CN1617742B - 使用肿瘤-衍生的树突细胞抑制因子拮抗剂和Toll类受体激动剂的组合治疗癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

树突细胞(DC)在抗原特异性免疫反应中扮演重要角色。材料和方法被提供用于治疗疾病状态，包括癌症，其通过活化因疾病而对活化刺激表达低反应的宿主的树突细胞。特别地，提供用于治疗哺乳类癌症的方法，其包括对于该哺乳类给予有效量的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂联合有效量的Toll类受体(TLR)激动剂。

Description

使用肿瘤-衍生的树突细胞抑制因子拮抗剂和Toll类受体激动剂的组合治疗癌症的方法
技术领域
本发明涉及在治疗疾病状态，特别是癌症中操作和活化树突细胞(DC)的方法。
现有技术
树突细胞(DC)在启动和调节先天性及适应性免疫反应上扮演重要角色(Banchereau等人，1998，Nature 392：245-252)。关于癌症，树突细胞可取样并呈现肿瘤抗原和激发肿瘤特异性细胞毒性T细胞(Chiodoni等人，1999，J.Exp.Med.190：125-133)。此外，树突细胞可以是在抗肿瘤免疫反应中起作用的细胞因子白细胞介素-12(IL-12)肿瘤坏死因子α(TNFα)，和干扰素α(IFNα)的重要来源。(Banchereau等人，1998，Nature 392：245-252)。因此，近年来，研究者已尝试将DC活性运用在癌症治疗中(参见，例如Mehta-Damani等人，1994，J.Immunology 153：996-1003；Hsu等人，1996，Nature Medicine 2：52；Murphy等人，1996，The Prostate 29：371；Mehta-Damani等人，1994，J.Immunology 153：996-1003；Dallal等人，2000，Curr.Opin.Immunol.12：583-588；Zeid等人，1993，Pathology 25：338；Furihaton等人，1992，61：409；Tsujitani等人，1990，Cancer 66：2012；Gianni等人，1991，Pathol.Res.Pract.187：496；Murphy等人，1993，J.Inv.Dermatol.100：3358)。
为了诱导适当的免疫反应，必需在抗原表达位置补充树突细胞，摄入抗原，并在接收通过病原体正在死亡的细胞和/或T细胞传递的活化信号时迁移至二级淋巴器官。很多研究已提出在人类肿瘤中DC的状态并已报道在肿瘤或在癌症患者中减弱的DC功能(Bell等人，1999，J.Exp.Med.190：1417-1426；Scarpino等人，2000，Am.J.Pathol.156：831-837；Lespagnard等人，1999，Int.J.Cancer 84：309-314；Enk等人，1997，Int.J.Cancer 73：309-316)。此外，在一些研究中观察到活化DC是正向(positive)预后因子(Enk等人，1997，Int.J.Cancer 73：309-316)。因此，提高在肿瘤中的树突细胞活性可能是治疗癌症的有效方法。
肿瘤可通过干扰DC的运行或通过不提供必要的活化信号而逃过免疫***(Vicari等人，2001，Seminars in Cancer Biology，出版中)。尤其，肿瘤似乎不表达可引发DC活化的许多病原体相关性分子模式(Pathogen Associated Molecular Patterns)(PAMPs)(Medzhitov等人，2000，Sem.Immunol.12：185-188)，(Reis等人，2001，Immunity14：495-498)。
近年来，Toll类受体(Toll-like receptor)(TLR)分子已被确认为PAMPs的受体的重要种类。Toll类受体(TLRs)识别微生物病原体特有的分子模式(Aderem等人，2000，Nature 406：782-787)。在人类中已描述十种不同的TLR分子。1999年11月12日公开的专利WO98/50547中公开了TLRs 2-10。值得注意的是，现在公开的命名法包括在人类中十种不同的TLRs，其中九种相当于WO 98/50547的TLR-2至TLR-10，但其编号不吻合(Kadowaki等人，2001，J.Exp.Med.194：863-869)。
微生物分子通过引发TLRs所发出的信号强烈地活化DCs以上升调节共刺激分子(CD80和CD86)(Hertz等人，2001，J.Immunol.166：2444-2450)并产生前炎性(proinflammatory)的细胞因子(TNF-α，IL-6和IL-12)(Thoma-Uszynski等人，2001，J.Immunol.154：3804-3810)。许多研究目前已鉴别出种类广泛的化学多样性(chemically-diverse)细菌产物，这些细菌产物可作为TLR蛋白质的配体，细菌产物包括细菌性脂聚醣(TLR-4)，鞭毛蛋白(TLR-5)，脂磷壁酸(TLR-2)和聚I:C(TLR-3)。更特殊地，TLR-9已显示为免疫刺激性细菌CpG DNA的配体(Hemmi等人，2000，Nature 408：740-745；Wagner，2001，Immunity 14：499-502)。
此外，肿瘤促进抑制DC分化或功能的因子的分泌。一种可在癌症中抑制DC功能的肿瘤相关性因子是IL-10。已报导多种人类原发性肿瘤或恶性肿瘤分泌白细胞介素-10(IL-10)(Chouaib等人，1997，Immunol.Today 18：493-497)。该因子已被描述是DC功能的强调节剂。实际上，IL-10可负向调节IL-12的产生并抑制DC的T-细胞共刺激潜力(co-stimulatory potential)(DeSmedt等人，1997，Eur.J.Immunol.27：1229-1235；Caux等人，1994，Int.Immunol.6：1177-1185)。拮抗DC抑制信号例如IL-10，以增强DC活化和因而产生的宿主对抗癌症的免疫反应的实施仍是未知的。
目前可用的癌症的治疗方法例如外科疗法，放射疗法，化疗法和免疫生物法，均具有有限的成功率或产生严重且不希望的副作用。在许多临床诊断的实体肿瘤中(其中该肿瘤是局部生长)，外科切除被认为是首选治疗方式。然而，常常在手术后和一段时间后，发现原始肿瘤已转移，使得第二部位的癌侵袭已遍布全身且患者随后死于第二次癌症生长。虽然化疗广泛用于癌症的治疗，它是一种通常基于预防细胞增生的***性疗法。因此，化疗是为非特异性治疗形式，其影响所有增生细胞，包括正常细胞，导致不希望的且通常是严重的副作用。
因此，需要新方法以治疗由异常免疫反应而产生的疾病，特别是癌症。特别地，阐明促进肿瘤-浸润的树突细胞活化的因子将允许操作树突细胞以提高肿瘤特异性免疫反应。通过操作树突细胞而调节免疫反应的方法和疗法将可应用于这些疾病的治疗。
发明概述
本发明通过提供用于疾病例如癌症的免疫疗法的材料和方法，通过促进肿瘤-浸润的树突细胞的活化而实现上述需求。已发现联合给予IL-10拮抗剂和TLR-9激动剂是一种有效的癌症疗法。因此，本发明提供治疗癌症的方法，其包含对需要的个体给予有效量的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂与有效量的TLR激动剂联合使用。
在优选实施例中，肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂可是下列任一种已知的抑制树突细胞功能的肿瘤相关因子的拮抗剂：IL-6，VEGF，CTLA-4，OX-40，TGF-β，***素，神经节苷脂，M-CSF和IL-10。较优选，该肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂是IL-10拮抗剂。最优选，该IL-10拮抗剂是IL-10细胞因子的直接拮抗剂或IL-10受体的拮抗剂。在某些具体实施例中，肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂是一种抗体或抗体片段，一种小分子或反义核苷酸序列。最优选，该肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂是一种抗-IL-10受体抗体。
在某些具体实施例中，TLR激动剂是一种小分子，重组蛋白质，抗体或抗体片段，核苷酸序列或蛋白质-核酸序列。在优选具体实施例中，TLR激动剂是TLR-9的激动剂。较优选，该TLR激动剂是免疫刺激性核苷酸序列。仍较优选，该免疫刺激性核苷酸序列含有一个CpG基序。最优选，该免疫刺激性核苷酸序列选自：CpG 2006(表2和SEQID NO：1)；CpG 2216(表2和SEQ ID NO：2)；AAC-30(表2和SEQ IDNO：3)；和GAC-30(表2和SEQ ID NO：4)。该免疫刺激性核苷酸序列可通过构造修饰例如硫代磷酸酯(phosphorotioate)修饰被稳定或可装入阳离子微脂体胶囊中以改善活体内药物动力学和肿瘤导向。
在某些具体实施例中，肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或TLR激动剂是静脉内、肿瘤内、皮内、肌内、皮下或局部给予。
在一些具体实施例中，肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂是以融合蛋白质或其它彼此连结的形式给予。
本发明方法可进一步包含给予至少一种肿瘤相关性抗原。该肿瘤抗原可以融合蛋白质的形式传送或可连结TLR激动剂和/或肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂。
在本发明另一方面中，还给予活化剂，例如TNF-α，IFN-α，RANK-L或RANK激动剂，CD40-L或CD40的激动剂，41BBL或41BB的激动剂或其它TNF/CD40受体家族成员的其它推测的配体/激动剂。
在本发明的另一方面中，细胞因子是在之前或同时与肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或TLR激动剂联合给予。在一个优选方面中，细胞因子是GM-CSF或G-CSF或FLT-3L，其可作为重组蛋白质或重组融合蛋白质或传送载体。给予这些因子刺激某些DC的亚组由前体生成，因而增加由肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂组合活化的肿瘤-浸润的树突细胞数目。
本发明的另一方面中，选用的趋化因子是在之前或同时与肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或TLR激动剂一起给予。在一优选方面中，趋化因子选自CCL13，CCL16，CCL7，CCL19，CCL20，CCL21，CXCL9，CXCL10，CXCL11，CXCL12，其可作为重组蛋白质或重组融合蛋白质或传送载体。在一最佳方面，趋化因子是在肿瘤内注射后直接，或经由导向构建物(targeting construct)，例如重组抗体，或经由胶囊化，在特别可有利地传送至肿瘤内的媒介物传送至肿瘤。给予趋化因子可促进某些DC亚组(subset)补充至肿瘤内，因而增加由肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂组合活化的肿瘤-浸润的树突细胞数目。
附图简要说明
图1显示与骨髓-衍生的树突细胞相比较，C26-6CK肿瘤-浸润的树突细胞对LPS+抗-CD40+IFNγ组合无反应。图1A表示通过FACS分析MHCII类，CD40和CD86的表面表达的结果(门控(gated)在CD11c阳性细胞)。图1B表示通过CD11c+细胞在20小时，包括与BrefeldinA温育2.5小时后的IL-12p40的细胞内表达。图1C表示混合的白血球反应。图1D中，以LPS+IFNγ+抗-CD40活化后通过特异性ELISA在培养上清液中测定IL-12p70。
图2.CpG 1668+抗-IL-10R组合复原了在C26-6CK肿瘤-浸润的树突细胞内的IL-12和TNFα。使用抗-CD11c磁珠富集来自C26-6CK的TIDC并在GM-CSF和各种组合的LPS、IFNγ、抗-CD40、抗-IL 10R和CpG 1668存在下培养过夜。通过特异性ELISA在培养上清液中测定IL-12p70和TNFα水平。
图3.CpG 1668+抗-IL-10R组合复原了的DC浸润的C26-6CK肿瘤的MLR刺激能力。使用抗-CD11c磁珠富集来自C26-6CK的TIDC并在GM-CSF和各种组合的LPS、IFN-γ、抗CD40、抗-IL 10R和CpG 1668存在下培养过夜。再将细胞照射并以不同数目在固定数目的富集的同种异体的T细胞(3x 105T细胞)存在下培养5天。通过在培养的最后18小时期间引入放射性胸苷测定其增殖。
图4来自亲代C26肿瘤的肿瘤-浸润的树突细胞和来自不同组织学起源的肿瘤对于LPS+IFNγ+抗-CD40组合无反应，但对CpG 1668+抗-IL-10R反应生成IL-12。将来自指定肿瘤的TIDC以抗-CD11c磁珠富集并在GM-CSF、LPS+IFNγ+抗-CD40或抗-IL-10R+CpG 1668存在下培养过夜。图4表示培养的细胞经20小时，包括与Brefeldin A温育2.5小时后的IL-12p40的细胞内表达和CD11c的表面表达。
图5表示C26-6CK肿瘤模型中的CpG 1668+抗-IL10R抗体的疗效。将7周大的雌BALB/c小鼠的组皮下注射5x104个C26-6CK细胞并以每周两次腹膜内注射250微克纯化的抗-IL10R抗体和每周一次在肿瘤内注射10微克CpG 1668的组合处理，在肿瘤接种第7天开始治疗三周。
图6表示C26肿瘤模型中的CpG 1668+抗-IL10R抗体的疗效。将7周大的雌BALB/c小鼠的组皮下注射5x104个C26细胞并以每周一次腹膜内注射250微克纯化的抗-IL10R抗体和在肿瘤内注射5微克CpG1668的组合处理，在肿瘤接种第7天开始治疗三周。
图7表示B1F0黑色素瘤肿瘤模型中的CpG 1668+抗-IL10R抗体的疗效。将7周大的雌C57BL/6小鼠的组皮下注射5x104个B16F0细胞并以每周一次腹膜内注射250微克纯化的抗-IL10R抗体和在肿瘤内注射5微克CpG 1668的组合处理，在肿瘤接种第7天开始治疗三周。
图8表示另一种IL-10拮抗剂，单克隆抗-IL10抗体，其与TLR-9激动剂CpG 1668组合，可诱导DC浸润的C26-6CK肿瘤的IL-12的生成。使用抗-CD11c磁珠富集来自C26-6CK的TIDC并在GM-CSF或抗-IL 10R+CpG 1668或抗-IL 10+CpG 1668存在下培养过夜。图8表示培养的细胞经20小时，包括与Brefeldin A温育2.5小时后的IL-12p40的细胞内表达和CD11c的表面表达。
图9表示另一种肿瘤-衍生的DC抑制因子，PGE2，其可被拮抗以使DC活化。在含有(吲哚美辛处理的)PGE2的肿瘤上清液存在或缺乏下培养骨髓-衍生的DC。不同DC经LPS、IFNγ和抗-CD40抗体的组合在抗-IL10R抗体存在或缺乏下活化后，测定其成熟标记物的表达和IL-12的产生。
图10表示C26-6CK结肠癌肿瘤模型中的CpG 1668+吲哚美辛的疗效。将8周大的雌BALB/c小鼠的组皮下注射5x104个C26-6CK细胞并以每周一次在肿瘤内注射5微克CpG 1668，在肿瘤接种第7天开始三周，和/或自第5至第28天给予吲哚美辛5微克/毫升在饮水中的组合处理治疗的。
发明的详细说明
本文中所列的参考文献均全文引入作为参考。
本发明是部分基于惊奇发现联合给予肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂与TLR激动剂在数种活体内肿瘤发展的模型中，包括C26-6CK，C26和B16F0具有强疗效活性。现已发现IL-10拮抗剂和TLR-9激动剂的联合给予可使肿瘤-浸润的树突细胞要么不反应，要么(refractory)产生IL-12和TNFα并诱导改善的肿瘤抗原特异性免疫反应。此外，现已发现对带有肿瘤的动物给予IL-10拮抗剂和TLR-9激动剂可诱导对肿瘤的排斥。
许多报告已提出肿瘤内部DC的活化状态。在其中-篇报告中，经转导以表达GM-CSF和CD40L的老鼠C26结肠癌肿瘤可被具有成熟表型的DC重度渗透，且一部分肿瘤在开始生长后退化(Chiodoni等人，1999，J.Exp.Med.190：125-133)。相同的C26细胞经改造以表达6Ckine被未成熟的DC渗透(Vicari等人，2000，J.Immunol.165：1992-2000)。因为DC的活化和随后的成熟对于免疫反应启动是关键步骤，所以认为C26-6CK肿瘤-浸润的树突细胞的活化可导致对肿瘤的排斥。出乎意料地，已发现那些肿瘤-浸润的DC无法对通过CD40的抗-CD40激动剂抗体的刺激作用进行反应，此分析用作读出共同刺激分子的上升调节，在混合白血球反应中刺激T细胞的能力和生成IL-12和TNFα的能力。它们对于细菌刺激的LPS-一种TLR-4的配体，对于细胞因子IFNγ或对于LPS、IFNγ和抗-CD40抗体的任何组合均无反应。
因此，本发明人假设肿瘤-衍生的因子可在考虑使用它们的特定刺激时诱导肿瘤-浸润的DC的不应状态。因此对可抑制此不应状态的因子的阐述可导致有效的癌症治疗。考虑到关于由许多人类肿瘤分泌的DC抑制信号--IL-10的报告(Chouaib等人，1997，Immunol.Today18：493-497；De Smedt等人，1997，Eur.J.Immuno l.27：1229-1235；Caux等人，1994，Int.Immunol.6：1177-1185)，本发明人测试拮抗IL-10是否可改善DC活化并进而增强宿主抗癌症的免疫反应。然而，结果发现以抗体阻断IL-10受体(抗-IL 10R)治疗小鼠对于C26结肠癌肿瘤或其C26-6CK变体的发展效果较小(后者是如Vicari等人，2000，J.Immunol.165：1992-2000说明经改造以表达趋化因子CCL21/SLC/6Ckine：(参见实施例IV和图5))。实际上，如实施例II和III显示，抗-IL 10R抗体与LPS+IFNγ+抗-CD40对于肿瘤-浸润的DC的活化无效或效果很小。
接着，本发明人假设其它活化信号，特别是经由异于TLR-4的通行Toll类家族的病原体相关性分子模式受体介导的信号，可在肿瘤-浸润的树突细胞中运作。尤其，他们研究了CpG 1668，一种TLR-9的配体在老鼠中的作用(Hemmi等人，2000，Nature 408：740-745)。然而，他们观察到CpG 1668在活化肿瘤-浸润的树突细胞(实施例II和III)或小鼠内建立的皮下肿瘤(实施例V至VII)的治疗中具有微小效果。
然而，明显对比下，本发明人惊喜发现联合使用CpG 1668与抗-IL10R诱导通过C26-6CK肿瘤-浸润的DC生成IL-12p70和TNFα并大幅提高那些DC在MLR中的刺激能力(参见实施例II和III)。接着，联合使用CpG 1668加抗-IL10R抗体在带有C26-6CK肿瘤的小鼠中显示显著的抗肿瘤效果(实施例V)。此外，联合使用CpG 1668和抗-IL10R抗体而不联合使用LPS+IFNγ+抗-CD40抗体同样可在来自亲代C26肿瘤和来自其它病史起源的肿瘤：B16黑色素瘤和LL2肺癌的肿瘤-浸润的DC中诱导IL-12生成(参见实施例IV)。联合使用CpG 1668加抗-IL10R也在C26和B16F0肿瘤模型中显示抗肿瘤活性(实施例VI和VII)。
本发明因此提供在哺乳类中通过肿瘤-浸润的树突细胞的活化治疗癌症的方法，其包含对该哺乳类给予有效量的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂联合有效量的TLR激动剂。
本文中定义″肿瘤-衍生的树突细胞(DC)抑制因子拮抗剂″是一种试剂，其在结合性或功能性分析中显示可阻断肿瘤细胞分泌并已知抑制树突细胞功能的试剂的作用。
本文中定义″TLR激动剂″是任何活化Toll类受体(″TLR″)的分子，如Bauer等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9237-9242中所描述的。在一特别优选的具体实施例中，TLR激动剂是TLR9激动剂，例如Hemmi等人，2000，Nature 408：740-745和Bauer等人，2001，Proc.Natl.Aca d.Sci.USA 98：9237-9242中所描述的。
1.肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂
术语″肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂″包括任何阻断在肿瘤-浸润的DC中诱导不应状态的肿瘤-衍生的因子的作用的试剂。这些肿瘤-衍生的因子的实例包括，但不限于IL-6、VEGF、CTLA-4、OX-40、TGF-β、***素、神经节糖苷、M-CSF和IL-10(Chouaib等人，1997，Immunol.Today 18：493-497)。
肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂可通过分析其在活化刺激物存在下对于肿瘤树突细胞的影响来辨别。在有效量的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂存在时，肿瘤-树突细胞可进行熟化过程，可随后测定细胞因子，例如IL-12、TNFα、IFNα的生成，或典型由成熟的树突细胞，表达的分子的表达例如CD80、CD86、CD83和DC-Lamp。或者，肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂的效果可在分析非分离自肿瘤，在被发表的抑制树突细胞成熟的肿瘤来源的纯化或未纯化因子存在下活化的人类树突细胞的活化时观察。
肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂可作用于DC抑制因子本身，例如抗-IL-10单克隆抗体可阻断IL-10的作用，或通过其它可防止DC抑制因子具有其对肿瘤-浸润的DC的正常效用的方式，例如抗-IL-10R单克隆抗体可防止IL-10通过其在DC上的受体而发出信号。
肿瘤-衍生的DC抑制因子的拮抗剂可衍生自抗体或含有抗体片断。此外，在结合或功能性分析中显现抑制受体活化的任何小分子拮抗剂、反义核苷酸序列、包含在基因传送载体例如腺病毒或逆转录病毒载体的核苷酸序列均符合此定义。本领域中已熟知如何筛选特异性结合给定靶例如肿瘤相关性分子如受体的小分子。参见例如高流量筛选会议，国际商业通讯，Southborough，MA 01772-1749。同样地，可使用缺乏膜穿透功能区域的可溶型受体。最后，可使用肿瘤-衍生的DC抑制因子的突变拮抗剂，其可强力结合相对应受体，但实质缺乏生物活性。
在本发明的特别优选具体实施例中，该肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂是IL-10拮抗剂。术语″IL-10拮抗剂″包括抑制IL-10活性的IL-10本身的拮抗剂和IL-10受体的拮抗剂。可用于本发明的IL-10拮抗剂的实例包括，但不限于那些说明在美国专利5,231,012，1993年7月27日申请(针对IL-10和IL-10拮抗剂)和美国专利5,863,796，1999年1月26日申请者(针对IL-10受体和IL-10受体拮抗剂)，它们均引入本文作为参考。
2.TLR激动剂
数种衍生自微生物的TLR激动剂已有所描述，例如脂聚多醣、肽聚醣、鞭毛蛋白和脂磷壁酸(Aderem等人，2000，Nature 406：782-787；Akira等人，2001，Nat.Immunol.2：675-680)。部分的这些配体可活化可表达不同模式TLRs的不同树突细胞亚组(Kadowaki等人，2001，J.Exp.Med.194：863-869)。因此，TLR激动剂可为具有TLR激动剂性质的任一种微生物制剂。例如，青霉素杀灭的链球菌试剂OK-432含有脂磷壁酸，其可通过TLR结合诱导Th1细胞因子的生成(Okamoto等人，2000，Immunopharmacology 49：363-376)。表1列出数种已知TLR配体：
表1
已知的TLR配体
Figure B028275985D00101
LTA：脂磷壁酸
LPS：脂聚醣
PG：肽聚醣
某些类型的未翻译DNA已显示通过活化TLRs来刺激免疫反应。特别地，含CpG基序的免疫刺激性寡核苷酸已被广泛公开及发表活化淋巴细胞(参见美国专利6,194,388)。本文所使用的″CpG基序″定义为未甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)双核苷酸。含CpG基序的免疫刺激性寡核苷酸也可根据本发明方法作为TLR激动剂使用。
许多免疫刺激性寡核苷酸序列已在本领域中有所描述并可利用可指明各方面的免疫反应，例如细胞因子分泌、抗体生成、NK细胞活化和T细胞增殖的标准分析辨别。参见例如美国专利6,194,388和6,207,646；WO 98/52962；WO 98/55495；WO 97/28259；WO 99/11275；Krieg等人，1995，Nature 374：546-549；Yamamoto等人，1992J.Immunol.148：4072-4076；Ballas等人，1996，J.Immunol.157(5)1840-1845；Klinman等人，1997，PNAS 93(7)：2879-83；Shimada等人，1986，Jpn.J.Cancer Res.77：808-816；Cowdery等人，1996，J.Immunol.156：4570-75；Hartmann等人，2000，J.Immunol.164(3)：1617-24。
免疫刺激性核苷酸序列可以是大于6个碱基或碱基对的任意长度。免疫刺激性核苷酸序列可包含修饰，例如3′OH或5′OH基的修饰，核苷酸碱基的修饰，糖成份的修饰和磷酸酯环的修饰。免疫刺激性核苷酸序列可以是单链或双链标准DNA，以及单链或双链标准RNA或其它修饰的聚核苷酸。免疫刺激性核苷酸序列可包括或不包括一个或多个回文区域。
免疫刺激性核苷酸序列可使用常用的聚核苷酸分离步骤进行分离，或可使用本领域中已熟知的技术和核酸合成设备合成，其包括但不限于酶促法、化学法和较大寡核苷酸序列的降解。(参见，例如Ausubel等人，1987和Sambrook等人，1989)。
可使用在本发明方法中的免疫刺激性核苷酸序列的实例包括但不限于那些公开在美国专利6,218,371；美国专利6,194,388；美国专利6,207,646；美国专利6,239,116和PCT WO 00/06588(洛瓦(lowa)大学)；PCT WO 01/62909；PCT WO 01/62910；PCT WO 01/12223；PCT WO 98/55495；和PCT WO 99/62923(Dynavax Technologies Corporation)，均引入本文作为参考。
特别地，美国专利6,194,388(洛瓦大学)公开免疫刺激核酸，其包含寡核苷酸序列，其至少包括下式：
5′X1X2CGX3X43′
其中C和G是未甲基化的，其中X1X2选自GpT、GpG、GpA、ApA、ApT、ApG、CpT、CpA、CpG、TpA、TpT和TpG的双核苷酸，且X3X4选自TpT、CpT、ApT、TpG、ApG、CpG、TpC、ApC、CpC、TpA、ApA和CpA的双核苷酸且其中至少一个核苷酸具有磷酸酯骨架修饰。为了促进细胞摄入，已公开的优选含CpG的免疫刺激性寡核苷酸大小范围为8至40个碱基对。符合此式的免疫刺激性寡核苷酸可使用在本申请要求保护的方法中。
WO 99/62923公开可与本发明联合使用的免疫刺激性核苷酸序列的其它实例。特别地，修饰的免疫刺激性核苷酸序列包含六聚序列或六核苷酸，其含有中心CG序列，其中公开该C残基通过加入具有吸电子(electron-withdrawing)部分的C-5和/或C-6进行修饰。
免疫刺激性寡核苷酸可通过构造修饰来稳定，其可使它们相对性抗活体内降解。稳定化修饰的实例包括硫代磷酸酯修饰(即将至少一个磷酸酯氧以硫取代)、非离子性DNA类似物，例如烷基-或芳基-膦酸酯(其中带电的膦酸酯氧以烷基或芳基取代)、磷酸双酯和烷基磷酸三酯，其中该带电性氧部分是经烷基化的。在一端或两端含有二醇，例如四乙二醇或六乙二醇的寡核苷酸也显示出基本抗核酸酶降解(参见美国专利6,194,388(洛瓦大学))。
免疫刺激性核苷酸序列也可包埋或结合于传送复合物内，其可造成对靶细胞表面的更高亲和力和/或提高靶细胞的细胞性摄入。免疫刺激性核苷酸序列传送复合物的实例包括连接于固醇(例如胆固醇)、脂质(例如阳离子性脂质、病毒体或微脂体)，或靶细胞特异性结合剂(例如可由靶细胞特定受体辨识的配体)。优选的复合物必需在活体内足够稳定以防止在靶细胞内化前显著解偶(uncoupling)。然而，该复合物应可在适当的细胞内条件下切割以使寡核苷酸以具有功能性的形式释放(美国专利6,194,388；WO 99/62923)。
在一特别优选的具体实施例中，TLR激动剂是TLR9的激动剂，例如在Hemmi等人，2000，Nature408：740-745和Bauer等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9237-9242所描述的。目前已知的TLR-9配体是含CpG基序的未甲基化寡核苷酸序列，例如老鼠中的CpG 1668(TCCATGACGTTCCTGATGCT)(SEQ ID NO：5)和人类中的CpG2006(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT)(SEQ ID NO：1)(Bauer等人，2001，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：9237-9242)。表2列出优选的TLR9激动剂：
表2
Figure B028275985D00131
除上述提到的以外，利用TLRs或其片段进行配体筛选可以辨别其它分子，包括对受体具有结合亲和力的小分子。参见例如高流量筛选会议，国际商业通讯，Southborough，MA 01772-1749。随后的生物分析可再用于测定推测的激动剂是否可提供活性。如果化合物具有内在的刺激活性，则其可活化受体且其因此刺激配体活性，例如诱导发出信号的激动剂。
本文所使用的TLR激动剂的″有效量″是引发所希望的生物效应的量。特别地，有效量是与有效量的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂联合使用时，足以触发肿瘤-浸润的DC活化的量。
″有效量″的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂是可引发所希望的生物效应的量。特别地，有效量是与有效量的TLR激动剂联合使用时，足以触发肿瘤-浸润的DC活化的量。
″联合″给予是指同时和先后给予。肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂可传送或给予在同一位置或不同位置且可同时或延迟不超过48小时后给予。本文所使用的同时或联合给予是指将肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或TLR激动剂和/或抗原在一般治疗计划疗程期间内的(a)同时，或(b)不同时间给予个体。在后者的情况，两化合物是在足够接近以达所希望的效果的时间内给予。
用以实施本发明的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或TLR激动剂可以是具有与天然产物相同的氨基酸序列的重组蛋白质，或是重组蛋白质，其衍生自天然产物但含有改变其药物动力学特性的修饰和/或增加新型生物特性但却保留其原始DC活化或抗肿瘤特性。
传送肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或TLR激动剂的模式可通过注射，包括静脉内、肿瘤内、皮肤内、肌内、皮下或局部。
在本发明的特别优选具体实施例中，一种或多种肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂是与肿瘤相关性抗原联合给予。可使用在本发明中的肿瘤相关性抗原包括，但不限于Melan-A，酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-12、MART-1、MUC1、MUC2、MUC 3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、黑色素瘤抗原gp75、HKer 8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1和Tyr2、pMe1 17基因家族成员、c-Met、PSA、PSM、α-胎儿蛋白(fetoprotein)、甲状腺过氧化酶(thyroperoxidase)、gp100、NY-ESO-1、端粒酶和p53。此处并非排他性列举，其仅为可使用以实施本发明的抗原型式的示例。
其它异于肿瘤相关性抗原的抗原可与肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂一起给予以提高对抗这些抗原的特异性免疫反应。这些抗原包括但不限于细菌、病毒、真菌、寄生虫表达的原态或修饰的分子。抗原也可包括变应原和自身抗原，且这种状况下，肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂的组合将与抗原一同给予以使免疫反应再度朝向较适合的结果，例如将Th2型免疫反应转形至Th1型免疫反应中。
可使用显示对不同族群、性别、地理分布和疾病阶段具有最佳功能的不同组合的抗原。在本发明的具体实施例中，至少二或更多种不同抗原与肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂组合一同给予。
肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或TLR激动剂的给予可彼此和/或与抗原联合使用或可以各种方式彼此或与抗原连结(参见例如WO98/16247；WO 98/55495；WO 99/62823)。例如TLR激动剂和/或肿瘤-衍生的DC抑制因子和/或抗原的给予可为空间性彼此相近，或为混合物(即：在溶液中)。连结的达成可通过许多方法，包括接合(conjugation)、衣壳化、经由附加至平台或吸附在表面。
要将TLR激动剂接合至肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或抗体，可使用多种方法。其结合可通过共价相互作用和/或通过非共价相互作用，包括高亲和力和/或低亲和力相互作用。可偶合TLR激动剂与肿瘤-衍生的DC抑制因子的非共价相互作用的实例包括但不限于：离子键、疏水性相互作用、氢键和范德华力。当肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂是一种蛋白质或抗体且TLR激动剂是一种免疫刺激性聚核苷酸时，例如可利用本领域中已熟知的方法将接合的肽部分通过固态载体相互作用连接于免疫刺激性聚核苷酸的3′端(参见例如Haralambidis等人，1990a，Nucleic Acids Res.18：493-499和Haralambidis等人，1990b，Nucleic Acids Res.18：501-505)。或者，***具有潜在反应功能性的″连接臂″，例如在胞嘧啶碱基的C-5处的胺或羧基提供肽连接的柄(handle)(Ruth，4th Annual Congress for Recombinant DNA Research，p.123)。免疫刺激性聚核苷酸至肽的连接也可通过高亲和力，非共价性相互作用形成，例如生物素-链霉抗生物素蛋白复合物。生物素基团可连接至例如寡核苷酸的修饰的碱基(Roget等人，Nucleic Acids Res.(1989)17：7643-7651)。将链霉抗生物素蛋白部分引入肽部分可生成链霉抗生物素蛋白接合的肽和生物素化聚核苷酸的非共价键复合物。
设计以进一步活化或刺激DC成熟化的部分可有利地给予。这些试剂的实例为TNF-α，IFN-α，RANK-L或RANK的激动剂，CD40-L或CD40的激动剂。这些活化剂可提供额外的成熟化信号，其可与TLR激动剂共同参与i)加速来自组织的DC经由引流淋巴(draining lymph)迁移至淋巴样器官，和ii)活化DC以分泌提高免疫反应-特别是抗肿瘤反应的分子-例如IL-12和IFNα(Banchereau等人，1998，Nature392：245-252)。
在本发明方法中，GM-CSF，G-CSF或FLT3-L也可有利地给予。给予GM-CSF，G-CSF或FLT3-L的目的可以是提高循环的DC的数目，其可再局部的在肿瘤内局部补充。此方案暗示一种使用GM-CSF，G-CSF或FLT3-L至少五至七天的***性预治疗。或者局部给予GM-CSF，G-CSF或FLT3-L以助于局部DC前体(单核细胞，DC的类浆细胞前体(plasmacytoid precursors)细胞分化为DC细胞，其可再拾起传送至相同位置的抗原。
此外，趋化因子或多重趋化因子的组合可有利地与本发明的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂联合给予。已知具有利作用的趋化因子包括CCL21、CCL3、CCL20、CCL16、CCL5、CCL25、CXCL12、CCL7、CCL8、CCL2、CCL13、CXCL9、CXCL10、CXCL11(参见例如Sozzani等人，1995，J.Immunol.155：3292-3295；Sozzani等人，1997，J.Immunol.159：1993-2000；Xu等人，1996，J.Leukoc.Biol.60：365-371；MacPherson等人，1995，J.Immunol.154：1317-1322；Roake等人，1995，J.Exp.Med 181：2237-2247和欧洲专利申请案EP 0974357A1，1998年7月16日申请且2000年1月26日公开)。一般而言，肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂、TLR激动剂和/或活化剂和/或细胞因子是以在医药载体中包含有效量的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂和/或抗原和/或活化剂和/或细胞因子的医药组合物给予。这些试剂可联合其它活性或惰性成份用于治疗用途，例如在常用的医药上可接受的载体或稀释剂，例如免疫原性辅剂，伴随生理无害性稳定剂和赋形剂。医药载体可为任何适于传送本发明组合物至患者的相容的、无毒性物质。
细胞因子和/或趋化因子可任选地使用包含趋化因子或细胞因子或其生物活性片段或变体和导向部分(targeting moiety)的导向构建物(targeting construct)传送至肿瘤。本文所使用的″导向部分″是指辨识或靶定肿瘤相关性抗原或由肿瘤的非癌性成份特异性表达的构造，例如肿瘤血管的部分。导向部分的实例包括但不限于肽、蛋白质、小分子、载体、抗体或抗体片段，这些实例辨识或靶定肿瘤相关性抗原或由肿瘤的非癌性成份特异性表达的构造。在优选具体实施例中，该导向部分是肽、蛋白质、小分子、载体，例如病毒载体、抗体或抗体片段。在更优选具体实施例中，该导向部分是抗体或抗体片段。在最优选具体实施例中，导向载体是ScFv片段。
导向部分可特异于肿瘤细胞表达的抗原，正如在人类中描述的，例如叶酸盐受体(Melani等人，1998，Cancer Res.58：4146-4154)，Her2/neu受体，表皮生长因子受体和CA125肿瘤抗原(Glennie等人，2000，Immunol.Today 21：403-410)。其它数种肿瘤抗原可作为靶且可由肿瘤的恶性细胞优选表达、独特表达、过度表达或表达为突变形式(Boon等人，1997，Curr.Opin.Immunol.9：681-683)。其可包括Melan-A、酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-12、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、黑色素瘤抗原gp75、HKer8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1和Tyr2、pMel 17基因家族成员、c-Met、PSA、PSM、α-胎儿蛋白、甲状腺过氧化酶、gp100、类胰岛素生长因子受体(IGF-R)、端粒酶和p53。此处并非排他性地列举，其仅为可使用于实施本发明的抗原型式的示例。或者，导向部分可以是非恶性细胞的肿瘤成分特别是肿瘤血管所优先表达的抗原特异的。αv整联蛋白家族、VEGF受体和蛋白聚醣NG2是这些肿瘤血管相关性抗原的实例(Pasqualini等人，1997，Nat.Biotechnol.15：542-546)。
原发和转移癌均可根据本发明治疗。可治疗的癌类型包括但不限于：黑色素瘤，胸、胰、结肠、肺、神经胶质瘤、肝细胞性、子宫内膜、胃部、肠、肾、***、甲状腺、卵巢、睾丸、肝、头和颈、结肠直肠、食道、胃、眼、膀胱、成胶质细胞瘤和转移癌。术语″癌″是指恶性的上皮或内分泌组织，包括呼吸***癌、胃肠***癌、泌尿生殖***癌、***癌、内分泌***癌和黑色素瘤。本文所使用的转移的定义为肿瘤散布至远离区***的位置。
有效治疗所需的试剂量根据许多不同因素而定，包括给予方式、靶定位置、患者的生理状态和所给予的其它药物。因此，治疗剂量可调整至最佳安全性和功效。针对特定癌症的有效治疗剂量的动物试验可供作人类剂量的进一步预测指标。各种考虑例如Gilman等人(编著)(1990)Goodman和Gilman的：The Pha rmacological Bases of Therapeutics，第八版，Pergamon Press；和Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版(1990)，Mack Publishing Co.Easton，PA中有所描述。给予方法在其中和下文有所讨论，例如针对静脉内、腹膜内或肌内给予，经皮肤扩散和其它。医药上可接受的载体可包括水、生理盐水、缓冲液和其它化合物，例如Merck Index，Merck&Co.，Rahway，New Jersey中描述的。缓慢释放配方或缓慢释放装置可用于连续给予。
肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和/或TLR激动剂的剂量范围根据激动剂/拮抗剂的形式而定。例如，IL-10受体抗体的有效剂量典型范围为约0.05至约25微克/公斤/天，优选为约0.1至约20微克/公斤/天，最优选为约1至约10微克/公斤/天。至于免疫原性组合物，例如TLR激动剂，其用量可基于TLR激动剂的形式、个体、待治疗病症和其它本领域技术人员显而易见的因素而改变。需考虑的因素包括抗原性、该TLR激动剂是否复合或共价性连接于辅剂或传送分子、给予途径和待给予的免疫剂量数目。这些因素是本领域已知的。适当的剂量范围是提供所希望的树突细胞活化的量。一般而言，免疫刺激性寡核苷酸的剂量范围可例如是约下列任一剂量：01.至100微克，01.至50微克，01.至25微克，01.至10微克，1至500微克，100至400微克，200至300微克，1至100微克，100至200微克，300至400微克，400至500微克。或者，剂量可以是约下列任一剂量：0.1微克，0.25微克，0.5微克，1.0微克，2.0微克，5.0微克，10微克，25微克，50微克，75微克，100微克。因此，剂量范围可以是那些下限为约下列任一剂量：0.1微克，0.25微克，0.5微克和1.0微克；和上限是约下列任一剂量：25微克，50微克和100微克。在此组合物中，含ISS聚核苷酸与抗原的摩尔浓度比可变化。给予各患者的绝对量根据药理性质，例如生物利用性、清除速率和给予途径而定。
一般而言，治疗由低于化合物最佳剂量的较小剂量开始。其后，少量提高剂量直至达到环境中的最佳效果为止。适当剂量的确定和特定情况中的给予方法是在本领域的技术范围内。
通过载体方式给予的肿瘤-衍生的DC抑制因子拮抗剂和TLR激动剂的剂量可主要依据所使用的特定载体的效率和患者的病情以及受治疗患者的体重或表面积而定。剂量大小也可通过伴随特定载体的给予的任何不良副作用的存在、特性和程度，或在特定患者内的转导细胞类型决定的。在决定治疗中给予的有效量载体时，医师需评估载体的循环性血浆水平、载体毒性、疾病的进展，和抗载体抗体的生成。核酸的典型剂量主要根据给予途径和基因传送***而定。根据传送方法，剂量的范围可大概为约1微克至100毫克或以上。一般对于典型的70公斤患者，来自载体的净核酸剂量当量为约1微克至100微克，且包含病毒粒子的载体的剂量也加以计算以得到治疗性核酸的当量。
在要求保护的本发明的方法的实施中的GM-CSF、G-CSF或FLT-L的优选生物活性剂量是可诱导循环的CD14+/CD13+前体细胞数目的最大量增加；在DC前体和成熟DC表面的抗原呈现(presenting)分子的表达；对T细胞的抗原呈现活性；和/或刺激抗原依赖性T细胞反应连同成熟DC功能的剂量组合。皮下给予所使用的GM-CSF量的典型范围为约0.25微克/公斤/天至约10.0微克/公斤/天，优选为约1.0-8.0微克/公斤/天，最优选为2.5-5.0微克/公斤/天。对于特定患者的有效量可通过测定一种或多种上述指明的参数的显著变化而确立。
实施例
本发明可通过下列非限制性实施例的方式说明。
实施例1
与骨髓-衍生的树突细胞相比较，C26-6CK肿瘤-浸润的树突细胞对LPS+抗-CD40+IFNγ组合无反应。
在此实施例中，发明人已表明与骨髓-衍生的DC相比较，DC浸润的C26-6CK肿瘤当考虑到在混合白血球反应(MLR)中的IL-12生成或刺激能力时，对LPS+IFNγ+抗-CD40抗体无反应(图1)。所有肿瘤细胞均培养在DMEM(Gibco-BRL，Life Technologies，Paisley Park，Scotland)中，其中添加10％FCS(Gibco-BRL)，1mM hepes(Gibco-BRL)，Gentallin(Schering-Plough，Union，NJ)，2x10-5M beta-2巯基乙醇(Sigma，St.Louis，MO)。所有细胞均培养在37℃下，经调湿并具有5％CO2的温育箱中。C26结肠癌和TSA乳癌细胞是由Mario Colombo(Istituto Nazionale perlo Studio e la Cura dei Tumori，Milano，Italy)提供。B16F0黑色素瘤和LL2癌细胞得自美国菌种保存中心(LGC，Strasbourg，法国)。改造的可稳定分泌老鼠趋化因子6Ckine/SLC/CCL21的C26-26CK细胞系已由本发明人先前说明(Vicari等人，2000，J.Immunol.165：1992-2000)。使用抗-CD11c磁珠(Myltenyi Biotec Gmbh，德国)将来自C26-26CK肿瘤的TIDC富集。骨髓-衍生的DC的获得是通过将骨髓祖细胞与GM-CSF(Schering-Plough，Union，NJ)和TNFα(R&D Systems，Minneapolis，MN)一起培养5天。活化是通过在培养基中添加10ng/毫升LPS(Sigma，St.Louis，MO)，20ng/毫升IFNγ(R&D Systems)和20微克/毫升纯化的抗-CD40抗体的FKG45.5(由AG Rolink，免疫学基础研究所，瑞士赠予)培养过夜。图1A显示通过FACS(门控在CD11c阳性细胞上)的MHC第二族，CD40和CD86的表面表达的分析。图1B显示CD11c+细胞在20小时，包括与Brefeldin A温育2.5小时后的IL-12p40的细胞内表达。图1C中，将混合的白血球反应TIDC或以LPS+IFNγ+抗-CD40刺激的骨髓-衍生的DC被照射并以不同数目在恒定数目的富集的同种异体的T细胞(3x105T细胞)存在下培养5天。通过***放射性胸腺嘧啶测定培养的最后18小时期间的增殖。图1D说明以LPS+IFNγ+抗-CD40活化后通过特异性ELISA在培养上清液中测定IL-12p70。
这些综合结果暗示树突细胞浸润的C26-6CK肿瘤并不可经由LPS+IFNγ+抗-CD40的刺激而得到树突细胞的典型功能，即刺激同种异体的T细胞的能力和分泌IL-12的能力。这些受损的功能似乎是树突细胞与肿瘤相互作用的结果。
实施例II
CpG 1668+抗I L-10受体组合复原了C26-6CK肿瘤-浸润的树突细胞中的IL-12和TNFα。
在此实施例中，发明人已显示CpG 1668与抗-IL 10R抗体联合给予复原了在C26-6CK肿瘤-浸润的树突细胞中的IL-12和TNFα(图2)。
使用抗-CD11c磁珠富集来自C26-6CK肿瘤的TIDC。活化是在GM-CSF 10ng/毫升存在下进行过夜。活化剂使用10ng/毫升LPS，20ng/毫升IFNγ，20微克/毫升抗-CD40抗体的FKG45.5，5微克/毫升CpG1668(序列：TCC-ATG-ACG-TTC-CTG-ATG-CT，经硫代磷酸酯修饰，MWG Biotech，德国)和10微克/毫升抗-IL 10R(1B13A复制体，Castro等人，2000，J.Exp.Med.192：1529-1534)。使用特异性ELISA在经24小时刺激后的培养上清液中测定IL-12 p70和TNFα含量。
总之，这些结果指出CpG 1668本身并不诱导C26-6CK肿瘤-浸润的DC生成IL-12。抗-IL 10R本身(未显示)也无作用或与LPS+IFNγ+抗-CD40联合只有微小作用。只有抗-IL 10R与CpG 1668的组合可诱导显著的自C26-6CK肿瘤-浸润的DC生成具有生物活性的IL-12和TNFα。
实施例III
CpG 1668+抗-IL-10R组合复原了C26-6CK肿瘤-浸润的树突细胞的MLR刺激能力。
在此实施例中，发明人已显示CpG 1668+抗-IL-10受体抗体的联合给予复原了MLR刺激能力。
使用抗-CD11c磁珠富集来自C26-6CK肿瘤的TIDC并在GM-CSF和各种组合的LPS、IFNγ、抗-CD40、抗-IL 10R和CpG 1668存在下培养过夜。再将细胞照射并以不同数目在固定数目的富集的同种异体的T细胞(3x105T细胞)存在下培养5天。通过在培养的最后18小时期间并入放射性胸苷测定其增殖。结果显示肿瘤-浸润的DC在MLR分析中为弱刺激细胞，但其刺激能力可受CpG 1668少量提高，可被抗-IL 10R+LPS+IFNγ+抗-CD40的组合进一步提高，且被抗-IL 10R与CpG 1668的组合提高最多。因此，此实施例显示抗-IL 10R加CpG 1668是复原在MLR中的DC刺激能力的最合适的组合。此可解释为：使用IL-10拮抗剂和TLR9激动剂的组合治疗癌症时，可更好地活化活体内原态T细胞，并因而有较好的T细胞-介导的抗肿瘤免疫反应。
实施例IV
来自C26野生型的肿瘤-浸润的树突细胞和来自其它组织学特性的肿瘤对于LPS+IFNγ+抗-CD40无反应但对CpG 1668+抗-IL-10R反应生成IL-12。
此实施例显示来自C26野生型的肿瘤-浸润的树突细胞和来自其它组织学特性的肿瘤对于LPS+IFNγ+抗-CD40组合无反应但对CpG1668+抗-IL-10R反应生成IL-12。
使用抗-CD11c磁珠富集来自均在皮下生长的C26结肠癌、B16黑色素瘤和LL2肺癌肿瘤的TIDC并在GM-CSF和各种组合的LPS、IFNγ、抗-CD40、抗-IL 10R和CpG 1668存在下培养过夜。以FACS分析经20小时，包括与Brefeldin A温育2.5小时后的IL-12p40的细胞内表达对CD11c的表面表达。图4显示，如在C26-6CK肿瘤所发现的，分离自亲代C26肿瘤和不同组织学来源的肿瘤的DC对于以LPS、IFNγ、抗-CD40活化均无反应但对于TLR-9激动剂CpG 1668加抗-IL 10R的组合可反应生成IL-12。因此，这些观察提示IL 10拮抗剂与TLR-9激动剂的组合可以是许多肿瘤的有效疗法。
实施例V
CpG 1668+抗-IL-10R抗体在C26-6CK肿瘤模型中的疗效。
-在第0天于七只8周大的雌BALB/c小鼠组皮下植入1x105个C26-6CK肿瘤细胞并如下治疗：
-在第7、14和21天在肿瘤周围(若肿瘤太小)或内部注射10微克的CpG 1668。
-在第7天开始(第24天结束)一周两次腹膜注射250微克纯化的抗-IL10R抗体。对照抗体为纯化的GL113抗体。
每周三次以触诊评估肿瘤发展并使用双角规形夹(calipef)测定肿瘤，其肿瘤体积＝I2xLx0.4，I为小直径而L为大直径。若肿瘤超过1500立方毫米则将小鼠处死或人道处理。
图5显示所有单独注射对照抗体或抗-IL10R抗体的小鼠均在7至10天内发展出肿瘤，其终于造成约4周即需牺牲动物。注射TLR-9激动剂CpG 1668有微小效果，因为1/7老鼠未发展出肿瘤。此外，CpG 1668组中的存活率稍佳且其三周后的肿瘤平均体积比对照组小。相反的，CpG 1668与抗-IL10R组合治疗的小鼠虽然发展出可触摸到的肿瘤，但7只小鼠中有6只排除了肿瘤。随后，在余下的实验中这些小鼠未再获肿瘤。这些结果指出TLR-9激动剂与IL-10拮抗剂的组合在C26-6CK模型中具有治疗价值，暗示其可用于治疗其它肿瘤，包括在人体中。
实施例VI
CpG 1668+抗-IL10R抗体在C26肿瘤模型中的疗效。
-在第0天在七只8周大的雌BALB/c小鼠组皮下植入5x104个C26肿瘤细胞并如下治疗：
-在第7、14和21天在肿瘤内部注射5微克的CpG 1668。
-在第7、14和21天腹膜注射250微克纯化的抗-IL10R抗体。对照抗体是纯化的GL113抗体。
每周三次以触诊评估肿瘤发展并使用双角规形夹(caliper)测定肿瘤，其肿瘤体积＝I2xLx0.4，I为小直径而L为大直径。若肿瘤超过1500立方毫米则将小鼠处死或人道处理。
图6显示所有单独注射对照抗体、CpG 1668或抗-IL10R抗体的小鼠均在7天内发展出肿瘤，其终于造成约3至4周即需处死动物。相反的，以CpG 1668与抗-IL10R组合治疗的小鼠虽然发展出可触摸到的肿瘤，但7只小鼠中有6只可排除肿瘤。随后，在余下的实验中这些小鼠未再获肿瘤。这些结果指出TLR-9激动剂与IL-10拮抗剂的组合在C26模型中具有治疗价值，暗示其可用以治疗其它肿瘤，包括在人体中。
实施例VII
CpG 1668+抗-IL10R抗体在B16F0黑色素瘤模型中的疗效。
-在第0天在七只8周大的雌C57BL/6小鼠组皮下植入5x104个B16F0肿瘤细胞并如下治疗：
-在第7、14和21天在肿瘤内部注射5微克的CpG 1668。
-在第7、14和21天腹膜注射250微克纯化的抗-IL10R抗体。对照抗体为纯化的GL113抗体。
每周三次以触诊评估肿瘤发展并使用双角规形夹(caliper)测定肿瘤，其肿瘤体积＝I2xLx0.4，I为小直径而L为大直径。若肿瘤超过1500立方毫米则将小鼠处死或人道处理。
图7显示所有单独注射对照抗体、CpG 1668或抗-IL10R抗体的小鼠均在7天内发展出肿瘤，其终于造成约3至4周即需处死动物。单独CpG 1668对存活率有微小效果。相反的，以CpG 1668与抗-IL10R组合治疗的小鼠虽然发展出可触摸到的肿瘤，但7只小鼠中有6只排除了肿瘤。随后，在余下的实验中这些小鼠未再获肿瘤。这些结果指出TLR-9激动剂与IL-10拮抗剂的组合在B16F0模型中具有治疗价值，暗示其可用以治疗其它肿瘤，包括在人体中。
实施例VIII
来自C26-6CK肿瘤的肿瘤-浸润的DC可对抗-IL10抗体和CpG1668的组合反应生成IL-12。
使用抗-CD11c磁珠富集来自C26-6CK的TIDC并在GM-CSF和各种组合的纯化抗-IL 10抗体与CpG 1668存在下培养过夜。以FACS分析经20小时，包括与Brefeldin A温育2.5小时后的IL-12p40的细胞内表达对CD11c的表面表达。
图8显示CpG 1668与抗-IL10的组合可在C26-6CK肿瘤-浸润的树突细胞内诱导IL-12的生成，这暗示IL-10本身的拮抗剂与有效量的TLR-9激动剂在一起，可有效治疗癌症。
实施例IX
由来自C26肿瘤的上清液对骨髓-衍生的DC活化的抑制可被抗-IL-10R和/或吲哚美辛(indomethacin)(为一种环氧化酶抑制剂)恢复。
骨髓-衍生的DC的获得是通过将骨髓祖细胞与GM-CSF和TNFα在10％体积比的C26肿瘤上清液存在或缺乏下培养5天。肿瘤上清液的制备是将皮下生长在BALB/c小鼠的0.5cm C26肿瘤割下并切碎，再在10毫升的DMEM中培养48小时。将所得上清液以0.2微米过滤并在使用前冷冻。此上清液以特异性ELISA(R&D Systems)测定含0.25ng/毫升的IL-10和50ng/毫升的PGE2。为了要抑制上清液中的PGE2合成，在48小时培养期间加入1微克/毫升的环氧化酶吲哚美辛抑制剂(Sigma)。
5天后，骨髓DC被不同组合的最佳剂量的LPS、IFNγ和抗-CD40抗体在10微克/毫升的抗-IL10R抗体存在或缺乏下活化。DC活化的测定是通过FACS测其共刺激分子CD40和CD86的表达和通过胞内染色测其IL-12生成。
图9显示C26肿瘤上清液可抑制DC活化。添加在吲哚美辛或抗-IL-10R存在下所制得的上清液至DC培养液中可部分减轻效用，但二者的组合可完全恢复CD40和CD86的上升调节和IL-12表达。
这些实验强烈暗示环氧化酶特别是***素的产物，也为肿瘤-衍生的DC抑制因子。
实施例X
CpG 1668+吲哚美辛在C26-6CK肿瘤模型中的疗效
-在第0天在七只6周大的雌BALB/c小鼠组皮下植入5x104个C26-6CK肿瘤细胞并如下治疗：
-在第7、14和21天在肿瘤内部注射5微克的CpG 1668。
-在第5天开始至28天止在饮水中随意添加5微克/毫升吲哚美辛。
每周三次以触诊评估肿瘤发展。若肿瘤超过1500立方毫米则将小鼠处死或人道处理。
图10显示所有对照小鼠均在7天内发展出肿瘤，其终于造成约3至4周即需处死动物。CpG或吲哚美辛组中仅有1/7未发展出肿瘤。相反的，4/7以CpG 1668和吲哚美辛的组合治疗的小鼠未发展出肿瘤。这些结果指出TLR-9激动剂与环氧化酶抑制剂的组合在C26-6CK模型中具有治疗价值，暗示其可用于治疗其它肿瘤，包括在人体中。
本发明可在不远离其精神和范围下进行许多修饰和变化，其对于本领域技术人员是显而易见的。本文中说明的特定具体实施例仅供作范例，且本发明并不仅限制于所附的权利要求的专有名词，连同该权利要求范围所称的同义语的全部范围。

Claims (18)

1.一种治疗癌症的医药组合物，其包括有效量的树突细胞抑制因子拮抗剂联合有效量的TLR-9激动剂，其中
a)所述树突细胞抑制因子拮抗剂是阻断IL-10活性的抗体或其片段，且选自白细胞介素-10抗体、IL-10抗体片段、IL-10受体抗体、和IL-10受体抗体片段；
b)TLR-9激动剂是具有选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列的免疫刺激性低聚核苷酸；和
c)所述树突细胞抑制因子是由肿瘤细胞分泌的。
2.如权利要求1所述的医药组合物，其中该抗体是单克隆抗体。
3.如权利要求2所述的医药组合物，其中该抗体是抗-IL-10受体单克隆抗体。
4.如权利要求1所述的医药组合物，其中该TLR-9激动剂是具有SEQ ID NO：1的序列的免疫刺激性核苷酸序列。
5.如权利要求4所述的医药组合物，其中该免疫刺激性核苷酸序列通过硫代磷酸酯修饰进行稳定。
6.如权利要求4所述的医药组合物，其中该免疫刺激性核苷酸序列包覆于阳离子脂质体内。
7.如权利要求1所述的医药组合物，其中该肿瘤-衍生的树突细胞抑制因子拮抗剂是抗-IL-10受体单克隆抗体且TLR-9激动剂是CpG2006(SEQ ID NO：1)。
8.如权利要求1所述的医药组合物，其进一步包括一种物质，其可使肿瘤-衍生的树突细胞抑制因子拮抗剂和/或TLR-9激动剂在传送位置缓慢释放。
9.如权利要求1所述的医药组合物，其中该肿瘤-衍生的树突细胞抑制因子拮抗剂和/或TLR-9激动剂是静脉内、肿瘤内、皮肤内、肌内、皮下或局部给予。
10.如权利要求1所述的医药组合物，其进一步包括至少一种肿瘤相关性抗原，所述肿瘤相关性抗原选自Melan-A，酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-12、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、黑色素瘤抗原gp75、HKer 8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1和Tyr2、pMe 117基因家族成员、c-Met、PSA、PSM、α-胎儿蛋白、甲状腺过氧化酶、gp100、NY-ESO-1、p53和端粒酶。
11.如权利要求10所述的医药组合物，其中该肿瘤相关性抗原连接于TLR-9激动剂。
12.如权利要求1所述的医药组合物，其进一步包括活化或刺激树突细胞成熟的试剂，其中该试剂选自IFNα，TNFα ，RANK配体或激动剂，CD40配体或激动剂，或其它TNF和CD40受体家族成员的配体或激动剂。
13.如权利要求1所述的医药组合物，其进一步包括提高血液树突细胞数目的细胞因子，其中该细胞因子选自FLT3-L，GM-CSF和G-CSF。
14.如权利要求1所述的医药组合物，其进一步包括对树突细胞有活性的趋化因子，其中该趋化因子选自：CCL21，CCL 3，CCL20，CCL16，CCL5，CCL25，CXCL12，CCL7，CCL8，CCL2，CCL13，CXCL9，CXCL10和CXCL11。
15.如权利要求14所述的医药组合物，其中该趋化因子利用导向构建物传送至肿瘤，其包括趋化因子或生物活性片段或其变体与辨识肿瘤相关性抗原的导向部分，其中该肿瘤相关性抗原选自：Melan-A，酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-12、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、黑色素瘤抗原gp 75、HKer 8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1和Tyr2、pMe 117基因家族成员、c-Met、PSA、PSM、α-胎儿蛋白、甲状腺过氧化酶、gp100、NY-ESO-1、p53和端粒酶。
16.如权利要求1所述的医药组合物，其中该肿瘤-衍生的树突细胞抑制因子拮抗剂和/或TLR-9激动剂彼此连结。
17.如权利要求16所述的医药组合物，其中该肿瘤-衍生的树突细胞抑制因子拮抗剂和/或TLR-9激动剂进一步连结于肿瘤相关性抗原，所述肿瘤相关性抗原选自：Melan-A，酪氨酸酶、p97、β-HCG、GalNAc、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-12、MART-1、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC、黑色素瘤抗原gp75、HKer 8、高分子量黑色素瘤抗原、K19、Tyr1和Tyr2、pMe1 17基因家族成员、c-Met、PSA、PSM、α-胎儿蛋白、甲状腺过氧化酶、gp100、NY-ESO-1、p53和端粒酶。
18.如权利要求1-17任一项所述的医药组合物在制备用于所需患者中的治疗癌症的药物中的应用。
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