CN1580779A - 生物样品结构氢氘置换的证实及氘百分含量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种氢同位素分析方法，特别是用于生物样品结构氢氘置换及氘百分含量的一种测定方法。它选取一种基质，将制备得到的生物样品与适量的基质均匀混合再冻干，冻干混合样品被氧化剂充分燃烧氧化，混合样品中的氢被氧化为水，生成的水经分离后与锌反应生成氢气，氢气的²H/¹H比值用气体同位素质谱仪测定，再通过计算公式计算出生物样品中氘的百分含量。生物样品的氘百分含量增大，其生物性状发生明显改变，主要是其耐热性发生明显改变。确定出生物样品最优耐热性的氘百分含量和生物样品的最优氘化条件，提高多肽等的稳定性。该方法测定重复性好，简单易操作，样品用量少，成本低。

Description

生物样品结构氢氘置换的证实及氘百分含量的测定方法

                            技术领域

本发明涉及氢同位素分析的一种方法，特别是用于生物样品结构氢氘置换及氘百分含量的一种测定方法。

                            背景技术

自1932年Urey等发现氢同位素氘以来，氘被广泛地应用于生物医学领域。重水对生物的影响也被广泛研究，如重水对细菌、真菌、植物及哺乳动物等的生长发育的影响等。1965年毛江森、黄祯祥等研究发现对热极为敏感的日本脑炎病毒(JEV)在重水处理过的细胞中繁殖其热稳定性增强，近年来，研究发现脊髓灰质炎病毒、流感病毒及甲肝病毒(HAV)用重水处理后也得到类似的结果。然而，重水对这些病毒的作用真实机理尚不清楚，而病毒结构中的氢被氘置换是其可能的合理解释，但是，至今尚无直接方法能证实病毒颗粒中的氢氘置换及测定其氘含量。因而无法优化生物样品的氘化条件和规范氘化的工艺。

氢同位素分析方法研究发展至今，已经有许多分析技术，如冰点法、折射率法、电阻率法、热电导率法、红外光谱法、中子热能谱法、气相色谱法、核磁共振法(NMR)和化学电离质谱法等。稳定同位素氘示踪质谱法是广泛用于生物医学研究领域中的分析方法，大量用于代谢产物的测定和鉴定、代谢途径的机理研究、分析生物体内药物和代谢产物的浓度测定。该法通过测量分子离子或少数特征碎片离子的强度，能确定待测物质的分子组成而了解待测物质的性质，测定待测物质的含量。它不需测出完整的质谱图，即只将感兴趣的化合物分离出来，然后使用离子监测技术，取得一部分质谱图，测定标记与不标记成分的比率。此法测定比值的精确度很低，一般为1～10％，但是此法具有特异性及高灵敏度。最近二十多年发展起来的分离技术，如毛细管分离技术大幅度地提高了稳定同位素氘示踪质谱分析方法准确度、灵敏度、选择性及专属性，使其越来越成为在生物医学领域研究中最重要的分析方法。但是该方法也有较大的局限性：①使用的测试仪器主要为气质联用(GC-MS)和液质联用(LC-MS)，测试仪器价格较贵；②高纯度稳定氘同位素标记药物的获得难度大、量小、合成价格较高；③样本处理和测试分析技术操作较繁琐费时。

²H-NMR法因具有深入物质内部、不破坏样品、提供生物分子量和分子结构等参数等优点而广泛地应用于生物化学及临床医学上。氘在自然界中的丰度低，氘的天然丰度为150×10^-6左右，它的灵敏度约为氢的150×10^-6。氘核的核磁矩较小，自旋量子数为1，氘核的旋磁比较低，所以氘核的共振频率也低，谱线的分散度也低，因而²H-NMR法的灵敏度很低。因此要得到满意的信噪比信号及测定精度，需要较多的样品量和较长的分析时间，样品在测定前需纯化。

近年来，迅速发展的生命科学提出了测定生物样品的氘含量问题。在生命科学的某些领域，一般只能提供微克量级的生物富氘样品，如JEV及HAV的研究，要证实整个病毒颗粒发生氢氘置换并测定病毒颗粒中氘百分含量，现有的氢同位素分析方法均不能直接用于这些生物样品的氢同位素分析。

                             发明内容

本发明的目的是发明一种新的氢同位素分析方法来证实所研究生物样品发生氢氘置换反应并计算其氘百分含量。能确定出生物样品最优含氘百分量和生物样品的最优氘化条件，提高多肽等的稳定性。通过该方法检测生物样品的氘百分含量，结果表明生物样品的氘百分含量增大，其生物性状发生明显改变，主要是其耐热性发生明显改变。

本发明是选取一种基质，将制备得到的生物样品与适量的基质均匀混合再冻干，冻干混合样品被氧化剂充分燃烧氧化，混合样品中的氢被氧化为水，生成的水经分离后与锌反应生成氢气。氢气的²H/¹H比值用气体同位素质谱仪测定，样品²H/¹H比值以δD_SMOW表示，即相对于国际标准平均海洋水(SMOW)的氢氘比值的变化值，再通过相应的计算公式计算出生物样品中氘的百分含量。可证实微生物和生物大分子发生氢氘置换，确定生物样品最优含氘量或最优氘化条件，证实微生物和生物分子的稳定性和耐热性与其氘含量密切相关。

本发明包括选取天然已知蛋白质作为基质。各纯化后的生物样品用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释至所需浓度，终体积均为0.1ml，然后加入0.5ml含5mg牛血清白蛋白(BSA)溶液。再将该混合样品放入到GEL-1型冻干机中冻干，冻干后混合样品水份含量＜3％(Karl Fischer Titrator法测定)。冻干混合样品与氧化剂CuO(500mg)和V₂O₅(50mg)在100℃温度下脱吸附水15min～30min，再于800℃～950℃下燃烧氧化反应，15min～30min反应完全后样品被彻底氧化成CO₂、H₂O以及NO₂等物质。将产物中的水分离并转移到水样品反应管中，水与锌于400℃～450℃下反应1.5h～2.5h被转化为氢气，其²H/¹H比值用气体同位素质谱仪MAT-251测定。

样品氢同位素的δD值通常以相对于世界通用的氢同位素标准-标准平均大洋水(Standard Mean Ocean Water，SMOW)表示，定义如下：

${\mathrm{\δD}}_{\mathrm{SA}-\mathrm{SMOW}}=\frac{R_{\mathrm{SA}}-R_{\mathrm{SMOW}}}{R_{\mathrm{SMOW}}}\×{10}^3,$

其中R_SA表示样品的²H/¹H比值；R_SMOW表示国际标准SMOW的²H/¹H比值，δD值一般只取整数。由样品的δD值可计算出生物样品的氘百分含量。

本发明测定方法包括如下步骤：

1.选取天然已知蛋白质作为基质，以磷酸缓冲液(PBS)配制浓度为10mg/ml的BSA溶液。

2.各生物样品纯化后以PBS稀释成一定浓度的样品溶液，终体积为0.1ml。

3.将0.1ml的生物样品溶液加入到0.5ml浓度为10mg/ml的BSA溶液中，该混合样品放入到GEL-1型冻干机中冻干。

4.冻干混合样品与氧化剂CuO(500mg)和V₂O₅(50mg)在100℃温度下脱吸附水15min～30min，再于800℃～950℃下燃烧氧化反应，15min～30min反应完全后样品被彻底氧化成CO₂、H₂O以及NO₂等物质。将产物中的水分离并转移到水样品反应管中，水与锌于400℃～450℃下反应1.5h～2.5h被转化为氢气，其²H/¹H比值用气体同位素质谱仪MAT-251测定。

5.由样品的δD值计算出生物样品的氘百分含量，具体计算公式如下：

第一步，

${\mathrm{\δD}}_{\mathrm{SA}\_\mathrm{SMOW}}=\frac{R_{\mathrm{SA}}-R_{\mathrm{SMOW}}}{R_{\mathrm{SMOW}}}\×{10}^3---\left(1\right)$

式中R_SA表示混合样品的²H/¹H比值，R_SMOW表示国际标准SMOW的²H/¹H比值，且R_SMOW＝(155.76±0.05)×10^-6。

第二步，R_SA＝²H/¹H比值，由基质BSA及生物样品两部分共同构成，各参数分别如表1所示。

表1基质BSA和生物样品参数

物质                 表示符号        物质用量        氢百分含量       氘百分含量

牛血清白蛋白         BSA             m_BSA            C_BSA ^H            C_BSA ^D

生物样品             bio             m_bio            C_bio ^H            C_bio ^D

则，

$R_{\mathrm{SA}}=\frac{\frac{1}{2}(m_{\mathrm{BSA}}\·C_{\mathrm{BSA}}^D+m_{\mathrm{bio}}\·C_{\mathrm{bio}}^D)}{m_{\mathrm{BSA}}\·C_{\mathrm{BSA}}^H+m_{\mathrm{bio}}\·C_{\mathrm{bio}}^H}\≈\frac{1}{2}\·\frac{C_{\mathrm{bio}}^D}{C_{\mathrm{BSA}}^H}\·\frac{m_{\mathrm{bio}}}{m_{\mathrm{BSA}}}+\frac{1}{2}\·\frac{C_{\mathrm{BSA}}^D}{C_{\mathrm{BSA}}^H}$

$=\frac{1}{2}\·\frac{C_{\mathrm{bio}}^D}{C_{\mathrm{BSA}}^H}\·\frac{m_{\mathrm{bio}}}{m_{\mathrm{BSA}}}+R_{\mathrm{BSA}}---\left(2\right)$

第三步， ${\mathrm{\δD}}_{\mathrm{SA}-\mathrm{SMOW}}=\frac{R_{\mathrm{SA}}-R_{\mathrm{SMOW}}}{R_{\mathrm{SMOW}}}\×{10}^3=\frac{\frac{1}{2}\·\frac{C_{\mathrm{bio}}^D}{C_{\mathrm{BSA}}^H}\·\frac{m_{\mathrm{bio}}}{m_{\mathrm{BSA}}}+R_{\mathrm{BSA}}-R_{\mathrm{SMOW}}}{R_{\mathrm{SMOW}}}\×{10}^3$

$=\frac{500\·C_{\mathrm{bio}}^D}{R_{\mathrm{SMOW}}\·C_{\mathrm{BSA}}^H}\·\frac{m_{\mathrm{bio}}}{m_{\mathrm{BSA}}}+{\mathrm{\δD}}_{\mathrm{BSA}-\mathrm{SMOW}}---\left(3\right)$

R_SMOW为(155.76±0.05)×10^-6，δD_BSA-SMOW可测得，C_BSA ^H可通过计算得出，生物样品的C_bio ^D为未知定值。第四步，令 $K=\frac{500\·C_{\mathrm{bio}}^D}{R_{\mathrm{SMOW}}\·C_{\mathrm{BSA}}^H},$ 则公式(3)可变形为 ${\mathrm{\δD}}_{\mathrm{SA}-\mathrm{SMOW}}=K\·\frac{m_{\mathrm{bio}}}{m_{\mathrm{BSA}}}+{\mathrm{\δD}}_{\mathrm{BSA}-\mathrm{SMOW}}---\left(4\right)$

则δD_SA-SMOW与

呈直线关系。

基质辅助气体同位素质谱分析法具有明显的优点，第一，测定准确，重复性好；第二，样品用量极少；第三，测定简单易操作，成本低；第四，样品δD_SMOW值和生物样品加入剂量呈直线关系，由该直线斜率K或直接由公式(3)可求出C_bio ^D值，即生物样品的氘百分含量。

                          附图说明

图1不同培养环境JEV的热稳定性比较实验

将氘化JEV(含36％D₂O培养)及未氘化JEV(不含D₂O培养)在50℃加热灭活，以PFU降低值对时间作图。在相同灭活时间时，氘化JEV的PFU降低值较未氘化JEV小。

图2不同培养环境HAV的稳定性比较实验

氘化HAV(HAV颗粒重悬于87％D₂O)与未氘化HAV(HAV颗粒重悬于H₂O)置于10℃，以CCID₅₀降低值对时间作图。在放置相同时间时，氘化HAV的CCID₅₀降低值较未氘化HAV小。

图3氘化HAV制得的V_D样品的δD_SMOW-m_bio/m_BSA×10^-3图

图4氘化HAV的核糖核酸(RNA)制得的RNA-C_D样品的δD_SMOW-m_bio/m_BSA×10^-3图

                           具体实施方式

实施例1

JEV全病毒颗粒氢氘置换的证实原代鸡胚细胞(CEC)用于繁殖JEV。CEC首先在不含重水(D₂O)的培养基中生长24h，然后在含有36％重水维持液中于37℃条件下培养2天。弃去含重水维持液，加入JEV到细胞中并吸附2h。吸附完毕后弃去吸附液，用PBS洗涤细胞2次，加入新鲜的含重水维持液，三天后收获(V_D代表氘化的JEV，V_H代表未氘化的JEV，C_D代表氘化的无病毒细胞对照)。所有病毒及相应的对照样品都经过聚乙二醇(PEG)沉淀、0.45mm滤器过滤、40％蔗糖垫底超速离心等方法进行纯化。病毒样品经甲醛灭活后，用血凝法测定其滴度(以HAU表示)。

研究发现氘化JEV与未氘化JEV于50℃时不同灭活时间下PFU滴度降低值不同，未氘化JEV在相同灭活时间下的PFU滴度降低值大于氘化JEV，见附图1。这表明在D₂O存在条件下繁殖的JEV其耐热性增强了。

选取BSA为基质，将氘化JEV、未氘化JEV及氘化的无病毒细胞对照经纯化后用PBS稀释至所需浓度，终体积均为0.1ml，然后加入0.5ml含5mgBSA的PBS液。再将该混合样品放入到GEL-1型冻干机中冻干，冻干后混合样品水份含量＜3％，制得样品分别用V_D、V_H及C_D表示。冻干混合样品与氧化剂CuO(500mg)和V₂O₅(50mg)在100℃温度下脱吸附水20min，再于850℃下燃烧氧化反应，30min反应完全后样品被彻底氧化成二氧化碳(CO₂)、水(H₂O)以及二氧化氮(NO₂)等物质。将产物中的水分离并转移到水样品反应管中，水与锌于420℃下反应2h被转化为氢气，其²H/¹H比值用气体同位素质谱仪MAT-251测定。测定V_D、V_H及C_D样品的δD_SMOW值见表2。

表2 V_D、V_H及C_D样品的δD_SMOW值

                                  δD_SMOW

样品                         JEV液加入体积量(μl)

                         7.5           15            30

V_D                      -35±3        -8±4         42±3

V_H                      -72±2        -54±0        -60±0

C_D                      -75±3        -65±0        -70±7

基质BSA的δD_SMOW值为一定值，所以混合样品的δD_SMOW值反应了所加入生物样品的²H/¹H比值高低及其加入剂量。在相同加入剂量情况下，混合样品的δD_SMOW值越大表明生物样品的²H/¹H比值越高；所加生物样品为同一样本时，混合样品的δD_SMOW值也越大则表明生物样品加入剂量越多。

由表2可知，JEV加入量相同的条件下，V_D样品的δD_SMOW值高于V_H样品；且随着加入的病毒体积量(蛋白含量)增加，其δD_SMOW值相应增大。V_D样品的δD_SMOW值增大不太可能来自于病毒样品制备中可能污染的细胞成份，因为在不同剂量时无病毒的细胞成份对照样品C_D的δD_SMOW值相似，在-65～-75之间，没有出现剂量正相关性，且与基质BSA的δD_SMOW值较为接近，这表明细胞成份对照样品C_D中的氘处于天然状态下。因此，与不含D₂O的培养基中获得的JEV相比，在D₂O存在的条件下繁殖JEV的²H/¹H比值显著增大，即氘化JEV的²H/¹H比值高于未氘化JEV，表明在D₂O存在条件下所繁殖的JEV中富集了氘，其氘含量增大，JEV病毒颗粒中的某些氢被氘所取代。

实施例2

HAV全病毒颗粒氢氘置换的证实及其氘百分含量的测定甲型肝炎病毒疫苗株(H2株)在人肺二倍体细胞中繁殖获得。感染H2株的细胞或未感染病毒的细胞对照收获后，用PBS重悬，经三次冻-化及超声波处理后，8000g离心30分钟以去除细胞碎片。收获的上清液用氯仿抽提三次，然后超速离心收获病毒或其细胞对照。样品的氘化采用以下方法：样品重悬于含87％重水的最低限度必要成分培养液(MEM)，36℃孵育一星期。氘化样品经超速离心弃去含重水的MEM，沉淀物用蒸馏水充分洗涤后，再次超速离心以收获氘化样品。洗涤过程重复三次以保证氘化样品中几乎不含有游离重水。病毒样品的滴度(半数细胞培养感染量，CCID₅₀)用细胞培养的方法测定。

研究发现氘化HAV与未氘化HAV于10℃时不同保存时间下CCID₅₀滴度降低值不同，未氘化HAV在相同保存时间下的CCID₅₀滴度降低值大于氘化HAV，见附图2。这表明D₂O存在下孵育的HAV其稳定性增强了。

选取牛血清白蛋白(BSA)为基质，将氘化HAV、未氘化HAV及氘化细胞对照用PBS稀释至所需浓度，终体积均为0.1ml，然后加入0.5ml含5mgBSA的PBS液。再将该混合样品放入到GEL-1型冻干机中冻干，冻干后混合样品水份含量＜3％，制得样品分别用V_D、V_H及C_D表示。冻干混合样品与氧化剂CuO(500mg)和V₂O₅(50mg)在100℃温度下脱吸附水20min，再于850℃下燃烧氧化反应，30min反应完全后样品被彻底氧化成二氧化碳(CO₂)、水(H₂O)以及二氧化氮(NO₂)等物质。将产物中的水分离并转移到水样品反应管中，水与锌于420℃下反应2h被转化为氢气，其²H/¹H比值用气体同位素质谱仪MAT-251测定。

测定由氘化HAV制得的V_D样品的δD_SMOW值。V_D样品的δD_SMOW值的显著升高，这不可能是由于氘化HAV颗粒中的游离水，因为其最后一次洗涤液(SV)和蒸馏水的δD_SMOW值相一致；也不可能是病毒样品中可能污染的氘化细胞成分，因为C_D样品的δD_SMOW值在本底水平。因此，V_D样品的δD_SMOW值的显著升高表明HAV在D₂O中孵育后²H/¹H比值增大，HAV颗粒发生氢氘置换富集氘；且随着氘化HAV的加入量增加，V_D样品的δD_SMOW值线性增加，即在一定范围内，

氘化HAV量(m_bio，μg)    基质BSA量(m_BSA，mR)    m_bio/m_BSA×10^-3 δD_SMOW

0                                               0                  -88

0.2                                             0.04               -51

0.5                      5                      0.10               22

1                                               0.20               55

2                                               0.40               291

V_D样品的δD_SMOW值与氘化HAV的加入量呈正比关系。V_D样品的δD_SMOW值与氘化HAV的加入量关系如表3所示。

表3氘化HAV所制得样品V_D的δD_SMOW与氘化HAV加入量的关系

将δD_SMOW对m_bio/m_BSA×10^-3作图，见附图3。

由附图3可知，直线的R²＝0.9762，具有良好的线性相关性。直线斜率为 $K=\frac{500\·C_{\mathrm{bio}}^D}{R_{\mathrm{SMOW}}\·C_{\mathrm{BSA}}^H}=917.59\×{10}^3,$ 截距为-90.004＝δD_BSA-SMOW与BSA实测值δD_BSA-SMOW＝-88一致。

计算氘化HAV的氘百分含量

^(a)由公式(1)可计算出BSA的²H/¹H比值得R_BSA＝142.05×10^-6

^(b)由BSA的氨基酸组成计算出BSA的¹H理论百分含量为 $C_{\mathrm{BSA}}^H=6.95$

(c)根据直线斜率计算得出氘化HAV的氘百分含量为

$C_{\mathrm{bio}}^D=917.59\×{10}^3\×R_{\mathrm{SMOW}}\×C_{\mathrm{BSA}}^H\×\frac{1}{500}$

$=917.59\×{10}^3\×155.76\×{10}^{-6}\×6.95\×\frac{1}{500}$

$=1.99$

实施例3

氘化HAV病毒的核糖核酸(RNA)中氢氘置换的证实及其氘百分含量的测定经充分洗涤的氘化HAV或细胞对照用于制备氘化的RNA，方法参照异硫氰酸胍-酚一步抽提法。RNA样品用分光光度法定量，并计算其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值用于表征RNA的纯度。

选取牛血清白蛋白(BSA)为基质，将氘化HAV、未氘化HAV及氘化细胞对照中提取的RNA用PBS稀释至所需浓度，终体积均为0.1ml，然后加入0.5ml含5mgBSA的PBS液。再将该混合样品放入到GEL-1型冻干机中冻干，冻干后混合样品水份含量＜3％，制得样品分别用RNA-V_D、RNA-V_H和RNA-C_D表示。冻干混合样品与氧化剂CuO(500mg)和V₂O₅(50mg)在100℃温度下脱吸附水20min，再于850℃下燃烧氧化反应，30min反应完全后样品被彻底氧化成二氧化碳(CO₂)、水(H₂O)以及二氧化氮(NO₂)等物质。将产物中的水分离并转移到水样品反应管中，水与锌于420℃下反应2h被转化为氢气，其²H/¹H比值用气体同位素质谱仪MAT-251测定。

测定样品RNA-V_D和RNA-V_H的δD_SMOW值，实验结果表明氘化HAV的RNA具有较高水平的氘含量，RNA-V_D的δD_SMOW值随着RNA加入量的增加而增大，实验结果见表4。而对照病毒RNA-V_H或细胞成份RNA-C_D的氘含量极低，这表明样品RNA-V_D的δD_SMOW值增加是因为加入的氘化HAV的RNA的²H/¹H比值高，氘化HAV的RNA的²H/¹H比值增大由于其中的氢被氘置换。

表4 RNA-V_D样品的δD_SMOW与氘化RNA加入量的关系

氘化RNA量(m_bio，μg)  基质BSA量(m_BSA，mg)    m_bio/m_BSA×10^-3  δD_SMOW

0                                              0                  -85

1                                              0.2                -60

2                                              0.4                -52

                        5

3                                              0.6                -36

4                                              0.8                -17

10                                             2                  86

将δD_SMOW对m_bio/m_BSA×10^-3作图，见附图4。

由附图4可知，直线的R²＝0.9965，具有良好的线性相关性，直线斜率为 $K=\frac{500\·C_{\mathrm{bio}}^D}{R_{\mathrm{SMOW}}\·C_{\mathrm{BSA}}^H}=84.211\×{10}^3,$ 截距为-83.474＝δD_BSA-SMOW与BSA实测值δD_BSA-SMOW＝-85一致。

计算氘化HAV的RNA的氘百分含量

^(a)由公式(1)可计算出BSA的²H/¹H比值得R_BSA＝142.52×10^-6

^(b)由BSA的氨基酸组成计算出BSA的¹H理论百分含量为 $C_{\mathrm{BSA}}^H=6.95$

(c)根据直线斜率计算得出氘化HAV的RNA的氘百分含量为

$C_{\mathrm{bio}}^D=84.211\×{10}^3\×R_{\mathrm{SMOW}}\×C_{\mathrm{BSA}}^H\×\frac{1}{500}$

$=84.211\×{10}^3\×155.76\×{10}^{-6}\×6.95\×\frac{1}{500}$

$=0.18$

Claims (6)

1.本发明是一种生物样品结构氢氘置换的证实及氘百分含量的测定方法，其特征在于选取一种基质，将制备得到的生物样品与适量的基质均匀混合后冻干，冻干混合样品被氧化剂充分燃烧氧化，混合样品中的氢被氧化为水，生成的水经分离后与锌反应生成氢气，氢气的²H/¹H比值用气体同位素质谱仪测定，再通过公式计算出生物样品中氘的百分含量。

2.根据权利要求1所述的生物样品结构氢氘置换的证实及氘百分含量的测定方法，其特征在于生物样品为微生物或蛋白质或核酸的氘百分含量的测定。

3.根据权利要求1所述的生物样品结构氢氘置换的证实及氘百分含量的测定方法，其特征在于采用天然已知蛋白质作为基质。

4.根据权利要求1所述的生物样品结构氢氘置换的证实及氘百分含量的测定方法，其特征在于证实微生物和生物大分子发生氢氘置换。

5.根据权利要求1所述的生物样品结构氢氘置换的证实及氘百分含量的测定方法，其特征在于确定生物样品最优含氘量或最优氘化条件。

6.根据权利要求1所述的生物样品结构氢氘置换的证实及氘百分含量的测定方法，其特征在于证实微生物和生物分子的稳定性和耐热性与其氘含量密切相关。

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