CN1637154B - 判别探针固定基体变化的方法、探针固定基体和检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明通过搭载对引起固相探针阵列等中的探针劣化的因子的有无或引起保护体变化的因子的有无进行判别的元件,读出该元件的变化,可以判断探针劣化的程度或保护体变化的程度。
Description
技术领域
本发明涉及到对固定了可与靶物质特异结合的探针的基体中的探针的劣化的程度、包括对探针等进行保护的保护体的变化在内的探针固定基体变化的程度进行判别的方法,含有对探针劣化、包括对探针等进行保护的保护体的变化在内的探针固定基体的变化进行判定有用的元件的探针固定基体、以及用于对探针劣化、包括对探针等进行保护的保护体的变化在内的探针固定基体的变化进行判定的***等。
背景技术
作为探针固定基体的一个例子,可举DNA芯片。所谓DNA芯片是在固相表面使作为探针对基因的表达、变异、多型等进行同时解析非常有用的许多DNA片段或寡核苷酸整齐排列的高密度阵列。例如报道的用光刻蚀法制作的固相寡核苷酸阵列(参照例如美国专利第5688642号说明书),以及使用喷墨法的固相DNA探针阵列的制作方法(参照例如国际公开第95/25116号公报)。
而靶物质的检测处理工序一般都是为了使用荧光物质等标记的靶物质与固相探针阵列的探针结合,进行杂交。杂交是通过使固相探针阵列与溶解了通常靶物质的溶液接触或浸渍,通过加热处理进行的反应,该浓度和温度等由于探针与靶物质的组合不同而不同。再使用荧光检测仪等装置观察探针与靶物质是否结合。
发明内容
一般来说,DNA等具有被紫外线或热等分解的性质,如果在长时间的来自日光等紫外线照射或高温下保管,探针劣化,最终失去与靶核酸杂交的功能。而且由于被固定在制作的探针阵列的探针量极微量,对探针量或活性进行非破坏性测定有时是困难的。因此,本发明提供能够容易判断由于紫外线或高温等各种各样环境造成的探针功能消失的方法。
另外,在基体上有时还设置了以保护这些探针等为目的的保护体。然而,该保护体也有可能在上述的要因下发生变化,所以也提供容易判断该变化的方法。
即,本发明作为在基体上固定了可与靶物质特异结合的探针的固定基体,其特征是还设置了对成为上述探针固定基体变化要因的环境变化进行检测的元件。
另外,还涉及到由探针固定基体具有的元件对探针固定基体有无变化或变化程度进行判别的方法。
另外还涉及到一种***,其特征在于具有以下装置:由探针固定基体具有的元件取得环境变化的量的取得装置,和根据通过该取得手段取得的环境变化判断探针固定基体有无变化的判断装置。
根据本发明,通过再设置对使基体上固定了探针的探针固定基体发生变化的环境变化进行检测的元件,可以通过简便的方法对探针固定基体的变化、即对探针的劣化、保护探针或/和基体的保护体等有无变化或其变化程度或变化的可能性进行判别,使得在制造时、流通时、保管时的品质管理或探针功能的确认变得容易。
附图的简单说明
图1是表示UV照射时间和UV标记的G色辉度的图。
图2是表示UV标记的G色辉度和荧光强度的关系的图。
图3是表示温度和加热累计标记的R色辉度的关系的图。
具体实施方式
在本发明中包括对关于固定了可与靶物质特异结合的探针的探针固定基体的性能有无什么变化和其变化程度进行判别的方法以及能够实施这样判断的方法的探针固定基体、以及利用这些方法对探针固定基体的变化状况进行计算的***。所谓探针固定基体的变化包括例如探针的劣化或对探针等进行保护的保护体的变化等。
用于固定探针的基体只要是对固定探针、使用得到的探针固定基体检测或分离靶物质的操作没有妨碍的,并没有特别限定,例如玻璃、树脂、金属、中空纤维等,如果举一个DNA芯片的例子的话,考虑到靶物质的检测和通用性,优选玻璃基板或塑料基板,特别优选不含有碱性成分等的无碱玻璃基板或石英基板。
至于将探针固定在基体上的方法已知有各种各样的方法。详细讲,有通过在基体上合成探针将探针固定在基体上的方法,以及通过点或印等将预先准备的探针负载到基体上的固定方法。
作为在基体上进行探针合成的固定方法,已知例如美国专利第51438545号公报记载的那样,通过活化剂将保护基从在基体上选择的区域除去,通过反复操作使具有可除去保护基的单体与上述区域结合,在基体上合成具有各种序列的聚合物的方法。
而作为通过将预先准备的探针负载到基体上进行固定的方法,已知有例如特开平8-23975号公报记载的那样,通过使基体和由具有可搭载到该基体上的碳化二亚胺基的高分子化合物构成的固定用的材料与具有与碳化二亚胺基反应性的生物学上的活性物质接触进行固定的方法。另外就象特开平8-334509号公报记载的那样,已知在具有生物学活性的物质的检测中,使用在具有碳化二亚胺化合物上借助于碳化二亚胺基进行固定化的探针进行检测的方法。
另外,在特开2001-178442号公报中报道了在液相中通过使在末端含有巯基的DNA片段、含有与巯基反应可形成共价键的反应性置换基的链状分子其一端被固定在表面的固相载体接触,在DNA片段和链状分子之间形成共价键使得DNA片段固定在固相载体表面的固定方法,作为含有与巯基反应可形成共价键的反应性置换基,具体来说如含有从马来酰亚胺基、α,β-不饱和羰基、α-卤代羰基、卤化烷基、氮丙啶基以及二硫化物基选择出来的基团的置换基。
探针的固定方法已知仅上述那样的DNA片断的固定方法就有很多,在本发明中对探针的种类和其固定方法并没有特别限定。
探针固定基体的探针虽然因其种类不同而有差异,但一般来说受到温度或紫外线、氧等影响,作为探针的功能就可能丧失.以下将该现象称为劣化.对该劣化的程度进行判别或计测的简便方法到目前为止还没有.因此,本发明通过将检测这些劣化的要因的元件搭载到基体上,在使用这些探针固定基体前对成为该劣化要因的因子会达到什么样的程度进行判断,测定探针劣化的程度.作为探针劣化的因子如受到紫外线的照射或结露、温度变化、氧化以及pH变化等,但并不限定于这些.
所谓检测劣化要因的元件,例如当要因为紫外线时,就象特开2001-281052号公报中公开的那样,将伴随着加热引起色变化而可复原到氧化型的2聚合醌化合物作为通过紫外线的照射脱色为还原基的紫外线检测材料配合在聚烯烃系树脂的材料、以及就象特公平3-19536公开的
那样,作为以低聚合度的聚氯乙烯和有色染料或无色染料作为必需成分的溶液状组成物,由于紫外线照射可引起上述有色染料或无色染料明显的色彩变化及色浓度变化为特征的紫外线检测材料、市售的紫外线检测材料(如商品名“紫外线标记”、日油技研工业株式会社生产)等。
另外由于探针的种类不同,紫外线影响的程度也不同,所以要对元件形成材料的灵敏度进行调整,最好选择对使用的探针最适合的材料,本发明对这些材料灵敏度或紫外线检测材料的种类并没有限定。
对于温度变化的情况,优选受到温度的影响色彩或色浓度变化的温度表示材料。作为具体使用的材料如通过非结晶-结晶或相分离-非相分离的リタイラブリ系的电子供给性呈色性化合物(例如,无色金胺类、二芳基苯并呋喃酮类聚芳基原醇类、酰基金胺类、罗丹明B内酰胺类、二氢吲哚类、螺吡喃类、荧烷类、花青苷色素类、结晶紫等电子供给性有机物等)、电子受体性化合物(例如酚类、酚金属盐类、羧酸金属盐类、磺酸、磺酸盐、磷酸盐、磷酸金属盐类、酸性磷酸酯、酸性磷酸酯金属盐类、亚磷酸盐、亚磷酸类、亚磷酸金属盐类等氧化物等)那样的化合物。另外更具体的就象特开平11-140339号公报公开的那样,在支持体上设置含有无色或淡色的碱性染料和呈色剂以及含有热可融性物质的层的不可逆型示温材料中,以作为碱性染料用3-(1-n-辛基-2-甲基吲哚-3-基)-3-(4-二乙基氨基-2-乙氧基苯基)-4-アザフタリド或3,3-二(1-n-辛基-2-甲基吲哚-3-基)フタリド,作为热可融性物质如含有1,2-二苯氧基乙烷和/或草酸二苄酯为特征的不可逆示温材料或市售的示温材料(例如商品名“热敏油漆”、“サ-モラベル”、“サ-モシ-ト”、“サ-モテ-プ”、都是日油技研工业株式会社生产)等。
另外,由于探针种类不同,温度影响的程度也不一样,所以最好是对灵敏度进行调整,选择对使用的探针最适合的检测材料,本发明对这些材料灵敏度或示温材料的种类并没有限定。
另外通过使用特性不同的多个示温材料,也可以追踪更详细的温度变化过程。
由于探针不同,也存在与大气中的氧反应被氧化的探针。有关这样的探针,氧检测材料是有效的。例如,已知通过亚甲基蓝等特定色素和作为用于还原该色素的还原剂的葡萄糖等组合检测氧存在的氧检测材料(参照特开昭53-120493号公报和特开昭56-60349号公报)等。
为了弥补葡萄糖对热和光不稳定等缺点,就象特开2000-39429号公报公开的那样,报道了以含有从半胱氨酸、其盐、酯以及N-酰基衍生物选择出来的至少一种和噻啶类和/或靛蓝为特征的氧检测材料。
另外,在特开昭56-210564号公报中报道了使用二(水杨醛)亚烃基二亚胺钴(II)或其衍生物的氧显示器,在特开昭64-10172号公报中报道了由高分子胺钴络合物的涂膜和热可塑性塑料皮膜层构成的氧显示板。
而这里给出的氧检测材料最好使用根据探针的种类等对灵敏度进行调整后的材料,但其种类并没有限定。
对于由开封包装的瞬间和制作探针固定基体的瞬间造成劣化的探针,时间显示器是有效的。举一个例子,如特开平11-14616号公报报道的特征如下的时间显示器:在基体的一面或两面层叠含有通过与氧反应迅速变色的化合物的变色层,在该变色层上再层叠氧气透过率0.1~3000ml/m2·24hr·atm·25℃·100%RH的氧气透过抑制层。
另外在特开平6-18676号公报中揭示了使对热可塑性树脂和具有挥散性的电子受体性有机化合物和难挥散性的电子供给性发色性有机化合物进行溶融混匀构成的组成物形成比表面积为连续的或非连续的不同形状构成的时间显示器。
另外在特开平10-293183号公报中公开了特征如下的时间显示器:由充填在容器内的空间部分的、由于与大气接触被延迟的具有形状恢复性的发泡体或层叠体形成的。
而这里给出的时间显示器最好使用根据探针的种类等对灵敏度进行调整后的材料,但其种类并没有限定。
对于由于pH造成劣化的探针的情况,有添付湿的pH试纸的方法、对于探针固定基体被保存在液体中的情况,有预先使酚磺酞溶解等的pH指示剂等方法。
最好设置以防止探针的劣化为目的的保护体。举一个DNA芯片的例子,通过在探针固定面设置聚乙烯醇(以下略称为PVA)膜等探针的保护膜可以抑制探针的劣化。特别是PVA膜被含有进行杂交时的靶物质的溶液溶解,可以不知不觉地使用PVA膜。然而,如果将具有该PVA膜的DNA芯片置于高温下,可知PVA硬化变得难于溶解。如果PVA没有溶解,由于以后的杂交反应不能正常进行,就妨碍检查了。
而当保护体是紫外线吸收体等保护探针避免劣化要因的物质时,当暴露于过度的劣化要因时,保护体劣化,保护能力下降。在这样的情况下由于担心探针也劣化,所以需要对保护体的变化进行检测。
因此本发明的另一个目的是通过在基体上搭载检测这些保护体变化的要因的元件,在使用这些探针固定基体前对成为该保护体变化要因的因子达到什么样程度进行判断,判断该基体能否可以正常使用。作为保护体变化的因子例如紫外线照射或结露、温度变化、氧化以及pH变化等,但不限定于这些。
象上述那样引起探针劣化和包括保护体的变化在内的探针固定基体的变化的要因各种各样。在本发明中不限于对其中的一个要因进行检测,还可以在基体上设置多个元件。
另外对这些探针劣化的要因或包括保护体的变化在内的探针固定基体的变化的要因进行检测的元件优选是能够检测其变化过程那样的不可逆的元件,通过这样设计,可以对一直到使用探针固定基体之前的该固定基体的状态进行判断。
另外,这些元件的形状可以是密封条(シ一ル)状、带状、薄片状、墨水状、糊状、板状、棒状或粒状等形状,没有限制。另外即使是由于热等要因等形状发生变化的也可以。如果考虑到通用性,优选将墨水状的元件涂布到基体上的方法、或将密封条状元件贴到基体上的方法。
可以通过喷墨法向基体上涂布.特别是用热喷法涂布上述的リタイラブリ系的电子供给性呈色性化合物时,通过加热头的加热将该化合物加热到熔点以上,急冷时变成无色,被固定在基体上.能够实现在该体系的玻璃转变点以上渐渐发色的构成.
另外,温度与发色的时间可以通过可逆剂等的浓度进行控制。
另外为了节省下面搭载的时间,也可以对预先在高分子的基体上混匀了这些元件的基体进行探针固定。
关于搭载检测变化要因的元件的场所,只要是不妨碍作为探针的功能,以及在使用时不妨碍其使用的场所,并没有特别限定,例如在对探针的劣化状况进行判断时,最好是搭载在探针的附近,为了避开探针固定基体的固定探针的部分,最好是直接搭载在基体上。另外,即使不能直接搭载在探针固定基体上,也可以搭载到包装等。
另外还有将糊状或墨水状的元件与探针混合后进行固定的方法,或与保护体混合后设置的方法。
另外,通过用粘接力低的粘接剂粘接上述密封条状的元件,做成容易从基体剥离的构成、或能够通过水溶性水洗容易除去,或使用时可除去的元件构成也比较好。
通过目视或读取装置等对那样搭载的检测探针固定基体的变化的要因的元件的变化(例如色变化或形状变化)进行检查,当存在变化时可以对探针的劣化或作为保护体的功能丧失等的可能性进行简便判断。
通过预先对检测这些探针的劣化的要因的元件的变化量和探针的劣化的程度进行实测,做成标准曲线,将实际检测劣化的要因的元件的变化量与该标准曲线进行比较,也可以定量求出探针的劣化的程度。
通过能够自动进行判断的自动化,可应用于探针劣化判断***中。即本发明的探针劣化判断***可以由探针固定基体具有的元件取得有关该探针固定基体的环境变化的信息的装置,和根据通过该取得装置取得的信息判定探针固定基体有无变化和量的装置构成。或者,本发明的探针劣化判断***也可以由用于从探针固定基体含有的元件读取环境变化的读取装置和对由通过该读取装置读取的变化计算探针劣化的程度的计算装置构成。例如,就象下面叙述的实施例所表示的那样,作为元件使用能够通过以色表示变化的元件,通过作为读取装置的扫描器(分色器)读取,将色成分分解为RGB各256种阶调,以R成分和G成分等的规定色成分强度表示,对这样得到的色成分强度与预先设定的基准值进行比较,判断探针有无劣化,或对所定的色成分的强度和探针劣化的程度的关系进行预先设定,可以构成能够由实际得到的色成分的强度计算探针劣化的程度的***。与该预先设定的基准值的比较或探针的劣化程度的计算可以通过设定在计算机中的程序进行。
另外本发明的这一保护体变化判断***可以由探针固定基体具有的元件取得有关该探针固定基体的环境变化的信息的装置,和根据通过该取得装置取得的信息判定探针固定基体有无变化和量的装置构成。或者,本发明的这一保护体变化判断***也可以由用于从探针固定基体含有的元件读取环境变化的读取装置和对由通过该读取装置读取的变化计算探针劣化的程度的计算装置构成。例如,可以使用与上述的探针劣化判断***同样的方法。
这些***通过例如设置在使靶物质与固定在基体上的探针反应的反应装置上,对于劣化状况激烈的情况或保护体变化,其功能丧失的情况等使反应装置的错误表示部表示错误信号后使反应不能进行,也可以防止误诊。另外,对于引起探针劣化的情况,为了使灵敏度提高也可以使反应时间延长,或变更反应温度等反应条件。
另外,也可以将这些***设置在对与固定于基体上的探针反应的靶物质的有无或其量进行测定的测定装置中。例如,也可以预先做成探针劣化与靶物质的测定量(例如为了容易检测对靶物质用荧光物质标记,测定其荧光强度的情况,其荧光强度)的关系的标准曲线,对实际测定的靶物质的测定量和探针的劣化状况进行测定,用探针的劣化状况校正靶物质的测定量。
以下用实施例对本发明进行更详细说明。
【实施例】
[实施例1]紫外线引起的探针劣化的判别
(1)基体的制作
将玻璃基板在预先将载玻片加温到60℃的1mol/l氢氧化钠水溶液中浸泡10分钟。在流动的纯水中充分洗涮,将载玻片附着的氢氧化钠通过水洗除去。充分洗涮后,将载玻片浸渍在纯水中,进行10分钟的超声清洗。超声清洗后,于纯水流水中充分洗涮,将附着在载玻片上的粒子通过水洗除去。然后对该载玻片进行旋转干燥。
将氨基硅烷偶联剂(商品名:KBM-603;信越化学工业公司生产)溶解使终浓度为1重量%,搅拌30分钟,将载玻片在该水溶液中浸渍30分钟后取出,用水清洗,放到烘箱中于120℃下干燥1小时。
接着,称量2.7mg的N-马来酸酐缩亚胺己酰氧琥珀酰亚胺(同仁化学研究所制造;以下简称EMCS),准备在二甲亚砜(DMSO)/乙醇的1∶1溶液中溶解EMCS使最终浓度为0.3mg/ml的溶液。在室温将硅烷偶联(バ一ク)处理过的导入了氨基的石英玻璃基板在EMCS溶液浸渍2小时,在表面导入马来酸酐缩亚胺基。EMCS溶解处理之后,将基板按DMSO/乙醇混合溶液、乙醇的顺序进行洗涤,在氮气氛中使其干燥。
(2)探针的合成
在本实施例中探针可以使用具有与要检测的靶核酸全部互补的碱基序列,通过与靶核酸的碱基序列特异杂交(杂交反应)对靶核酸进行检测的单链核酸。可以使用DNA自动合成仪合成由序列编号1的序列构成的单链核酸。而在用DNA自动合成仪合成时,在该单链DNA末端导入了巯基修饰物(Thiol-Modifier)(Glen Research公司生产)。然后进行通常的脱保护,回收DNA,通过高效液相层析进行纯化,用于以下实验。
5′HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA 3′(序列编号:1)。
(3)探针的固定
将上述(2)合成的DNA片段(序列编号1)溶解于含有7.5重量%甘油、7.5重量%尿素、7.5重量%硫二甘醇、1重量%乙炔醇(商品名:アセチレノ-ルE100;川研フアインケミカル公司生产)的水溶液,使吸光度为0.6OD。另外将寡核苷酸溶解于1ml,在1cm光路长的杯中260nm的吸光度为1的量作为1OD。
用泡沫喷射打印机(商品名:BJ-F850;通过将佳能公司生产的机器改造为可以向平板印刷,BJ头与载玻片的间隔约1mm、吐出量约4p1)将含有该DNA片段的水溶液点印在用上述(1)方法制作的载玻片上,制作DNA芯片。此时通过15倍的放大镜观测不到卫星点(来自液体弹到固相表面时的飞沫的点)。
将点印了含有探针的溶液的载玻片于室温下放置10分钟,先用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH7.0)清洗,然后用纯水清洗,进行旋转干燥。
(4)紫外线检测材料的搭载
将UV标记S带(日油技研工业株式会社生产)贴附到上述(3)制作的DNA芯片的没有固定探针的部分。该UV标记S带虽然是白色,但如果受到紫外线照射,就可以不可逆地变色为赤色(粉红色),是在约250mJ/cm2下变色程度饱和的物质。
(5)紫外线的照射
对上述(4)搭载了紫外线检测材料的DNA芯片照射紫外线,达到约5mJ/cm2。
(6)封闭·杂交反应
使牛血清清蛋白溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中,达到1.0重量%,将上述(5)照射了紫外线的DNA芯片和上述(4)制作的DNA芯片(没有照射紫外线的DNA芯片)都于室温下在上述溶液中浸渍2小时,进行封闭反应。
使罗丹明结合在具有与序列编号1互补的核酸序列的DNA片段的5’末端,合成标记的DNA片段,然后使他溶解于1M NaCl/50mM磷酸缓冲液(pH7.0),使终浓度达到50nM。将进行了封闭处理的DNA芯片浸渍于含有该标记的DNA片段的溶液中,于45℃下放置2小时。然后用1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH7.0)清洗未反应的DNA片段,再用纯水进行清洗。
(7)结果
对进行了杂交的DNA芯片用荧光扫描器(商品名:GenePix4000B;Axon Instruments Inc.生产)进行波长532nm的荧光观测。结果观测到各个点大致为圆形,其直径为55μm。当用PMT400V、激光功率100%进行测定时,起因于进行UV照射的DNA芯片的序列编号1的探针的点中心附近的荧光强度为6335,而起因于没有进行照射的DNA芯片的序列编号1的探针的点中心附近的荧光强度为21676。而点周围的背景的荧光强度在进行UV照射时为270,没有进行UV照射时为383。按照上述作法由荧光强度可以判断由于UV照射引起的探针的劣化。
另外,在进行杂交反应前,贴附在没有照射UV的DNA芯片的UV标记是白色,照射了UV的DNA芯片的UV标记变色成浅粉红色。由此可以证明当UV标记变色时可以判断UV引起了探针的劣化,通过目视也可以判断该劣化。表1归纳了有无UV照射的荧光强度的比较结果。
【表1】
UV照射时间 | 荧光强度背景 |
0秒 | 21676383 |
5秒 | 6335270 |
[实施例2]紫外线引起的探针劣化的判定
(1)DNA芯片的制作
采用与实施例1同样的方法制作需要的DNA芯片数。
(2)紫外线检测材料的搭载
将UV标记S带(日油技研工业株式会社生产)贴附到制作的DNA芯片的没有固定探针的部分。
(3)紫外线的照射
对上述(2)搭载了紫外线检测材料的DNA芯片于直至10秒钟的不同时间照射紫外线,约5mJ/cm2。另外也准备没有进行照射的样品。
(4)标准曲线1的制作
用扫描器(佳能公司生产,N-1240U)对各个UV标记进行扫描,将色成分分解为RGB各256种阶调,对G成分和UV照射时间作图。结果如图1所示。就象图1所表示的那样,UV照射时间和UV标记的G色成分的辉度的关系直线减少。
(5)标准曲线2的制作
采用与实施例1同样的方法对DNA芯片进行封闭反应和杂交反应,再与同实施例1同样的条件下进行荧光强度的测定。结果如表2所示。
【表2】
UV照射时间 | 荧光强度 |
0秒1秒5秒10秒 | 216761663863351029 |
由(4)做成的G成分和UV照射时间的关系曲线(标准曲线1)和(5)做成的荧光强度和照射时间的关系可以做成G成分和荧光强度的关系的曲线。结果如图2所示。
(6)探针劣化程度的计算
对上述(2)所示的紫外线检测材料搭载的DNA芯片照射3秒钟紫外线,与上述(4)同样测定UV标记的G成分,结果为181。由图2的标准曲线得到该DNA芯片的荧光强度的期望值约为11000,探针劣化度约为50%。
(7)结果
采用与实施例1同样的方法对在上述(6)中进行3秒钟UV照射的DNA芯片进行封闭反应和杂交反应,再用与实施例1同样的方法进行荧光强度测定。测定的荧光强度为11121。由该结果可以证明可以由UV标记的G色成分的辉度(UV照射量)计算探针的劣化程度。
[实施例3]温度引起的探针劣化的判定
(1)DNA芯片的制作
采用与实施例1同样的方法制作需要的DNA芯片数。
(2)温度检测材料的搭载
将加热累计标记KS90-20(日油技研工业株式会社生产)贴附到制作的DNA芯片的没有固定探针的部分。该加热累计标记KS90-20虽然是白色,但如果受到紫外线照射,就可以不可逆地变色为茶色,在约80℃下加热约30分钟,在约90℃下加热20分钟或在约100℃下加热7分钟左右该变色饱和。
(3)加热
将上述(2)搭载的温度检测材料的该DNA芯片分别于50℃、70℃、90℃的清洁的烘箱中加热20分钟.
用扫描器(佳能公司生产,N-1240U)对在(2)中贴附的加热累计标记进行扫描,将加热累计标记的色成分分解为RGB各256种阶调,表3给出了R成分和加热温度。图3给出了加热温度、加热累计标记与R成分的关系。由该结果可知在20分钟的加热时间下,当超过70℃时R成分辉度急剧减少。
(4)封闭·杂交反应
采用与实施例1同样的方法对进行加热处理的DNA芯片和没有进行加热处理的DNA芯片分别进行封闭反应和杂交反应。
(5)荧光测定
用荧光扫描器(商品名:GenePix4000B;Axon Instruments Inc.生产)对进行了杂交的DNA芯片进行波长532nm的荧光观测。结果观测到各个点大致为圆形,其直径为55μm。当用PMT400V、激光功率100%进行测定时的荧光强度如表3所示。
【表3】
温度 | R成分 | 荧光强度 | 探针劣化率 |
25℃ | 237 | 20650 | 0% |
50℃ | 236 | 17194 | 17% |
70℃ | 200 | 16311 | 20% |
90℃ | 85 | 14370 | 25% |
(6)不良基准的做成
如果将20%以上劣化的芯片定为不良,由表3可知,如果R成分不到200,探针的劣化超过20%。将该值作为不良基准。
(7)样品制作
将加热累计标记KS90-20贴附到用先前的方法做成的DNA芯片上,于90℃下加热3分钟。用扫描器对该加热累计标记进行扫描,将加热累计标记的色成分分解为RGB各256种阶调,对R成分进行测定。结果为204,由于是比先前的不良基准还高的值,所以推测探针的劣化程度在20%(良品)以下。
(8)结果
采用与先前同样的方法对于90℃下加热3分钟的DNA芯片进行封闭反应和杂交反应,用荧光扫描器进行波长532nm的荧光观测。当用PMT400V、激光功率100%测定时的荧光强度为17985,探针劣化程度为13%,确认为良品。
由以上结果可以确认:无论加热时间不同,还是实际上没有进行杂交反应,通过使用加热累计标记都可以判别探针的劣化程度。
[实施例4]温度引起保护体变化的判定
(1)DNA芯片的制作
采用与实施例1同样的方法制作需要的DNA芯片数。
(2)聚乙烯醇的溶解和向探针固定载体的附着(保护体的形成)
各秤量5g的PVA103(株式会社クラレ公司生产的聚乙烯醇,硬化度98.0-99.0mol%、聚合度约300),边搅拌边将PVA103加入到含有纯水495g的烧杯中,使其分散于纯水中。然后通过1小时温育,加热到80~90℃,进行溶解,制备浓度1.0重量%的PVA水溶液。放冷后,确认没有不溶物,进行过滤,制备PVA水溶液。过滤使用0.22μm的滤膜。
将做成的DNA芯片于PVA水溶液中浸渍30秒钟,取出进行自然干燥。但不限定于这样的镀法,也可以运用旋转镀法、滚镀法等。另外通过喷墨法、点法等也可以使PVA只附着在探针固定载体的探针固定的部分。
(3)温度检测材料的搭载
将加热累计标记KS90-20(日油技研工业株式会社生产)贴附到制作的DNA芯片的没有固定探针的部分。该加热累计标记KS90-20虽然是白色,但如果加热,就可以不可逆地变色为茶色,在约80℃下加热30分钟、在90℃下加热20分钟或在约100℃下加热7分钟左右该变色饱和。
(4)保护膜的膜厚测定
(5)加热
将形成保护层的DNA芯片于80℃下放置5小时,然后回到室温。温度检测材料完全变色为茶色。
(5)保护膜的溶解
使实施加热处理的DNA芯片和没有实施加热处理的DNA芯片于1MNaCl/50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中各浸渍10分钟,然后用纯水洗净,通过旋转干燥使其干燥。
(6)保护膜的膜厚测定
用椭圆应力测定计测定实施了加热处理的DNA芯片的膜厚。其结果为没有进行加热处理的DNA芯片不能检测膜厚。由此可知由于加热,保护体硬化,保护膜没有溶解,预料不能进行杂交反应。
(7)封闭·杂交反应
采用与实施例1同样的方法对进行加热处理的DNA芯片和没有进行加热处理的DNA芯片分别进行封闭反应和杂交反应。
(8)荧光测定
对进行了杂交的DNA芯片用荧光扫描器(商品名:GenePix4000B;Axon Instruments Inc.生产)进行波长532nm的荧光观测。进行加热处理的DNA芯片没有观测到荧光。而没有进行加热处理的DNA芯片各个点大致为圆形,其直径为55μm。当用PMT400V、激光功率100%测定时的荧光强度为20139。
由以上结果可以确认即使实际上不进行杂交反应,由对保护体的变化有无劣化进行判别的元件也可以判别保护体的变化。
虽然通过利用紫外线、温度产生的外部因子的实施例对本发明的效果进行了说明,但就象根据本发明的宗旨在说明书中所述的那样,对于其他外部因子也可以通过使用同样的手法对探针的劣化程度进行简便判断.
序列表
<110>佳能株式会社
<120>判别探针固定基体变化的方法、探针固定基体和检测装置
<130>10003471CN01
<150>JP2003-387003
<151>2003-11-17
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>被固定在基体上的测试核酸
<400>1
actggccgtc gttttaca 18
Claims (7)
1.一种判别方法,是判定在基体上固定了可与靶物质特异结合的探针的固定基体有无变化或量的方法,其特征是:在所述探针固定基体上设置对成为上述探针固定基体变化要因的环境变化进行检测的元件,由上述检测成为上述探针固定基体变化要因的环境变化的元件的变化程度,来判别探针固定基体有无变化或量。
2.权利要求1所述的方法,其特征是:上述探针固定基体的变化是探针的劣化或/和保护体的变化。
3.用于实施权利要求1所述方法的***,是在基体上固定了可与靶物质特异结合的探针的固定基体,其特征是:设置对成为上述探针固定基体变化要因的环境变化进行检测的元件,由该元件取得有关该探针固定基体的环境变化信息的装置、和根据通过该取得手段取得的信息判定探针固定基体有无变化或量的装置。
4.权利要求3所述的***,其特征是:上述探针固定基体的变化是探针的劣化或/和保护体的变化。
5.一种反应装置,是使上述探针和靶物质反应的反应装置,其特征是配置有权利要求3所述的***。
6.一种检测装置,是用于检测有无与上述探针反应的靶物质或靶物质的量的检测装置,其特征是配置有权利要求3所述的***。
7.权利要求6所述的检测装置,其特征是根据探针劣化状况,使用预先做成的标准曲线,对与上述探针固定载体反应的靶物质的量或/和有无进行检测的结果进行校正。
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