CN1635904A - 肺炎链球菌疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种多血清型肺炎链球菌缀合物疫苗的最佳制剂。
Description
技术领域：
本发明涉及一种改进的肺炎链球菌(streptococcus pneumonia)疫苗。
背景技术：
不到2岁的儿童对大多数多糖疫苗不产生免疫应答，所以必须通过与蛋白载体进行化学缀合产生免疫原性的多糖。将多糖(一种不依赖T的抗原)偶合到蛋白(一种依赖T的抗原)，能赋予多糖胸腺依赖的性质，包括同种型转换、亲和力成熟和记忆诱导。
然而，重复应用多糖-蛋白缀合物或将多糖-蛋白缀合物联合成多价疫苗可能有问题。例如，已有报道对一定剂量范围内以破伤风类毒素作为蛋白载体的b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)多糖(PRP)疫苗进行试验，该疫苗与(游离的)TT和肺炎链球菌多糖-TT缀合物疫苗按标准婴儿计划同时免疫。当肺炎链球菌疫苗的剂量增加时，对Hib缀合物疫苗中的PRP多糖部分的免疫应答降低，这表明很可能是使用相同的载体蛋白而引起的对多糖的免疫干扰(Dagan等，Infect Immun.(1998)；66：2093-2098)。
已证实载体-蛋白的剂量对蛋白自身的体液免疫应答上的影响是多方面的。据报道在人婴儿体内增加四价破伤风类毒素缀合物的剂量会导致对破伤风载体的应答下降(Dagan等，见上文)。对联合疫苗效应进行传统分析认为是载体诱导了表位抑制，这一点还没有完全弄清楚，但认为是由于载体蛋白过量引起的(Fattom，Vaccine 17：126(1999))。这似乎导致对载体蛋白产生应答的B-细胞和对多糖产生应答的B-细胞产生对Th细胞的竞争。假如对载体蛋白产生应答的B-细胞占优势，将得不到足够的Th细胞为对多糖特异性的B-细胞提供帮助。然而，观察到的免疫效果是不一致的，载体蛋白的总量在一些例子中增加免疫应答，在另一些例子中降低免疫应答降低。
因此，将多种多糖缀合物联合制成单一的、有效的疫苗制剂还存在技术上的困难。本发明的目的就是开发一种改进的多种血清型肺炎链球菌多糖缀合物疫苗的制剂。
发明概述
一方面，本发明涉及一种改进的肺炎链球菌疫苗，它包括与2种或更多的载体蛋白缀合的11种或更多的不同肺炎链球菌血清型多糖，其中，血清型6B、19F和23F的多糖缀合到第一载体蛋白上，其余的血清型缀合到1或2种第二载体蛋白上，并且第二载体蛋白不同于第一载体蛋白。优选地，将血清型6B和2 3F缀合到第一载体蛋白上，更优选，只有血清型6B缀合到第一载体蛋白上。在优选的实施方案中，一种第二载体蛋白为流感嗜血杆菌蛋白D。本发明可进一步包括肺炎链球菌表面蛋白，优选来自PhtX家族、CbpX家族、CbpX截断体家族和Ply。
在一个相关方面，本发明涉及一种通过应用本发明的多糖缀合物疫苗诱导婴儿产生抗肺炎链球菌的保护性免疫应答的改进的方法。
在另一个相关方面，本发明涉及一种诱导产生保护性免疫应答的改进的方法，该方法为通过应用本发明多糖缀合的疫苗和肺炎链球菌表面蛋白预防或改善老年人感染肺炎链球菌(pneumococcal)(例如，肺炎)和/或儿童感染肺炎链球菌(例如，中耳炎)的方法。
附图简要说明
图1为通过多糖免疫后的几何平均倍增测定的12种不同肺炎链球菌多糖引起的免疫应答的图示。
图2显示了单独用1.0μgPS-PD或与四价、五价、七价或十价疫苗联合对成年大鼠免疫后第14天(Post II)的IgG几何平均浓度[GMC](μg/ml)和调理素滴度。
图3显示了11种血清型和PD(蛋白D)的GMC对一维上6B和23F的剂量和第二维上9种其它血清型剂量的变化。对于所有的血清型和PD，趋势总是相同的。增加6B和23F的剂量，对其余的缀合物的免疫应答有显著降低的效应，即使那些缀合物的剂量不变。
图4显示了11种血清型免疫后幼大鼠IgG的GMC对PD总量(即总计各剂量时每种成分的所有PD的和)的曲线图。总趋势是当载体蛋白的剂量增加时，对所有多糖和PD本身的IgG应答将降低。该总趋势为载体诱导的表位抑制的强有力的证据。然而，曲线并不是单调性的，这一事实表明了存在另外的似乎依赖血清型6B的因素。
发明详述
本发明通过对多种与不同的或交替的载体蛋白缀合的多糖进行正确地选择提供一种多血清型肺炎链球菌多糖缀合物疫苗的最佳制剂。本发明是建立在以下事实的基础之上的：一种血清型的多糖缀合物可能影响或调节其它(血清型)多糖缀合物的免疫应答。因此，通过将具有不同免疫调节性能的不同的肺炎链球菌多糖置于可选择的载体蛋白上可制备一种最佳的多价多糖缀合物疫苗。
本发明是建立在以下几种因素相结合的基础之上的：(i)多糖的剂量-反应曲线通常呈钟形(高斯型曲线)，对于每种多糖(即血清型或结构)在某一特定的剂量处有最大反应；(ii)在人和动物模型中某些多糖的免疫原性随年龄进行调节；(iii)将肺炎链球菌多糖缀合物联合制成多价制剂通常会引起疫苗中一种或多种成分的免疫原性降低；(iv)然而，某些多糖缀合物联合时免疫应答会增强；(v)当与共同的的载体蛋白缀合时，血清型6B和23F和较低程度的19F多糖能调节其它多糖(即其它血清型)的免疫应答。
因此，本发明是建立在所有上述复杂关系的基础上的，与先前的研究相反，本发明得出这样的结论：多糖-蛋白缀合物的钟形剂量-反应曲线(即该曲线指示最大的免疫原性)受其它多糖的数量和特性的影响很大。这种免疫效应称为调节。而且还发现多糖缀合物的调节是通过共同的载体蛋白进行的。也就是，少数多糖缀合物可调节不同的多糖缀合物引起的免疫应答，只要它们有共同的载体蛋白。因此如上所述，本发明是建立在通过对多糖的正确选择来确定哪些多糖将被缀合到相同或不同的载体蛋白上。
下面进行更具体的说明：(a)某些肺炎链球菌多糖(PS)缀合时随年龄有很大调节，尤其是血清型6B、14、19F和23F。血清型8、12和18C随年龄有较小的调节。血清型1、2、3、4、5、7F和9V不随年龄进行调节(参见图1)。
此外(b)，与单价的多糖缀合物相比，将多糖1、3、6B、9V和23F联合成11价的多价制剂用时所引起的免疫应答增强。与此相反，血清型14在多价制剂中引起的免疫应答显示出明显的降低(参见图2)。
而且(c)，如果与共同的载体蛋白缀合，血清型6B和23F，和较低程度的19F的多糖能调节其它多糖(即其它血清型)引起的免疫应答(参见图3和4)。
因此，在一实施方案中，本发明包括的多糖6B、19F和23F与一种(第一)载体蛋白缀合，其余的多糖与另外的(或第二)载体蛋白缀合，条件是第一载体蛋白与第二载体蛋白不同。优选地，多糖6B和23F与相同的载体蛋白缀合，其余的多糖与第二载体蛋白缀合。更优选地，只有多糖6B与初级(第一)载体蛋白缀合，其余的多糖与第二载体蛋白缀合。
第一载体蛋白不必限于具体的实施方案中的蛋白，但可包括DT(白喉类毒素)、TT(破伤风类毒素)、DTcrm197(DT突变体)、其它DT点突变体(例如在Glu-148位置的突变，参见US4,709,017，WO93/25210，WO95/33481)、FragC(TT的片段)、Ply(肺炎链球菌溶血素及其突变体)、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE(下文对PhtA-E进行更详细的描述)、OmpC(源自脑膜炎奈氏球菌(N.meningitidis))、PorB(源自脑膜炎奈氏球菌)等蛋白或它们的片段。优选为DT、TT或crm197。更优选为DT。
第二载体蛋白也选自PD(流感嗜血杆菌蛋白D-例如参见EP 0594 610 B)、DT、TT、DTcrm197、FragC、Ply、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、OmpC、PorB等。可以考虑在本发明中可使用两种不同的第二载体蛋白，但优选只使用一种第二载体蛋白。
肺炎链球菌多糖数可为11种不同的血清型(或“V”，价)至23种不同的血清型(23V)。优选为11、13或16种不同的血清型。在本发明的另一实施方案中，疫苗可包括缀合的肺炎链球菌多糖和未缀合的肺炎链球菌多糖。优选多糖血清型的总数小于或等于23。例如，本发明包括11种缀合的血清型和12种未缀合的多糖。类似地，该疫苗可包括13或16种缀合的多糖和分别10或7种未缀合的多糖。
本发明的多价肺炎链球菌疫苗优选选自血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F，尽管可以理解一种或两种其它的血清型能被取代，这依赖于疫苗接受者的年龄和疫苗应用的地理位置。例如，11价疫苗可包括选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的多糖。13价用于儿科(婴儿)的疫苗也可包括血清型6A和19A，而13价用于老年人的疫苗可包括血清型8和12F。
优选地，将本发明的链球菌多糖解聚(筛分)为100-500kD的最终范围。因而，本发明的另一特征是载体蛋白与多糖的比例。就缀合的多糖而言，至少七种血清型中载体蛋白与多糖的比值(P/PS)大于0.5(即＞0.5直至1.7)(w/w)。优选其比值为□0.70-1.5(例如至少血清型6B、19F、23F)。该范围更优选为0.8-1.5((例如至少血清型6B、19F、23F)。对于本发明的一种或多种血清型(例如血清型4)，最优选P/PS的比值至少接近1(例如0.9-1.1)。
本发明的一个相关的特征是：对于每种血清型而言，未缀合的(游离的)载体蛋白的水平小于载体蛋白总量的10％，未缀合的多糖的水平小于多糖总量的10％。
多糖可用任何已知的方法连接到载体蛋白上(例如，Likhite申请的美国专利4,372,945，Armor等申请的美国专利4,474,757和Jennings等申请的美国专利4,356,170)。优选进行CDAP缀合化学反应(参见WO95/08348)。
在CDAP反应中，优选使用氰化试剂1-氰基-二甲基氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)来合成多糖-蛋白缀合物。氰化反应在相对温和的条件下完成，这样能避免碱性敏感的多糖水解。这种合成能直接与载体蛋白偶合。
多糖溶解在水或盐水溶液中。将CDAP溶解于乙腈并立即加入到多糖溶液中。CDAP与多糖的羟基反应形成氰酸酯。活化后加入载体蛋白。赖氨酸的氨基与活化的多糖反应形成异脲共价键。偶合反应发生后，加入大量过量的甘氨酸猝灭剩余的活化官能团。然后，让产物通过凝胶渗透柱以除去未反应的载体蛋白和剩余的试剂。
在另一实施方案中肺炎链球菌缀合物可与其它的多糖联合使用，例如，A、C、W、Y型脑膜炎奈氏球菌，B型流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌(S.aureus)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、B族链球菌、A族链球菌等。优选为脑膜炎奈氏球菌(A型和/或C型为最优选)和/或B型流感嗜血杆菌。另外，本发明的肺炎链球菌缀合物可与病毒抗原例如灭活的脊髓灰质炎病毒(poliovirus)(IPV)、流感病毒(灭活的、裂解的亚单位(例如F，G抗原))等联合使用。在另一可选方案中，肺炎链球菌缀合物可伴随DTPa(白喉、破伤风、非细胞性百日咳)疫苗和DTPa联合疫苗(DTPa+/-乙型肝炎病毒(Hepatitis B)+/-IPV+/-B型流感嗜血杆菌)应用。优选的DTPa疫苗含25Lf或更低的白喉类毒素。这类额外的抗原可以液体的形式或冻干的形式存在。
在另一实施方案中，本发明涉及一种通过应用安全和有效量的本发明的疫苗在婴儿(0-2岁)体内产生(保护性的)免疫应答的改进方法。本发明其它实施方案包括提供用于药物的本发明的抗原性肺炎链球菌缀合物组合物和本发明的肺炎链球菌缀合物在制备预防(或治疗)肺炎链球菌疾病的药物中的用途。
本发明进一步提供一种预防或改善婴儿肺炎链球菌感染(例如中耳炎)的改进的疫苗，其中该疫苗是通过向本发明的肺炎链球菌缀合物组合物中加入肺炎链球菌蛋白制得的。该肺炎链球菌蛋白优选来自PhtX家族(见下文)，可向其中再加入其它蛋白。这类额外的肺炎链球菌蛋白可包括CbpX、CbpX截断体(truncates)和Ply(见下文)，条件是所选择的肺炎链球菌表面蛋白不同于第一和第二载体蛋白。联合疫苗中还能包括一种或多种粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)蛋白抗原。因此，本发明涉及一种在婴儿体内产生抗中耳炎的(保护性的)免疫应答的改进的方法。
在另一实施方案中，本发明还涉及一种在老年人群(在本发明的上下文中，如果患者是年龄为50岁或更老就认为是老年人，通常为55岁以上，更通常的是60岁以上)中产生(保护性的)免疫应答的改进的方法，该方法是通过应用安全和有效量的本发明的疫苗来实现的，优选结合一种、两种或可能三种肺炎链球菌表面蛋白，条件是所选的肺炎链球菌表面蛋白不同于第一和第二载体蛋白。该肺炎链球菌蛋白优选来自PhtX家族(见下文)，其中PhtX族可加入了Ply和任选的CbpX或CbpX截断体(见下文)。
本发明的肺炎链球菌蛋白是表面暴露的，至少在肺炎链球菌的部分生活周期内是表面暴露的，或者是肺炎链球菌分泌或释放的蛋白。优选地，本发明的蛋白选自下列种类，如具有II型信号序列基序LXXC(其中X为任何氨基酸，例如聚组氨酸三联体家族(PhtX))的蛋白、胆碱结合蛋白(CbpX)、具有I型信号序列基序的蛋白(例如Sp101)、具有LPXTG基序的蛋白(其中X为任何氨基酸，如Sp128、Sp130)和毒素(例如Ply)。在这些种类(或基序)中优选的例子是下列蛋白或其免疫功能的等同体。
优选地，本发明的免疫原性组合物包括一种或多种蛋白，所述蛋白选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截断体、LytX家族、LytX截断体、CbpX截断体-LytX截断体嵌合蛋白(或融合物)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA、Sp128、Sp101、Sp130、Sp125和Sp133。然而，如果CbpX为PspC，则第二蛋白不能是PspA或PsaA。更优选地，该免疫原性组合物包括2种或多种选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截断体、LytX家族、LytX截断体、CbpX截断体-LytX截断体嵌合蛋白(或融合物)、肺炎链球菌溶血素(Ply)、PspA、PsaA和Sp128的蛋白。更优选地，该免疫原性组合物包括2种或多种选自聚组氨酸三联体家族(PhtX)、胆碱结合蛋白家族(CbpX)、CbpX截断体和肺炎链球菌溶血素(Ply)的蛋白。
Pht(聚组氨酸三联体)家族包括蛋白PhtA、PhtB、PhtD和PhtE。该家族的特征是脂化序列、被脯氨酸富集区分开的两个功能区和若干组氨酸三联体(可能参与金属或核苷的结合或酶的活性)、(3-5)卷曲螺旋区、保守的N端和异源的C端。它存在于所有受试的肺炎链球菌菌株中。在其它的链球菌和萘瑟氏菌属也发现了同源蛋白。该家族优选的成员包括PhtA、PhtB和PhtD。更优选地包括PhtA或PhtD。最优选地包括PhtD。然而，应当理解术语PhtA、B、D和E是指具有下面的引文中公开的序列的蛋白和其天然存在的(和人为的)变体，该变体与引用的蛋白至少具有90％的序列相同性。优选至少有95％的相同性，最优选有97％的相同性。
关于PhtX蛋白，在WO98/18930中公开了PhtA，也称为Sp36。如上所述，它是一种属于聚组氨酸三联体家族的蛋白并具有II型信号基序LXXC。在WO00/37105公开了PhtD，也称为Sp036D。如上所述，它也是一种属于聚组氨酸三联体家族的蛋白并具有II型信号基序LXXC。在WO00/37105中公开了PhtB，也称为Sp036B。PhtB家族的另一成员是C3-降解的多肽，它在WO00/17370中被公开。该蛋白也属于聚组氨酸三联体家族的蛋白并具有II型信号基序LXXC。优选的免疫功能等同体是WO98/18930中公开的Sp42蛋白。PhtB截断体(约79kD)在WO99/15675中公开，也被认为是PhtX家族的成员。PhtE也称为BVH-3，在WO00/30299中公开。
关于胆碱结合蛋白家族(CbpX)，该家族的成员最初被鉴定为肺炎链球菌蛋白，它能经胆碱亲和层析纯化。所有的胆碱结合蛋白都是与细胞壁的磷壁酸和与膜相关的脂磷壁酸的磷酰胆碱部分非共价结合。在结构上，整个家族具有若干共同的区域，虽然这类蛋白的精细特性(氨基酸序列、长度等)可能有差异。一般，胆碱结合蛋白包括N端区(N)、保守的重复区(R1和/或R2)、脯氨酸富集区(P)和保守的胆碱结合区(C)(由多个重复单元构成，约构成该蛋白的一半)。本申请中所用到的术语“胆碱结合蛋白家族(CbpX)”选自WO97/41151中定义的胆碱结合蛋白、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpD和CbpG。CbpA在WO97/41151中公开。CbpD和CbpG在WO00/29434中公开。PspC在WO97/09994中公开。PbcA在WO98/21337中公开。SpsA为WO98/39450中公开的胆碱结合蛋白。胆碱结合蛋白优选选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。
另一优选的实施方案为CbpX截断体，其中“CbpX”在上面定义，“截断体”是指缺少50％或更多的胆碱结合区(C)的CbpX蛋白。这类蛋白优选地缺少整个胆碱结合区。更优选地，这类蛋白截断体缺少(i)胆碱结合区和(ii)保留脯氨酸富集区和至少一个重复区(R1或R2)。更优选地，截断体具有2个重复区(R1和R2)。这类优选的实施方案的例子有WO99/51266或WO99/51188中列举的NR1xR2、NR1xR2P、R1xR2P和R1xR2，不过，其它缺少类似胆碱结合区的胆碱结合蛋白也在本发明的范围内。
LytX家族是与细胞溶解有关的膜相关蛋白。N末端结构域包括胆碱结合结构域，然而LytX家族没有上述CbpA家族中所发现的所有特征，因而对本发明而言，LytX族与CbpX族被认为是截然不同的。与CbpX家族相反，LytX蛋白族的C-端结构域含有催化的结构域。该家族包括LytA、B和C。关于LytX家族，Ronda等在Eur J Biochem，164：621-624(1987)公开了LytA。LytB也称为Sp46，在WO98/18930中公开。LytC也称为Sp91，也在WO98/18930中公开。该家族中优选的成员为LytC。
另一优选的实施方案为LytX截断体，其中“LytX”按上述定义且“截断体”是指缺少50％或更多的胆碱结合区的LytX蛋白。这类蛋白优选地缺少整个胆碱结合区。本发明另一优选的实施方案为CbpX截断体-LytX截断体的嵌合蛋白(或融合物)。优选地，它包括CbpX的NR1×R2(或R1xR2)和LytX的C-端部分(Cterm，即缺少胆碱结合结构域)(例如LytCCterm或Sp91 Cterm)。更优选地，CbpX选自CbpA、PbcA、SpsA和PspC。更优选地为CbpA。更优选地，LytX为LytC(也称为Sp91)。本发明的另一优选的实施方案为缺少胆碱结合结构域(C)的PspA或PsaA截断体，该截断体与LytX表达为融合蛋白。优选地，LytX为LytC。
肺炎链球菌溶血素为具有截然不同的细胞溶解(溶血的)和补体激活活性的多功能毒素(Rubins等Am.Respi.Cit Care Med，153：1339-1346(1996))。该毒素不由肺炎链球菌分泌，但由肺炎链球菌受自溶素的影响而溶解后释放。例如，它的作用包括刺激人单核细胞产生炎症细胞因子、抑制人呼吸道上皮纤毛的搏动和降低嗜中性粒细胞杀细菌的活性和迁移。肺炎链球菌溶血素最明显的作用是溶解红细胞，它包括与胆固醇结合。因为它是毒素，所以在体内应用之前必须是解毒的(即当给予适于保护的剂量时对人是无毒的)。野生型或天然的肺炎链球菌溶血素的表达和克隆属于本领域的已知的技术。例如，参见Walker等(Infect Immun，55：1184-1189(1987))，Mitchell等(Biochim Biophys Acta，1007：67-72(1989))和Mitchell等(NAR，18：4010(1990))。Ply的解毒可用化学方法进行，例如，经过GMBS处理、或***或戊二醛处理或二者结合处理。这些方法为本领域用于许多毒素的已知方法。另外，ply能用遗传学方法解毒。因此，本发明包括肺炎链球菌蛋白的衍生物，例如可以是突变的蛋白。术语“突变的”在本文中是指用已知用于定点诱变的技术或任何其它常规方法发生缺失、添加或替代了一个或多个氨基酸的分子。例如，如上所述，ply蛋白的突变体可能发生变化以致于它失去了生物活性但还保留了其免疫原性的表位，例如，参见WO90/06951、Berry等(Infect Immun，67：981-985(1999))和WO99/03884。应当理解本文中所用的术语“Ply”是指适合于药用的(即无毒的)突变的或解毒的肺炎链球菌溶血素。
至于PsaA和PspA，两者均为本领域所已知。例如，Berry&Paton在Infect Immun 1996.12月；64(12)：5255-62中已描述了PsaA和其跨膜缺失变异体。PspA及其跨膜缺失变异体也在如US5804193，WO92/14488和WO99/53940中作了描述。
WO00/76540公开了Sp128和Sp130。Sp125为具有LPXTG(其中X为任何氨基酸)的细胞壁锚着基序的肺炎链球菌表面蛋白的一个例子。已发现属于具有该基序的这类肺炎链球菌表面蛋白的任何蛋白均可用于本发明，因此也是本发明的蛋白。Sp125本身在WO98/18930中公开，也称为ZmpB-一种锌金属蛋白酶。Sp101在WO98/06734中公开(其中它具有访问号#y85993)。其具有I型信号序列的特征。Sp133在WO98/06734中公开(其中它具有访问号#y85992)。它也具有I型信号序列的特征。
可包括于联合疫苗(尤其是预防中耳炎的疫苗)中的优选的粘膜炎莫拉氏菌蛋白抗原的例子为：OMP106[WO 97/41731(Antex)和WO96/34960(PMC)]；OMP21；LbpA和/或LbpB[WO98/55606(PMC)]；TbpA和/或TbpB[WO97/13785和WO97/32980(PMC)]；CopB[Helminen ME等(1993)Infect.Immun.61：2003-2010]；UspA1和/或UspA2[WO93/03761(University of Texas)]；OmpCD；HasR(PCT/EP99/03824)；PilQ(PCT/EP99/03823)；OMP85(PCT/EP00/01468)；lipo06(GB9917977.2)；lipo10(GB9918208.1)；lipo11(GB9918302.2)；lipo18(GB9918038.2)；P6(PCT/EP99/03038)；D15(PCT/EP99/03822)；OmplA1(PCT/EP99/06781)；Hly3(PCT/EP99/03257)；和OmpE。可包括于联合疫苗(尤其是预防中耳炎的疫苗中的)不能分型的流感嗜血杆菌抗原的例子包括：丝束蛋白[(US5766608-Ohio State Research Foundation)]及其含肽的融合体[例如LB1(f)肽融合体；US5843464(OSU)或WO99/64067]；OMP26[WO97/01638(Cortecs)]；P6[EP281673(State University ofNew York)]；TbpA和/或TbpB；Hia；Hsf；Hin47；Hif；Hmw1；Hmw2；Hmw3；Hmw4；Hap；D15(WO94/12641)；P2和P5(WO94/26304)。
前面已经提到，本发明的蛋白也可有益地联合。优选的联合包括但不限于PhtD+NR1xR2，PhtD+NR1xR2P，PhtD+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白，PhtD+Ply，PhtD+Sp128，PhtD+PsaA，PhtD+PspA，PhtA+NR1xR2，PhtA+NR1xR2P，PhtA+NR1xR2-Sp91Cterm嵌合或融合蛋白，PhtA+Ply，PhtA+Sp128，PhtA+PsaA，PhtA+PspA，NR1xR2+LytC，NR1xR2P+PspA，NR1xR2+PspA，NR1xR2P+PsaA，NR1xR2+PsaA，NR1xR2+Sp128，R1xR2+LytC，R1xR2+PspA，R1xR2+PsaA，R1xR2+Sp128，R1xR2+PhtD，R1xR2+PhtA。优选地，NR1xR2+/-P(或R1xR2+/-P)源自CbpA或PspC。更优选地它源自CbpA。其它的联合包括3种蛋白的联合，如PhtD+NR1xR2P+Ply，PhtD+NR1xR2+Ply，PhtA+NR1xR2+Ply和PhtA+NR1xR2P+Ply。
本发明的疫苗优选添加佐剂。合适的佐剂包括铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但也可为钙盐、镁盐、铁盐或锌盐，或者可以是酰化的酪氨酸、或酰化的糖、阳离子或阴离子衍生化的多糖、或聚磷腈的不溶性悬浮液。当用铝盐作佐剂时，铝盐与多糖的比例小于10∶1(w/w)。优选地小于8∶1且大于2∶1。
优选所选的佐剂是对TH1型应答优选的诱导剂。这种高水平的Th1-型细胞因子倾向于诱导细胞介导的对特定抗原的免疫应答，而高水平的Th2-型细胞因子倾向于诱导对抗原的体液免疫应答。
重要的是记住Th1和Th2-型免疫应答的区分并不是绝对的。事实上，个体将支持一种描述为主要为Th1型或主要为Th2型的免疫应答。然而，通常根据Mosmann和Coffman对鼠CD4+ve T细胞克隆的描述(Mosmann，T.R.Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞：不同方式的淋巴因子分泌导致不同的功能性质different patterns oflymphokine secret ion lead to different functionalpropertes)。Annual Review of Immunology，7，第145-173页)来考虑细胞因子家族是比较方便的。传统上认为，Th1型应答与T淋巴细胞产生INF-γ和IL-2细胞因子相关。其它常与Th1型免疫应答诱导直接相关的细胞因子不由T细胞产生，如TL-12。与此相反，Th2型应答与IL-4、IL-5、IL-6、IL-10的分泌有关。促进以Th1型应答为主的合适佐剂***包括：单磷酰类脂A或其衍生物，尤其是3-脱氧-酰基-单磷酰类脂A(3D-MPL)(关于其制备参见GB2220211A)；和单磷酰类脂A(优选3-脱氧-酰基-单磷酰类脂A)与铝盐(例如磷酸铝或氢氧化铝)或水包油乳剂结合物。在这样的结合中，在同一特定的结构中包含抗原和3D-MPL，这样使得抗原性的和免疫刺激的信号更有效地传递。研究表明3D-MPL能进一步增强明矾吸附的抗原的免疫原性[Thoelen等Vaccine(1998)16：708-14；EP689454-B1]。
增强***包括单磷酰类脂A与皂苷衍生物的联合，尤其是WO94/00153中公开的QS21与3D-MPL的联合，或WO96/33739中公开的较少反应原性的联合，其中QS21被胆固醇猝灭。WO95/17210中描述了一种的特别有效的佐剂制剂，该制剂在水包油乳剂中包含QS21、3D-MPL和生育酚，是优选的制剂。优选地，该疫苗额外地包含皂苷，更优选地包括QS21。该制剂也可包括水包油乳剂和生育酚(WO95/17210)。本发明也提供生产疫苗制剂的方法，该方法包括将本发明的蛋白与药学上可接受的赋形剂如3D-MPL混合。含寡核苷酸的未甲基化的CpG(WO96/02555)也是TH1型应答优选的诱导剂且适合用于本发明。
本发明的疫苗制剂可通过将所述疫苗经全身或粘膜途径应用来用于保护或治疗对感染敏感的哺乳动物。这些应用可包括经肌肉内、腹膜内、皮内或皮下注射；或经粘膜应用到口腔/饮食、呼吸道、泌尿生殖道中。优选鼻内应用疫苗用来治疗肺炎或中耳炎(因为它能更有效地阻止肺炎链球菌经鼻咽输入，因而能在最初始阶段减少感染)。虽然本发明的疫苗可以单一的剂量应用，但也可将其成分在同一时间或在不同的时间共同应用(例如，为了使免疫应答相互达到最佳的协同作用，肺炎链球菌多糖可与疫苗的细菌蛋白成分在同一时间分开应用或在疫苗的细菌蛋白成分应用1-2周后应用)。关于共同应用，任选的Th1佐剂可存在于任何或所有不同应用形式，然而优选存在于与疫苗的细菌蛋白成分的联合中。除单一的应用途径外，还可使用2种不同的应用途径。例如，多糖可经IM(或ID)应用，细菌蛋白可经IN(或ID)应用。此外，本发明的疫苗引发剂量可经IM应用，加强剂量可经IM或IN(不含铝)应用。
各疫苗剂量中缀合物抗原的量应选择为在通常的疫苗中能诱导免疫保护性应答而又不引起明显的有害副作用的量。此量将随使用的具体免疫原和使用的方式而变化。通常，要求每个剂量包括0.1-100μg多糖，对于多糖缀合物为0.1-50μg多糖，优选1-10μg(其中1-5μg为优选的范围和2-5μg为更优选的范围)。然而，对于血清型6B，优选的剂量包括3-10μg多糖，更优选5-10μg多糖缀合物。
疫苗中蛋白抗原的含量通常为1-100μg，优选的范围为5-50μg，最常用的范围为5-25μg。在初始接种疫苗后，受治疗者可接受间隔足够的一次或几次加强免疫。
Vaccine Design(“the subunit and adjuvant approach”(edsPowell M.F.&Newman M.J.)(1995)Plenum Press New York)对疫苗制剂作了总的论述。Fullerton申请的美国专利4,235,877中描述了脂质体中的被囊化。
本发明的疫苗可以贮存在溶液溶液中或冻干。当为液体时，本发明的疫苗通常以0.5ml/剂量的形式贮存。疫苗优选地吸附在铝盐上。假如该溶液被冻干，优选含有糖如蔗糖、乳糖或海藻糖。更优选的是将疫苗冻干并在使用前临时重建。链球菌多糖的冻干可能产生更稳定的组合物(疫苗)且在存在3D-MPL和缺少以铝为基础的佐剂时可能产生更高的抗体滴度。
虽然本发明的疫苗可经任何途径应用，但本发明的一个实施方式是将所述疫苗应用到皮肤中(ID)。人的皮肤包括外层的“角质”外皮，称为角质层，它覆盖在表皮上。在表皮下是所谓的真皮层，它依次覆盖皮下的组织。研究者已显示将疫苗注射到皮肤内尤其是真皮内，能刺激免疫应答，这也可能与许多额外的好处有关。本发明优选形式是将本文中所述的疫苗皮内接种。
皮内注射的常规技术“Mantoux氏程序”包括下列步骤：清洁皮肤，然后用一只手使其伸展，使细规格针(26-31规格)的斜面朝上，以10-15°角将针***。一旦针的斜面***，降低针管并前推，同时轻压使其在皮肤下抬高。然后将液体缓慢注入，这样便形成一个大疱或肿块，接着将针缓慢撤下。
最近，已描述了为液体试剂应用到皮肤内或穿透皮肤而专门设计的装置，例如WO99/34850和EP1092444中描述的装置，还有例如WO01/13977；US5,480,381，US5,599,302，US5,334,144，US5,993,412，US5,649,912，US5,569,189，US5,704,911，US5,383,851，US5,893,397，US5,466,220，US5,339,163，US5,312,335，US5,503,627，US5,064,413，US5,520,639，US4,596,556，US4,790,824，US4,941,880，US4,940,460，WO97/37705和WO97/13537中描述的快速注射装置。另外，皮内应用疫苗制剂的方法可包括使用传统的注射器和针或为冲击输送固体疫苗而设计的装置(WO99/27961)，或经皮贴剂(WO97/48440；WO98/28037)；或应用于皮肤的表面(经皮或经皮输送WO98/20734；WO98/28037)。
当将本发明的疫苗应用到皮肤，更准确地说是应用到真皮内时，疫苗为小体积的液体形式，尤其为约0.05ml-0.2ml之间的体积。
本发明皮肤内或皮内应用的疫苗中抗原的含量可以与肌内的疫苗中常用的剂量相似(见上面)。然而，经皮肤或皮内应用的疫苗的特点是制剂可为“低剂量”。因此，在“低剂量”的疫苗中蛋白抗原优选为少至0.1-10μg，优选每剂量0.1-5μg；且多糖(优选为缀合的)抗原的量为0.01-1μg，优选为每剂量在0.01-0.5μg多糖之间。
本文中所使用的术语“皮内输送”是指疫苗输送到皮肤的真皮部位。然而，疫苗不一定只局限于真皮内。真皮是指位于人皮肤表面下约1.0-约2.0mm的皮肤层，但不同的个体之间及身体的不同部位有一定量的差异。一般认为往皮肤的表面向下进入1.5mm就到达真皮层。真皮位于角质层及表面的表皮和下面的皮下层之间。跟输送方式有关，疫苗可能最终只位于或主要位于真皮内，或者它最终可能分布于表皮和真皮内。
为了更好地理解本发明，列举了下面的实施例。这些实施例只是用来作为示范说明本发明，而决不能认为是限制本发明的范围的。
具体实施方式
实施例：
实施例1
免疫应答随年龄进行调节的多糖的测定
内部收集或经外部来源收集对免疫前和免疫后(2周-3月)多糖(未缀合的)人抗体滴度数据。图1显示了每种血清型多糖的免疫原性与研究对象的平均年龄之间的关系，其中多糖的免疫原性是由用多糖免疫后的抗体滴度的几何平均倍增(GFI)来测量的。几何平均倍增的对数与年龄之间的线性关系能显示免疫应答是否随年龄进行调节。如图1所示，血清型6、14、19和23与年龄之间呈明显的相关(p＜0.001)，而血清型8、12和18与年龄之间的相关不明显(0.05＜p＜0.2)。最后，血清型1、2、3、4、5、7和9与年龄之间没有明显的相关(p＞或＝0.20)。
实施例2
测定多种哺乳动物的抗体应答的一般方法
用ELISA方法测试血清中的抗肺炎链球菌多糖的IgG抗体，该测试方法是建立在1994-1996的联合的CDC/WHO专题学术讨论会建议的达成共识的人血清测试的基础之上(WHO 1996，Plikatis等J.Clin.Mierobiol 38：2043(2000))。简而言之，购自ATCC(Rockyille，Md，20852)的纯化的英膜多糖，以磷酰缓冲盐水(PBS)中的25μg/ml在高结合的微量滴定板(Nunc Maxisorp)上4℃包被过夜。用胎牛血清(FCS)封闭微量滴定板，37℃1小时。用20μg/ml细胞壁多糖(Statens Serum Institute，Copenhagen)和10％FCS在室温下预温育血清样品30分钟以中和抗该抗原的抗体。用同样的方法处理对照用的血清89SF(由Dr.C Frasch惠赠，USFDA)，包括在每个盘上。然后将样品用PBS中的10％FCS在微量培养板上稀释两倍，并在室温下搅拌1小时至平衡。洗涤后，用过氧化物酶标记的抗人IgGFc单克隆抗体(HP6043-HRP，Stratech Scientific Ltd)在室温下搅拌1小时平衡微量培养板，其中抗人IgG Fc单克隆抗体以PBS中的10％FCS按1∶4000的比例稀释。以ELISA方法使用JacksonImmuno Labortories Inc.生产的过氧化物酶缀合的亲和纯(AffiniPure)山羊抗大鼠IgG(H+L)(编码112-035-003)在1∶5000时测量大鼠IgG。对于每种血清型，滴定曲线用SoftMax Pro进行逻辑对数而以标准血清为对照。除了6B和23F使用的浓度为20μg/ml外，用来包被ELISA板的多糖的浓度都固定在10μg/ml。此外，当测试6B血清型的抗血清时，使用100％的胎牛血清作为稀释液，因为该血清型倾向于非特异性的ELISA反应。对于猕猴血清的血清型3血清学使用mHSA共混(comix)以包被抗原。用4mg OPD(Sigma)/10mlpH4.5的0.1M柠檬酸缓冲液和14μl H2O2在暗处室温下15分钟显色。用50μl的HCl终止反应，在490nm处读取相对于650nm处的光密度值。参考标定曲线的滴定点确定IgG浓度，其中标准曲线是应用SoftMax Pro软件计算的4-参数的逻辑对数方程作出的。
为获得抗体的绝对浓度(μg/ml)，用两种独立的方法标定混合的对照用的抗血清。对于大鼠抗血清，使用Zollinger和Boslego的方法(1981)来测定11种血清型，将4种血清型该方法的测定值与免疫沉淀获得的测定值比较。发现两种方法的测定结果非常一致。对于鼠血清，使用纯化的单克隆抗体IgG1，通过corollary应答来确定其活性浓度PVW1999。在这种情况下发现有较好的一致。对于猕猴血清，测试表明所用的抗IgG试剂与人和猕猴的IgG发生同等的反应；因而应用标定的人对照血清89SF(购自US FDA)作为ELISA中的对照。
测定鼠和大鼠抗肺炎链球菌多糖的IgG的ELISA方法除了下面的区别外相似。使用本实验室制的多糖包被ELISA板，对于6B和23F血清型为PBS中的20μg/ml，对于14和19F血清型为PBS中的10μg/ml。用Jackson Immuno Labortories Inc.生产的过氧化物酶缀合的亲和纯(AffiniPure)山羊抗小鼠IgG(H+L)和亲和纯(AffiniPure)山羊抗大鼠IgG(H+L)来测定结合的IgG.HP6043-HRP与人和猕猴纯化的IgG发生同等的反应，所以该试剂可用作猕猴抗血清，且用89SF作为对照血清。
用于人和猕猴血清学的对照血清为89SF，由Dr.Carl Frasch惠赠。已公开了普遍接受的抗10种肺炎链球菌血清型的IgG、IgA和IgM的人对照血清89SF基于重量的浓度标定值，该值用2种不同的方法标定的。
蛋白的ELISA与多糖的ELISA方法相似，但有下面的改变。蛋白在PBS中的2.0μg/ml时包被过夜。血清样品用含10％的胎牛血清和0.1％的聚乙烯醇的PBS稀释。用Sigma过氧化物酶缀合的山羊亲和纯化的抗人IgG Fc抗体(对照品A-2290)测定结合的人抗体。为标定人和猕猴血清学的蛋白反应，用Sandoglobulin批号069(被发现含显著的抗蛋白D抗体)作为对照，并给定其100个ELISA个单位中一任意值。对于鼠和大鼠血清学，可由直接的抗原包被或抗体捕获通过corollary应答来确定抗体的浓度。
通过对体外调理素细胞吞噬进行检测来测试血清杀死活肺炎链球菌的能力。用已公开的方案(Romero-Steiner等1997)，和CDC(多实验室研究的一部分)的Sandy Steiner提供的具体方案修改为调理素细胞吞噬的检测。
可运用两种方法。在方法A中，由CDC提供的肺炎链球菌菌株被SB生产菌株取代。其次，HL-60细胞被新鲜纯化的人嗜中性粒细胞(PMN)取代。以50％的细菌被杀死所需的血清稀释度表示结果。
在方法B中，更严格地按CDC(多实验室研究的一部分)提供的公开的和具体的标准化的方案(Romero-Steiner 1997，Romero-Steiner2000)进行。
简而言之，分化的HL60细胞在1000rpm(300xg)的转速下离心，移去培养物上清液。用由HBSS-BSA组成的检测缓冲液将细胞再悬浮。如果培养基中存在抗生素，就重复该操作以确保将抗生素完全移去。
血清样品事先预稀释以便在4种检测中的检测体积最适宜。试验表明若在4℃保存，用检测缓冲液以1∶2稀释的样品能产生至少5天稳定的调理素滴度。向微量培养板的圆底孔内的25μl检测缓冲液中加入25μl稀释的血清。用25μl的体积再进行两倍的系列稀释以使检测体积最适宜。
幼兔的补体和肺炎链球菌培养物在使用前保存在-70℃下。将活化的HL60细胞、新鲜解冻的肺炎链球菌培养基物和新鲜解冻的幼兔补体按4∶2∶1的体积比涡旋混合。将25μl的该混合物迅速分配到含稀释的血清的微量培养板的孔中，得到的最终体积为50μl。这样在每个孔最终的混合物中得到1E5 HL60，150CFU的肺炎链球菌和7.1％的补体浓度，除了血清型6B有两点改变外：最终的补体浓度为12.5％且在检测缓冲液中包含5％FCS以使肺炎链球菌在温育期间达到生长平衡。微量培养板用5％的CO2在37℃下温育2小时，同时以210rpm的转速振荡。
温育后，从孔中取出20μl等分试样对肺炎链球菌进行活菌计数。用只含检测缓冲液不含血清的孔作为空白孔以测定加入到每个孔中的肺炎链球菌的精确数量。每个板上8个空白孔的CFU平均数用于后面的计算中。
相对于空白孔平均数计算杀死细菌的百分数。以杀死50％以上肺炎链球菌的血清稀释度倒数的最大值确定血清样品的滴度。所测值是以非连续的滴度8，16，32等报告的。杀死细菌的百分数小于50％的样品以滴度＜8报告。将观察到前区效果(prozone effect)的样品重复试验，取第2次试验的结果。若再一次观察到前区效果，则认为该结果无效。这种情况在样品中的发生率小于5％。滴度大于1024的样品以1∶64的稀释度为起始点重复试验。
实施例3
肺炎链球菌PS-PD缀合物的联合在成年大鼠体内对免疫原性的影响
已观察到疫苗联合成多价制剂可能引起疫苗中一种或多种成分的免疫原性降低。尤其在缀合物疫苗中能观察到这种情况，称为载体诱导的表位抑制。引起该抑制的机理还不是很清楚，但在载体蛋白的剂量较高时易于发生。
11-价肺炎链球菌缀合物疫苗为联合疫苗的一个例子。因为各种血清型缀合物的联合将增加用于免疫的蛋白的总量，所以确定各缀合物疫苗联合成多价制剂是否会导致缀合物的免疫原性明显降低将是重要的。
方案：
用肺炎链球菌多糖蛋白D的缀合物疫苗(参见WO00/56360)单独地或在多价制剂中联合免疫成年大鼠。每组10只大鼠，28天内分两次免疫各组，在第28天和第42天(第二次免疫后14天)取血测试。
按所述方法测定抗体的浓度。调理素的滴度按A方法测定。
结果：
根据ELISA测定(图2)，所有的缀合物均诱导特异性的IgG抗体。在所有的血清中对调理素的活性(以能杀死50％活肺炎链球菌的混合血清的稀释度之倒数来确定)进行了检测。
图2也显示了单价PS-PD缀合物联合后对成年大鼠体内免疫原性的影响，这可由II次免疫后第14天的IgG浓度和调理素滴度来测量。
对所有的样品进行统计学分析以确定联合后IgG的浓度是否存在显著性的差异。只有血清型14在联合时ELISA滴度显示出显著性的降低。其IgG浓度降低到与其它血清型相似的水平。所有其它的差异均不显著，但血清型7F的差异接近显著(p＝0.08)。
血清型1、3、6B、9V和23F联合后实际上显示为增加。
实施例4
血清型6B和23F剂量的独立变化
将单个的缀合物疫苗联合成多价制剂会导致抗体应答的增加或降低。该免疫应答调节是血清型依赖性的。为描述对联合的11价缀合物疫苗的免疫应答的特征，将11价疫苗分成两组联合进行实验：6B和23F为一组，其余的9种价的血清型为一组。
方案：
用11价的PS-PD肺炎链球菌缀合物疫苗以双重剂量(two-tiereddosage)免疫幼大鼠和成年大鼠，即如表1中所显示的6B&23F的剂量独立于其它9种价的血清型而变化。
表1：11价PS-PD双向(Two-Way)剂量制剂
| 组 | 6B和23F的剂量(μg) | 1，3，4，5，7F，9V，14，18C，19F(μg) |
| 123456789 | 0.010.010.010.10.10.1111 | 0.010.110.010.110.010.11 |
幼OFA大鼠随机分配给不同的母亲且成长7天时接受第一次免疫。每组10只大鼠分别在第0、14和28天接受3次免疫。于第42天(第III次免疫后第14天)和第56天(第III免疫后第28天)取血。
结果：
双重剂量的三维分析(3D analysis)指示出幼大鼠体内由6B-PD和23F-PD引起的免疫调节。图3显示了11种血清型和PD的GMC对6B和23F的剂量在一维上的变化，及其对其它9种血清型的剂量在第二维上的变化。所有的血清型和PD的变化趋势相同。增加6B和23F的剂量会引起对其余的缀合物的抗体反应显著降低，即使缀合物的剂量不变。在幼大鼠体内这种效应相当明显，但对于成年大鼠只能观察到轻微的变化(没有显示)。
图4显示了抗缀合物疫苗中每种血清型的抗体浓度是总蛋白D含量的函数。若载体诱导的表位抑制是疫苗剂量增加后免疫应答降低的主要或唯一的原因，则可预料到这些曲线将会单调性地下降。波动的函数表明有一些其它因素影响抗体免疫应答。如图3中显示的，当联合血清型6B和23F将剂量分次使用时，可得到平滑的三维(3D)面，这表明6B和23F调节对其它血清型的免疫应答。图4血清型6B显示了单调性下降的免疫应答，因此可以推测出血清型6B的剂量是主要因素，因为它与它本身的相互作用总是恒定的因而就只显示出载体诱导的表位抑制作用。
结论：
6B&23F与其余的9种血清型剂量的独立变化表明血清型6B&23F对其它的血清型引起的抗体应答有影响。每种血清型引起的抗体免疫应答随用于免疫的PD总量的增加而降低，表明存在载体诱导的表位抑制，但由于其关系曲线不平滑，所以一定存在其它的因素。此外，PD引起的IgG应答也随剂量的增加而降低，这与根据载体诱导的表位抑制而预测的结果相反。综上所述可得出这样的结论：缀合物疫苗引起的免疫应答存在目前未知的调节因素，这一点反映在6B和23F血清型的剂量图上。
实施例5
血清型6B和23F对免疫的调节经蛋白载体传递的证实
目的：
显然缀合物6B和23F的剂量调节对多价制剂中其它缀合物引起的抗体应答。下面的实验用来确定幼大鼠体内6B&23F-PD(缀合物)相关的免疫调节是否是由于多糖或多糖蛋白缀合物引起的。
方案：
缀合物6B&23F-PD或PS(未缀合的)与其它的血清型联合成多价制剂，其中6B&23F的剂量为0.01和1.0μg，普通的多糖为1.0μg(非6B&23F缀合物)。
幼OFA大鼠随机分配给不同的母亲且成长7天时接受第一次免疫。每组10只鼠分别在第0、14和28天接受3次免疫。于第42天(第III次免疫后第14天)取血。
结果：
正如前面所观察到的，增加6B&23F-PD的剂量会降低19F引起的应答。当PS取代缀合物时，可观察到19F引起的较高应答。
结论：
存在1μg的6B和23F缀合物疫苗的剂量足以调节多价缀合物疫苗中19F血清型引起的免疫应答，然而，普通多糖同样的剂量没有影响。由于已经确定了人和动物体内血清型6B和23F在其引起的免疫应答中受调节，因此我们可得出这样的结论：血清型6B和23F的免疫调节是由普通的蛋白载体传递的。
实施例6
血清型6B的蛋白载体的变化
在幼大鼠体内剂量为0.1μg时抗6B PS-缀合物的血清转变率低。对能影响缀合物的免疫原性的其它因素进行了检测。这些因素包括材料中碳水化合物与蛋白的比例、所使用的键合的具体方法、游离多糖的存在以及所用的具体的载体蛋白。
在幼大鼠或小鼠模型中偶合的化学方法的改变都不增加6B缀合物的免疫原性。在小鼠模型中使用TT载体似乎会增加免疫原性，但仅在较高剂量时才出现。以初始载体蛋白(蛋白D)/PS为2.5∶1的比例合成缀合物。其它缀合物的合成中初始载体蛋白(蛋白D)/PS的比例为1∶1。
实施例7
临床评估
对本发明的几种疫苗制剂正在人体内进行临床评估。表2举例说明了这类疫苗组合物。
表2-肺炎链球菌制剂
| Strep PS的血清型：6B (μgPS-载体)19F (μgPS-载体)23F (μgPS-载体)1 (μgPS-载体)3 (μgPS-载体)4 (μgPS-载体)5 (μgPS-载体)7F (μgPS-载体)9V (μgPS-载体)14 (μgPS-载体)18C (μgPS-载体)PS的总含量： | N°1 | N°2 | N°3 | N°4 |
| 10μg-DT3μg-DT5μg-DT3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD42μg PS | 5μg-DT3μg-DT5μg-DT3μg-PD2μg-PD2μg-PD3μg-PD3μg-PD2μg-PD2μg-PD2μg-PDH32μg PS | 10μg-DT5μg-PD5μg-DT5μg-PD5μg-PD5μg-PD5μg-PD5μg-PD5μg-PD5μg-PD5μg-PD60μg PS | 5μg-DT3μg-PD5μg-DT3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD3μg-PD37μg PS | |
| 蛋白载体的含量： | ～22μg PD～18μg DT | ～18μg PD～14μg DT | ～42μg PD～15μg DT | ～25μg PD～10μg DT |
| 明矾的含量(Al3+)： | ～0.21mg | ～0.16mg | ～0.32mg | ～0.19mg |
| 与MenC ads lye+/-：μg PSμg TTμg Al3+ | 10μg PSC～10μg TT0.05mg Al3+ | 10μg PSC～10μg TT0.05mg Al3+ | ||
尽管以上举例说明了本发明的优选实施方案，应当理解本发明不限于本文中公开的明确的教导并保留了下述权利要求的范围内所有改变的权利。
Claims (24)
1.一种改进的肺炎链球菌疫苗，包括：与2种或更多的载体蛋白缀合的11种或更多的来自不同肺炎链球菌血清型的多糖，其中，血清型6B、19F和23F缀合到第一载体蛋白上，其余的血清型缀合到1或2种第二载体蛋白上，并且其中，第二载体蛋白不同于第一载体蛋白。
2.一种改进的肺炎链球菌疫苗，包括：与2种或更多的载体蛋白缀合的11种或更多的来自不同肺炎链球菌血清型的多糖，其中，血清型6B和23F缀合到第一载体蛋白上，其余的血清型缀合到1或2种第二载体蛋白上，并且其中，第二载体蛋白不同于第一载体蛋白。
3.一种改进的肺炎链球菌疫苗包括：与2种或更多的载体蛋白缀合的11种或更多的来自不同肺炎链球菌血清型的多糖，其中，血清型6B缀合到第一载体蛋白上，其余的血清型缀合到1或2种第二载体蛋白上，并且其中，第二载体蛋白不同于第一载体蛋白。
4.前述任一权利要求的疫苗，其中第一载体蛋白选自DT、crm197、TT、片段C、Ply、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、OmpC、和PorB。
5.前述任一权利要求的疫苗，其中第二载体蛋白包括1种或2种选自PD、DT、crm197、TT、片段C、Ply、PhtA、PhtB、PhtD、PhtE、OmpC、和PorB的蛋白。
6.前述任一权利要求的疫苗，其中存在1种第二载体蛋白。
7.前述任一权利要求的疫苗，其中每种血清型的多糖存在的量为1-10μg。
8.权利要求7的疫苗，其中选自1、3、4、5、7F、9V、14和18C的一种或多种血清型存在的量为2-5μg。
9.前述任一权利要求的疫苗，其中载体蛋白与多糖的比值为0.5至1.7(w/w)。
10.权利要求9的疫苗，其中，对于选自6B、19F和23F的一种或多种血清型而言，载体蛋白与多糖的比值为0.7至1.5。
11.前述任一权利要求的疫苗，第二载体蛋白为流感嗜血杆菌蛋白D(PD)。
12.前述任一权利要求的疫苗，其中多糖血清型6B缀合到选自DT、crm197或TT的第一载体蛋白上。
13.权利要求12的疫苗，其中第一载体蛋白为DT。
14.前述任一权利要求的疫苗，其中多糖6B存在的量为5-10μg/剂量。
15.前述任一权利要求的疫苗，进一步包括未缀合的肺炎链球菌的多糖，该多糖的血清型不同于已缀合的多糖，以便其中缀合和未缀合多糖数小于或等于23。
16.一种诱导婴人产生抗肺炎链球菌的保护性免疫应答的方法，包括应用前述任一权利要求所述的疫苗。
17.一种诱导老年人产生抗肺炎链球菌的保护性免疫应答的方法，包括应用(i)前述任一权利要求所述的疫苗和(ii)源自PhtX族的肺炎链球菌表面蛋白。
18.一种诱导婴儿产生抗中耳炎的保护性免疫应答的方法，包括应用(i)前述任一权利要求所述的疫苗和(ii)源自PhtX族的肺炎链球菌表面蛋白。
19.权利要求17或18的方法，其中PhtX家族蛋白为PhtD或PhtB。
20.权利要求19的方法，其中PhtX家族蛋白为PhtD。
21.权利要求17的方法，进一步包括CbpX家族蛋白。
22.权利要求21的方法，其中CbpX家族蛋白为缺少胆碱结合结构域的截断体。
23.权利要求22的方法，其中CbpX截断体为胆碱结合蛋白A。
24.权利要求18的方法，进一步包括Ply。
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