CN1624139A - 一种超氧化物歧化酶基因的表达方法及其专用载体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超氧化物歧化酶基因表达的方法及其专用载体。本发明所提供的超氧化物歧化酶基因表达的专用载体，是将超氧化物歧化酶基因***到毕赤酵母表达载体的多克隆位点处获得的。本发明所提供的超氧化物歧化酶基因表达的方法，是构建含有超氧化物歧化酶基因的毕赤酵母表达载体，将构建的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中，获得重组毕赤酵母，诱导重组毕赤酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。本发明弥补了传统SOD制备方法以及原核表达***表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化SOD的生产，则具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

Description

一种超氧化物歧化酶基因的表达方法及其专用载体

技术领域

本发明涉及超氧化物歧化酶基因表达的方法及其专用载体。

背景技术

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是广泛存在于生物体内的金属酶，它有多种类型，如：Fe-SOD，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD等。SOD酶是机体内唯一一种以超氧阴离子自由基(O^- ₂)为底物的酶，它能专一地催化O^- ₂发生歧化反应，生成H₂O₂和O₂，因而可较好地抵御氧自由基和其它氧化物自由基对细胞质膜的毒性，对防御机体的氧化损伤起到十分重要的作用(赵宝路。氧自由基和天然抗氧化剂。科学出版社，1999，3-125)。SOD在临床上主要用于治疗氧中毒、老年性白内障、糖尿病、心血管疾病、各种炎症等多种疾病；SOD还可作为防辐射剂，用于辅助放疗与化疗以及肾、肝、心脏等器官的保护和移植，以降低大剂量辐射的副作用。SOD在食品工业中主要是作为食品添加剂用于生产口香糖、饮料和啤酒(方允中，李文杰。自由基与酶。科学出版社，1989)。此外，将SOD加入化妆品中，还可起到防晒、防皮肤衰老和脂褐质形成的作用。

目前，SOD的制备来源主要有动物、植物和微生物。目前市场上的SOD产品大部分是从动物血液中提取的。由于原材料有限、纯化困难等原因，导致SOD的纯度低、产量少，特别是随着世界各地疯牛病、禽流感、口啼疫以及由动物传播的SARS等恶性传染病不时报道，生产动物源血液制品的风险加大，此外，对产品纯度要求的增高也增加了生产成本。因此，寻找廉价、高效的外源基因表达***是突破传统制备方法的有效途径之一。

甲醇酵母表达***是近十年发展起来的真核表达体系，和传统的大肠杆菌表达***及第一代酵母表达***一酿酒酵母相比，甲醇酵母具有不可比拟的优势。它不仅具有原核生物生长快速、培养基廉价和技术方案简单可行的特点，同时又具备了典型真核生物的分子生物学特性，如可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰等；此外，它还弥补了原核表达***的一些缺陷，如表达产物多以包涵体形式存在，复性困难，表达效率低(＜20％)，杂蛋白多，纯化困难等。

巴斯德毕赤酵母是甲醇酵母中的一种，迄今为止，已报道有400多种外源蛋白在此体系中成功表达(Cereghino，J L.and cregg J M.Heterologous proteinexpression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.FEMS micrrobiol.

Rev.2001，24，45-66)。与酿酒酵母相比，毕赤酵母具有更强的启动子，因而分泌效率更高，表达质粒更稳定，并可用于高密度发酵(细胞干重＞100g/L)(Romanos MA，Scorer CA，Clare J J.Foreign gene expression in yeast.Yeast，1992，8：423-488)。它可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长，这是因为其细胞的过氧化物酶体中含有甲醇代谢途径所必需的酶，如醇氧化酶，二羟丙酮合成酶和过氧化氢酶等，其中醇氧化酶(AOX)是甲醇利用途径中的第一个酶，它催化甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢。AOX由AOX1和AOX2两个基因编码，AOX2基因与AOX1基因序列相似，有92％的同源性，其编码蛋白有97％的同源性；AOX1基因严格受甲醇诱导和调控，AOX1基因的编码产物在氧化过程中起主要作用。在甲醇培养的细胞中，醇氧化酶可占总蛋白的30％以上，而在以葡萄糖、甘油、乙醇为碳源生长时，则不能检测到AOX的活性。毕赤酵母表达***使用的醇氧化酶基因(AOX1)启动子为强诱导型启动子，可有效地调控外源基因的高效表达；采用整合型载体，可将外源基因整合到酵母染色体上，从而获得遗传稳定的菌株；表达量高，有许多蛋白的表达水平可达每克升以上，如破伤风毒素C片段表达量高达12g/L(Clare JJ，Rayment FB，Ballantine SP，et al.High-lever expession of tananus toxin fragment C in pichia pastorisstrains containing multiple tandem integration of the gene.Bio Technology，1991，9：455-460.)，明胶表达量达到14.8g/L(Mare WT，et al.High-yieldsecretion of recombinant gelations by Pichia pastoris.Yeast，1999，15：1087-1096)。

蜡样芽孢杆菌M22(Bacillus.cereus M22)是一种植物内生细菌，其体内富含SOD酶，对从该菌体内获得的SOD进行理化性质测定发现，其稳定性高于从植物、动物中分离的SOD(苏宁，衣文平，王琦等，蜡质芽胞杆菌超氧化物歧化酶理化性质的研究(中国微生态学杂志。1999，11(1)：7-9)。

发明内容

本发明的目的是提供一种超氧化物歧化酶基因表达的方法及其专用载体。

本发明所提供的表达超氧化物歧化酶基因的专用载体是含有超氧化物歧化酶基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体。

所述超氧化物歧化酶基因位于毕赤酵母表达载体的多克隆位点处EcoR I和Kpn I限制性内切酶酶切位点之间。

所述筛选标志为组氨醇脱氢酶基因(HIS4)的互补筛选标志或Zeocin^R筛选标志，其中Zeocin^R筛选标志是优选的。

所述超氧化物歧化酶基因可为任意一种超氧化物歧化酶基因，优选的是Mn-SOD和CuZn-SOD基因。

PICZαA为最优选的毕赤酵母胞外表达载体，因其具备表达水平高、筛选及纯化快速等特点，并且含有AOX1启动子和终止子序列以及Zeocin抗性基因，可以直接对转化子进行筛选，提高了筛选效率；此外，在其多克隆位点下游，还融合有6×His标签和Myc位点，有助于目的蛋白的纯化和检测。PICZαA质粒的物理图谱如图1所示。

以PICZαA为出发载体构建的含有Mn-SOD基因的毕赤酵母表达载体为pPICZαA-sodM18；含有超氧化物歧化酶基CuZn-SOD基因的毕赤酵母表达载体为pPICZαA-sodC。

本发明所提供的超氧化物歧化酶基因表达的方法，是构建含有超氧化物歧化酶基因的毕赤酵母表达载体，将构建的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中，获得重组毕赤酵母，诱导重组毕赤酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。

为提高转化效率，导入毕赤酵母中的为线性化的毕赤酵母表达载体；将重组毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中的方法优选为电激转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，例如氯化锂转化法、原生质体转化法。

诱导重组毕赤酵母时需加入甲醇，所加入甲醇的浓度为0.4-0.6％。为补偿甲醇的挥发损失，发酵时每24小时还要补加甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在O.4-0.6％。诱导重组毕赤酵母表达的时间为2-6天。

本发明所提供的超氧化物歧化酶基因在毕赤酵母中进行表达的方法弥补了传统SOD制备方法以及原核表达***表达方式的不足；此外，若将本发明应用于工业化SOD的生产，则具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。

附图说明

图1为毕赤酵母分泌型表达载体pPICZαA的物理图谱。

图2为含有超氧化物歧化酶基因的载体构建图。

图2a含有超氧化物歧化酶基因的载体pET-22b-sod的构建图。

图3为Mn-sod2编码区PCR扩增结果。

图5为重组子pPICZαA-sodM18的酶切鉴定。

图7为重组菌株GS115/pPICZαA-sodM18基因组DNA的PCR鉴定结果。

图9为重组菌株GS115/pPICZαA-sodM18表达产物的Native-PAGE分析。

图11为重组菌株GS115/pPICZαA-sodM18表达产物的SDS-PAGE分析。

图13为重组菌株Mn-SOD酶活力测定。

图4为CuZn-sod编码区PCR扩增结果。

图6为重组子pPICZαA-sodC的酶切鉴定。

图8为重组菌株GS115/pPICZαA-sodC基因组DNA的PCR鉴定结果。

图10为重组菌株GS115/pPICZαA-sodC表达产物的Native-PAGE分析。

图12为重组菌株GS115/pPICZαA-sodC表达产物的SDS-PAGE分析。

图14为重组菌株CuZn-SOD酶活力测定。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、Mn-sod2基因在毕赤酵母中的分泌表达

1、含有超氧化物歧化酶基因(Mn-sod2)的载体pPICZαA-sodM18的构建

构建含有超氧化物歧化酶基因的载体pPICZαA-sodM18的过程如图2所示，包括如下步骤：

1)载体pET-22b-sod的构建(构建过程如图2a所示)：根据Mn-sod2序列及表达质粒pPICZαA的适宜酶切位点设计引物，引物序列如下：

上游引物P1：5′--CG GAATTC(EcoRI)ATGTCTTCATTTCAATTGCC--3′

下游引物P2：5′--GTC GGTACC(KpnI)TGTTTTTGTGATTGAATTGC--3′

以蜡样芽孢杆菌M22的基因组DNA为模板，在引物P1和引物P2的引导下，PCR扩增Mn-sod2片断，再用EcoRI和XhoI双酶切该基因片段，最后将其用T₄ DNA连接酶与用同样酶酶切的载体pET-22b连接，得到含有整合有Mn-sod2的质粒载体，将其命名为pET-22b-sod。

2)目的基因Mn-sod2的获得

以步骤1)构建的质粒载体pET-22b-SOD为模板，在引物P1和引物P2的引导下，进行PCR扩增Mn-sod2，并使克隆的Mn-sod2两端分别加上EcoR I和Kpn I识别位点。将PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示(泳道1为DNA分子量标准，泳道2为PCR产物)，在约630bp处有一条清晰条带，与Mn-sod2的大小一致，与预期结果相符，表明扩增得到了正确的Mn-sod2。

3)用限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切载体pPICZαA(Invitrogen公司)。

4)用限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切经PCR扩增获得的Mn-sod2目的基因片断，然后将其与步骤2)用同样酶酶切的载体pPICZαA用T₄ DNA连接酶连接，得到含有Mn-sod2的重组载体，命名为pPICZαA-sodM18。

2、重组质粒pPICZαA-sodM18的酶切鉴定

将重组载体pPICZαA-sodM18用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含25mg/mL Zeocin的低盐LB抗性平板37℃培养12-24小时进行筛选。挑取在上述抗性平板上长出的单菌落接种于5ml含25ml/L Zeocin的液体LB培养基中，37℃培养12-24小时，用碱裂解法提取质粒DNA，进行限制酶酶切鉴定。用EcoRI单酶切及用EcoRI和KpnI双酶切pPICZαA、pPICZαA-sodM18，结果如图5所示(泳道1、5为Marker，泳道2为EcoRI，KpnI/pPICZαA-sodM18，泳道3为EcoRI/pPICZαA-sodM18，泳道4为EcoRI/pPICZαA)，可以看出，泳道3、4均只有1个条带，而泳道2则有2个条带，确定所获得的重组质粒是正确的。

4、将重组载体pPICZαA-sodM18转化毕赤酵母

1)将待转化的质粒线性化

因线性化的质粒更易转化进酵母染色体中，先对重组体质粒进行单酶切，使之线性化。取50μl质粒pPICZA-sodM18用SacI酶切3h。酶切体系为：

              无菌水            适量

              DNA               50μl

              10×buffer        40μl

              SacI              100U

              总体积            100μl

将100μl酶切产物依次用等体积的酚∶氯仿、氯仿抽提，再加入1/10体积的乙酸钠(pH5.2)及2-3倍体积的无水乙醇沉淀，再用70％乙醇洗一次，真空干燥后溶于10μl水中，待用。

2)毕赤酵母感受态细胞的制备

菌株：毕赤酵母GS115

YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose Mediun)固体培养基(g/L)：在850ml去离子水中加入酵母提取物10，胰蛋白胨20，定容至900ml，再加入20g琼脂粉，冷却至低于50℃后加入8磅湿热灭菌的100ml 20％葡萄糖，倒制平板，4℃保存。

YPD液体培养基(g/L)：高压灭菌，冷却后加入8磅湿热灭菌的100ml 20％葡萄糖，4℃保存

(1)挑取YPD平板上的毕赤酵母GS115单菌落于5mlYPD液体培养基中，30℃、300rpm摇床过夜；

(2)将摇床过夜的新鲜GS115菌液按1/1000接种量转接至100mlYPD中，30℃、300rpm摇床过夜，OD₆₀₀约为1.3-1.5时，停止振荡；

(3)将预冷的菌液转移至冰预冷的离心管中，4℃、1500g离心5min，沉淀用100ml预冷的无菌水重悬；

(4)4℃、1500g离心5min，沉淀用50ml预冷的无菌水重悬；

(5)4℃、1500g离心5min，沉淀用4ml预冷的1mol/L山梨醇溶液重悬；

(6)4℃、1500g离心5min，沉淀用200μl预冷的山梨醇溶液重悬，备用。

3)质粒的电击转化

质粒DNA：线性化的质粒载体pPICZαA-sodM18

宿主菌：毕赤酵母GS115感受态细胞

YPDS(Yeast Extract Peptone Dextrose Mediun With Sorbitol)固体培养基(g/L)：

在850ml去离子水中加入酵母提取物10，胰蛋白胨20，山梨醇182.2，琼脂20，定容至900ml，高压灭菌，冷却后加入8磅湿热灭菌的100ml20％葡萄糖，倒制平板，4℃保存。

(1)将80μl毕赤酵母GS115感受态细胞与10μl线性化待转化质粒DNA混合，并将其转至0.2cm电转化杯中；

(2)将装有混合液的转化杯冰浴5min；

(3)调整基因导入仪的参数(电容20μF、电压2000V)，电击一次，时间约为5ms；

(4)立即往转化杯中加入1ml预冷的1mol/L山梨醇溶液，混匀后，将其转至经灭菌的离心管中；

(5)将混合液涂于YPDS板(含100mg/ml Zeocin)上，每个YPDS板上涂150μl-300μl的混合液；

(6)将YPDS板置于30℃培养箱中培养2-3d，直到长出单菌落为止。

5、重组菌株的PCR鉴定

将经SacI单酶切线性化的pPICZαA-sodM18通过电击法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布于YPDS平板(Zeocin终浓度分别为100，300，1000μg/mL)，28℃培养2-4天后，挑取单菌落进行培养，提取基因组DNA，利用特异引物P1和P2进行PCR鉴定。结果如图7所示泳道1为DNA分子量标准，泳道2-5为以GS115/pPICZαA-sod18基因组DNA为模板的PCR产物，泳道6为以GS115/pPICZαA基因组DNA为模板的PCR产物作为阴性对照)，在约630bp处有一条清晰条带，表明特异引物P1和P2能够从阳性重组菌株扩增得到630bp左右的DNA片段与预期结果相符，即与Mn-sod2基因的大小(627bp)相符，说明外源基因已经成功重组到毕赤酵母的基因组染色体上。

6、Mn-sod2基因在毕赤酵母中的诱导表达

YPDS(Yeast Extract Peptone Dextrose Mediun With Sorbitol)固体培养基：在850ml去离子水中加入酵母提取物10，胰蛋白胨20，山梨醇182.2，琼脂20，定容至900ml，高压灭菌，冷却后加入8磅湿热灭菌的100ml 20％葡萄糖，倒制平板，4℃保存。

BMGY(Buferred Glycerol-complex Medium)选择性液体培养基：在650ml去离子水中加入酵母提取物10，胰蛋白胨20，溶解后定容至700ml，高压灭菌，待冷却至50℃以下时，加入经0.22μm过滤除菌的10×YNB100ml，500×B 2ml，10×GY 100ml，1M 100ml，pH 6.0，4℃保存。

500×B(生物素)：将20mg生物素溶解于100ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存，保存期约为一年。

10×YNB(酵母氮碱，含硫酸胺，不含氨基酸)：将134g酵母氮碱(含硫酸胺，不含氨基酸)溶解于1000ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存，保存期约为一年。

10×M(甲醇)：将5ml甲醇加入到950ml去离子水中，混匀后0.22μm过滤除菌，4℃保存，保存期约为2个月。

10×GY(甘油)：将100ml甘油加入到1000ml去离子水中，0.22μm过滤除菌或湿热灭菌，室温保存，保存期约为一年。

1M磷酸盐缓冲液(pH 6.0)：在850ml去离子水中加入1M Na₂HPO₁ 12m，1M NaH₂PO₄88ml。

(1)挑取YPDS(含1000mg/mL Zecion)平板上的单克隆接种于装有10mlBMGY培养基的50ml离心管中，30℃、250-280rpm摇床培养2-3天；

(2)摇床培养2-3天的培养液，4℃，3000g离心15min，取沉淀(尽量将上清除尽)，再往沉淀中加入40ml含有0.5％甲醇的BMMY培养基，在28℃、250-280rpm进行诱导培养；

(3)为补偿甲醇的挥发损失，每24小时补加甲醇，使菌液中的甲醇浓度保持在0.5％。

(4)每隔24h取样，4℃，12000g离心5min，收集上清液，待检测蛋白及酶活力。

(5)诱导4-5天后，停止诱导，4℃，12000g离心5min，收集上清液，待检测蛋白及酶活力。

实施例2、Mn-sod2基因在毕赤酵母中分泌表达的检测

挑取鉴定为阳性的重组菌株GS115/Mn-sod2及转空质粒对照菌株接种BMGY培养基，培养至OD₆₀₀＝2-6，收集菌体后，转接BMMY培养基进行诱导表达。

1、Native-PAGE电泳分析

分别取诱导前、诱导24h、48h、72h的酵母菌液，4℃、12000rpm离心5min，取上清进行Native-PAGE电泳。电泳结果如图9所示(泳道1为转空质粒对照菌株/72h，泳道2为GS115/pPICZαA-sodM18/诱导前，泳道3为GS115/pPICZαA-sodM18/24h，泳道4为GS115/pPICZαA-sodM18/48h，泳道5为GS115/pPICZαA-sodM18/72h)，重组菌株在甲醇诱导之前的Nativ-PAGE凝胶上无活性条带出现，而在甲醇诱导后的Native-PAGE凝胶上显示单一的亮带，且亮度随诱导时间的增加而增强，到72小时表达量最高。

2、SDS-PAGE电泳分析

将诱导前和诱导72h后的菌液上清进行SDS-PAGE，结果如图11所示(泳道1为GS115/pPICZαA-sodM18/诱导前，泳道2为GS115/pPICZαA-sodM18/72h)，在约23kD处有一特异蛋白带，与从氨基酸序列推断出的理论分子量相一致。说明目标Mn-sod2基因在毕赤酵母GS115中实现了分泌表达。

3、NBT法测定SOD酶活性测定

取经甲醇诱导后的菌液，离心后取上清，用NBT光抑制法测定上清液中SOD酶的活性，吸取30μl样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3ml NBT反应液，混匀，在28℃SOD光化反应室中，2×15W日光灯光照20min，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设两个重复，整个测定过程除光化反应外，均在闭光或弱光条件下进行。以抑制NBT光化还原反应速率的50％所需的酶量定为一个酶活力单位。公式如下：

样品酶活力(U/ml)＝(OD_对照-OD_样品)/(1/2OD_对照)×稀释倍数

结果如图13所示，表明整合有Mn-sod2基因的重组毕赤酵母菌株在甲醇诱导前表达的SOD酶的活性较低，约为12U/ml。甲醇诱导后，重组菌株的酶活约为43U/ml，比诱导前提高了大约2.6倍。

实施例3、CuZn-sod基因在毕赤酵母中的分泌表达

1、含有超氧化物歧化酶基因(CuZn-sod)的载体pPICZαA-sodC的构建

构建含有超氧化物歧化酶基因的载体pPICZαA-sodC的过程如图2所示，具体步骤如下：

1)载体pET-22b-sod1的构建：根据CuZn-sod序列及表达质粒pPICZαA的适宜酶切位点设计引物，引物序列如下：

上游引物P3：5′--CGC GAATTC(EcoRI)GGCAGAATATATTTTGGAGGG--3′

下游引物P4：5′--GTC GGTACC(KpnI)TTTTTCTTCATATCCGATGC--3′

以蜡样芽孢杆菌M22的基因组DNA为模板，在引物P3和引物P4的引导下，PCR扩增CuZn-sod片断，再用EcoRI和Kpn I双酶切该基因片段，最后将其用T₄ DNA连接酶与用同样酶酶切的载体pET-22b连接，得到含有整合有CuZn-sod的质粒载体，将其命名为pET-22b-sod1。

2)目的基因CuZn-sod的获得

以实施例1中构建的质粒载体pET-22b-SOD1为模板，在引物P3和引物P4的引导下，进行PCR扩增CuZn-sod，并使克隆的CuZn-sod两端分别加上EcoR I和Kpn I识别位点。将PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示(泳道1为DNA分子量标准，泳道2为PCR产物)，在约540bp处有一条清晰条带，与CuZn-sod基因的大小一致，与预期结果相符，表明扩增得到了正确的CuZn-sod。

3)用限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切载体pPICZαA(Invitrogen公司)。

4)用限制性内切酶EcoR I和Kpn I双酶切经PCR扩增获得的CuZn-sod目的基因片断，然后将其与步骤2)用同样酶酶切的载体pPICZαA用T₄ DNA连接酶连接，得到含有CuZn-sod的重组载体，命名为pPICZαA-sodC。

2、重组质粒pPICZαA-sodC的酶切鉴定

将重组载体pPICZαA-sodC用热击法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含25mg/mL Zeocin的低盐LB抗性平板37℃培养12-24小时进行筛选。挑取在上述抗性平板上长出的单菌落接种于5ml含25ml/L Zeocin的液体LB培养基中，37℃培养12-24小时，用碱裂解法提取质粒DNA，进行限制酶酶切鉴定。用EcoRI单酶切及用EcoRI和KpnI双酶切pPICZαA、pPICZαA-sodC，结果如图6所示(泳道1、5为Marker，泳道2为EcoRI，KpnI/pPICZαA-sodC，泳道3为EcoRI/pPICZαA-sodC，泳道4为EcoRI/pPICZαA)，可以看出，泳道3、4均只有1个条带，而泳道2则有2个条带，确定所获得的重组质粒是正确的。

4、将重组载体pPICZαA-sodC转化毕赤酵母

转化方法同实施例1。

5、重组菌株的PCR鉴定

将经SacI单酶切线性化的pPICZαA-sodC通过电击法转化毕赤酵母GS115感受态细胞，涂布于YPDS平板(Zeocin终浓度分别为100，300，1000μg/mL)，28℃培养2-4天后，挑取单菌落进行培养，提取基因组DNA，并将其为模板，利用特异引物对P3、P4和毕赤酵母的通用引物P5、P6

p5：5′--GACTGGTTCCAATTGACAAGC--3′

p6：5′--GCAAATGGCATTCTGACATCC--3′

进行PCR鉴定。结果如图8所示(泳道M为DNA分子量标准，泳道1为以P3、P4为引物的PCR产物，泳道2为以P5、P6为引物的PCR产物)，在约630bp处有一条清晰条带，表明特异引物P1和P2能够从阳性重组菌株扩增得到630bp左右的DNA片段与预期结果相符，即与CuZn-sod基因的大小(540bp)相符，而通用引物P5和P6可以从重组菌株扩增到1140bp左右的DNA片段，也与预期结果相符，表明外源基因已经成功重组到毕赤酵母的基因组染色体上。

6、CuZn-sod基因在毕赤酵母中的诱导表达

诱导表达的方法同实施例1。

实施例4、CuZn-sod基因在毕赤酵母中分泌表达的检测

挑取鉴定为阳性的重组菌株GS115/CuZn-sod2及转空质粒对照菌株接种BMGY培养基，培养至OD₆₀₀＝2-6，收集菌体后，转接BMMY培养基进行诱导表达。

1、Native-PAGE电泳分析

分别取诱导前、诱导72h的酵母菌液，4℃、12000rpm离心5min，取上清进行Native-PAGE电泳。电泳结果如图10所示(泳道1为GS115/pPICZαA-sodC/诱导前泳道2为GS115/pPICZαA-sodC/72h)，重组菌株在甲醇诱导之前的Nativ-PAGE凝胶上无活性条带出现，而在甲醇诱导后的Native-PAGE凝胶上显示单一的亮带，而在甲醇诱导后的Native-PAGE凝胶上显示出单一的亮带，说明经诱导表达出了有活性的蛋白。

2、SDS-PAGE电泳分析

将诱导前和诱导72h后的菌液上清进行SDS-PAGE，结果如图12所示(泳道1为GS115/pPICZαA-sodC/诱导前，泳道2为GS115/pPICZαA-sodC/72h)，在约23kD处有一特异蛋白带，与从氨基酸序列推断出的理论分子量相一致。说明目标Mn-sod2基因在毕赤酵母GS115中实现了分泌表达。

3、NBT法测定SOD酶活性测定

取经甲醇诱导后的菌液，离心后取上清，用NBT光抑制法测定上清液中SOD酶的活性，吸取30μl样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3ml NBT反应液，混匀，在28℃SOD光化反应室中，2×15W日光灯光照20min，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设两个重复，整个测定过程除光化反应外，均在闭光或弱光条件下进行。以抑制NBT光化还原反应速率的50％所需的酶量定为一个酶活力单位。公式如下：

样品酶活力(U/ml)＝(OD_对照-OD_样品)/(1/2OD_对照)×稀释倍数

结果如图14所示，表明整合有CuZn-sod基因的重组毕赤酵母菌株在甲醇诱导前表达的SOD酶的活性较低，约为15U/ml。甲醇诱导后，重组菌株的酶活约为35U/ml，比诱导前提高了大约1.3倍。

Claims (9)

1、一种表达超氧化物歧化酶基因的载体，含有超氧化物歧化酶基因、AOX1启动子和终止子序列、多克隆位点以及筛选标志的毕赤酵母表达载体。

2、根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述超氧化物歧化酶基因位于毕赤酵母表达载体的多克隆位点处的EcoR I和Kpn I限制性内切酶酶切位点之间。

3、根据权利要求1或2所述的专用载体，其特征在于：所述筛选标志为Zeocin^R筛选标志。

4、根据权利要求1或2或3所述的载体，其特征在于：所述超氧化物歧化酶基因为Mn-SOD或CuZn-SOD基因。

5、根据权利要求4所述的专用载体，其特征在于：所述含有超氧化物歧化酶基Mn-SOD基因的毕赤酵母表达载体为pPICZαA-sodM18；所述含有超氧化物歧化酶基CuZn-SOD基因的毕赤酵母表达载体为pPICZαA-sodC。

6、一种超氧化物歧化酶基因表达的方法，是构建含有超氧化物歧化酶基因的毕赤酵母表达载体，将构建的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中，获得重组毕赤酵母，诱导重组毕赤酵母使超氧化物歧化酶基因得到表达。

7、根据权利要求6所述的超氧化物歧化酶基因表达的方法，其特征在于：所述将构建的毕赤酵母表达载体导入毕赤酵母中的方法为电转化法。

8、根据权利要求7所述的超氧化物歧化酶基因表达的方法，其特征在于：所述诱导重组毕赤酵母表达时加入甲醇，甲醇的浓度保持在0.4-0.6％。

9、根据权利要求7所述的超氧化物歧化酶基因表达的方法，其特征在于：所述诱导重组毕赤酵母表达的时间为2-6天。

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