CN1587400A - 凝血酶分离纯化方法 - Google Patents

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马永征
李敏康
宋宏新
王旭
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Abstract

一种凝血酶分离纯化方法，首先取动物血液为原材料，将此血液加入柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；离心分离获得血浆；经冷冻、解冻，再次离心获得上清液；在上清液中加入BaCl2离心收集沉淀物；在此沉淀物中加入EDTA溶液解吸附，再次离心弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。本发明通过将血浆冷冻，低温解冻先有效地去除了部分纤维蛋白原，提高了凝血酶的得率，通过优化离子交换层析获得高纯度的凝血酶，其比活力为1500U/mg蛋白，得率为0.4‰。

Description

凝血酶分离纯化方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域的凝血酶分离纯化的方法。
背景技术
现有凝血酶分离纯化的工艺较复杂：一种是在400ml新鲜原料猪血浆中滴加32ml浓度为1mol/L的BaCl2溶液，搅拌，离心分离取沉淀。沉淀用0.02mol/L，pH7.4Tris-HCl缓冲液，洗涤2次后，用0.02mol/L，Tris-HCl缓冲液，pH7.4(含0.2mol/l的EDTANa2，0.1mol/LNaCl)解吸附，离心取上清，透析过夜。透析后样品中加入固体(NH4)2SO4达到35％的饱和度，去沉淀。然后样品加入固体(NH4)2SO4达到65％～70％的饱和度，离心收集沉淀。沉淀溶于0.02mol/L，Tris-HCl pH8.0，再透析过夜。透析后的样品溶液加入CaCl2使Ca2+终浓度达到0.1mol/L，再加入活化剂，室温下激活凝血酶原，直到活性达到最大。经Amberllte CG-50柱层析，收集活性峰，透析3h后，再进行SP-SephadexC-50柱层析，收集活性峰，透析除盐，得到凝血酶纯品。比活力达到1954.5NIH U/mg。(林缨、刘彦信等.高纯度人凝血酶的制备.中国医学院科学院学报.1995.17(1)：36～39)。这种工艺流程较复杂，生产周期较长，至少需要3天。另一种是取猪血浆400ml，缓慢加入1.0mol/LBaCl2溶液24ml，在磁力搅拌器上搅拌1h后，3000转/分钟离心15min，收集柠檬酸钡沉淀，将沉淀溶于pH8.0，0.2mol/LEDTA溶液中，搅拌1h后，300转/分钟离心15min，弃不溶物，将上清液对0.05mol/L，pH7.5的Tris-HCl缓冲液透析，不断更换透液，至无Ba2+为止。得到猪凝血酶原的粗样品液。凝血酶原的粗样品液加入0.1mol/L，CaCl2，25℃下激活2h，得到凝血酶粗品。凝血酶粗品经免疫亲和层析(Sepharose4B为载体，肝素为配基)获得凝血酶纯品。比活力达到1111U/mg。(肖丽霞、史永昶等猪凝血酶的分离纯化及部分性质研究.江苏农业研究.1999.20(3)：63～66)。这种工艺较简单，但是使用了亲和层析，成本较高。另外按上述两种方法获得的凝血酶原粗品中纤维蛋白原含量过高，激活后凝血酶损失，导致凝血酶的得率下降。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离纯化工艺简单，而且能够提高凝血酶纯度的凝血酶分离纯化的方法。
为达到上述目的本发明采用的分离纯化方法为：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2500～3000转/分钟的离心力下离心5～10分钟分离获得血浆；将此血浆在-20～-30℃冷冻1～3天后，2～4℃解冻，在4℃以2500～3000转/分钟的离心力下离心5～10分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入80～120ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3500～4000转/分钟的离心力离心5～10分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3500～4000转/分钟的离心力离心5～10分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
本发明通过将血浆冷冻，低温解冻先有效地去除了部分纤维蛋白原，提高了凝血酶的得率，通过优化离子交换层析获得高纯度的凝血酶，其比活力为1500U/mg蛋白，得率为0.4‰。
具体实施方式
实施例1：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2500转/分钟的离心力下离心10分钟分离获得血浆；将此血浆在-30℃冷冻1天后，2℃解冻，在4℃以2600转/分钟的离心力下离心7分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入80ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以4000转/分钟的离心力离心10分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3800转/分钟的离心力离心5分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例2：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2800转/分钟的离心力下离心7分钟分离获得血浆；将此血浆在-25℃冷冻3天后，4℃解冻，在4℃以2800转/分钟的离心力下离心8分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入90ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3500转/分钟的离心力离心6分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以4000转/分钟的离心力离心9分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例3：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2600转/分钟的离心力下离心5分钟分离获得血浆；将此血浆在-29℃冷冻3天后，3℃解冻，在4℃以3000转/分钟的离心力下离心6分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入110ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3800转/分钟的离心力离心5分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3600转/分钟的离心力离心7分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例4：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2750转/分钟的离心力下离心8分钟分离获得血浆；将此血浆在-26℃冷冻2天后，2℃解冻，在4℃以2750转/分钟的离心力下离心5分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入120ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3600转/分钟的离心力离心7分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3500转/分钟的离心力离心10分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例5：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以3000转/分钟的离心力下离心6分钟分离获得血浆；将此血浆在-28℃冷冻1天后，3℃解冻，在4℃以2500转/分钟的离心力下离心10分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入100ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3900转/分钟的离心力离心8分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3700转/分钟的离心力离心8分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例6：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2900转/分钟的离心力下离心9分钟分离获得血浆；将此血浆在-27℃冷冻2天后，4℃解冻，在4℃以2900转/分钟的离心力下离心9分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入105ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3700转/分钟的离心力离心9分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3900转/分钟的离心力离心6分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。

Claims (7)

  1. 一种凝血酶分离纯化方法，其特征在于：
    1)首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；
    2)在4℃以2500～3000转/分钟的离心力下离心5～10分钟分离获得血浆；
    3)将此血浆在-20～-30℃冷冻1～3天后，2～4℃解冻，在4℃以2500～3000转/分钟的离心力下离心5～10分钟分离获得上清液；
    4)在每升上清液中加入80～120ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3500～4000转/分钟的离心力离心5～10分钟收集沉淀物；
    5)在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3500～4000转/分钟的离心力离心5～10分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；
    6)室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
  2. 2、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法，其特征在于：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2500转/分钟的离心力下离心10分钟分离获得血浆；将此血浆在-30℃冷冻1天后，2℃解冻，在4℃以2600转/分钟的离心力下离心7分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入80ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以4000转/分钟的离心力离心10分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3800转/分钟的离心力离心5分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
  3. 3、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法，其特征在于：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2800转/分钟的离心力下离心7分钟分离获得血浆；将此血浆在-25℃冷冻3天后，4℃解冻，在4℃以2800转/分钟的离心力下离心8分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入90ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3500转/分钟的离心力离心6分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以4000转/分钟的离心力离心9分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
  4. 4、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法，其特征在于：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2600转/分钟的离心力下离心5分钟分离获得血浆；将此血浆在-29℃冷冻3天后，3℃解冻，在4℃以3000转/分钟的离心力下离心6分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入110ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3800转/分钟的离心力离心5分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3600转/分钟的离心力离心7分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
  5. 5、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法，其特征在于：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2750转/分钟的离心力下离心8分钟分离获得血浆；将此血浆在-26℃冷冻2天后，2℃解冻，在4℃以2750转/分钟的离心力下离心5分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入120ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3600转/分钟的离心力离心7分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3500转/分钟的离心力离心10分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
  6. 6、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法，其特征在于：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以3000转/分钟的离心力下离心6分钟分离获得血浆；将此血浆在-28℃冷冻1天后，3℃解冻，在4℃以2500转/分钟的离心力下离心10分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入100ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3900转/分钟的离心力离心8分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3700转/分钟的离心力离心8分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
  7. 7、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法，其特征在于：首先取动物血液为原材料，在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8％的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂；在4℃以2900转/分钟的离心力下离心9分钟分离获得血浆；将此血浆在-27℃冷冻2天后，4℃解冻，在4℃以2900转/分钟的离心力下离心9分钟分离获得上清液；在每升上清液中加入105ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液，在4℃以3700转/分钟的离心力离心9分钟收集沉淀物；在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附，在4℃下以3900转/分钟的离心力离心6分钟弃去沉淀，获得凝血酶原粗液；室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l，再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品，冷冻干燥得到凝血酶成品。
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