgg gtacgagcac gttcaatacg   2100
atgttttgcc tggtggtcaa acggacaggt agctgggtcc agggtgtgca gacgacgcat   2160
tgcatcagcc atgatagaaa ctttctctgc cggagccagg tgagaagaca gcaggtcctg   2220
acccggaact tcacccagca gcagccagtc acgaccagct tcagtaacta catccagaac   2280
tgcagcacac ggaacaccag tggttgccag ccaagacaga cgagctgctt catcctgcag   2340
ttcattcaga gcaccagaca ggtcagtttt aacaaacaga actggacgac cctgtgcaga   2400
cagacggaaa acagctgcat cagagcaacc aatggtctgc tgtgcccagt cataaccaaa   2460
cagacgttca acccaggctg ccggagaacc tgcatgcaga ccatcctgtt caatcatgcg   2520
aaacgatcct catcctgtct cttgatcaga tcttgatccc ctgcgccatc agatccttgg   2580
cggcaagaaa gccatccagt ttactttgca gggcttccca accttaccag agggcgcccc   2640
agctggcaat tccggttcgc ttgctgtcca taaaaccgcc cagtctagca actgttggga   2700
agggcgatcg                                                          2710
<210>18
<211>2713
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
     这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对大鼠的密码
<223>
     子优化
<400>18
tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct     60
cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt    120
ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg    180
gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg    240
tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct    300
cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag    360
cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac    420
agctcaccta gctgccatgg ccctgtgggt gttcttcgtg ctgctgaccc tgaccagcgg    480
aagccactgc agcctgcctc ccagccctcc cttcagggtg cgccggcacg ccgacgccat    540
cttcaccagc agctacagga ggatcctggg ccagctgtac gctaggaagc tcctgcacga    600
gatcatgaac aggcagcagg gcgagaggaa ccaggagcag aggagcaggt tcaactgata    660
agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt    720
gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac    780
taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt    840
gggaagacaa cctgtagggc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg    900
agggttaatt tcgagcttgg tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg    960
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat   1020
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta   1080
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa   1140
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc   1200
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt   1260
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca   1320
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg   1380
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat   1440
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta   1500
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct   1560
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac   1620
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa   1680
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc   1740
cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag   1800
gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat   1860
gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc   1920
attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc   1980
atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc   2040
ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat   2100
acgatgtttt gcctggtggt caaacggaca ggtagctggg tccagggtgt gcagacgacg   2160
cattgcatca gccatgatag aaactttctc tgccggagcc aggtgagaag acagcaggtc   2220
ctgacccgga acttcaccca gcagcagcca gtcacgacca gcttcagtaa ctacatccag   2280
aactgcagca cacggaacac cagtggttgc cagccaagac agacgagctg cttcatcctg   2340
cagttcattc agagcaccag acaggtcagt tttaacaaac agaactggac gaccctgtgc   2400
agacagacgg aaaacagctg catcagagca accaatggtc tgctgtgccc agtcataacc   2460
aaacagacgt tcaacccagg ctgccggaga acctgcatgc agaccatcct gttcaatcat   2520
gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgatc agatcttgat cccctgcgcc atcagatcct   2580
tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc   2640
cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gcaactgttg   2700
ggaagggcga tcg                                                      2713
<210>19
<211>2704
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对牛的密码子
     优化
<400>19
tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct     60
cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt    120
ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg    180
gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg    240
tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct    300
cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag    360
cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac    420
agctcaccta gctgccatgg tgctgtgggt gttcttcctg gtgaccctga ccctgagcag    480
cggctcccac ggctccctgc cctcccagcc tctgcgcatc cctcgctacg ccgacgccat    540
cttcaccaac agctaccgca aggtgctcgg ccagctcagc gcccgcaagc tcctgcagga    600
catcatgaac cggcagcagg gcgagcgcaa ccaggagcag ggagcctgat aagcttatcg    660
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca    720
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc    780
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca    840
acctgtaggg ctcgaggggg ggcccggtac cagcttttgt tccctttagt gagggttaat    900
ttcgagcttg gtcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc    960
ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata   1020
acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg   1080
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct   1140
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa   1200
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc   1260
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt   1320
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg   1380
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg   1440
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct   1500
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc   1560
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg   1620
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc   1680
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggc tagcgcttag aagaactcat ccagcagacg   1740
gtagaatgca atacgttgag agtctggagc tgcaatacca tacagaacca ggaaacggtc   1800
agcccattca ccacccagtt cctctgcaat gtcacgggta gccagtgcaa tgtcctggta   1860
acggtctgca acacccagac gaccacagtc aatgaaacca gagaaacgac cattctcaac   1920
catgatgttc ggcaggcatg catcaccatg agtaactacc aggtcctcac catccggcat   1980
acgagctttc agacgtgcaa acagttcagc cggtgccaga ccctgatgtt cctcatccag   2040
gtcatcctgg tcaaccagac ctgcttccat acgggtacga gcacgttcaa tacgatgttt   2100
tgcctggtgg tcaaacggac aggtagctgg gtccagggtg tgcagacgac gcattgcatc   2160
agccatgata gaaactttct ctgccggagc caggtgagaa gacagcaggt cctgacccgg   2220
aacttcaccc agcagcagcc agtcacgacc agcttcagta actacatcca gaactgcagc   2280
acacggaaca ccagtggttg ccagccaaga cagacgagct gcttcatcct gcagttcatt   2340
cagagcacca gacaggtcag ttttaacaaa cagaactgga cgaccctgtg cagacagacg   2400
gaaaacagct gcatcagagc aaccaatggt ctgctgtgcc cagtcataac caaacagacg   2460
ttcaacccag gctgccggag aacctgcatg cagaccatcc tgttcaatca tgcgaaacga   2520
tcctcatcct gtctcttgat cagatcttga tcccctgcgc catcagatcc ttggcggcaa   2580
gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg ccccagctgg   2640
caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agcaactgtt gggaagggcg   2700
atcg                                                                2704
<210>20
<211>2704
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
     这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对羊的密码子
<223>
     优化
<400>20
tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct     60
cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt    120
ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg    180
gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg    240
tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct    300
cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag    360
cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac    420
agctcaccta gctgccatgg tgctgtgggt gttcttcctg gtgaccctga ccctgagcag    480
cggaagccac ggcagcctgc ccagccagcc cctgaggatc cctaggtacg ccgacgccat    540
cttcaccaac agctacagga agatcctggg ccagctgagc gctaggaagc tcctgcagga    600
catcatgaac aggcagcagg gcgagaggaa ccaggagcag ggcgcctgat aagcttatcg    660
gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca    720
gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc    780
ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca    840
acctgtaggg ctcgaggggg ggcccggtac cagcttttgt tccctttagt gagggttaat    900
ttcgagcttg gtcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc    960
ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata   1020
acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg   1080
cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct   1140
caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa   1200
gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc   1260
tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt   1320
aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg   1380
ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg   1440
cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct   1500
tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc   1560
tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg   1620
ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc   1680
aagaagatcc tttgatcttt tctacggggc tagcgcttag aagaactcat ccagcagacg   1740
gtagaatgca atacgttgag agtctggagc tgcaatacca tacagaacca ggaaacggtc   1800
agcccattca ccacccagtt cctctgcaat gtcacgggta gccagtgcaa tgtcctggta   1860
acggtctgca acacccagac gaccacagtc aatgaaacca gagaaacgac cattctcaac   1920
catgatgttc ggcaggcatg catcaccatg agtaactacc aggtcctcac catccggcat   1980
acgagctttc agacgtgcaa acagttcagc cggtgccaga ccctgatgtt cctcatccag   2040
gtcatcctgg tcaaccagac ctgcttccat acgggtacga gcacgttcaa tacgatgttt   2100
tgcctggtgg tcaaacggac aggtagctgg gtccagggtg tgcagacgac gcattgcatc   2160
agccatgata gaaactttct ctgccggagc caggtgagaa gacagcaggt cctgacccgg   2220
aacttcaccc agcagcagcc agtcacgacc agcttcagta actacatcca gaactgcagc   2280
acacggaaca ccagtggttg ccagccaaga cagacgagct gcttcatcct gcagttcatt   2340
cagagcacca gacaggtcag ttttaacaaa cagaactgga cgaccctgtg cagacagacg   2400
gaaaacagct gcatcagagc aaccaatggt ctgctgtgcc cagtcataac caaacagacg   2460
ttcaacccag gctgccggag aacctgcatg cagaccatcc tgttcaatca tgcgaaacga   2520
tcctcatcct gtctcttgat cagatcttga tcccctgcgc catcagatcc ttggcggcaa   2580
gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg ccccagctgg   2640
caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agcaactgtt gggaagggcg   2700
atcg                                                                2704
<210>21
<211>2713
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
     这是具有生长激素释放激素类似物序列的质粒载体，该序列经针对鸡的密码子
<223>
     优化
<400>21
tgtaatacga ctcactatag ggcgaattgg agctccaccg cggtggcggc cgtccgccct     60
cggcaccatc ctcacgacac ccaaatatgg cgacgggtga ggaatggtgg ggagttattt    120
ttagagcggt gaggaaggtg ggcaggcagc aggtgttggc gctctaaaaa taactcccgg    180
gagttatttt tagagcggag gaatggtgga cacccaaata tggcgacggt tcctcacccg    240
tcgccatatt tgggtgtccg ccctcggccg gggccgcatt cctgggggcc gggcggtgct    300
cccgcccgcc tcgataaaag gctccggggc cggcggcggc ccacgagcta cccggaggag    360
cgggaggcgc caagcggatc ccaaggccca actccccgaa ccactcaggg tcctgtggac    420
agctcaccta gctgccatgg ccctgtgggt gttctttgtg ctgctgaccc tgacctccgg    480
aagccactgc agcctgccac ccagcccacc cttccgcgtc aggcgccacg ccgacggcat    540
cttcagcaag gcctaccgca agctcctggg ccagctgagc gcacgcaact acctgcacag    600
cctgatggcc aagcgcgtgg gcagcggact gggagacgag gccgagcccc tgagctgata    660
agcttatcgg ggtggcatcc ctgtgacccc tccccagtgc ctctcctggc cctggaagtt    720
gccactccag tgcccaccag ccttgtccta ataaaattaa gttgcatcat tttgtctgac    780
taggtgtcct tctataatat tatggggtgg aggggggtgg tatggagcaa ggggcaagtt    840
gggaagacaa cctgtagggc tcgagggggg gcccggtacc agcttttgtt ccctttagtg    900
agggttaatt tcgagcttgg tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg    960
ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat   1020
caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta   1080
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa   1140
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc   1200
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt   1260
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca   1320
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg   1380
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat   1440
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta   1500
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct   1560
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac   1620
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa   1680
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggct agcgcttaga agaactcatc   1740
cagcagacgg tagaatgcaa tacgttgaga gtctggagct gcaataccat acagaaccag   1800
gaaacggtca gcccattcac cacccagttc ctctgcaatg tcacgggtag ccagtgcaat   1860
gtcctggtaa cggtctgcaa cacccagacg accacagtca atgaaaccag agaaacgacc   1920
attctcaacc atgatgttcg gcaggcatgc atcaccatga gtaactacca ggtcctcacc   1980
atccggcata cgagctttca gacgtgcaaa cagttcagcc ggtgccagac cctgatgttc   2040
ctcatccagg tcatcctggt caaccagacc tgcttccata cgggtacgag cacgttcaat   2100
acgatgtttt gcctggtggt caaacggaca ggtagctggg tccagggtgt gcagacgacg   2160
cattgcatca gccatgatag aaactttctc tgccggagcc aggtgagaag acagcaggtc   2220
ctgacccgga acttcaccca gcagcagcca gtcacgacca gcttcagtaa ctacatccag   2280
aactgcagca cacggaacac cagtggttgc cagccaagac agacgagctg cttcatcctg   2340
cagttcattc agagcaccag acaggtcagt tttaacaaac agaactggac gaccctgtgc   2400
agacagacgg aaaacagctg catcagagca accaatggtc tgctgtgccc agtcataacc   2460
aaacagacgt tcaacccagg ctgccggaga acctgcatgc agaccatcct gttcaatcat   2520
gcgaaacgat cctcatcctg tctcttgatc agatcttgat cccctgcgcc atcagatcct   2580
tggcggcaag aaagccatcc agtttacttt gcagggcttc ccaaccttac cagagggcgc   2640
cccagctggc aattccggtt cgcttgctgt ccataaaacc gcccagtcta gcaactgttg   2700
ggaagggcga tcg                                                      2713
<210>22
<211>55
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是人生长激素5’非翻译区的核酸序列
<400>22
caaggcccaa ctccccgaac cactcagggt cctgtggaca gctcacctag ctgcc          55
<210>23
<211>782
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是质粒pUC-18复制起点的核酸序列
<400>23
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta     60
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag    120
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg    180
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg    240
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg    300
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga    360
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc    420
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt    480
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact    540
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg    600
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt    660
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt    720
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct    780
tt                                                                   782
<210>24
<211>5
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是NEO核糖体结合位点
<400>24
tcctc                                                                  5
<210>25
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是原核PNEO启动子的核酸序列
<400>25
accttaccag agggcgcccc agctggcaa                                       29
<210>26
<211>3558
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是含人(1-40)GHRH的诱导型pGR1774的质粒序列
<400>26
atgcctggag acgccatcca cgctgttttg acctccatag aagacaccgg gaccgatcca     60
gcctccgcgg ccgggaacgg tgcattggaa cgcggattcc ccgtgttaat taacaggtaa    120
gtgtcttcct cctgtttcct tcccctgcta ttctgctcaa ccttcctatc agaaactgca    180
gtatctgtat ttttgctagc agtaatacta acggttcttt ttttctcttc acaggccacc    240
atgtagaact agtgatccca aggcccaact ccccgaacca ctcagggtcc tgtggacagc    300
tcacctagct gccatggtgc tctgggtgtt cttctttgtg atcctcaccc tcagcaacag    360
ctcccactgc tccccacctc cccctttgac cctcaggatg cggcggtatg cagatgccat    420
cttcaccaac agctaccgga aggtgctggg ccagctgtcc gcccgcaagc tgctccagga    480
catcatgagc aggcagcagg gagagagcaa ccaagagcga ggagcataat gactgcagga    540
attcgatatc aagcttatcg gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg    600
ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca    660
ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca    720
aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga    780
gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc    840
tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt    900
tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat    960
ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg   1020
ctcccttccc tgtccttctg attttaaaat aactatacca gcaggaggac gtccagacac   1080
agcataggct acctggccat gcccaaccgg tgggacattt gagttgcttg cttggcactg   1140
tcctctcatg cgttgggtcc actcagtaga tgcctgttga attcgatacc gtcgacctcg   1200
agggggggcc cggtaccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaatttcg agcttggcgt   1260
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca   1320
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat   1380
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt   1440
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct   1500
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa   1560
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa   1620
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc   1680
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga   1740
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc   1800
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt   1860
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct   1920
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg   1980
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta   2040
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct   2100
acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa   2160
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt   2220
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta   2280
cggggtctga cgctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat   2340
cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt   2400
cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc   2460
cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat   2520
cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca   2580
gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg   2640
cttccatycg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg   2700
tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg   2760
caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt   2820
cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca   2880
gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct   2940
tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc   3000
cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac   3060
ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcatcctgtc tcttgatcag   3120
atcttgatcc cctgcgccat cagatccttg gcggcaagaa agccatccag tttactttgc   3180
agggcttccc aaccttacca gagggcgccc cagctggcaa ttccggttcg cttgctgtcc   3240
ataaaaccgc ccagtctagc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat   3300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt   3360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt gtaatacgac tcactatagg   3420
gcgaattaat tcgagcttgc atgcctgcag ggtcgaagcg gagtactgtc ctccgagtgg   3480
agtactgtcc tccgagcgga gtactgtcct ccgagtcgag ggtcgaagcg gagtactgtc   3540
ctccgagtgg agtactgt                                                 3558
<210>27
<211>4855
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>这是肌特异性基因开关，pGS1633的质粒序列
<400>27
aggggccgct ctagctagag tctgcctgcc ccctgcctgg cacagcccgt acctggccgc     60
acgctccctc acaggtgaag ctcgaaaact ccgtccccgt aaggagcccc gctgcccccc    120
gaggcctcct ccctcacgcc tcgctgcgct cccggctccc gcacggccct gggagaggcc    180
cccaccgctt cgtccttaac gggcccggcg gtgccggggg attatttcgg ccccggcccc    240
gggggggccc ggcagacgct ccttatacgg cccggcctcg ctcacctggg ccgcggccag    300
gagcgccttc tttgggcagc gccgggccgg ggccgcgccg ggcccgacac ccaaatatgg    360
cgacggccgg ggccgcattc ctgggggccg ggcggtgctc ccgcccgcct cgataaaagg    420
ctccggggcc ggcgggcgac tcagatcgcc tggagacgcc atccacgctg ttttgacctc    480
catagaagac accgggaccg atccagcctc cgcggccggg aacggtgcat tggaacgcgg    540
attccccgtg ttaattaaca ggtaagtgtc ttcctcctgt ttccttcccc tgctattctg    600
ctcaaccttc ctatcagaaa ctgcagtatc tgtatttttg ctagcagtaa tactaacggt    660
tctttttttc tcttcacagg ccaccaagct accggtccac catggactcc cagcagccag    720
atctgaagct actgtcttct atcgaacaag catgcgatat ttgccgactt aaaaagctca    780
agtgctccaa agaaaaaccg aagtgcgcca agtgtctgaa gaacaactgg gagtgtcgct    840
actctcccaa aaccaaaagg tctccgctga ctagggcaca tctgacagaa gtggaatcaa    900
ggctagaaag actggaacag ctatttctac tgatttttcc tcgagaccag aaaaagttca    960
ataaagtcag agttgtgaga gcactggatg ctgttgctct cccacagcca gtgggcgttc   1020
caaatgaaag ccaagcccta agccagagat tcactttttc accaggtcaa gacatacagt   1080
tgattccacc actgatcaac ctgttaatga gcattgaacc agatgtgatc tatgcaggac   1140
atgacaacac aaaacctgac acctccagtt ctttgctgac aagtcttaat caactaggcg   1200
agaggcaact tctttcagta gtcaagtggt ctaaatcatt gccaggtttt cgaaacttac   1260
atattgatga ccagataact ctcattcagt attcttggat gagcttaatg gtgtttggtc   1320
taggatggag atcctacaaa cacgtcagtg ggcagatgct gtattttgca cctgatctaa   1380
tactaaatga acagcggatg aaagaatcat cattctattc attatgcctt accatgtggc   1440
agatcccaca ggagtttgtc aagcttcaag ttagccaaga agagttcctc tgtatgaaag   1500
tattgttact tcttaataca attcctttgg aagggctacg aagtcaaacc cagtttgagg   1560
agatgaggtc aagctacatt agagagctca tcaaggcaat tggtttgagg caaaaaggag   1620
ttgtgtcgag ctcacagcgt ttctatcaac ttacaaaact tcttgataac ttgcatgatc   1680
ttgtcaaaca acttcatctg tactgcttga atacatttat ccagtcccgg gcactgagtg   1740
ttgaatttcc agaaatgatg tctgaagtta ttgctgggtc gacgcccatg gaattccagt   1800
acctgccaga tacagacgat cgtcaccgga ttgaggagaa acgtaaaagg acatatgaga   1860
ccttcaagag catcatgaag aagagtcctt tcagcggacc caccgacccc cggcctccac   1920
ctcgacgcat tgctgtgcct tcccgcagct cagcttctgt ccccaagcca gcaccccagc   1980
cctatccctt tacgtcatcc ctgagcacca tcaactatga tgagtttccc accatggtgt   2040
ttccttctgg gcagatcagc caggcctcgg ccttggcccc ggcccctccc caagtcctgc   2100
cccaggctcc agcccctgcc cctgctccag ccatggtatc agctctggcc caggccccag   2160
cccctgtccc agtcctagcc ccaggccctc ctcaggctgt ggccccacct gcccccaagc   2220
ccacccaggc tggggaagga acgctgtcag aggccctgct gcagctgcag tttgatgatg   2280
aagacctggg ggccttgctt ggcaacagca cagacccagc tgtgttcaca gacctggcat   2340
ccgtcgacaa ctccgagttt cagcagctgc tgaaccaggg catacctgtg gccccccaca   2400
caactgagcc catgctgatg gagtaccctg aggctataac tcgcctagtg acaggggccc   2460
agaggccccc cgacccagct cctgctccac tgggggcccc ggggctcccc aatggcctcc   2520
tttcaggaga tgaagacttc tcctccattg cggacatgga cttctcagcc ctgctgagtc   2580
agatcagctc ctaaggatcc tccggactag aaaagccgaa ttctgcagga attgggtggc   2640
atccctgtga cccctcccca gtgcctctcc tggccctgga agttgccact ccagtgccca   2700
ccagccttgt cctaataaaa ttaagttgca tcattttgtc tgactaggtg tccttctata   2760
atattatggg gtggaggggg gtggtatgga gcaaggggca agttgggaag acaacctgta   2820
gggctcgagg gggggcccgg taccagcttt tgttcccttt agtgagggtt aatttcgagc   2880
ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct cacaattcca   2940
cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg agtgagctaa   3000
ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct gtcgtgccag   3060
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc   3120
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct   3180
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg   3240
tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc   3300
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga   3360
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct   3420
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg   3480
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag   3540
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat   3600
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac   3660
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac   3720
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc   3780
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt   3840
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc   3900
ttttctacgg ggtctgacgc tcagaagaac tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc   3960
tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca   4020
agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc   4080
agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt ccaccatgat attcggcaag   4140
caggcatcgc catgcgtcac gacgagatcc tcgccgtcgg gcatgcgcgc cttgagcctg   4200
gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca   4260
agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat   4320
gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg catcagccat gatggatact   4380
ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc   4440
agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc   4500
gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt cattcagggc accggacagg   4560
tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca   4620
gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc   4680
ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct   4740
tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag atccttggcg gcaagaaagc catccagttt   4800
actttgcagg gcttcccaac cttaccagag ggcgaattcg agcttgcatg cctgc        4855

Claims (170)

1.降低个体的身体脂肪比例的方法，该方法包含：向个体细胞中送递核酸表达构建体，该构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物。
2.权利要求1的方法，其中通过电穿孔将核酸表达构建体向个体细胞中送递。
3.权利要求1的方法，其中个体细胞是体细胞、干细胞或生殖细胞。
4.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID No：11、SeqID No：12、SeqID No：13、SeqID No：14、SeqID No：17、SeqID No：18、SeqID No：19、SeqID No：20或SeqID No：21。
5.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
6.权利要求5的方法，其中该转染促进多肽包含带电荷的多肽。
7.权利要求5的方法，其中该转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
8.权利要求1的方法，其中核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。
9.权利要求8的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体的组织特异性细胞中表达。
10.权利要求9的方法，其中个体的组织特异性细胞包含肌细胞。
11.权利要求8的方法，其中编码的GHRH是生物活性的多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
12.权利要求8的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
13.权利要求12的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
14.权利要求1的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物促进个体生长激素(“GH”)分泌。
15.降低个体的身体脂肪比例的方法，该方法包含以下步骤：
(a)向个体的细胞中送递第一个核酸表达构建体、第二个核酸表达构建体和分子开关；其中第一个核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物；且其中第二个核酸表达构建体具有调节蛋白质的编码区；及
(b)将分子开关分子送递入个体中，其中分子开关分子控制调节蛋白质的活化。
16.权利要求15的方法，其中通过电穿孔将第一个核酸表达构建体向个体的细胞中送递。
17.权利要求15的方法，其中通过电穿孔将第二个核酸表达构建体向个体的细胞中送递。
18.权利要求15的方法，其中第一个核酸表达构建体编码包含SeqID No：1、SeqID No：2、SeqID No：3或SeqID No：4序列的多肽。
19.权利要求15的方法，其中第一个核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
20.权利要求19的方法，其中该转染促进多肽包含带电荷的多肽。
21.权利要求19的方法，其中该转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
22.权利要求15的方法，其中第二个核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的调节蛋白质的表达。
23.权利要求22的方法，其中编码的调节蛋白质在个体细胞中表达，但为无活性的。
24.权利要求23的方法，其中分子开关向个体细胞中的送递活化了调节蛋白质，且分子开关包含米非司酮或其功能性等价物。
25.权利要求24的方法，其中活性的调节蛋白质起始了在第一个核酸序列上编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。
26.权利要求25的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
27.权利要求25的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
28.权利要求27的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物促进个体生长激素(“GH”)分泌。
29.权利要求15的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
30.权利要求15的方法，其中第一个核酸表达构建体包含SeqIDNo：26。
31.权利要求15的方法，其中第二个核酸表达构建体包含SeqIDNo：27。
32.降低个体的身体脂肪比例的方法，该方法包含以下步骤：向个体送递重组生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物。
33.权利要求32的方法，其中重组GHRH是生物活性多肽；而GHRH的重组功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
34.权利要求32的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
35.权利要求32的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
36.权利要求32的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
37.增加个体的瘦体重的方法，该方法包含以下步骤：向个体细胞中送递核酸表达构建体，该构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物。
38.权利要求37的方法，其中通过电穿孔将核酸表达构建体向个体细胞中送递。
39.权利要求37的方法，其中个体细胞是体细胞、干细胞或生殖细胞。
40.权利要求37的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID No：11、SeqID No：12、SeqID No：13、SeqID No：14、SeqID No：17、SeqID No：18、SeqID No：19、SeqID No：20或SeqID No：21。
41.权利要求37的方法，其中核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
42.权利要求41的方法，其中转染促进多肽包含带电荷的多肽。
43.权利要求41的方法，其中转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
44.权利要求37的方法，其中核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。
45.权利要求44的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体的组织特异性细胞中表达。
46.权利要求45的方法，其中个体的组织特异性细胞包含肌细胞。
47.权利要求44的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
48.权利要求44的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
49.权利要求48的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
50.权利要求37的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
51.增加个体的瘦体重的方法，该方法包含以下步骤：
(a)向个体的细胞中送递第一个核酸表达构建体、第二个核酸表达构建体和分子开关；其中第一个核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物；且其中第二个核酸表达构建体具有调节蛋白质的编码区；及
(b)将分子开关分子送递入个体中，其中分子开关分子控制调节蛋白质的活化。
52.权利要求51的方法，其中通过电穿孔将第一个核酸表达构建体向个体细胞中送递。
53.权利要求51的方法，其中通过电穿孔将第二个核酸表达构建体向个体的细胞中送递。
54.权利要求51的方法，其中第一个核酸表达构建体编码包含SeqID No：1、SeqID No：2、SeqID No：3或SeqID No：4序列的多肽。
55.权利要求51的方法，其中第一个核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
56.权利要求55的方法，其中转染促进多肽包含带电荷的多肽。
57.权利要求55的方法，其中转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
58.权利要求51的方法，其中第二个核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的调节蛋白质的表达。
59.权利要求58的方法，其中编码的调节蛋白质在个体细胞中表达，但为无活性的。
60.权利要求59的方法，其中分子开关向个体细胞中的送递活化了调节蛋白质，且分子开关包含米非司酮或其功能性等价物。
61.权利要求60的方法，其中活化的调节蛋白质起始了在第一个核酸序列上编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。
62.权利要求51的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
63.权利要求51的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
64.权利要求63的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
65.权利要求51的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
66.权利要求51的方法，其中第一个核酸表达构建体包含SeqIDNo：26。
67.权利要求51的方法，其中第二个核酸表达构建体包含SeqIDNo：27。
68.增加个体的瘦体重的方法，该方法包含以下步骤：向个体送递重组生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物。
69.权利要求68的方法，其中重组GHRH是生物活性多肽；而GHRH的重组功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
70.权利要求68的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
71.权利要求70的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
72.权利要求68的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
73.增加个体的骨密度的方法，该方法包含：向个体细胞中送递核酸表达构建体，该构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物。
74.权利要求73的方法，其中通过电穿孔将核酸表达构建体向个体细胞中送递。
75.权利要求73的方法，其中个体细胞是体细胞、干细胞或生殖细胞。
76.权利要求73的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID No：11、SeqID No：12、SeqID No：13、SeqID No：14、SeqID No：17、SeqID No：18、SeqID No：19、SeqID No：20或SeqID No：21。
77.权利要求73的方法，其中核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
78.权利要求73的方法，其中转染促进多肽包含带电荷的多肽。
79.权利要求73的方法，其中转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
80.权利要求73的方法，其中核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。
81.权利要求80的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体的组织特异性细胞中表达。
82.权利要求81的方法，其中个体的组织特异性细胞包含肌细胞。
83.权利要求80的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
84.权利要求80的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
85.权利要求84的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
86.权利要求73的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
87.增加个体的骨密度的方法，该方法包含以下步骤：
(a)向个体的细胞中送递第一个核酸表达构建体、第二个核酸表达构建体和分子开关；其中第一个核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物；且其中第二个核酸表达构建体具有调节蛋白质的编码区；及
(b)将分子开关分子送递入个体中，其中分子开关分子控制调节蛋白质的活化。
88.权利要求87的方法，其中通过电穿孔将第一个核酸表达构建体向个体的细胞中送递。
89.权利要求87的方法，通过电穿孔将其中第二个核酸表达构建体向个体的细胞中送递。
90.权利要求87的方法，其中第一个核酸表达构建体编码包含SeqID No：1、SeqID No：2、SeqID No：3或SeqID No：4序列的多肽。
91.权利要求87的方法，其中第一个核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
92.权利要求87的方法，其中转染促进多肽包含带电荷的多肽。
93.权利要求87的方法，其中转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
94.权利要求87的方法，其中第二个核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的调节蛋白质的表达。
95.权利要求94的方法，其中编码的调节蛋白质在个体细胞中表达，但为无活性的。
96.权利要求95的方法，其中分子开关向个体细胞中的送递活化了调节蛋白质，且分子开关包含米非司酮或其功能性等价物。
97.权利要求96的方法，其中活性调节蛋白质起始了在第一个核酸序列上编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。
98.权利要求97的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
99.权利要求97的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
100.权利要求99的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
101.权利要求87的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
102.权利要求87的方法，其中第一个核酸表达构建体包含SeqIDNo：26。
103.权利要求87的方法，其中第二个核酸表达构建体包含SeqIDNo：27。
104.增加个体的骨密度的方法，该方法包含以下步骤：向个体送递重组生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物。
105.权利要求104的方法，其中重组GHRH是生物活性的多肽；而GHRH的重组功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
106.权利要求104的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
107.权利要求106的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
108.权利要求104的方法，其中重组GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
109.增加个体的骨愈合速率的方法，该方法包含：向个体细胞中送递核酸表达构建体，该构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物。
110.权利要求109的方法，其中通过电穿孔将核酸表达构建体向个体细胞中送递。
111.权利要求109的方法，其中个体细胞是体细胞、干细胞或生殖细胞。
112.权利要求109的方法，其中核酸表达构建体包含SeqID No：11、SeqID No：12、SeqID No：13、SeqID No：14、SeqID No：17、SeqID No：18、SeqID No：19、SeqID No：20或SeqID No：21。
113.权利要求109的方法，其中核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
114.权利要求113的方法，其中转染促进多肽包含带电荷的多肽。
115.权利要求113的方法，其中转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
116.权利要求115的方法，其中核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。
117.权利要求109的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体的组织特异性细胞中表达。
118.权利要求117的方法，其中个体的组织特异性细胞包含肌细胞。
119.权利要求109的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
120.权利要求119的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
121.权利要求120的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
122.权利要求109的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
123.增加个体的骨愈合速率的方法，该方法包含以下步骤：
(a)向个体的细胞中送递第一个核酸表达构建体、第二个核酸表达构建体和分子开关；其中第一个核酸表达构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物；且其中第二个核酸表达构建体具有调节蛋白质的编码区；及
(b)将分子开关分子送递入个体中，其中分子开关分子控制调节蛋白质的活化。
124.权利要求123的方法，通过电穿孔将其中第一个核酸表达构建体向个体的细胞中送递。
125.权利要求123的方法，通过电穿孔将其中第二个核酸表达构建体向个体的细胞中送递。
126.权利要求123的方法，其中第一个核酸表达构建体编码包含SeqID No：1、SeqID No：2、SeqID No：3或SeqID No：4序列的多肽。
127.权利要求123的方法，其中第一个核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
128.权利要求127的方法，其中转染促进多肽包含带电荷的多肽。
129.权利要求127的方法，其中转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
130.权利要求123的方法，其中第二个核酸表达构建体向个体细胞中的送递起始了编码的调节蛋白质的表达。
131.权利要求130的方法，其中编码的调节蛋白质在个体细胞中表达，但为无活性的。
132.权利要求131的方法，其中分子开关向个体细胞中的送递活化了调节蛋白质，且分子开关包含米非司酮或其功能性等价物。
133.权利要求132的方法，其中活化的调节蛋白质起始了在第一个核酸序列上编码的GHRH或其功能性生物等价物的表达。
134.权利要求133的方法，其中编码的GHRH是生物活性多肽；而编码的GHRH功能性生物等价物是与GHRH多肽比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
135.权利要求133的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物具有式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
136.权利要求135的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
137.权利要求123的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
138.权利要求123的方法，其中第一个核酸表达构建体包含SeqIDNo：26。
139.权利要求123的方法，其中第二个核酸表达构建体包含SeqIDNo：27。
140.改变个体的瘦体重的方法，该方法包含：
向个体组织中送递核酸表达构建体，该构建体编码生长激素释放激素(“GHRH”)或其功能性生物等价物；
其中GHRH或其生物等价物随后的表达足以增加瘦体重或降低身体脂肪比例。
141.权利要求140的方法，该方法进一步包含：
向组织应用细胞转染性脉冲；
其中细胞转染性脉冲送递入包含送递的核酸表达构建体的组织区域中。
142.权利要求141的方法，该方法进一步包含：
在向组织应用细胞转染性脉冲之前在组织中放置许多电极；
其中核酸表达构建体送递到***许多电极的组织区域。
143.权利要求141的方法，其中细胞转染性脉冲是电脉冲或血管压力脉冲。
144.权利要求140的方法，其中核酸表达构建体向个体组织中的送递包含电穿孔。
145.权利要求140的方法，其中送递步骤是通过注射、基因枪或金微粒轰击。
146.权利要求140的方法，其中个体是家养动物、食用动物或劳力牲畜。
147.权利要求140的方法，其中个体是人。
148.权利要求140的方法，其中核酸表达构建体实质上无病毒骨架。
149.权利要求140的方法，其中核酸表达构建体的启动子包含组织特异性启动子。
150.权利要求149的方法，其中组织特异性启动子包含肌肉特异性启动子。
151.权利要求149的方法，其中启动子包含SPc5-12(SeqID No：7)。
152.权利要求140的方法，其中核酸表达构建体的3’非翻译区是人生长激素的3’UTR、牛生长激素的3’UTR、骨骼α-肌动蛋白的3’UTR或SV40聚腺苷酸化信号。
153.权利要求140的方法，其中组织包含肌肉。
154.权利要求140的方法，其中核酸表达构建体是SeqID No：11、SeqID No：12、SeqID No：13、SeqID No：14、SeqID No：17、SeqID No：18、SeqID No：19、SeqID No：20或SeqID No：21。
155.权利要求140的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物包含SeqID No：2。
156.权利要求140的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物包含SeqID No：3。
157.权利要求140的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物包含SeqID No：4。
158.权利要求140的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物包含SeqID No：10。
159.权利要求140的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物包含氨基酸式(SeqID No：6)：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
160.权利要求140的方法，其中核酸表达构建体进一步包含转染促进多肽。
161.权利要求160的方法，其中转染促进多肽包含带电荷的多肽。
162.权利要求160的方法，其中转染促进多肽包含聚-L-谷氨酸。
163.权利要求140的方法，其中编码的GHRH功能性生物等价物是当与GHRH多肽比较时具有相似或改善的生物活性的多肽。
164.权利要求140的方法，其中编码的GHRH或其功能性生物等价物在个体中促进生长激素(“GH”)分泌。
165.一种包含生长激素释放激素(“GHRH”)功能性生物等价物的用于改变瘦体重的肽，其中GHRH是在个体中有生物活性的多肽；而GHRH功能性生物等价物是与GHRH比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
166.权利要求165的肽，该肽具有式：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
167.权利要求165的肽，该肽包含SeqID No：1、SeqID No：2、SeqIDNo：3或SeqID No：4。
168.一种包含生长激素释放激素(“GHRH”)功能性生物等价物的用于改变骨密度的肽，其中GHRH是在个体中有生物活性的多肽；而GHRH功能性生物等价物是与GHRH比较时已改造而含有不同的氨基酸序列但同时具有相似或改善的生物活性的多肽。
169.权利要求168的肽，该肽具有式：
-X1-X2-DAIFTNSYRKVL-X3-QLSARKLLQDI-X4-X5-RQQGERNQEQGA-OH
其中该式具有如下特征：
X1是氨基酸酪氨酸(“Y”)或组氨酸(“H”)的D-或L-异构体；
X2是氨基酸丙氨酸(“A”)、缬氨酸(“V”)或异亮氨酸(“I”)的D-或L-异构体；
X3是氨基酸丙氨酸(“A”)或甘氨酸(“G”)的D-或L-异构体；
X4是氨基酸甲硫氨酸(“M”)或亮氨酸(“L”)的D-或L-异构体；
X5是氨基酸丝氨酸(“S”)或天冬酰胺(“N”)的D-或L-异构体；
或其组合。
170.权利要求168的肽，该肽包含SeqID No：1、SeqID No：2、SeqIDNo：3或SeqID No：4。
CNB028234758A 2001-10-26 2002-10-25 改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法 Expired - Lifetime CN100417419C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US35780801P 2001-10-26 2001-10-26
US60/357,808 2001-10-26

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1649496A true CN1649496A (zh) 2005-08-03
CN100417419C CN100417419C (zh) 2008-09-10

Family

ID=23407110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB028234758A Expired - Lifetime CN100417419C (zh) 2001-10-26 2002-10-25 改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法

Country Status (10)

Country Link
US (2) US7338656B2 (zh)
EP (1) EP1450605B1 (zh)
CN (1) CN100417419C (zh)
AR (1) AR037038A1 (zh)
AT (1) ATE536100T1 (zh)
AU (1) AU2002348417B9 (zh)
BR (1) BR0213965A (zh)
CA (1) CA2464199C (zh)
MX (1) MXPA04003944A (zh)
WO (1) WO2003038112A2 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1313494C (zh) * 2005-08-29 2007-05-02 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种具有促增长作用的融合蛋白及其编码基因与应用
CN105671139A (zh) * 2014-11-17 2016-06-15 武汉白原科技有限公司 人体lbm（瘦体重）检测试剂盒和方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040192593A1 (en) * 1999-07-26 2004-09-30 Baylor College Of Medicine Protease resistant ti-growth hormone releasing hormone
US7493171B1 (en) * 2000-11-21 2009-02-17 Boston Scientific Neuromodulation Corp. Treatment of pathologic craving and aversion syndromes and eating disorders by electrical brain stimulation and/or drug infusion
US7440806B1 (en) * 2000-11-21 2008-10-21 Boston Scientific Neuromodulation Corp. Systems and methods for treatment of diabetes by electrical brain stimulation and/or drug infusion
US20030157717A1 (en) * 2001-09-07 2003-08-21 Baylor College Of Medicine Texas Medical Center Linear DNA fragments for gene expression
MXPA04007638A (es) * 2002-02-07 2004-12-06 Baylor College Medicine Desarrollo modificado de la glandula pituitaria en productos de madres animales prenadas, tratadas con terapia de hormona liberadora de hormona del crecimiento.
US20030220284A1 (en) * 2002-02-22 2003-11-27 Patricia Yotnda Delivery of adenoviral DNA in a liposomal formulation for treatment of disease
US20060128615A1 (en) * 2002-09-18 2006-06-15 Pierrette Gaudreau Ghrh analogues
EP1713828B1 (en) * 2004-01-20 2011-04-27 VGX Pharmaceuticals, LLC Enhanced secretion/retention of growth hormone releasing hormone (ghrh) from muscle cells by species-specific signal peptide
US7846720B2 (en) * 2005-01-26 2010-12-07 Vgx Pharmaceuticals, Inc. Optimized high yield synthetic plasmids
US7824870B2 (en) * 2006-01-03 2010-11-02 Alcon, Inc. System for dissociation and removal of proteinaceous tissue
US20110118729A1 (en) * 2009-11-13 2011-05-19 Alcon Research, Ltd High-intensity pulsed electric field vitrectomy apparatus with load detection
US20110118734A1 (en) * 2009-11-16 2011-05-19 Alcon Research, Ltd. Capsularhexis device using pulsed electric fields
US20110135626A1 (en) * 2009-12-08 2011-06-09 Alcon Research, Ltd. Localized Chemical Lysis of Ocular Tissue
US20110144562A1 (en) * 2009-12-14 2011-06-16 Alcon Research, Ltd. Localized Pharmacological Treatment of Ocular Tissue Using High-Intensity Pulsed Electrical Fields
WO2011081897A1 (en) * 2009-12-15 2011-07-07 Alcon Research, Ltd. High-intensity pulsed electric field vitrectomy apparatus
US8546979B2 (en) 2010-08-11 2013-10-01 Alcon Research, Ltd. Self-matching pulse generator with adjustable pulse width and pulse frequency
US20130261058A1 (en) * 2010-09-16 2013-10-03 University Of Miami Acceleration of wound healing by growth hormone releasing hormone and its agonists
US8993316B2 (en) 2011-11-16 2015-03-31 Brian P. Hanley Methods and compositions for gene therapy and GHRH therapy

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4223021A (en) 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228156A (en) 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4224316A (en) 1979-03-30 1980-09-23 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4226857A (en) 1979-03-30 1980-10-07 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223020A (en) 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4223019A (en) 1979-03-30 1980-09-16 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4228158A (en) 1979-03-30 1980-10-14 Beckman Instruments, Inc. Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4410512A (en) 1981-12-28 1983-10-18 Beckman Instruments, Inc. Combinations having synergistic pituitary growth hormone releasing activity
NL8200523A (nl) 1982-02-11 1983-09-01 Univ Leiden Werkwijze voor het in vitro transformeren van planteprotoplasten met plasmide-dna.
US5134120A (en) * 1984-08-03 1992-07-28 Cornell Research Foundation, Inc. Use of growth hormone to enhance porcine weight gain
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5036045A (en) 1985-09-12 1991-07-30 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Method for increasing growth hormone secretion
US4833166A (en) 1987-05-01 1989-05-23 Grosvenor Clark E Growth hormone releasing hormone complementary peptides
US4839344A (en) 1987-06-12 1989-06-13 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
USRE33699E (en) 1987-07-09 1991-09-24 International Minerals & Chemical Corp. Growth hormone-releasing factor analogs
FR2622455B1 (fr) 1987-11-04 1991-07-12 Agronomique Inst Nat Rech Application du facteur de stimulation de la secretion de l'hormone de croissance humaine, de ses fragments actifs et des analogues correspondants, pour augmenter la production laitiere et le poids des nouveau-nes chez les mammiferes
US4952500A (en) 1988-02-01 1990-08-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cloning systems for Rhodococcus and related bacteria
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5023322A (en) 1988-08-31 1991-06-11 Mta Kutatas-Es Szervezetelemzo Intezete Analogs of growth hormone releasing factor (GRF) and a method for the preparation thereof
US5084442A (en) 1988-09-06 1992-01-28 Hoffmann-La Roche Inc. Cyclic growth hormone releasing factor analogs and method for the manufacture thereof
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5302523A (en) 1989-06-21 1994-04-12 Zeneca Limited Transformation of plant cells
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5550318A (en) 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
US5137872A (en) 1989-09-18 1992-08-11 Pitman-Moore, Inc. Growth hormone-releasing factor analogs
US5322783A (en) 1989-10-17 1994-06-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Soybean transformation by microparticle bombardment
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
AU7174791A (en) 1990-01-26 1991-08-21 Baylor College Of Medicine Mutated promoter region from chicken skeletal alpha-actin gene
EP0544706A4 (en) 1990-06-29 1993-10-13 Hoffmann-La Roche Inc. Histidine substituted growth hormone releasing factor analogs
US5486505A (en) 1990-07-24 1996-01-23 Polygen Holding Corporation Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US5384253A (en) 1990-12-28 1995-01-24 Dekalb Genetics Corporation Genetic transformation of maize cells by electroporation of cells pretreated with pectin degrading enzymes
CA2084061A1 (en) 1991-04-09 1992-10-10 Arthur M. Felix Growth hormone releasing factor analogs
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5663146A (en) 1991-08-22 1997-09-02 Administrators Of The Tulane Educational Fund Polypeptide analogues having growth hormone releasing activity
US5610042A (en) 1991-10-07 1997-03-11 Ciba-Geigy Corporation Methods for stable transformation of wheat
US5298422A (en) * 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
JP3368603B2 (ja) 1992-02-28 2003-01-20 オリンパス光学工業株式会社 遺伝子治療用処置具
US6033884A (en) 1992-03-20 2000-03-07 Baylor College Of Medicine Nucleic acid transporter systems and methods of use
DK0636028T3 (da) 1992-04-03 2004-07-12 Univ California Selvorganiserende polynucleotidleveringssystem omfattende et amfipatisk kationisk peptid
US5545130A (en) 1992-04-08 1996-08-13 Genetronics, Inc. Flow through electroporation method
CA2135644C (en) 1992-05-14 2009-01-27 Elisabetta Vegeto Mutated steroid hormone receptors, methods for their use and molecular switch for gene therapy
US6132419A (en) 1992-05-22 2000-10-17 Genetronics, Inc. Electroporetic gene and drug therapy
US5507724A (en) 1992-07-01 1996-04-16 Genetronics, Inc. Electroporation and iontophoresis apparatus and method for insertion of drugs and genes into cells
DE69334225D1 (de) 1992-07-07 2008-07-31 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US5702932A (en) 1992-07-20 1997-12-30 University Of Florida Microinjection methods to transform arthropods with exogenous DNA
AU670316B2 (en) 1992-07-27 1996-07-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. An improved method of (agrobacterium)-mediated transformation of cultured soybean cells
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
GB9222888D0 (en) 1992-10-30 1992-12-16 British Tech Group Tomography
US5439440A (en) 1993-04-01 1995-08-08 Genetronics, Inc. Electroporation system with voltage control feedback for clinical applications
US5656610A (en) 1994-06-21 1997-08-12 University Of Southern California Producing a protein in a mammal by injection of a DNA-sequence into the tongue
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
US5655961A (en) 1994-10-12 1997-08-12 Acres Gaming, Inc. Method for operating networked gaming devices
US5736524A (en) 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
US5792747A (en) 1995-01-24 1998-08-11 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Highly potent agonists of growth hormone releasing hormone
EP0820296A4 (en) 1995-04-14 1999-06-30 Univ Tulane ANALOGS OF THE GROWTH HORMONE-RELEASING FACTOR
AU6855796A (en) 1995-08-29 1997-03-19 Cbr Laboratories, Inc. In vivo electroporation of cells
US5780448A (en) 1995-11-07 1998-07-14 Ottawa Civic Hospital Loeb Research DNA-based vaccination of fish
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5945100A (en) 1996-07-31 1999-08-31 Fbp Corporation Tumor delivery vehicles
US5981274A (en) 1996-09-18 1999-11-09 Tyrrell; D. Lorne J. Recombinant hepatitis virus vectors
US5704908A (en) 1996-10-10 1998-01-06 Genetronics, Inc. Electroporation and iontophoresis catheter with porous balloon
US6165755A (en) * 1997-01-23 2000-12-26 University Of Victoria Innovation And Development Corporation Chicken neuropeptide gene useful for improved poultry production
JP2001511353A (ja) * 1997-07-24 2001-08-14 バレンティス・インコーポレーテッド Ｇｈｒｈの発現システムおよび使用法
US5994624A (en) 1997-10-20 1999-11-30 Cotton Incorporated In planta method for the production of transgenic plants
US6759393B1 (en) * 1999-04-12 2004-07-06 Pfizer Inc. Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions
US20040192593A1 (en) * 1999-07-26 2004-09-30 Baylor College Of Medicine Protease resistant ti-growth hormone releasing hormone
PL366132A1 (en) * 1999-07-26 2005-01-24 Baylor College Of Medicine Super-active porcine growth hormone releasing hormone analog
US6486134B2 (en) * 1999-09-17 2002-11-26 Leadergene Limited Gene treatment to enhance feed efficiency and growth rate of livestock
WO2001066149A2 (en) * 2000-03-03 2001-09-13 Valentis, Inc. Nucleic acid formulations for gene delivery and methods of use
AR035671A1 (es) 2000-12-12 2004-06-23 Advisys Inc Administracion de secuencia de acido nucleico a un animal hembra, para aumentar el crecimiento de la descendencia
US20030074679A1 (en) * 2000-12-12 2003-04-17 Schwartz Robert J. Administration of nucleic acid sequence to female animal to enhance growth in offspring
AU2002357143B2 (en) * 2001-12-11 2009-07-30 Advisys, Inc. Growth hormone releasing hormone supplementation for treating chronically ill subjects
US9302725B2 (en) 2013-03-14 2016-04-05 Bell Sports, Inc. Locking rack system for bicycles
CA2946531C (en) 2014-05-19 2018-08-07 Felix Sorkin Modified permanent cap

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1313494C (zh) * 2005-08-29 2007-05-02 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种具有促增长作用的融合蛋白及其编码基因与应用
CN105671139A (zh) * 2014-11-17 2016-06-15 武汉白原科技有限公司 人体lbm（瘦体重）检测试剂盒和方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1450605A2 (en) 2004-09-01
AU2002348417B2 (en) 2009-10-01
EP1450605B1 (en) 2011-12-07
AR037038A1 (es) 2004-10-20
CN100417419C (zh) 2008-09-10
CA2464199C (en) 2013-12-24
US7338656B2 (en) 2008-03-04
US20040138111A1 (en) 2004-07-15
WO2003038112A3 (en) 2003-11-06
WO2003038112A2 (en) 2003-05-08
BR0213965A (pt) 2005-03-15
CA2464199A1 (en) 2003-05-08
US20090292107A1 (en) 2009-11-26
MXPA04003944A (es) 2004-07-08
EP1450605A4 (en) 2007-01-17
ATE536100T1 (de) 2011-12-15
WO2003038112B1 (en) 2004-04-08
AU2002348417B9 (en) 2010-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN100417419C (zh) 改变个体的瘦体重和骨特性的组合物和方法
CA2469310C (en) Plasmid mediated supplementation for treating chronically ill subjects
US20040014645A1 (en) Increased delivery of a nucleic acid construct in vivo by the poly-L-glutamate (&#34;PLG&#34;) system
TWI290174B (en) Synthetic muscle promoters with activities exceeding naturally occurring regulatory sequences in cardiac cells
CA2378943C (en) Super-active porcine growth hormone releasing hormone analog
CA2513743C (en) Reducing culling in herd animals growth hormone releasing hormone (ghrh)
US20030157717A1 (en) Linear DNA fragments for gene expression
AU2002348417A1 (en) A composition and method to alter lean body mass and bone properties in a subject
JP2000350590A (ja) 成長ホルモン及び成長ホルモン放出ホルモン組成物
US20040192593A1 (en) Protease resistant ti-growth hormone releasing hormone
US6759393B1 (en) Growth hormone and growth hormone releasing hormone compositions
TW200424214A (en) Plasmid mediated GHRH supplementation for renal failures
CN101027081A (zh) 生长激素释放激素增强疫苗接种应答
CN1662261A (zh) 通过多聚－l－谷氨酸(“plg”）***增加核酸构建体的体内递送
US8188056B2 (en) Reducing arthritis and lameness in subjects by growth hormone releasing hormone (GHRH) supplementation
CA2595619A1 (en) Enhanced secretion/retention of growth hormone releasing hormone (ghrh) from muscle cells by species-specific signal peptide
US20090005333A1 (en) Reducing culling in herd animals growth hormone releasing hormone (ghrh)
MC et al. GHRH ZUR VERWENDUNG BEI DER BEHANDLUNG VON CHRONISCHER NIERENINSUFFIZIENZ GHRH POUR LE TRAITEMENT DES INSUFFISANCES RENALES CHRONIQUES

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20080910

CX01 Expiry of patent term