CN1646911A - 基因检测工具、检测方法以及检测用试剂盒 - Google Patents
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-
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Abstract
本发明提供一种基因检测工具,其含有均可密闭的反应室与检测室,在上述反应室与前述检测室之间具有将上述反应室与上述检测室隔开的隔壁部。上述隔壁部可进行自由地开合,上述反应室由通过使相互的开口手段嵌合能够形成密闭状态的反应室的至少2个部件形成,同时上述检测室或上述反应室具有基因检测部。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因检测工具、检测方法以及检测用试剂盒。通过本发明中的基因检测工具及检测方法,能够在密闭的***中从微量的被检样品中检测出基因,尤其能够提高医疗机构或临床检查机构等对患者来源的检测样品进行操作时的安全性。
背景技术
适今为止,在针对具有特定的碱基序列的DNA的检测技术中,有例如被广泛使用的杂交法,尤其是普遍使用Southern印迹法(Southern blot法).
在Southern印迹法中,首先以限制性内切酶使被检测样品中的DNA片段化,通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量大小对DNA片段进行分离,在凝胶上分离的各个DNA片段变性成为单链后,固定到尼龙滤膜或硝酸纤维素滤纸等上。然后,变性的单链DNA与标记的探针DNA进行杂交(作为标记,可以使用例如放射性同位素、荧光物质、或者发光物质等等)。接下来将滤膜洗净以除去未杂交的标记探针DNA,可以通过检测杂交形成的双链DNA的标记物的信号,检测出具有特定碱基序列的DNA。
但是,前述的杂交法中,不仅需要比较大量的电泳用被检样品,而且各操作均在开放***中进行。因此,例如在医疗机构或临床检查机构等场所,对来源于患者的被检样品(例如血液样品)进行操作时,如这些被检样品被具有危害的病原菌或病毒污染,可能会有感染实施检测的人员的危险。另外,也有检测产生的废弃物(凝胶以及洗净液等等)的处理困难等问题。
作为针对具有特定碱基序列的DNA的检出技术,已知有利用电极型感应器及嵌入剂的电化学的检测方法。
例如,在特开平9-288080号公报中记载了使用装备有输出端子并同时固定了探针DNA的电极,与检测对象DNA在嵌入剂存在下进行反应,并测定反应后的电极的电流,检测出探针DNA与检测对象DNA形成的杂交DNA的存在的方法。
特开平5-285000号公报中公开了通过将载体浸入含有变性的单链状态的检测对象DNA的样品溶液中,使检测对象DNA吸附到载体表面,然后,在储有探针DNA的反应槽中,浸入上述载体,并通过控制探针溶液的温度进行杂交,然后,将上述载体浸入含有嵌入剂溶液的检测槽中,识别在载体表面形成的双链DNA,检测来自结合的嵌入剂的电化学信号,进行基因检测的方法。另外,在上述公报中,也公开了在检测对象DNA的含量是微量的情况下,通过PCR进行DNA扩增后,可以进行上述检测。
但是,上述电化学的检测方法,操作也在开放***中进行,因此在医疗机构或临床检查机构等场所对来源于患者的被检样品进行操作时,具有与上述相同的缺点。
另一方面,作为粪便等特殊样品的检测工具,已知的有密闭***的检测工具。例如,在特开平8-54390号公报中记载了具有粪便悬浊液调制用密闭溶液室,和抗原抗体复合物检测用密闭检测物室的粪便内潜出血检测装置。在使用该检测装置的时候,在调制粪便悬浊液之前溶液室和检测物室互相密闭,调制好粪便悬浊液后,通过可裂膜的破开,溶液室与检测物室形成1个密闭室。
另外,在特开2000-146957号公报中记载了主要用于检测细菌用的擦拭检查工具。
但是,用于检测DNA等基因的密闭***检测工具是未知的。另外,在上述各公报中记载的任意一种密闭***检测工具,都是在假定样品量比较多的情况下,都不是在检测工具中设置的样品调制室中,在进行检测对象(例如,细菌)的添加后进行检测的技术,并且,破开可裂膜的方法复杂,制造成本也高昂。
因此,本发明的课题为提供一种能够从微量的样品中检测出含有特定碱基序列的基因的,在医疗机构或临床检查机构等中操作危险的检测样品的情况下也能够降低感染检测实施人员的危险性,并使检测产生的废弃物容易进行处理的,构造更加简单和小型化的基因检测技术,即,基因检测工具、基因检测方法及检测用试剂盒。
发明内容
上述课题可以通过以下所述的本发明得到解决。
即,本发明涉及一种基因检测工具,其是含有均可以密闭的反应室和检测室,并在上述反应室和上述检测室之间具有区分上述反应室和上述检测室的隔壁部的基因检测工具,其中,上述隔壁部可进行自由地开合,上述反应室由通过使相互的开口手段嵌合能够形成密闭状态的反应室的至少2个部件形成,同时上述检测室或上述反应室具有基因检测部。
在上述本发明的基因检测工具中,对于上述隔壁部,表面的一部分具有沟状的槽口,同时,至少与上述隔壁部邻接的上述反应室和上述检测室由具有柔软性的材料形成,以此通过从外部对工具的挤压操作使上述槽口的至少一部分破裂,可使上述隔壁部开封。
在上述本发明的基因检测工具中,上述反应室由一端与上述检测室连接且被上述隔壁部密闭,另一端是开口手段的筒状部件与一端封闭,另一端为开口手段的有底筒状部件形成,上述2个开口手段嵌合,形成密闭状态的反应室。另外,上述反应室也可以在上述有底筒状部件的封闭端具有基因检测部。
在上述本发明的基因检测工具中,上述检测室由一端与上述反应室连接且被上述隔壁部密闭,另一端是开口手段的筒状部件形成,并且在上述开口手段具有含基因检测部的密闭盖。
在上述本发明的基因检测工具中,上述反应室可用于充填被检样品及基因合成反应用液。
在上述本发明的基因检测工具中,上述检测室可用于充填与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质。另外,用于将上述反应室内的被检样品及基因合成反应用液和上述检测室内的与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质混合的通路,可通过上述隔壁部的开封而形成。
在上述本发明的基因检测工具中,上述基因检测部可以为电化学检测部或者荧光检测部。
上述本发明的基因检测工具,更具体而言,其含有各自互相独立可密闭的反应室和检测室,具有通过在上述反应室及上述检测室之间配置使上述反应室和上述检测室互相密闭的隔壁部,其特征为
(A)上述反应室具有可装入可能含有检测目标基因的被检样品及基因合成反应用液的开口手段,
(B)上述检测室具有可装入与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质的开口手段,
(C)维持含有上述反应室及上述检测室的基因检测工具整体的密闭状态的同时,上述隔壁部可通过外部的操作进行开封,并且
(D)上述隔壁部开封后,上述反应室内的液体可以从因开封而形成的通路移至上述检测室中。
在上述本发明的基因检测工具中,基因结合性物质可选自以下的物质,
(a)可与基因特异结合的电化学活性物质,
(b)可与基因特异结合的荧光物质,以及
(c)具有可与检测目标基因进行序列特异性结合的区域及一对荧光基团及淬灭基团,并在与检测目标基因结合前不能产生荧光,在与检测目标基因结合时可产生荧光的探针。
另外,本发明涉及一种基因检测方法,该方法是使用基因检测工具,在密闭状态下进行基因扩增操作及基因检测操作的基因检测方法,所述基因检测工具含有均可密闭的反应室和检测室,并在上述反应室和上述检测室之间具有区分上述反应室和上述检测室的隔壁部,在上述反应室中充填有被检样品及基因合成反应用液,在上述检测室中充填有与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质,该方法含有以下操作
(1)至少使上述反应室为上述检测目标基因可扩增的条件,
(2)在(1)的操作之后,在维持上述基因检测工具的密闭状态的同时,使上述隔壁部开封,
(3)经通过开封在上述隔壁部形成的通路,使上述反应室内的溶液和上述检测室内的与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质相接触,
(4)检测得到的信号。
在上述基因检测方法中,上述基因结合性物质可以选自以下的物质,
(a)可与基因特异结合的电化学活性物质,
(b)可与基因特异结合的荧光物质,以及
(c)具有可与检测目标基因进行序列特异性结合的区域及一对荧光基团及淬灭基团,并在与检测目标基因结合前不能产生荧光,在与检测目标基因结合时可产生荧光的探针。
在上述基因检测方法中,信号的检测可以是电化学检测或荧光检测。
上述基因检测方法可以是在上述反应室中预先充填基因合成反应用液,并在(1)的操作之前将被检样品装入上述反应室中的方法。
在上述基因检测方法中,上述反应室具有开口手段,可以将被检样品和/或基因合成反应用液从上述开口手段装入上述反应室中,装入后关闭开口手段,密闭反应室。
上述基因检测方法可以是在上述检测室中充填与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质的方法。
上述基因检测方法更具体而言,其特征为,含有以下的步骤:
(1)由反应室的开口手段装入可能含有检测目标基因的被检样品及基因合成反应用液后,关闭开口手段,密闭反应室,
(2)使上述反应室内的条件为上述检测目标基因可扩增的条件,
(3)经过扩增上述检测目标基因所需的时间后,在维持包括上述反应室及上述检测室的基因检测工具的全体的密闭状态的同时,通过外部的操作使通过设置在上述反应室和检测室之间使上述反应室和上述检测室互相密闭的隔壁部开封,
(4)使上述反应室内的反应液从因上述开封而形成的通路移至上述检测室中,
(5)在上述检测室内,将与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质与上述反应液相接触,
(6)检测得到的信号。
本发明还涉及一种基因检测用试剂盒,其含有上述本发明的基因检测工具、基因合成反应用液或基因合成试剂、以及与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质。此基因检测用试剂盒还可以含有基因纯化用手段。
附图说明
图1为本发明的基因检测工具的示意性截面图。
图2为图1的基因检测工具的示意性分解图。
图3为图1的基因检测工具中包含的隔壁部的俯视图。
图4为图3的A-A线的截面图。
图5为示出本发明的基因检测工具中包含的隔壁部开封状态的示意性透视图。
图6为隔壁部开封后本发明的基因检测工具的示意性截面图。
图7为本发明的基因检测工具中包含的其他形态的隔壁部开封前的示意性截面图。
图8是图7的隔壁部开封后的示意性截面图。
图9为示出使用B型肝炎病毒时通过线性扫描伏安测量法(リニァスイ一プボルタンメトリ一)的测定结果的曲线图。
上述附图中使用的符号如下所述。
1…反应室;1a…反应室的开放端部;2…电化学检测室;2a…检测室的开放端部;3…隔壁部;4…嵌合部;5…盖部;5a,5b…盖部端部;6…基因合成反应用液;7…含有基因结合性物质的溶液;8…手指;9…混合液;10…基因检测工具;11…有底圆筒体;11a,11b…有底圆筒体端部;12…有节圆筒体;12a,12b…有节圆筒体端部;31…薄膜部;31a…薄膜部外缘部;32…沟部;33…薄膜中央部;34…封闭膜支撑帽;34a…封闭膜;34b…封闭膜支撑框;35…突起支撑帽;35a…突起;35b…突起支撑框;51…电极;52…密栓部;53…端子。
具体实施方式
以下,以使用可与基因发生特异性结合的电化学活性物质作为上述基因结合性物质时的方式为主,根据附图对本发明的基因检测工具的具体方式作出说明。也就是说,在以下的说明中,对于使用电化学活性物质的特定方式以外的方式,使用荧光物质或可发出荧光的探针作为基因结合性物质的场合也可直接适用。
图1为本发明的基因检测工具10的示意性截面图,图2为其分解图。如图1所示,基因检测工具10包含反应室1与检测室2,上述反应室1及上述检测室2之间设置有隔壁部3。即,反应室1与检测室2被隔壁部3分隔。在上述反应室1中可以具有以螺栓等自由装卸的嵌合部4作为上述反应室1的开口手段,另外,内部可包含基因合成反应用液6。另外,在使用电化学活性物质作为基因结合性物质的时候,上述检测室2为电化学检测室,一端装备含有电极51的盖部5,内部可包含基因结合性物质含有液7。如图1所示,隔壁部3在进行后述开封之前,上述反应室1与前述检测室2各自密封。
图1所示的本发明的基因检测工具10,例如图2所示,可由有底圆筒体11、有节圆筒体12与盖部5组合形成。有底圆筒体11是一端11a封闭,另一端11b开口的圆筒体。有节圆筒体12是两端12a、12b都开口,中间部具有竹节状的隔壁部3的圆筒体。通过用螺栓将有底圆筒体11的开口端部11b与有节圆筒体12的一端部12a嵌合,可形成作为密闭室的反应室1。另一方面,在有节圆筒体12的另一端部11b,可以将盖部5用螺栓等自由装卸地进行安装,通过嵌合盖部5,可形成作为密闭室的检测室2。
盖部5在使用上述电化学活性物质作为上述基因结合性物质的时候,密栓部52的一端部5a上装备有裸露的电极51,另一端部5b上装备有裸露的端子53。盖部5可通过设置于密栓部52侧面的螺栓等与有节圆筒体12的一端部12b自由装卸地进行嵌合,在有节圆筒体12的一端部12b上安装盖部5时进行嵌合,使具有电极51的端部5a侧被包含在有节圆筒体12的内部,具有端子53的端部5b侧被安置在有节圆筒体12的外侧。
盖部5通过安装在有节圆筒体12的一端12b上,可形成作为密闭室的检测室(电化学检测室)2,通过取开盖部5,可以提供能够装入基因结合性物质的开口手段。
在不使用电化学活性物质作为上述基因结合性物质的时候,没有必要在盖部5处设置电极和端子。
图1所示的本发明的基因检测工具10在盖部5处设置电极51,不过电极51也可以设置在反应室中。
图3~图5示出隔壁部3的一种方式。图3为隔壁部3的俯视图,图4为图3的A-A线截面图,图5为表示通过外部的挤压操作使隔壁部3开封的状态的示意性透视图。
如图3及图4所示,隔壁部3由薄膜部31和在其一表面上形成的沟部32组成,并通过薄膜部31的外缘部31a与有节圆筒体12的内侧的侧壁相结合。沟部32是为方便通过外部的挤压操作(参照图5)进行开封而设计的破裂用沟,例如图4所示,可以是V字型状的沟。例如,如图3所示,在薄膜部31的中央部33处设置沟部32,以形成圆形开口部。在沟部32破裂的时候,为使中央部33不从薄膜部31处脱离,优选设置非破裂部31b。
作为图1及图2所示的本发明的基因检测工具10的隔壁部3,在设置图3及图4所示的隔壁部3时,如图5所示,通过手指8从隔壁部3的外侧挤压,可在沟部32的部分使薄膜部31容易地破裂,并在中心部分形成圆形开口部。在设置了非破裂部31b之外的场合,虽然中央部33不从薄膜部31脱离,但如果在薄膜部31的检测室2一侧的表面上形成沟部32,则如图5所示,通过外侧的挤压操作可以使薄膜部31的中央部33倒向检测室2一侧,使液体可以容易地从反应室1移至检测室2,因而是优选的。
以下说明使用图1~图5所示的本发明的基因检测工具10,实施本发明的基因检测方法时的操作。
首先,将有底圆筒体11从有节圆筒体12上取下,在有底圆筒体11中装入被检样品及基因合成反应用液6后,再次将有底圆筒体11与有节圆筒体12嵌合,使反应室1为密闭状态(参照图1及图2)。另一方面,将盖部5从有节圆筒体12上取下,在有节圆筒体12的检测室2一侧装入含有基因结合性物质的溶液7后,再将盖部5与有节圆筒体12嵌合,使检测室2为密闭状态(参照图1及图2)。
另外,如图1所示,也可以预先准备好在反应室1的内部充填基因合成反应用液6,在检测室2的内部充填基因结合性物质含有液7的状态的基因检测工具10,在实施检测的时候,将有底圆筒体11从有节圆筒体12上取下,在有底圆筒体11中装入被检样品,再将有底圆筒体11与有节圆筒体12嵌合,使反应室1为密闭状态。
然后,将基因检测工具10的全部,或至少反应室1的部分置入适当的培养箱中(例如,PCR装置),扩增被检样品内的检测目标基因。扩增被检样品内的检测目标基因的步骤中,对反应室1与检测室2的相对位置没有限定,如图1及图2所示,可将反应室1设置于下方,检测室2设置于上方,相反,也可将反应室1设置于上方,检测室2设置于下方,或将反应室1和检测室2沿水平方向并列设置,或倾斜于垂直方向。
经过检测目标基因扩增所需的时间后,从培养箱中取出基因检测工具10,如图5所示,通过外部的挤压操作使隔壁部3开封,接下来,将反应室1中的反应液移至检测室2,与预先装入检测室2中的基因结合性物质含有液7相接触。将反应液从反应室1移至检测室2时,例如,可通过挤压反应室1侧将反应液压入检测室2侧,或用手拿住反应室1侧的前端部,振动基因检测工具10整体1~2次,以简单地使之移动。通过以上操作,如图6所示,在检测室2中形成反应室1的反应液与检测室2的基因结合性物质含有液7的混合液9,因此,可以使此混合液9与电极51接触,从端子53在外部取出电信号。
在本发明的基因检测工具中,反应室或检测室的形状并不限定于图1~图6所示的圆筒状,可为任意的形状(例如棱柱状)。另外,本发明的基因检测工具并不限定于只有1组反应室与检测室与隔壁部组合的单通路形式,也可为含有2组或2组以上反应室与检测室与隔壁部组合的多通路形式。多通路形式的情况下,可在相同的条件下实施后述的比较试验。
本发明的基因检测工具的尺寸在检测被检样品中基因目的的范围内没有限定,例如,图1~图6所示的圆筒状基因检测工具10的场合,基因检测工具10的全长[从有底圆筒体11的封闭端部11a(参照图2)至盖部5的端部5b(参照图2)的全长]可约为2~10cm(特别是约3-7cm),反应室1的全长[从有底圆筒体11的封闭端部11a(参照图2)至隔壁部3的全长]可约为1~5cm,检测室2的全长[从隔壁部3至盖部5的端部5a(参照图2)的全长]可约为1~5cm。另外,图1~图6所示的圆筒状基因检测工具10的内径可为例如约3~10mm。但是,本发明的基因检测工具也可以比上述尺寸更为小型或更为大型。
本发明的基因检测工具的材料并无特别限定,可由例如塑料材料(例如聚烯烃,尤其是聚乙烯、聚酯,特别是聚对苯二甲酸乙二酯或者聚丙烯酸酯,尤其是聚甲基丙烯酸甲酯)形成。另外,为了能从外部观察反应室中的反应状态或检测室中的检测状态,优选使用透明材料制造。
图3及图4所示的具有隔壁部3的有节圆筒体12,可通过例如含有隔壁部3作为封闭端的圆筒体与两端开放的圆筒体相结合制造而成。
另外,本发明的基因检测工具的材料,从采用挤压操作使隔壁部开封的观点出发,至少在隔壁部邻近的部位适宜选用适于挤压操作的柔软性材料。
本发明的基因检测工具中,作为反应室及检测室之间设置的隔壁部,除3及图4所示的隔壁部之外,也可以使用可通过外部的操作进行开封的任意手段。例如如图7(示意性截面图)所示,在反应室1的开放端部1a与检测室2的开放端部2a之间,可以使用含有封闭膜支撑帽34和突起支撑帽35的隔壁部3。封闭膜支撑帽34具有封闭膜34a与封闭膜支撑框34b,可置于反应室1的开放端部1a处。突起支撑帽35具有突起35a与突起支撑框35b,可置于检测室2的开放端部2a处。另外,在突起支撑框35b的端部与反应室1的外缘部之间设置间隙g,以装备突起支撑框35b。根据需要,可设置适当的止动手段(图中未示出),在开封之前维持间隙g。
图7所示的隔壁部3开封时,解除根据情况设置的止动手段,将检测室2侧向反应室1侧的方向(箭头P的方向)挤压,如图8(示意性截面图)所示,突起支撑帽35上支撑的突起35a突破封闭膜支撑帽34上支撑的封闭膜34a而破裂。
使用图7及图8所示的隔壁部3时,通过将封闭膜支撑帽34从反应室1的开放端部1a处取下,可用作装入被检样品及基因合成反应用液的开口手段,因此,不必设置图1~图6所示形态的嵌合部4。另外,通过将突起支撑帽35从检测室2的开放端部2a上取下,可用作装入基因结合性物质的开口手段。
适用本发明的检测目标基因只要是可设计基因合成反应用的引物,并可以用此引物进行基因合成反应的基因即可,对此并无特别限定,例如可以是天然存在的基因(例如,来源于动物、植物、微生物、或者病毒的基因),或者,由人工制造的基因(例如,化学合成的基因,或遗传工程制造的基因)。另外,本说明书中的“基因”包含DNA和RNA两种。
另外,适用本发明的被检样品,只要可能含有检测目标基因即可,并无特别限定,例如,生物学样品[例如动物(含人类)的体液(例如血液、血清、血浆、脊髓液、泪液、汗、尿、脓、或痰),或者***物(例如粪便)、脏器、组织、或动植物本身或者它们的干燥体],或者来自环境的样品(例如河流水、湖泊水、或海水、或土壤)。本发明可以在密闭的状态下进行检测操作,因此,尤其可以适用于危险的被检样品或存在危险性的被检样品(例如来源于病毒感染患者的被检样品)。
作为本发明中使用的“基因结合性物质”,只要是与基因结合并发出可检测信号的物质即可,并无特别限定,例如可以使用,
(1)可与基因特异结合的电化学活性物质,
(2)可与基因特异结合的荧光物质,以及
(3)具有可与检测目标基因进行序列特异性结合的区域及一对荧光基团及淬灭基团,并在与检测目标基因结合前不能产生荧光,在与检测目标基因结合时可产生荧光的探针。
可与基因特异结合的电化学活性物质在与基因特异结合后发出可检测的电化学信号。即,不会与基因以外的物质结合,而与基因发生特异结合,并在电化学检测中显示氧化或还原活性。对存在电化学活性物质结合的基因的样品溶液施加特定的电压时,可得到与基因结合性物质的量成比例的信号。
本发明中使用的电化学活性物质可与基因发生特异性结合,并且,只要是电化学活性的基因结合性物质,并无特别限定,例如优选可以与双链DNA特异结合,并且具有电化学活性的嵌入剂(intercalating agent)。另外,“与双链DNA特异结合”指,不与单链DNA结合而与基因结合。
作为可在本发明中使用的电化学活性基因结合性物质,可举出例如二苯甲酰亚胺衍生物、二茂铁衍生物、醌衍生物、靛酚衍生物、吖啶衍生物、黄素衍生物、紫罗碱(ビオログン)衍生物、钌络合物、锇络合物、钴络合物、铂络合物、铜络合物、放线菌素D或道诺霉素或者它们的衍生物等等。
可与基因特异结合的荧光物质与基因特异结合(即,不与基因以外的物质结合,与基因特异性的结合),发出可检测的荧光。作为这样的荧光物质,可使用公知的物质,例如,溴化乙锭或SYBR green I。例如,溴化乙锭嵌合于核酸(单链和双链)上时,在260nm的激发光下产生590nm的荧光,可以利用此荧光进行检测。同样SYBR green I可与DNA特异结合,在激发波长为494nm下发出519nm波长的荧光。
具有可与检测目标基因进行序列特异性结合的区域及一对荧光基团及淬灭基团,并在与检测目标基因结合前不能产生荧光,在与检测目标基因结合时可产生荧光的探针,与检测目标基因的特定碱基序列进行特异的结合(即,与检测目标基因的特定碱基序列进行杂交),发出可检测的荧光。此类探针可以使用例如,与分子信标法(MolecularBeacon)中使用的探针相同的探针。此探针在探针分子内具有荧光基团和淬灭基团,并具有可与检测目标基因进行序列特异结合的碱基序列区域及可发生自身配对的碱基区域。当此探针处于分子内自身配对的状态时,由于荧光基团与淬灭基团互相接近,因而即使施加激发光也不能发出荧光,当与检测目标基因进行序列特异性杂交时,荧光基团与淬灭基团之间的间隔增大,因而对荧光基团施加激发光时可以发出荧光。
在本发明中,使用电化学活性物质作为上述基因结合性物质时,有必要在检测室中设置电极,但在使用荧光物质或可发出荧光的探针时,不必在检测室中设置电极,而需要成为可应用荧光光度计进行测定的形态,例如,由可以透过激发光和荧光的材料形成,可以装备在荧光光度计测定部的形状。
本发明中,在上述反应室中使用下述物质进行基因合成反应。
(a)可能含有检测目标基因的被检样品,以及
(b)至少含有能够以上述检测目标基因为模板进行基因合成的引物的基因合成反应用液
本发明中进行的上述基因合成反应,只要是能够以被检样品中的检测目标基因为模板,合成与基因结合性物质结合的基因的反应即可,此外并无特别限定,可以举出例如基因扩增反应、复制反应、转录反应、或者逆转录反应,优选使用上述基因扩增反应。
基因扩增反应可使用任意公知的方法,例如,聚合酶链式反应(PCR)、LAMP(Loop介导的等温扩增技术)法、ICAN(等温和嵌合引物介导的核酸扩增技术)法、TMA(转录介导的扩增)法、SDA(链置换扩增)法、LCR(连接酶链式反应)法、或者NASBA(基于核酸序列的扩增)法等等。
通常,在上述基因合成反应(尤其是基因扩增反应)中,如存在基因结合性物质,将会阻碍基因合成反应。即,如在上述基因合成反应(尤其是基因扩增反应)中存在上述电化学活性物质或荧光物质的任何一种,将阻碍基因合成反应(尤其基因扩增反应)。但是,在本发明中,可在上述基因结合性物质不存在的条件下进行上述基因合成反应(尤其是基因扩增反应),因此,即使在被检样品中存在的检测目标基因的拷贝数低,也可以高灵敏地进行检测。
本发明中的基因合成反应的反应本身,可以与通常的基因合成反应完全相同地进行。例如,在本发明中,进行作为基因合成反应的PCR时,可以与通常的PCR同样地进行。
当检测目标基因为DNA的时候,可以通过例如,使用耐热性DNA聚合酶(例如,Taq聚合酶),进行初期变性反应(例如,97℃2~3分钟)以后,重复(例如,15~45次)下述扩增循环进行PCR:(1)DNA的变性步骤(90~94℃30秒),(2)单链DNA与引物的退火步骤(50~55℃30秒),以及(3)采用耐热性DNA聚合酶的DNA合成步骤(70~75℃1~2分钟)。
当检测目标基因为RNA时,可使用例如逆转录PCR(RT-PCR)法进行。即,使用逆转录酶以及寡(dT)引物,进行逆转录反应后,与上述针对DNA的情况相同,应用耐热性DNA聚合酶(例如,Taq聚合酶),重复进行初期变性反应以及其后的扩增循环。
本发明中,对于被检样品,将上述基因合成反应得到的基因合成反应生成液,与含有基因结合性物质的溶液在检测室混合,测定此混合液的电化学应答或荧光等。例如,在进行作为基因合成反应的PCR时,对于被检样品,将聚合酶链式反应得到的聚合酶链式反应生成液与含有基因结合性物质(例如,嵌入剂)的溶液在检测室中混合,测定此混合液的电化学应答或荧光等。
另一方面,本发明中,对于上述被检样品,除不进行上述基因合成反应之外,优选进行重复同样的操作的比较试验。即,将上述被检样品在反应室中与基因合成反应用液接触,在检测目标基因不可能扩增的条件下,将隔壁部开封,使被检样品与基因合成反应用液的混合液移动至检测室,与含有基因结合性物质的溶液混合,测定此混合液的电化学应答或荧光等。
在本发明中,通过测定对检测室中的混合液(例如,基因合成反应生成液和含有基因结合性物质的溶液的混合液)外加电压时产生的电流值,或给予激发光时产生的荧光量,可以进行电化学应答或荧光量的测定。
作为电化学应答的测定法,具体可举出各种电化学测定方法,例如线性扫描伏安法(LSV)、计时电流法(CA)、计时库仑法(CC)、或者循环伏安法(CV)等等。
本发明中利用电化学应答进行的检测,可根据以下原理判断被检样品中的检测目标基因的有无。
即,在检测室中装填的基因结合性物质可与基因进行特异性的结合,而且具有电化学活性。因此,当从反应室中送出的反应液不含有基因,或含有少量基因时在检测室生成的混合液的电化学应答,与从反应室中送出的反应液含有大量基因时在检测室生成的混合液的电化学应答相比,后一种情况下基因结合性物质与基因相结合,所以与前种情况下的电化学应答相比,后一种情况下的电化学应答下降,产生可以检测的电化学差异。
因此,通过反应室中的基因合成反应合成基因,当反应液中存在大量基因时,在检测室中生成的混合液的电化学应答,与比较实验(即,在反应室中未进行基因合成反应的实验)中检测室中生成的混合液相比,电化学的应答降低。在此情况下,可判断被检样品中存在检测目标基因。
另一方面,在反应室中未通过基因合成反应进行基因合成,反应液中不存在大量基因时,检测室中生成的混合液的电化学应答与比较试验中的混合液的电化学应答之间不产生差异。这时,可判定被检样品中不存在检测目标基因。
例如,作为基因合成反应进行PCR时,作为基因结合性物质,可以使用通过嵌入[即嵌合(intercalation)]到双链DNA中相邻碱基对之间而与双链DNA特异结合的嵌合剂。
DNA通过PCR扩增、在反应液中大量存在双链DNA时,与比较试验中的混合液的电化学应答相比,检测室内的混合液的电化学应答降低。这时,可判定被检样品中存在检测目标基因。
另一方面,DNA不通过PCR扩增、在反应液中不大量存在双链DNA时,检测室内的混合液的电化学应答与比较试验中的混合液的电化学应答之间不产生差异。这时,可判定被检样品中不存在检测目标基因。
本发明利用荧光物质的检测,基于与前述利用电化学应答的检测相同的原理,也可以判定被检样品中是否存在检测目标基因。
即,填充在检测室内的基因结合性物质,可以与基因特异性结合,且在与基因结合时可产生荧光,不与基因结合时不可产生荧光。因此,当由反应室送来的反应液不含基因时,即使用激发光照射检测室中生成的混合液,也不会产生荧光。另外,当由反应室送来的反应液所含的基因的量少时,即使用激发光照射,也只能产生微弱的荧光。
相反,当由反应室送来的反应液含有大量基因时,如果用激发光照射检测室中生成的混合液,就会与基因量相应产生大量的荧光。比较这种荧光的差异,就可以判定被检样品中是否存在检测目标基因。
进而,本发明利用可产生荧光的探针的检测,也可以基于与前述利用荧光物质的检测相同的原理,来判定被检样品中是否存在检测目标基因。
即,填充在检测室内的基因结合性物质,可以与检测目标基因进行序列特异性结合,且在与检测目标基因杂交时可产生荧光,不与检测目标基因杂交时不可产生荧光。因此,当由反应室送来的反应液不含检测目标基因时,即使用激发光照射检测室中生成的混合液,由于淬灭基团的影响,也不会产生荧光。另外,当由反应室送来的反应液所含的检测目标基因的量少时,即使用激发光照射,也只能产生微弱的荧光。
相反,当由反应室送来的反应液含有大量检测目标基因时,如果用激发光照射检测室中生成的混合液,就会与检测目标基因量相应产生大量的荧光。比较这种荧光的差异,就可以判定被检样品中是否存在检测目标基因。
另外,在利用可产生荧光的探针的检测中,反应室中使用的引物将特异性地扩增检测目标基因,进而在检测室,前述探针也会序列特异性地识别检测目标基因,因此,可更加特异性地检测,可提高检测精度。
本发明的基因检测用试剂盒,除了上述本发明的基因检测工具,还包括基因合成反应用液或基因合成试剂、及与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质。基因合成反应用液和基因合成试剂,以及与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质,与前述物质相同。基因合成反应用液和基因合成试剂,以及与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质,可事先分别收纳于基因检测工具的一定的室内。或者,也可以与基因检测工具分别收纳于不同的容器中,使用时由各容器装入基因检测工具的一定的室内。
本发明的基因检测用试剂盒可进一步包括基因纯化用手段。作为基因纯化用手段,可直接采用公知的手段,例如,带有滤膜器的离心柱(spin column)、纯化用色谱柱、洗涤液、溶解液等。但并不限于这些。
实施例
下面通过实施例对本发明进行具体说明,但本发明的范围并不限于此。实施例中表示的配合量的份表示重量份。
实施例1
《B型肝炎病毒DNA的检测》
本实施例使用与图1~图6所示的本发明的基因检测工具10相同的基因检测工具(基因检测工具全长=约5cm;反应室全长=约2.5m;检查室全长=约1.5cm;反应室及检测室的内径=约6mm),利用LAMP法扩增基因,使用电化学方法进行检测。
被检样品使用含有质粒的悬浊液,其中该质粒***了B型肝炎病毒(下面简称为HBV)的全基因组序列。另外,LAMP法使用的靶DNA为HBV(7575bp)碱基序列中的第178号到第380号的202bp。
首先,从有节圆筒体12取下盖部5,从有节圆筒体12的检测室2侧装入含有60μmol/L式:
所表示的化合物(Hoechst 33258;Hoechst公司)的水溶液(以下简称为Hoechst 33258水溶液)240μL,然后,再将盖部5与有节圆筒体12嵌合,使检测室2为密闭状态。
然后,从有节圆筒体12取下有底圆筒体11,注入23μL的LAMP液[40单位Bst聚合酶大片段(New England BioLabs公司制)、5pmol引物B3、5pmol引物F3、20pmolFIP、20pmolBIP及缓冲液]和2μL(相当于10pgHBV质粒)被检样品,再将有底圆筒体11与有节圆筒体12嵌合,使反应室1为密闭状态。
在PCR用热循环仪(宝酒造)上安装基因检测工具10,实施LAMP。在65℃下使前述LAMP反应进行1小时后,在80℃下使其反应10分钟而进行。
LAMP反应结束后,如图5所示,由外部用手指通过挤压操作开封隔壁部3,用手拿住反应室1侧的尖端部,整体振动基因检测工具101~2次,使反应室1内的反应液向检测室2移动,与预先装入检测室2内部的含有基因结合性物质的液体7相接触。在得到的混合液9与电极51相接触的状态下,装在恒电位电解装置上,将电应答由端子53取出至外部。
使用线性扫描伏安法(LSV)测定检测室2中的电化学应答。在LSV测定中,扫描速度为100mV/秒,200~900mV扫描,测定电流值。电极面积为0.8mm2。
作为对照试验,不实施LAMP反应开封隔壁部3之外,重复前述操作。
LSV测定的结果如图9所示。图9中,曲线a为不实施LAMP反应的情况下(对照试验)的结果,曲线b为实施LAMP反应的情况下的结果。
通过LSV测定了前述通式所表示的化合物(Hoechst 33258)的氧化电流,氧化电流值依赖于Hoechst 33258的浓度。另一方面,已知Hoechst 33258与DNA形成复合体,且与DNA形成的复合体有凝集的倾向。因此,如果利用LAMP反应扩增DNA,则与DNA复合凝集的Hoechst33258的量增大。结果,如果与DNA形成的复合体变多的话,相应地,Hoechst 33258的表观浓度将降低,LSV测定中的氧化电流值也将降低。伴随DNA添加的氧化电流值降低与DNA添加量呈线性关系,例如可进行检测范围1.5~25ng/ml、分解能1.5ng/ml的DNA定量。
在图9所示的结果中,认为:作为实施了LAMP反应时的结果的曲线b,与作为未实施LAMP反应时(对照试验)的结果的曲线a相比,氧化电流值下降,通过LAMP反应,靶DNA的HBV的基因组扩幅,Hoechst33258凝集,结果,氧化电流值下降。
工业实用性
由于本发明可以在密闭***中处理被检样品,在医疗机构或临床检察机构等处理危险样品时,将降低对检查实施者感染的危险性,检查所产生的废弃物的处理也变得容易。而且,由于在嵌入剂等基因结合性物质不存在时可以实施基因扩幅反应,因而不会发生基因扩幅反应的阻碍,可以高敏感度地检测出哪怕是微量的检测目标基因,在这些方面是有利的。此外,可以从微量的样品(例如,2μL以下或1μL以下)中检测出具有特定的碱基序列的基因,可以简单地使装置的构造小型化。
Claims (20)
1.一种基因检测工具,其含有均可以密闭的反应室和检测室,并在上述反应室和上述检测室之间具有区分上述反应室和上述检测室的隔壁部,其中,上述隔壁部可进行自由地开合,上述反应室由通过使相互的开口手段嵌合能够形成密闭状态的反应室的至少2个部件形成,同时上述检测室或上述反应室具有基因检测部。
2.权利要求1所述的基因检测工具,其中,对于上述隔壁部,表面的一部分具有沟状的槽口,同时,至少与上述隔壁部邻接的上述反应室和上述检测室由具有柔软性的材料形成,以此通过从外部对工具的挤压操作使上述槽口的至少一部分破裂,可使上述隔壁部开封。
3.权利要求1或2所述的基因检测工具,其中,上述反应室由一端与上述检测室连接且被上述隔壁部密闭,另一端是开口手段的筒状部件以及一端封闭,另一端为开口手段的有底筒状部件形成,上述2个开口手段嵌合,形成密闭状态的反应室。
4.权利要求3所述的基因检测工具,其中,上述反应室在上述有底筒状部件的封闭端具有基因检测部。
5.权利要求1~3的任一项所述的基因检测工具,其中,上述检测室由一端与上述反应室连接且被上述隔壁部密闭,另一端是开口手段的筒状部件形成,并且在上述开口手段具有含基因检测部的密闭盖。
6.权利要求1~5的任一项所述的基因检测工具,其中,上述反应室用于充填被检样品及基因合成反应用液。
7.权利要求1~6的任一项所述的基因检测工具,其中,上述检测室用于充填与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质。
8.权利要求7所述的基因检测工具,其中,用于将上述反应室内的被检样品及基因合成反应用液和上述检测室内的与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质混合的通路,通过上述隔壁部的开封而形成。
9.权利要求1~8的任一项所述的基因检测工具,其中,上述基因检测部为电化学检测部或者荧光检测部。
10.一种基因检测工具,其含有各自互相独立可密闭的反应室和检测室,具有通过在上述反应室及上述检测室之间配置使上述反应室和上述检测室互相密闭的隔壁部,其特征为
(A)上述反应室具有可装入可能含有检测目标基因的被检样品及基因合成反应用液的开口手段,
(B)上述检测室具有可装入与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质的开口手段,
(C)维持含有上述反应室及上述检测室的基因检测工具整体的密闭状态的同时,上述隔壁部可通过外部的操作进行开封,并且
(D)上述隔壁部开封后,上述反应室内的液体可以从因开封而形成的通路移至上述检测室中。
11.权利要求7-10的任一项所述的基因检测工具,其中,基因结合性物质选自以下的物质,
(a)可与基因特异结合的电化学活性物质,
(b)可与基因特异结合的荧光物质,以及
(c)具有可与检测目标基因进行序列特异性结合的区域及一对荧光基团及淬灭基团,并在与检测目标基因结合前不能产生荧先,在与检测目标基因结合时可产生荧光的探针。
12.一种基因检测方法,该方法是使用基因检测工具,在密闭状态下进行基因扩增操作及基因检测操作的基因检测方法,所述基因检测工具含有均可密闭的反应室和检测室,并在上述反应室和上述检测室之间具有区分上述反应室和上述检测室的隔壁部,在上述反应室中充填有被检样品及基因合成反应用液,在上述检测室中充填有与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质,该方法含有以下操作
(1)至少使上述反应室为上述检测目标基因可扩增的条件,
(2)在(1)的操作之后,在维持上述基因检测工具的密闭状态的同时,使上述隔壁部开封,
(3)经通过开封在上述隔壁部形成的通路,使上述反应室内的溶液和上述检测室内的与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质相接触,
(4)检测得到的信号。
13.权利要求12所述的基因检测方法,其中,上述基因结合性物质选自以下的物质,
(a)可与基因特异结合的电化学活性物质,
(b)可与基因特异结合的荧光物质,以及
(c)具有可与检测目标基因进行序列特异性结合的区域及一对荧光基团及淬灭基团,并在与检测目标基因结合前不能产生荧光,在与检测目标基因结合时可产生荧光的探针。
14.权利要求12或13所述的基因检测方法,其中,信号的检测为电化学检测或荧光检测。
15.权利要求12~14的任一项所述的基因检测方法,其中,在上述反应室中预先充填基因合成反应用液,并在(1)的操作之前将被检样品装入上述反应室中。
16.权利要求12~15的任一项所述的基因检测方法,其中,上述反应室具有开口手段,可以将被检样品和/或基因合成反应用液从上述开口手段装入上述反应室中,装入后关闭开口手段,密闭反应室。
17.权利要求12~16的任一项所述的基因检测方法,其中,在上述检测室中充填与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质。
18.一种基因检测方法,其特征为,含有以下的步骤:
(1)由反应室的开口手段装入可能含有检测目标基因的被检样品及基因合成反应用液后,关闭开口手段,密闭反应室,
(2)使上述反应室内的条件为上述检测目标基因可扩增的条件,
(3)经过扩增上述检测目标基因所需的时间后,在维持包括上述反应室及上述检测室的基因检测工具的全体的密闭状态的同时,通过外部的操作使通过设置在上述反应室和检测室之间使上述反应室和上述检测室互相密闭的隔壁部开封,
(4)使上述反应室内的反应液从因上述开封而形成的通路移至上述检测室中,
(5)在上述检测室内,将与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质与上述反应液相接触,
(6)检测得到的信号。
19.一种基因检测用试剂盒,其中,含有权利要求1~11的任一项所述的基因检测工具、基因合成反应用液或基因合成试剂、以及与基因结合并产生可检测信号的基因结合性物质。
20.权利要求19所述的基因检测用试剂盒,其进一步含有基因纯化用手段。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
AD01 | Patent right deemed abandoned | ||
C20 | Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned |