CN1587400A - 凝血酶分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
一种凝血酶分离纯化方法,首先取动物血液为原材料,将此血液加入柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;离心分离获得血浆;经冷冻、解冻,再次离心获得上清液;在上清液中加入BaCl2离心收集沉淀物;在此沉淀物中加入EDTA溶液解吸附,再次离心弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。本发明通过将血浆冷冻,低温解冻先有效地去除了部分纤维蛋白原,提高了凝血酶的得率,通过优化离子交换层析获得高纯度的凝血酶,其比活力为1500U/mg蛋白,得率为0.4‰。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域的凝血酶分离纯化的方法。
背景技术
现有凝血酶分离纯化的工艺较复杂:一种是在400ml新鲜原料猪血浆中滴加32ml浓度为1mol/L的BaCl2溶液,搅拌,离心分离取沉淀。沉淀用0.02mol/L,pH7.4Tris-HCl缓冲液,洗涤2次后,用0.02mol/L,Tris-HCl缓冲液,pH7.4(含0.2mol/l的EDTANa2,0.1mol/LNaCl)解吸附,离心取上清,透析过夜。透析后样品中加入固体(NH4)2SO4达到35%的饱和度,去沉淀。然后样品加入固体(NH4)2SO4达到65%~70%的饱和度,离心收集沉淀。沉淀溶于0.02mol/L,Tris-HCl pH8.0,再透析过夜。透析后的样品溶液加入CaCl2使Ca2+终浓度达到0.1mol/L,再加入活化剂,室温下激活凝血酶原,直到活性达到最大。经Amberllte CG-50柱层析,收集活性峰,透析3h后,再进行SP-SephadexC-50柱层析,收集活性峰,透析除盐,得到凝血酶纯品。比活力达到1954.5NIH U/mg。(林缨、刘彦信等.高纯度人凝血酶的制备.中国医学院科学院学报.1995.17(1):36~39)。这种工艺流程较复杂,生产周期较长,至少需要3天。另一种是取猪血浆400ml,缓慢加入1.0mol/LBaCl2溶液24ml,在磁力搅拌器上搅拌1h后,3000转/分钟离心15min,收集柠檬酸钡沉淀,将沉淀溶于pH8.0,0.2mol/LEDTA溶液中,搅拌1h后,300转/分钟离心15min,弃不溶物,将上清液对0.05mol/L,pH7.5的Tris-HCl缓冲液透析,不断更换透液,至无Ba2+为止。得到猪凝血酶原的粗样品液。凝血酶原的粗样品液加入0.1mol/L,CaCl2,25℃下激活2h,得到凝血酶粗品。凝血酶粗品经免疫亲和层析(Sepharose4B为载体,肝素为配基)获得凝血酶纯品。比活力达到1111U/mg。(肖丽霞、史永昶等猪凝血酶的分离纯化及部分性质研究.江苏农业研究.1999.20(3):63~66)。这种工艺较简单,但是使用了亲和层析,成本较高。另外按上述两种方法获得的凝血酶原粗品中纤维蛋白原含量过高,激活后凝血酶损失,导致凝血酶的得率下降。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离纯化工艺简单,而且能够提高凝血酶纯度的凝血酶分离纯化的方法。
为达到上述目的本发明采用的分离纯化方法为:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2500~3000转/分钟的离心力下离心5~10分钟分离获得血浆;将此血浆在-20~-30℃冷冻1~3天后,2~4℃解冻,在4℃以2500~3000转/分钟的离心力下离心5~10分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入80~120ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3500~4000转/分钟的离心力离心5~10分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3500~4000转/分钟的离心力离心5~10分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
本发明通过将血浆冷冻,低温解冻先有效地去除了部分纤维蛋白原,提高了凝血酶的得率,通过优化离子交换层析获得高纯度的凝血酶,其比活力为1500U/mg蛋白,得率为0.4‰。
具体实施方式
实施例1:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2500转/分钟的离心力下离心10分钟分离获得血浆;将此血浆在-30℃冷冻1天后,2℃解冻,在4℃以2600转/分钟的离心力下离心7分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入80ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以4000转/分钟的离心力离心10分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3800转/分钟的离心力离心5分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例2:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2800转/分钟的离心力下离心7分钟分离获得血浆;将此血浆在-25℃冷冻3天后,4℃解冻,在4℃以2800转/分钟的离心力下离心8分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入90ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3500转/分钟的离心力离心6分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以4000转/分钟的离心力离心9分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例3:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2600转/分钟的离心力下离心5分钟分离获得血浆;将此血浆在-29℃冷冻3天后,3℃解冻,在4℃以3000转/分钟的离心力下离心6分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入110ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3800转/分钟的离心力离心5分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3600转/分钟的离心力离心7分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例4:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2750转/分钟的离心力下离心8分钟分离获得血浆;将此血浆在-26℃冷冻2天后,2℃解冻,在4℃以2750转/分钟的离心力下离心5分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入120ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3600转/分钟的离心力离心7分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3500转/分钟的离心力离心10分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例5:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以3000转/分钟的离心力下离心6分钟分离获得血浆;将此血浆在-28℃冷冻1天后,3℃解冻,在4℃以2500转/分钟的离心力下离心10分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入100ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3900转/分钟的离心力离心8分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3700转/分钟的离心力离心8分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
实施例6:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2900转/分钟的离心力下离心9分钟分离获得血浆;将此血浆在-27℃冷冻2天后,4℃解冻,在4℃以2900转/分钟的离心力下离心9分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入105ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3700转/分钟的离心力离心9分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3900转/分钟的离心力离心6分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
Claims (7)
- 一种凝血酶分离纯化方法,其特征在于:1)首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;2)在4℃以2500~3000转/分钟的离心力下离心5~10分钟分离获得血浆;3)将此血浆在-20~-30℃冷冻1~3天后,2~4℃解冻,在4℃以2500~3000转/分钟的离心力下离心5~10分钟分离获得上清液;4)在每升上清液中加入80~120ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3500~4000转/分钟的离心力离心5~10分钟收集沉淀物;5)在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3500~4000转/分钟的离心力离心5~10分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;6)室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
- 2、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法,其特征在于:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2500转/分钟的离心力下离心10分钟分离获得血浆;将此血浆在-30℃冷冻1天后,2℃解冻,在4℃以2600转/分钟的离心力下离心7分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入80ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以4000转/分钟的离心力离心10分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3800转/分钟的离心力离心5分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
- 3、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法,其特征在于:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2800转/分钟的离心力下离心7分钟分离获得血浆;将此血浆在-25℃冷冻3天后,4℃解冻,在4℃以2800转/分钟的离心力下离心8分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入90ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3500转/分钟的离心力离心6分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以4000转/分钟的离心力离心9分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
- 4、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法,其特征在于:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2600转/分钟的离心力下离心5分钟分离获得血浆;将此血浆在-29℃冷冻3天后,3℃解冻,在4℃以3000转/分钟的离心力下离心6分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入110ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3800转/分钟的离心力离心5分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3600转/分钟的离心力离心7分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
- 5、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法,其特征在于:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以2750转/分钟的离心力下离心8分钟分离获得血浆;将此血浆在-26℃冷冻2天后,2℃解冻,在4℃以2750转/分钟的离心力下离心5分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入120ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3600转/分钟的离心力离心7分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3500转/分钟的离心力离心10分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
- 6、根据权利要求1所述的凝血酶分离纯化方法,其特征在于:首先取动物血液为原材料,在此血液中按9∶1的体积比加入质量百分比浓度为3.8%的柠檬酸钠溶液作为抗凝剂;在4℃以3000转/分钟的离心力下离心6分钟分离获得血浆;将此血浆在-28℃冷冻1天后,3℃解冻,在4℃以2500转/分钟的离心力下离心10分钟分离获得上清液;在每升上清液中加入100ml的浓度为1mol/l的BaCl2溶液,在4℃以3900转/分钟的离心力离心8分钟收集沉淀物;在此沉淀物中加入pH值为7.4的0.2mol/l的EDTA溶液解吸附,在4℃下以3700转/分钟的离心力离心8分钟弃去沉淀,获得凝血酶原粗液;室温下向凝血酶原粗液中加入CaCl2溶液使凝血酶原粗液浓度达到0.1mol/l,再经DEAE——纤维素阴离子交换柱层析获得凝血酶纯品,冷冻干燥得到凝血酶成品。
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