CN1590533A - 新的乳酸菌、其细菌素、及利用该菌的食品加工方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及保藏号为BCRC 910210的戊糖片球菌YJL菌株及保藏号为BCRC910211的戊糖片球菌YJS菌株的新颖菌株。本发明提供一种使用上述菌株的鱼肉食品加工方法及该方法所制得的鱼肉加工产品。本发明又提供一种使用上述菌株的豆类食品加工方法及该方法所得的豆类加工产品。本发明更提供由上述菌株所得的细菌素。该方法可制得可抑制杂菌生长、风味特佳、经济价值高的加工产品。又，该细菌素可有效地抑制其它杂菌的生长，进而确保保存期间食品的品质。

Description

新的乳酸菌、其细菌素、及利用该菌的食品加工方法

技术领域

本发明提供一种新颖的乳酸菌及其细菌素、利用该类乳酸菌的鱼肉食品加工方法与产品以及豆类食品加工方法与产品。更具体而言，本发明系提供一种筛选自肉中的新颖性乳酸菌，可使用于利用鱼类或豆类作为原料的发酵加工食品加工方法，且提供由该方法所制得的可抑制杂菌生长、风味特佳、经济价值更高的加工食品。本发明更提供一种由该新颖性乳酸菌所产生的细菌素，该细菌素可有效地抑制其它杂菌的生长，进而确保保存期间食品的品质。

背景技术

传统食品已渐渐不能满足消费者的需求，由市面上健康食品、精致食品的充斥，不难了解食品的多元化、安全性与机能性是现今食品业开发的重点。

乳酸菌是一群可发酵醣类产生乳酸的微生物，常在蔬菜、谷类、乳品及肉品等发酵产品中被当成发酵菌酉(starter)使用，可以增进食品营养价值(Acton等人，1977)、抑制肠内病原菌生长(Bacus和Brown，1981)、提高乳糖的利用性(Siddons和Coates，1985)、具有抗癌(Oda等人，1983)与降低胆固醇(Mann和Spoerry，1974)功能等特性。发酵过程中乳酸菌因利用醣类进行糖解作用，而提供产品特殊风味；亦能分泌乳酸、醋酸等有机酸分子，使制品的pH值下降，抑制微生物的生长，延长产品的储藏期限；此外有些乳酸菌尚能产生过氧化氢、双乙醯、细菌素等产物以抑制腐败菌或病原菌的生长(Gibbs，1987；Klaenhammer，1988；Daeschel.1989；Schillinger和Lucke，1989)。

乳酸菌能产生抑制病原菌生长的物质(森地，1997)，主要的物质为细菌素(Bacteriocins)、diacetyl、H₂O₂和次级代谢产物。细菌素是一种含蛋白质的大分子，具有抑制微生物生长作用(Scbillinger和Holzapfel，1996；Roller和Lusengo，1997)。能产生细菌素的乳酸菌有发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)(Deklerk和Smit，1967)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus plantarum)(Sedewitz等人，1983)、瑞士乳杆菌(Lactobacillshelveticus)(Joerger和Klaenhammer，1986)、嗜酸乳杆菌(Lactobacilluacidophilus)(Muriana和Klaenhammer，1987)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillu plantarum)(West和Warner，1988)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)(Daeschel和Klaenhammer，1985)。

乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)所产生的细菌素能抑制鲜肉、发酵香肠、发酵甘蓝菜、碎牛肉和乳酪中单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的生长(Nielsen等人，1990；Choi和Beuchat，1994；Motlagh等人，1992；Parente等人，1996；Vignolo等人，1996；Cutter和Siragusa，1996)，增加冷藏的保存期限。德氏乳杆菌乳亚种(Lactobacillus lactis)ATCC 11454，戊糖片球菌ATCC 43200和戊糖片球菌ATCC43201所产生的细菌素添加于含3～4％食盐的冷藏调理食品中，能抑制肉毒梭菌(Clostridium botulinum)孢子的萌芽与生长(Okereke和Montville，1991)。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)和戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceous)所产生的细菌素能抑制革兰氏阳性的病原菌，如蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和单核细胞增生利斯特氏菌；此外，对于某些革兰氏阴性病原菌，如嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila AH₂)、大肠杆菌(Escherichia coli O157：H7)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)851和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus A865957)(Spelhaug和Harlander，1989；Helander等人，1997)亦有抑制作用。乳酸乳球菌乳亚种所产生的乳酸链球菌肽已被列为GRAS(generallyrecognized as safe)(FDA，1992)，使用于冷藏乳酪以抑制肉毒梭菌孢子的萌芽生长(园田等，1996)。

乳酸菌除产生细菌素外，亦产生丁二酮和H₂O₂。丁二酮(2，3-丁二酮)为乳酸菌中间代谢产物丙酮酸所合成的终产物(Kandler，1983；Monnet等人，1994)。Jay(1982)研究丁二酮在200μg/ml能抑制革兰氏阳性菌。丁二酮也是GRAS，但具强烈风味，挥发性高，最好限量使用。H₂O₂为乳酸菌在生长时，分别由丙酮酸、乳糖酶和NADH经由丙酮酸氧化酶，L-乳糖酶和NADH氧化酶与O₂作用产生(Kandler，1983；Sedewitz等人，1983)，能抑制有害微生物的生长(森地，1997)。H₂O₂能与其它成分形成良好抑菌物质，如以乳糖过氧化酶作用于硫氰酸盐，形成中间氧化产物以抑制微生物，此过程为“乳糖过氧化乳糖过氧化酶抗菌***(lactoperoxidase antibacterial system)”，能增加食品的保存期限(Harnulv等人，1982)。

由片球菌菌属生产的细菌素种类及特性，包括由乳酸片球菌H生产的PediocinAcH、乳酸片球菌PA1.0生产的Pediocin PA-1、戊糖片球菌FBB61生产Pediocin A。此外，啤酒片球菌(Ped.cerevesiae)FBB63和乳酸片球菌PC生产的细菌素目前仍未命名。

Bhunia等人在1987年自发酵香肠中筛选出能分泌细菌素Pediocin AcH的菌株乳酸片球菌H菌株，其分子量约2,700Da(SDS-PAGE)。经结果证实此细菌素可抑制乳杆菌(Lactobacilli)、明串珠菌(Leuconostocs)、金黄色葡萄球菌、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和单核细胞增生利斯特氏菌等微生物的生长。具有对蛋白分解酵素敏感、对热安定。Pediocin AcH因作用于细胞膜上，造成细胞膜内钾离子等的流失，导致细胞分解(Bhunia等人，1991)。

发明内容

有鉴于上述课题，本发明人等详细研究结果发现，使用由肉品中所筛选分离的戊糖片球菌YJL和YJS菌株等特殊乳酸菌可改善鲭鱼等鱼类及豆类的加工适性，且由探讨乳酸菌发酵过程中所产生的产物对鱼肉品质(质地、风味、色泽等)及豆类的影响、及乳酸菌所产生的蛋白酶对鱼肉质地及豆类的影响，可增加鱼类及豆类的加工范围，更提升其利用性。又，进一步利用该新颖乳酸菌于在不同条件下进行鱼肉或豆类发酵时，则因所产生的产物及所生产的蛋白酶作用程度的不同，最终产品的质地、色、香、味影响亦不同。因此，本发明提供一种可以利用发酵条件来控制并生产不同新产品的新食品加工技术。

由上可知，本发明提供如下发明。

本发明一方面提供了一种保藏号为BCRC910210的戊糖片球菌YJL。

本发明第二方面提供了一种保藏号为BCRC910211的戊糖片球菌YJS。

本发明第三方面提供了一种鱼肉加工方法，该方法使用了上述第1方面或第2方面的乳酸菌、第1方面与第2方面的混合乳酸菌、或其它乳酸菌的混合乳酸菌进行鱼肉发酵者；其加工方法为：鱼肉加0.3～2.0％食盐及0.5～3倍水后使其均质，经100～115℃杀菌15～30分钟后冷却至25～40℃，调整基质水分含量(从不稀释至五倍稀释)及添加1.0～6.0％糖后接种乳酸菌，在25～40℃发酵6～30小时任意添加适当量的调味剂及香辛料或进行包装。

在上述方法中，其它乳酸菌的混合乳酸菌含有1种以上选自嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC 14092的乳酸菌。鱼肉原料选自红色肉、白色肉鱼、其混合鱼肉、冷冻鱼浆的至少一种。糖原料选自蔗糖、葡萄糖、甜菜的至少一种。鱼肉基质可为不稀释～五倍稀释的鱼肉浆。调味剂选自一般的水果、加工的水果酱、芝麻、花生的至少一种。香辛料选自姜、蒜、味淋(味精)、酒、五香粉的至少一种。发酵后基质的pH在3.8～5.5。

本发明第四方面提供了一种鱼肉加工食品，其特征在于使用上述第1方面或第2方面的乳酸菌、或第1方面和第2方面的混合乳酸菌、或其它乳酸菌的混合乳酸菌进行鱼肉原料发酵所得的产品。

在该方法中，其它乳酸菌的混合乳酸菌含有1种以上选自嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC 14092的乳酸菌。

本发明第五方面提供了一种鱼肉加工食品，该食品是用本发明第三方面的鱼肉加工方法进行鱼肉原料发酵制得的。

本发明第六方面提供了一种鱼肉加工食品，该食品是用第3方面的鱼肉加工方法进行鱼肉原料发酵后在100～115℃加热杀菌、成型、部分干燥所得的类似起司(cheese)的产品。

在上述食品中，鱼肉原料为至少一种选自红色肉、白色肉鱼、其混合鱼肉或冷冻鱼浆等。

本发明第七方面提供了一种豆类加工方法，该方法使用上述第1方面或第2方面的乳酸菌、或第1方面和第2方面的混合乳酸菌、或其它乳酸菌的混合乳酸菌进行豆类发酵；其加工方法为：经浸泡豆类加水后均质、过滤后在经100～115℃加热杀菌15～30分钟后冷却至25～40℃，调整基质水分含量(50％～98％)及添加1.0～6.0％的糖后接种乳酸菌，在25～40℃发酵6～30小时后任意添加适当量的调味剂或进行包装。

在上述方法中，其它乳酸菌的混合乳酸菌为1种以上选自嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC 14092的乳酸菌。豆类原料为选自黄豆或黑豆的至少一种。糖原料为选自蔗糖、葡萄糖、甜菜等的至少一种。豆类发酵基质的水分含量为50％～98％。调味剂为至少一种选自一般的水果、加工的水果酱的调味剂。发酵后豆类基质的pH在4.5～6.0。

本发明第八方面提供了一种豆类加工食品，该食品是用第1方面或第2方面的乳酸菌、或如第1方面和第2方面的混合乳酸菌、或其它乳酸菌的混合乳酸菌进行豆类原料发酵所得的食品。

在该食品的加工方法中，其它乳酸菌的混合乳酸菌为1种以上选自嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC 14092的乳酸菌。

本发明第九方面提供了一种豆类加工食品，该食品是用上述豆类加工方法进行豆类原料发酵所得的食品。

在一个较佳的实施方案中，豆类为至少一种选自于黄豆、黑豆、或其混合物。

本发明第十方面提供了一种豆类加工食品，该食品是用上述豆类加工方法进行豆类原料发酵后在90～115℃加热杀菌、成型、部分干燥所得的类似起司的产品。

本发明第十一个方面提供了一种细菌素，其特征为来自上述第一方面的乳酸菌。该细菌素是分子量为20～30kDa的抑菌性物质。

本发明第十二个方面提供了一种细菌素，其特征为来自上述第二方面的乳酸菌。该细菌素是分子量为20～30kDa的抑菌性物质。

本发明提供一种新颖性乳酸菌、使用其的豆类、鱼肉食品加工方法、及使用其的豆类、鱼肉加工食品。更具体而言，本发明系提供一种筛选自肉中的新颖性乳酸菌，其可使用于利用鱼类或豆类作为原料的发酵食品加工方法上，且提供由该方法所制得的可抑制杂菌生长、风味特佳、经济价值更高的发酵食品。本发明更提供一种由该新颖性乳酸菌所产生的细菌素，该细菌素可有效地抑制其它杂菌于食品中的生长，进而确保保存期间食品的品质。

附图说明

图1表示乳酸四连球菌的鉴定流程。

图2表示纯化的Pentocins YJL和YJS的SDS-PAGE(8～15％聚丙烯胺)。

图3表示发酵鱼肉起司的实例。

图4表示发酵鱼肉酸乳酪(yogurt)的实例。

图5表示发酵黄豆布丁的实例。

具体实施方案

以下更详细地说明本发明。本发明系提供新颖的乳酸菌及其细菌素、利用该类乳酸菌的鱼肉食品加工方法与产品以及豆类食品加工方法与产品。

本发明所使用的具有新颖性的乳酸菌系由肉品中所筛选分离出的戊糖片球菌YJL和YJS菌株。片球菌属为乳酸四链球菌，不具运动性、不产孢子且为触媒阴性的革兰氏阳性菌。

本发明的戊糖片球菌YJS(BCRC 910211)和戊糖片球菌YJL(BCRC 910210)已经于2003年8月8日保藏于国立生命科学和人体技术研究所(日本茨城县Tsukuba市东一区1番3号(邮编305-8566))(International Patent Organism Depositary NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology，Higashi 1-1-3，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，保藏号分别为FERM BP-8449和FERM BP-8450。

本发明提供一种鱼肉加工方法，其特征为使用戊糖片球菌YJL和YJS菌株或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC 14092等进行红色肉或白色肉鱼或其混合鱼肉或冷冻鱼浆等鱼肉发酵，其加工方法为将作为鱼肉原料的鱼肉基质的鱼肉浆加入0.3～2.0％食盐及0.3～1.5倍水后使其均质化，经100～115℃杀菌15～30分钟后冷却至25～40℃，调整基质水分含量(由不稀释～五倍稀释)及添加1.0～6.0％的至少一种选自蔗糖、葡萄糖、甜菜的糖后接种乳酸菌，在25～40℃发酵6～30小时后，使该发酵基质的最后pH在3.8～5.0，任意添加适当量的至少一种选自水果、加工的水果酱、芝麻、花生的调味剂及香辛料并视情况做任意包装。

本发明又提供一种鱼肉加工食品，其为使用戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC14092等进行至少一种选自红色肉或白色肉鱼或其混合鱼肉或冷冻鱼浆的鱼肉原料发酵所得的食品。

本发明又提供一种鱼肉加工食品，其为使用戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC14092等进行至少一种选自红色肉或白色肉鱼或其混合鱼肉或冷冻鱼浆的鱼肉原料，经发酵、加热杀菌、成型、部分干燥后所得的类似起司的产品。

本发明又提供一种豆类加工方法，其特征为戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC14092等进行豆类发酵；其加工方法为：经浸泡的至少一种选自黄豆或黑豆的豆类加水后均质、过滤，在100～115℃加热杀菌15～30分钟后冷却至25～40℃，调整基质水分含量(50％～98％)及添加1.0～6.0％的至少一种选自蔗糖、葡萄糖、甜菜的糖后接种乳酸菌，在25～40℃发酵6～30小时后任意添加适当量的调味剂并视情况做包装。

本发明又提供一种豆类加工食品，其为使用戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC14092等，对至少一种选自黄豆或黑豆或其混合物的豆类原料进行发酵所得的产品。

本发明又提供一种豆类加工食品，其为使用戊糖片球菌YJL BCRC910210和YJSBCRC910211菌株的乳酸菌或戊糖片球菌YJL和YJS菌株的混合乳酸菌或其它乳酸菌如嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC14092等，对至少一种选自黄豆或黑豆或其混合物的豆类原料经发酵、加热杀菌、成型、部分干燥后所得的类似起司的产品。

本发明又提供一种分子量为20～30kDa的抑菌性物质的细菌素，其来自戊糖片球菌YJL菌株。

本发明又提供一种分子量为20～30kDa的抑菌性物质的细菌素，其特征为来自戊糖片球菌YJS菌株。

以下例举实施例以更具体地说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。

主要仪器

低温振荡培养箱：Orbital shaking incubator(HOTECH 718，Hotech Instruments Co.，Taiwan).

低温高速离心机：Automatic high speed refrigerated centrifuge(SCR 20B，Hitachi，Japan).

色差仪：Model TC-1800MK-II，Tokyo Denshoku Co.，Japan.

pH测定仪：pH Meter(HM-30S，TOA Electronic Co.，Japan).

恒温恒湿培养箱：TC-120HD，Tungtec instruments C.，LTD.

碎肉乳化机：UM-12，Stephan，Germany.

冻干机：Model FD-20-84，Fts ststems，INC.，U.S.A.

胺基酸测定仪：Amino Acid Analyzer(Hitachi L-8500，Japan).

真空减压浓缩机：Rotavapor(Biichi RE111，Buchi，Switzerland).

迷你电泳：Electrophoresis Cell(Mini-PROTEAN II，Bio-Rad，U.S.A.).

电源供应器：Power Supply(Model 200/2.0，Bio-Rad，U.S.A.).

止泡均质机：Waring Blender(subjoined with a baffle，Japan).

冷冻柜：-30℃及-80℃为Bio-Freezer(Model 8442，Forma Scientific，U.S.A.).

分光光度计：Hitachi U-2001，Hitachi，Japan.

尾部血压量测器：Softron BP 98-A，Japan.

实施例1戊糖片球菌YJL BCRC910210及戊糖片球菌YJS BCRC910211的筛选及鉴定结果

由表一结果得知在MRSA选择性培养基上呈现乳酸菌乳白色典型菌落的戊糖片球菌YJL菌株为不具运动性、触媒阴性的革兰氏阳性四连球菌，可利用葡萄糖发酵产酸且不产气；此外，戊糖片球菌YJS菌株亦为触媒阴性、不具运动性的革兰氏阳性四连球菌，可利用葡萄糖发酵产酸且不产气。由以上结果根据1988年Simpson与1991年Pilone学者所提菌种分类表(图一)即可将此二株乳酸菌归属于片球菌属。

进一步测试此二菌株的生长温度范围、耐盐度和pH范围等。由表一结果显示：MPL菌株可于4～45℃、pH4.0～7.0间生长，10％盐浓度以上不能生长。而戊糖片球菌YJS菌株可于15～45℃下生长，但不能于4℃下生长且可于pH4.0～7.0间生长，此外，亦可在10.0％盐浓度下生长。在醣类发酵测试方面(如表二)，戊糖片球菌YJL和戊糖片球菌YJS二株乳酸菌可发酵核糖(ribose)、但是不能利用D-***糖、L-木糖等醣类进行发酵。此特性与1978年Back学者提出片球菌属的菌种分类表，可知此二菌株均属于戊糖片球菌。

表一.P.pentosaceus YJL及P.pentosaceus YJS之生理特性

鉴定                          P.pentosaceus YJL              P.pentosaceus YJS

革兰氏染色                    +                              +

触酶测试(Catalase test)       -^a                            -

运动                          -                              -

细胞型态                      球菌                           球菌

生长

    45℃(2天)^c               +                              +^b

    40℃(2天)                 +                              +

    35℃(2天)                 +                              +

    30℃(2天)                 +                              +

    25℃(3天)                 +                              +

    20℃(3天)                 +                              +

    15℃(7天)                 +                              +

    4℃(7天)                  +                              -

开始生长时的pH

    pH4.0(3天)                +                              +

    pH5.0(3天)                +                              +

    pH6.0(3天)                +                              +

    pH7.0(3天)                +                              +

生长时的NaCl浓度％

    0.0(3天)                  +                              +

    2.5(3天)                  +                              +

    4.0(3天)                  +                              +

    5.0(3天)                  +                              +

    10.0(3天)                 -                              +

    20.0(3天)                 -                              -

最后pH(3天)                   3.99                           3.91

菌株均培养于MRS培养基。

a：“-”表示不生长或负反应：b：“+”表示生长或正反应：c：培养时间。

API 50CHL***鉴定

将戊糖片球菌YJL及YJS菌株与购自食工所的标准菌戊糖片球菌CCRC 14024三株乳酸菌进行API 50CHL***鉴定测试，结果列于表三。由表中可知标准菌戊糖片球菌CCRC 14024可利用核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯胺基葡糖、苦杏仁苷、熊果苷(arbutine)、七叶苷(esculin)、纤维二糖酶、麦芽糖、蜜二糖(melibiose)、蔗糖、海藻糖、水杨苷(salicin)。但不能利用β-龙胆二糖、D-***糖、木糖及果糖等。测试结果经***研判为戊糖片球菌，判别率达99.8％。因β-龙胆二糖为负反应与***值相反造成误差。

戊糖片球菌YJL菌株可利用核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯胺基葡糖、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、纤维二糖酶、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖。但对于水杨苷、β-龙胆二糖、D-***糖、木糖及果糖等均不能利用。上述结果经***研判为戊糖片球菌，因水杨苷、β-龙胆二糖为负反应与***值有不同测试结果，使戊糖片球菌YJL菌株的判别率为99.6％。

戊糖片球菌YJS此菌株可利用核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、N-乙醯胺基葡糖、苦杏仁苷、熊果苷、七叶苷、水杨苷、纤维二糖酶、麦芽糖、蜜二糖及蔗糖，但不能利用β-龙胆二糖、D-***糖、木糖、水杨苷和果糖等。有二种测试结果水杨苷、β-龙胆二糖为负反应与***值不同，使测试结果的判别率为99.3％。综合以上传统鉴定方法与API 50CHL乳酸菌***鉴定法比对，可确定此二株乳酸菌为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。

表二.P，pentosaceus YJL及P.pentosaceus YJS之API 50CHL乳酸菌***鉴定

糖类                           P.pentosaceus CCRC 14024       P.pentosaceus YJL             P.pentosaceus YJS

2-celo-葡糖酸                  -                              -                             -

5-celo-葡糖酸                  -                              -                             -

测金盏花醇                     -                              -                             -

***                         -                              -                             -

苦杏仁苷                       +                              +                             +

熊果苷(arbutine)               +                              +                             +

纤维二糖                       +                              +                             +

D-***糖                     -                              -                             -

D-***糖醇                   -                              -                             -

D-果糖                         +                              +                             +

D-海藻糖                       -                              -                             -

D-葡萄糖                       +                              +                             +

                        -                              -                             -

D-甘露糖                       +                              +                             +

D-Raffubose                    +                              +                             +

                        +                              +                             +

D-松二糖                       -                              -                             -

半乳糖醇                       -                              -                             -

D-木糖                         -                              -                             +

                        -                              -                             -

七叶树糖甙                     +                              +                             +

半乳糖                         +                              +                             +

葡糖酸盐                       -                              -                             -

甘油                           -                              -                             -

糖酶                           -                              -                             -

                -                              -                             -

L-树胶醛糖                     +                              +                             +

乳糖                           +                              +                             +

L-***糖醇(L-Arbitol)        -                              -                             -

L-海藻糖                       -                              -                             -

L-山梨糖                       -                              -                             -

L-木糖                         -                              -                             -

麦芽糖                         +                              +                             +

L-甘露糖醇                     -                              -                             -

松三糖                         -                              -                             -

蜜二糖                         +                              +                             +

N-乙醯胺基葡糖                 +                              +                             +

鼠李糖                         +                              +                             +

核糖                           +                              +                             +

蔗糖                           +                              +                             +

水杨糖                         -                              +                             +

山梨酸醇                       -                              -                             -

海藻糖(Trehalose)              +                              +                             +

木醇糖                         -                              -                             -

α-甲基-D-糖苷                 -                              -                             -

α-甲基-D-甘露糖苷             -                              -                             -

β-龙胆二糖                    -                              +                             +

β-甲基-木糖                   -                              -                             -

P.pentosaceus ID(％)           99.6                           99.6                          99.3

于37℃厌氧培养48小时。

(+)：表示利用；(-)：表示不利用。

生化测试

P.pentosaceus YJL及P.pentosaceus YJS均对精胺酸具水解能力，但无法利用尿素、四唑红(tetrazolium red)及丙酮酸等。此二株菌的菌体型态于TEM下观察结果显示此二菌株均为无鞭毛的四连球菌。

抗生素敏感性试验

抗生素敏感性试验结果如表三所示，由表中得知P.pentosaceus YJL对头孢噻甲羧肟(30mcg)、羟羧氧酰胺菌素(30mcg)、萘啶酸(30mcg)具抗性；对庆大霉素(10mcg)有微耐抗性(intermediate resistant)；对氨苄青霉素(10mcg)、头孢噻肟(30mcg)、头孢氨呋肟(30mcg)、盘尼西林(10mcg)微敏感性(moderately susceptible)；对氯林肯霉素(2mcg)、红霉素(15mcg)、Imipenem(10mcg)、乙基西梭霉素(30mcg)、四环素(30mcg)、替卡西林(75mcg)、万古霉素(30mcg)具敏感性(susceptible)。

P.pentosaceus YJS对庆大霉素(10mcg)羟羧氧酰胺菌素(30mcg)、萘啶酸(30mcg)、万古霉素(30mcg)具耐抗性；对四环素(30mcg)微耐抗；对氨苄青霉素(10mcg)、头孢噻肟(30mcg)、头孢噻甲羧肟(30mcg)具微敏感性(moderatelysusceptible)；而对头孢氨呋肟(30mcg)、氯林肯霉素(2mcg)、红霉素(15mcg)、Imipenem(10mcg)、乙基西梭霉素(30mcg)、盘尼西林(10mcg)、替卡西林(75mcg)具敏感性。

根据上述试验结果可知此二株乳酸菌在生理生化特性上有差异，因此将的分别命名为戊糖片球菌YJL(P.pentosaceus YJL)和戊糖片球菌YJS(P.pentosaceus YJS)。

表三、P.pentosaceus YJL及P.pentosaceus YJS之抗生素敏感性试验

抗生素              浓度(mcg)     R^a       I^a     MS^a    S^a       P.pentosaceus YJL    P.pentosaceus YJS

氨苄青霉素          10            21^b               22-29   30        MS                   MS

头孢噻肟            30            14                 15-22   23        MS                   MS

头孢噻甲羧肟        30            14                 15-22   23        R                    MS

头孢氨呋肟          30            14                 15-22   23        MS                   S

氯林肯霉素          2.0           14        15-16            17        S                    S

红霉素              15            13        14-17            18        S                    S

庆大霉素            10            12        13-14            15        I                    R

Imipenem            10                                       16        S                    S

羟羧氧酰胺菌素      30            14                 15-22   23        R                    R

萘啶酮酸            30            13        14-18            19        R                    R

乙基西梭霉素        30            12        13-14            15        S                    S

盘尼西林            10            19                 20-27   28        MS                   S

四环素              30            14        15-18            19        S                    I

替卡西林            75            14                 15-19   20        S                    S

万古霉素            30            9         10-11            12        S                    R

a：R，具耐抗性；I，微耐抗性；MS，微敏感性；S，具敏感性。

b：抑制区的直径(mm)。

实施例2  利用嗜酸乳杆菌CCRC10069、乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315、瑞士乳杆菌CCRC 14092、戊糖片球菌YJL BCRC910210及戊糖片球菌YJS BCRC910211的鱼类加工方法

冷冻鲭鱼于室温下经流水解冻，去除内脏及头后，利用采肉机采肉。以2％NaCl溶液等体积均质盐溶，再作三倍稀释鱼肉基质。经100℃杀菌20分钟后冷却至40℃，最后添加4％蔗糖、1％葡萄糖及乳酸菌以灭菌玻离棒均匀混合后置于37℃发酵48小时。在此基质中乳酸菌接种的浓度约为10⁵ CFU/g。实验中检测的项目包括pH值、乳酸菌数及好气性菌数。此外，亦检测原物料及加工制程中可能存在主要微生物菌相的变化，包括假单胞菌、葡萄球菌和肠杆菌等菌群，藉以了解乳酸菌的抑菌能力。最后添加适当量的桑椹及糖后作官能品评。

结果：37℃发酵48小时后，五种乳酸菌发酵制品的pH值自6.2-6.3降低至4.5-4.7，未添加乳酸菌组则pH值上升至7.4-7.6；且VBN值于发酵24小时后由8.2-8.6上升至50.2-51.4mg/100g，甚至于发酵48小时后亦提高至70.1-71.3mg/100g。然而添加乳酸菌组则仅由8.1-8.6些微上升至21.0-24.8mg/100g。该项结果显示利用乳酸菌发酵可抑制VBN的生成，同时由于细菌素的生成而能可有效抑制腐败菌或病原菌如假单胞菌、葡萄球菌及肠杆菌等的生长(表四)。五种乳酸菌发酵制品的Hunter L(透明指示物)、b(黄色/蓝色的指示物)和白度(whiteness)均高于未添加乳酸菌组(L：从47.61-49.98升高至59.03-65.06；b：从7.14-8.64至9.35-11.68；白度：从46.8-49.3％升高至57.9-63.5％，p＜0.05)。五种乳酸菌发酵产品的口感、风味及整体接受性均受好评。由表五发现发酵24小时产品接受性优于48小时组，但大体上不同乳酸菌的接种其差异不大。

表四  以一倍水稀释的鲭鱼肉浆在37℃下乳酸菌发酵48小时时过程的好氧菌，乳酸菌，肠杆菌(Entero)，葡萄球菌(Staph)和假单胞菌(Pseudo)的菌数变化

起始物^*     发酵时间                                      细菌^b(log CFU/mL)

             (h)          APC                LAB                 Entero.            Staph.             Pseudo.

NS           0            4.20±0.31^e       3.34±0.15^c       2.78±0.13^b       2.97±0.13^c       4.10±0.15^c

             24           7.78±0.36^b       6.35±0.32^b       9.04±0.27^a       6.63±0.23^b       8.04±0.26^b

             48           8.17±0.33^a       7.24±0.17^a       9.08±0.18^a       7.54±0.15^a       9.04±0.21^a

A            0            6.23±0.18^b       6.40±0.16^b       3.15±0.15^c       2.77±0.21^c       3.22±0.11^b

             24           9.38±0.33^a       9.46±0.19^a       3.66±0.21^b       3.38±0.22^b       4.00±0.26^a

             48           9.27±0.24^a       9.49±0.17^a       4.10±0.18^a       4.13±0.22^a       4.20±0.30^a

B            0            6.28±0.21^c       6.34±0.21^c       3.08±0.19^e       3.10±0.17^b       3.31±0.22^b

             24           8.20±0.32^b       8.65±0.17^a       3.38±0.13^bc      3.20±0.15^b       3.52±0.19^b

             48           9.32±0.32^a       8.85±0.21^a       4.40±0.23^b       4.43±0.18^a       4.53±0.20^a

C            0            6.28±0.20^c       6.34±0.21^b       3.18±0.19^b       3.10±0.17^b       3.31±0.21^b

             24           8.20±0.31^b       8.65±0.17^a       3.38±0.13^b       3.20±0.15^b       3.32±0.19^b

             48           9.32±0.35^a       8.85±0.22^a       4.50±0.24^a       4.43±0.19^a       4.33±0.20^a

D            0            6.43±0.19^b       6.45±0.12^b       3.19±0.11^b       2.80±0.25^b       3.3±0.14^b

             24           9.36±0.20^a       9.26±0.12^a       3.95±0.21^a       3.00±0.16^b       3.49±0.20^b

             48           9.20±0.27^a       9.18±0.20^a       4.30±0.15^a       4.21±0.20^a       4.33±0.17^a

             0            6.43±0.19^b       6.45±0.12^b       3.19±0.11^e       2.80±0.25^b       3.3±0.14^b

E            24           9.36±0.21^a       9.26±0.14^a       3.95±0.20^b       3.00±0.16^b       3.09±0.21^b

             48           9.20±0.31^a       9.18±0.21^a       4.30±0.14^a       4.21±0.20^a       4.33±0.19^a

^*NS：无添加起始物；A：Lactobacillus plantarum CCRC10069；B：Lactococcus lactis subsp.lactis CCRC12315；C：Lactobacillus helveticus CCRC14092；D：Pediococcus pentosaceus YJL；E：Pediococcus pentosaceus YJS.b：表中数值为3个重复实验之平均值±SD；各个处理组中，相对于同一发酵时间、同一栏中具有不同上标的数值显著地不同(p＜0.05)。

表五、以一倍水稀释之鲭鱼肉浆在37℃下乳酸菌发酵四十八小时过程之官能品评结果

                                       恒温培养时间(小时)

起始物^*     官能评估

                                     0                 24             48

             尝(Taste)               4.1±1.1^a        --^***         --

NS           风味(Flavor)            4.2±1.2^a        --             --

             组织(Texture)           3.3±0.5^a        --             --

             整体接受度              4.0±0.5^a        --             --

             品尝(Taste)             4.2±1.1^b        7.6±1.2^a     6.9±1.0^a

A            风味(Flavor)            3.8±1.2^b        7.6±1.1^a     6.8±0.8^a

             组织(Texture)           3.3±1.1^b        8.2±1.1^a     7.1±1.1^a

             整体接受度              3.9±1.0^b        7.9±0.8^a     6.8±0.7^a

             品尝(Taste)             4.2±1.2^b        7.7±1.2^a     7.1±1.1^a

B            风味(Flavor)            4.0±1.1^b        7.9±1.0^a     6.9±0.9^a

             组织(Texture)           3.4±0.9^b        8.3±1.2^a     7.2±0.7^a

             整体接受度              4.0±1.2^b        7.7±1.2^a     7.0±1.0^a

             品尝(Taste)             3.6±0.7^b        7.9±0.9^a     6.8±1.2^a

C            风味(Flavor)            3.9±1.0^b        7.9±1.1^a     7.1±1.1^a

             组织(Texture)           3.7±0.6^b        8.3±1.1^a     7.3±0.8^a

             整体接受度              3.9±1.0^c        8.2±1.1^a     7.0±1.3^a

             品尝(Taste)             4.0±1.0^b        7.7±0.7^a     7.0±1.3^a

D            风味(Flavor)            4.0±0.8^b        7.9±1.1^a     7.1±1.2^a

             组织(Texture)           3.7±0.6^b        8.4±1.2^a     7.4±1.1^a

             整体接受度              4.0±1.1^b        8.2±1.1^a     7.0±1.1^a

             品尝(Taste)             3.7±1.0^b        7.9±0.9^a     7.0±1.1^a

E            风味(Flavor)            4.0±0.8^b        8.0±1.1^a     7.1±1.2^a

             组织(Texture)           3.9±0.6^b        8.2±1.0^a     7.2±1.0^a

             整体接受度              4.1±1.1^b        8.0±1.1^a     7.1±1.2^a

^*参考表4的附注

^**：表中数值为3个重复实验之平均值±SD；同一栏中具有不同上标的数值显著地不同(p＜0.05)

^***：腐败

实施例3  利用嗜酸乳杆菌CCRC10069、乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315、瑞士乳杆菌CCRC 14092、戊糖片球菌YJL BCRC910210及戊糖片球菌YJSBCRC910211的鱼肉起司及酸乳酪加工方法

冷冻金线鲢鱼浆于5℃下解冻一夜，再以1.0％NaCl溶液等体积均质，经100～115℃杀菌15分钟后冷却至30℃，添加4％蔗糖及乳酸菌以灭菌玻离棒均匀混合后置于37℃发酵24小时。在此基质中乳酸菌接种的浓度约为10⁵CFU/g。最后添加适当量的芝麻或花生粉后于100～115℃杀菌15分钟，成型(如图3及4所示)为方形并在适度干燥后进行官能品评。

结果：37℃发酵24小时后，五种乳酸菌发酵制品的pH值均降低至4.6-4.8，五种乳酸菌发酵产品的口感、风味及整体接受性均受好评。

实施例4

利用戊糖片球菌YJL及戊糖片球菌YJS的豆类加工方法

经浸泡的黄豆加水后进行均质、过滤，以100～115℃加热杀菌20分钟后冷却至30℃，调整基质水分含量为60％，最后添加4％蔗糖与1％葡萄糖及乳酸菌以灭菌玻离棒均匀混合后置于37℃发酵24小时。在此基质中乳酸菌接种的浓度约为10⁵CFU/g。并检测pH值、乳酸菌数、好气性菌数、主要微生物菌相～假单胞菌、葡萄球菌和肠杆菌等菌群的变化。最后添加适当量的草莓及糖后作成布丁(如图5)，并作官能品评。

结果：37℃发酵24小时后，乳酸菌发酵制品的pH值自6.0-6.2降低至4.7-4.9，未添加乳酸菌组则pH值上升至7.5-7.7；假单胞菌、葡萄球菌及肠杆菌等的生长均有效被抑制(表六)。五种乳酸菌发酵制品的Hunter L、b和白度(whiteness)均高于未添加乳酸菌组(p＜0.05)。五种乳酸菌发酵产品的口感、风味及整体接受性均受好评(表七)。

表六、豆浆在37℃下乳酸菌发酵24小时后的好氧菌、乳酸菌、肠杆菌(Entero)、葡萄球菌(Staph)和假单胞菌(Pseudo)的菌数变化

                                             细菌^b(log CFU/mL)

起始物^*    发酵时间(小时)

                             APC            LAB              Entero.         Staph.          Pseudo.

             0               4.20±0.31^e   3.34±0.15^c    2.78±0.13^b    2.97±0.13^c    4.10±0.15^c

NS

             24              7.79±0.37^b   6.33±0.33^b    9.14±0.27^a    6.73±0.23^b    8.10±0.26^b

             0               6.43±0.19^b   6.45±0.12^b    3.19±0.11^b    2.80±0.25^b    3.3±0.14^b

A

             24              9.37±0.20^a   9.29±0.12^a    3.55±0.21^a    3.10±0.16^b    3.29±0.20^b

             0               6.23±0.19^b   6.35±0.12^b    3.09±0.11^e    2.90±0.25^b    3.20±0.14^b

B

             24              9.32±0.21^a   9.28±0.14^a    3.45±0.21^b    3.05±0.11^b    3.09±0.20^b

^*NS：无添加起始物；A：Pediococcus pentosaceus YJL；B：Pediococcus pentosaceus YJS.

b：表中数值为3个重复实验之平均值±SD；各个处理组中，相对于同一发酵时间、同一栏中具有不同上标的数值显著地不同(p＜0.05)。

表七、豆浆在37℃下乳酸菌发酵二十四小时后之官能品评结果

起始物           官能评估            0                    24

                 品尝(Taste)         4.1±1.1^a**         4.0±1.3^a**

NS               风味(Flavor)        4.2±1.2^a          4.1±1.5^a

                 整体接受度          4.0±0.5^a          4.0±0.8^a

                 品尝(Taste)         4.3±1.1^a**         7.6±1.2^a

A                风味(Flavor)        4.0±1.2^a          7.6±1.1^a

                 整体接受度          4.0±0.7^a          7.9±0.8^a

                 品尝(Taste)         4.2±1.1^a**         7.7±1.2^a

B                风味(Flavor)        4.2±1.4^a          7.9±1.0^a

                 整体接受度          4.1±0.6^a          7.7±1.2^a

^*参考表6的附注

^**：表中数值为3个重复实验之平均值±SD；同一栏中具有不同上标的数值显著地不同(p＜0.05)。

实施例5

来自戊糖片球菌YJL及戊糖片球菌YJS的细菌素的萃取及定性结果

1.粗细菌素的分离

乳酸菌接种至MRS培养基，置于37℃培养48小时后，以5,000xg，离心30min后，上层液经0.45μm膜过滤(No.4654，Gelman)，以去除菌体。抑菌活性测定则以L.monocytogenes CCRC 14845做为指示菌株，所得滤液则进行抑菌活性测定确认其为具有抑菌活性的粗细菌素液。

2.氯仿萃取

分别接种0.1％戊糖片球菌YJL和戊糖片球菌YJS二菌液至400mL MRS培养基，置于37℃培养18小时。所得菌液以9,500g离心15min(4℃)，上层液再以0.45μm膜过滤，所得滤液混合200mL氯仿剧烈搅拌20min后进行10,400g(4℃)离心20min。离心后则分为四相，其中溶剂与水层的界面层及沉淀层具有最大的抑菌活性，利用5-10mL缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH7.0)悬浮溶解。其余二相包括水相与溶剂相均不具有活性。悬浮后的缓冲液再以真空浓缩机(40℃)(Rotavapor R114，BCHI)去除氯仿，最后浓缩至约2-3mL(Burianek和Yousef，2000)，分别命名为Pediocin YJL和Pediocin YJS。

3.SDS-PAGE

为确定细菌素的纯度并测定其分子量，将细菌素液溶解在样品缓冲液解离缓冲液(62.5mM Tris-HCl缓冲液，pH6.8，含3％SDS和0.002％溴酚蓝)并隔水煮沸5min。再以8-15％丙烯醯胺进行SDS-PAGE电泳分析(Laemmli，1970)。泳动完成后的胶片以15％TCA进行固定，用考马斯亮蓝G-250染色，最后以25％甲醇脱色，并将胶片夹于玻璃纸中阴干即可。

4.蛋白质浓度

蛋白质定量依Bradford(1976)的方法进行，并以牛血清白蛋白为标准品。

5.抑菌活性测定

本实验法是采用Piddock(1990)的琼脂扩散法。将指示菌株接种于10ml适当的培养液中，在其最适生长温度下培养8小时，调整菌液浓度约1.5×10⁵CFU/ml，取菌液0.1ml指示菌株的悬浮液加至15ml适当的培养基(45℃)中，充分振荡，再将含菌液的培养基倒入培养皿中，静置30min后移入冰箱(4℃)中放置1小时。之后，以直径8mm的金属环在培养基表面挖洞，再取细菌素溶液30μl，滴于洞内，并于指示菌株最适生长温度下培养24小时后，观察是否有抑制环并记录其大小。

6.生化特性

6.1 细菌素对蛋白水解性酶的敏感性

将细菌素液以1.0N HCl或1.0N NaOH分别调至pH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0后，各别加入所测试酵素20.0mg/ml(胃泌素[来自猪胃粘膜，Sigma]、α-胰凝乳蛋白酶[来自牛胰，Sigma]、链霉蛋白酶[来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)，Sigma]、菠萝蛋白酶[来自菠萝茎干，Sigma]，37℃作用2小时后，于80℃下加热15分钟，使蛋白质分解酵素失活，再置于冰浴槽中使其温度迅速冷却至室温，测其抑菌活性(Piddock，1990)。

6.2 经纯化的细菌素的热稳定性

首先将抑菌物质分别以1.0N HCl或NaOH调整其pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，并于80℃、100℃下15min、30min、45min、60min及121℃、15min的条件进行热处理后迅速置于冰浴槽中使其温度冷却至室温，再测其抑菌活性(Piddock，1990)。

6.3 抑菌范围试验

细菌素液Pentocin YJL和Pentocin YJS对于食品中常见病原菌及腐败菌的抑菌范围测试如表八所示。

表八、抑菌范围试验用菌株所用的培养条件

微生物                                                培养基/温度^a           来源

粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 8750               NA/37℃                 CCRC^b

Aeromonas faecalis                                    NA/37℃                 Prof.Tsai^c

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)ATCC 11059            NA/37℃                 CCRC

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 10225             NA/37℃                 CCRC

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 10254             NA/37℃                 CCRC

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC 11778               NA/37℃                 CCRC

生孢梭菌(Clostridium sporogenous)ATCC 11259           TSB/37℃                CCRC

产气肠杆菌(Enterobacter aetogenes)ATCC 13048          NA/37℃                 CCRC

大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 11229                  NA/37℃                 CCRC

大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 11303                  Na+0.5％NaCl/37℃       CCRC

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC 13182          NA/37℃                 CCRC

单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)RII     TSBYE/37℃              FDA^d

单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)LM      TSBYE/37℃              FDA

单核细胞增生利斯特氏菌CCRC 14845                      TSBYE/37℃              CCRC

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ATCC 13523       NA/26℃                 CCRC

普通变形菌(Proteus vulgaris)ATCC 13315                NA/37℃                 CCRC

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923       TSA/37℃                CCRC

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 14990    NA/37℃                 CCRC

粪肠球菌(Streptococcus faecalis)DS-5                  MRS/37℃                CCRC

痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)ATCC 13983          NA/37℃                 CCRC

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)                             Na+0.5％NaCl/26℃       CCRC

a：培养时间24小时

b：CCRC：菌种保藏和研究中心-食品工业发展研究所

c：国立台湾海洋大学食品科学系江善宗教授实验室

d：NLFD：行政院卫生署药物食品检验局

7.结果

7.1 戊糖片球菌YJL和戊糖片球菌YJS细菌素的纯化

根据超滤膜浓缩所得细菌素液进行SDS-PAGE电泳分析及经蛋白酶作用后均无抑菌活性，显见Pentocins YJL和YJS其分子量为27与25kDa且该细菌素为一蛋白质。此外，Pentocin YJL和Pentocin YJS分别在pH4.0-8.0与pH4.0-6.0时，80℃加热30min仍有80％残存活性。Pentocin YJS甚至pH4.0和5.0于100℃加热30min后亦分别有41％及37％残存活性。Pentocin YJL在pH4.0下，经100℃加热30min后仍有34％残存活性。该现象显示这两个细菌素可广泛应用在作为多种加工制程上的天然保鲜剂。

7.2 抑菌范围

Pentocin YJL和Pentocin YJS对于食品中常见病原菌及腐败菌的抑菌范围测试结果列于表九。由表中可观察到Pentocin YJL对革兰氏阴性菌Shigella、E.aerogenes、P.vulgaris、S.dysenteriae、V.cholerae及革兰氏阳性菌B.subtilis、B.cereus、B.circular、L.monocytogenes、S.epidermidis等有明显的抑制表现。细菌素Pentocin YJS对革兰氏阴性菌Shigella、K.oxytoca、V.cholerae和革兰氏阳性菌B.subtilis、B.cereus、B.circular及L.monocytogenes等有抑菌表现。显示此二细菌素为一广效性细菌素。

表九  Phentocins YJL和YJS细菌素液抑菌范围

微生物                                             Pentocin YJL           Pentocin YJS

G(-)

粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)ATCC 8750            -^*                    -

Aeromonas faecalis                                 -                      -

产气肠杆菌(Enterobacter aetogenes)ATCC 13048       +                      -

大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 11229               -                      -

大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 11303               +                      -

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)ATCC 13182       +                      +

荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)ATCC 13523    -                      -

普通变形菌(Proteus vulgaris)ATCC 13315             +                      +

痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)ATCC 13983       +                      +

霍乱弧菌(Vibrio cholerae)                          +                      +

G(+)

单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)RII  +                      +

单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)LM   +                      +

单核细胞增生利斯特氏菌CCRC 14845                   +                      +

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923    -                      -

表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)ATCC 14990 +                      -

粪肠球菌(Streptococcus faecalis)DS-5               -                      -

形成孢子的细菌

环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)ATCC 11059         +                      +

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 10225          +                      +

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 10254          +                      +

蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)ATCC 11778            +                      +

生孢梭菌(Clostridium sporogenous)ATCC 11259        +                      +

^*：a：″-″抑制区＜6mm；b：″+″抑制区＞6mm

7.3 产孢菌及其孢子萌发的抑制

由上述结果发现细菌素Pentocin YJL和Pentocin YJS对Bacillus和Clostridium等产孢菌有良好的抑菌效果，因此进一步探讨对Bacillus subtilis ATCC 10225、B.subtilis ATCC 10254、B.cereus等产孢菌的孢子进行抑制活性试验。由表十发现此二细菌素均具有明显抑制孢子萌发的效果，以细菌素Pentocin YJL而言，抑制Bacillussubtilis ATCC 10225、B.subtilis ATCC 10254、B.cereus产孢菌的抑菌环面积分别为120.3、174.3、236.3mm²；抑制孢子萌发的抑菌环面积分别为64.0、96.3、189.0mm²。以细菌素Pentocin YJS而言，抑制产孢菌的抑菌环面积分别为189.0、146.3、236.3mm²；抑制孢子萌发的抑菌环面积分别为85.0、108.0、189.0mm²。由结果得知细菌素PentocinYJL和Pentocin YJS均对B.cereus及其孢子萌发的抑制环面积最大，可达236.3、189.0mm²。此外，二株菌的细菌素对产孢菌的抑菌效果较抑制孢子佳。

本发明并不限定于上述实施型态，于不脱离其要旨的范围内，可施以诸种改变而加以实施。

表十、Pentocins YJL和YJS细菌素液对产孢菌的繁殖体及孢子生长的抑制效果

                                     抑制区(mm²)

细菌                                 Pentocin YJL          Pentocin YJS

枯草芽孢杆菌ATCC 10225

营养细胞                             120.3                 189.0

孢子                                 64.0                  85.0

枯草芽孢杆菌ATCC 10254

营养细胞                             174.3                 146.3

孢子                                 96.3                  108.0

蜡状芽孢杆菌ATCC 11778

营养细胞                             236.3                 236.3

孢子                                 189.0                 189.0

Claims (31)

1.一种保藏号为BCRC 910210的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)YJL。

2.一种保藏号为BCRC 910211的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)YJS。

3.一种鱼肉加工方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的乳酸菌、或权利要求1和2的混合乳酸菌、或与其它乳酸菌的混合乳酸菌进行鱼肉发酵；其加工方法为：鱼肉加0.3～2.0％食盐及0.5～3倍水后使其均质，经100～115℃杀菌15～30分钟后冷却至25～40℃，在从不稀释到稀释五倍的范围内调整基质水分含量，并添加1.0～6.0％的糖，然后接种乳酸菌，在25～40℃发酵6～30小时后任意添加适当量的调味剂及香辛料或进行包装。

4.如权利要求3所述的鱼肉加工方法，其中其它乳酸菌的混合乳酸菌为1种以上选自嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC14092的混合乳酸菌。

5.如权利要求3所述的鱼肉加工方法，其中鱼肉原料为至少一种选自红色肉、白色肉鱼、其混合鱼肉、冷冻鱼浆的鱼肉原料。

6.如权利要求3所述的鱼肉加工方法，其中糖原料为至少一种选自蔗糖、葡萄糖、甜菜的糖原料。

7.如权利要求3所述的鱼肉加工方法，其中鱼肉基质是未经稀释或至多经五倍稀释的鱼肉浆。

8.如权利要求3所述的鱼肉加工方法，其中调味剂为至少一种选自水果、加工的水果酱、芝麻、花生的调味剂。

9.如权利要求3所述的鱼肉加工方法，其中香辛料为至少一种选自姜、蒜、味淋、酒、五香粉的香辛料。

10.如权利要求3所述的鱼肉加工方法，其中发酵后基质的pH在3.8～5.5。

11.一种鱼肉加工食品，其特征在于，它是用权利要求1或2的乳酸菌、或权利要求1和2的混合乳酸菌、或和其它乳酸菌的混合乳酸菌进行鱼肉原料发酵所得的食品。

12.如权利要求11所述的食品，其中其它乳酸菌的混合乳酸菌为1种以上选自嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC 14092的乳酸菌。

13.一种鱼肉加工食品，其特征在于，它是用权利要求3所述的鱼肉加工方法进行鱼肉原料发酵所得的食品。

14.一种鱼肉加工食品，其特征在于，它是用权利要求3所述的鱼肉加工方法进行鱼肉原料发酵后在90～115℃加热杀菌、成型、部分干燥所得的类似起司的产品。

15.如权利要求11～14中任一项的鱼肉加工食品，其中鱼肉原料为至少一种选自红色肉、白色肉鱼、其混合鱼肉或冷冻鱼浆的鱼肉原料。

16.一种豆类加工方法，其特征为用权利要求1或2的乳酸菌、或权利要求1和2的混合乳酸菌、或与其它乳酸菌的混合乳酸菌进行豆类发酵；其加工方法为：经浸泡的豆类加水后均质、过滤后在经100～115℃加热杀菌15～30分钟后冷却至25～40℃，调整基质水分含量，添加1.0～6.0％的糖后接种乳酸菌，在25～40℃发酵6～30小时后任意添加适当量的调味剂或进行包装。

17.如权利要求16所述的加工方法，其中其它乳酸菌的混合乳酸菌为1种以上选自嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC14092的乳酸菌。

18.如权利要求16所述的豆类加工方法，其中豆类原料为至少一种选自黄豆或黑豆的豆类原料。

19.如权利要求16所述的豆类加工方法，其中糖原料为至少一种选自蔗糖、葡萄糖、甜菜的糖原料。

20.如权利要求16所述的豆类加工方法，其中豆类发酵基质的水分含量为50％～98％。

21.如权利要求16所述的豆类加工方法，其中调味剂为至少一种选自水果、加工的水果酱的调味剂。

22.如权利要求16所述的豆类加工方法，其中发酵后豆类基质的pH在4.5～6.0。

23.一种豆类加工食品，其特征在于，它是用权利要求1或2的乳酸菌、或权利要求1和2的混合乳酸菌、或与其它乳酸菌的混合乳酸菌进行豆类原料发酵所得的食品。

24.如权利要求23的加工方法，其中其它乳酸菌的混合乳酸菌为1种以上选自嗜酸乳杆菌CCRC10069，乳酸乳球菌乳亚种CCRC 12315，瑞士乳杆菌CCRC 14092的乳酸菌。

25.一种豆类加工食品，其特征在于，它是用权利要求16的豆类加工方法进行豆类原料发酵所得的食品。

26.如权利要求23～25中任一项的豆类加工食品，其中豆类为至少一种选自黄豆、黑豆、或其混合物的豆类。

27.一种豆类加工食品，其特征在于，它是用权利要求16所述的豆类加工方法进行豆类原料发酵后在90～115℃加热杀菌、成型、部分干燥所得的类似起司的产品。

28.一种细菌素，其特征为，它来自权利要求1所述的乳酸菌。

29.如权利要求28所述的细菌素，其为分子量为20～30kDa的抑菌性物质。

30.一种细菌素，其特征为，它来自权利要求2所述的乳酸菌。

31.如权利要求30所述的细菌素，其为分子量为20～30kDa的抑菌性物质。

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