CN1557952A - 类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白编码序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在类番茄茄(Solanumlycopersicoides Dun.)中表达的新的抗大丽轮枝菌受体蛋白(S1Ve1)、编码序列及其在改良植物抗病性特别是抗黄萎病上的应用。本发明涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。还涉及被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物对植物病害特别是黄萎病具有增强的抗性。

Description

类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白编码序列及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种在类番茄茄(Solanum lycopersicoides Dun.)中表达的抗大丽轮枝菌受体蛋白[Verticillium dahliae Kleb.resistance protein(Ve)from Solanum lycopersicoidesDun.，SlVe1]及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。

背景技术

由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)等引起的黄萎病是一种世界范围的顽固性维管束病害，严重为害棉花、番茄、茄子、马铃薯、苜蓿等重要农作物的生长。作为一种土传病害，黄萎病的寄主广，危害重，化学防治成本高、效果差，并且存在食品安全性和生态安全性问题。选育抗黄萎病作物品种是黄萎病防治的根本途径，但却面临育种周期长和抗黄萎病资源严重匮乏的限制，利用基因工程技术分离植物抗黄萎病基因并通过遗传转化创造作物抗黄萎病新材料，具有基因型资源广泛、周期相对较短和不受生殖障碍限制等优点，是抗黄萎病遗传改良的一个重要方向。

根据基因对基因学说(Gene-for-gene Theory)，植物抗病基因R的产物即受体蛋白R与来自病原菌无毒基因Avr的直接或间接产物即Avr配体之间的原初识别，是介导植物抗病反应的根本分子机制。许多抗病和感病植物材料之间的本质差异并不在于个别下游防卫反应基因的有无，而在于负责原初识别的抗病基因的有无或启动抗病信号传导的机制上存在差异，所以克隆和利用受体蛋白类的抗病基因是植物抗病基因工程的核心内容。采用类番茄茄的无菌苗，人工接种大丽轮枝菌诱导，构建了一个全长cDNA文库。首先从cDNA中经PCR扩增获得SlVe1的保守区685bp片断，进而扩增得到主体编码区2.9kb片断，据此设计两个正向引物和两个反向引物，分别进行cDNA的3’和5’末端锚定扩增，再根据cDNA末端序列信息设计引物成功扩增出全长3400bp(不计poly(dA))的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因SlVe1。

在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白SlVe1序列及其核酸序列。

发明内容

本发明的第一目的就是提供一种新的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)，该基因是一个抗大丽轮枝菌受体蛋白基因。

本发明的第二目的是提供一种新的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)。

本发明的第三目的是提供这种类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽和编码序列在利用转基因技术改良植物抗病特别是抗黄萎病上的应用。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离出的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。

在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草。

在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物抗病能力的方法，其步骤如下：

(1)将编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞如植物细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的转基因植株对植物病害具有增强的抗性作用。

较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第23-3175位的序列。

在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本发明中，术语“类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第23-3175位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第23-3175位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第23-3175位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)；若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、***和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白或多肽”指具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的活性片段和活性衍生物。

本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本发明中，“类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

                    表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Ash
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还包括类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽时，可以将类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因产物的表达，即分析类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，根据本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白同源基因或同源蛋白。

为了得到与类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因相关的类番茄茄cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选类番茄茄cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自类番茄茄的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。这种筛选方法可以识别与类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因相关的基因家族的核苷酸序列。

本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

利用本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

表2为本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)与普通番茄抗黄萎病蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。

表3为本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)与普通番茄抗黄萎病蛋白的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)基因的克隆

1.植物材料和RNA分离((Plant material and RNA isolation)

类番茄茄种系LA2386的种子由美国戴维斯加利福尼亚大学蔬菜作物系C.M.Rick番茄遗传资源中心(C.M.Rick Tomato Genetic Resources Center，Dept.Vegetable Crops，University of California，Davis，USA)的Chetelat博士惠赠。种子经15％的次氯酸钠消毒液浸种30min，在4次换水的灭菌蒸馏水中漂洗4h，然后接种到几层灭菌滤纸中间于25℃催芽，萌发的种子播种到含有1∶1∶1比例壤土、蛭石和珍珠岩的培养罐中，保持于20℃和14h光/10h暗的条件待其出苗和生长，对再生植株进行大丽轮枝菌接种处理0、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小时后取植物根、茎、叶的混合样抽提总RNA。RNA抽提采用TRIZOL试剂(GIBCO BRL，USA)根据其说明的方法进行。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。

2.大丽轮枝菌诱导的类番茄茄全长cDNA文库的构建(Construction of cDNA libraryfrom Verticillium dahliae-induced Solanum lycopersicoides plant materials)

鉴于普通番茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因Ve1的mRNA很长及在总mRNA中的丰度较低，我们构建了类番茄茄的全长cDNA文库。来自不同诱导时间的总RNA各取相等比例混合形成的250μg总RNA按试剂盒(Oligotex mRNA Spin Column，QIAGEN)的方法过Oligotex层析柱，纯化获得的总mRNA马上用于全长cDNA文库构建(SMART cDNA Library Construction Kit，CLONTECH Laboratories)。反转录合成的cDNA一链经LD PCR扩增文库得到文库cDNA双链(dd-cDNA)，取5μL dd-cDNA经琼脂糖凝胶电泳后获得一条分子量为约250bp-8kb大小的smear，丰度的重心在1000bp-4000bp左右)，说明合成的文库dd-cDNA质量是理想的。经cDNA纯化、SfiI酶切、cDNA的大小分级、目的cDNA最后与λ载体的两臂(A、B)的连接，获得的诱导全长cDNA文库重组λ最后包装到Stratagene公司的Golden Packaging包装蛋白中形成λ文库，经检测其滴度达到1.2×10⁶pfu·mL^-1，重组率85.9％。

3.类番茄茄中Ve同源基因保守区片断的扩增(Amplification of conservativefragment of Ve homologue from Solanum lycopersicoides)

根据普通番茄抗大丽轮枝菌受体蛋白Ve1的mRNA全长和来自马铃薯的几条类似Ve基因3’近中部序列的EST在Vector NTI Suite 6上的多重比的结果，我们设计了一对扩增类番茄茄中Ve同源基因保守区的PCR引物FVE685(5’-GTTGTTGGAGGTCCTGAATGTTGGAAATAA-3’，SEQ ID NO.1)和RVE685(5’-GTTTCCTTCAAAGGAATCTGCTGAGAATGT-3’，SEQ ID NO.2)。50μL的反应体系中包括文库dd-cDNA 1μL，10×PCR buffer 5μL，25mmol·L^-1 MgCl₂ 3μL，10mmol·L^-1 dNTP 1μL，10μmol·L^-1 FVE685 1μL，10μmol·L^-1 RVE685 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH₂O 37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下：94℃预变性3min→35个扩增循环(94℃变性45sec→55℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。获得一条685bp的PCR扩增片断。

4.SlVe1主要编码区2.9kb片断的扩增(Amplification of 2.9kb fragment of SlVe1coding region)

685bp片断测序后经多重比对和BLAST发现与Ve1基因具有高相似性(similarity)，所以根据Ve1的起始密码区设计了一条上游引物FSLO(5’-ATGAAAATGATGGCAACTCTGTACT-3’)与RVE685联合扩增SlVe1编码区的主体片断。50μL PCR的反应体系中包括：文库dd-cDNA1μL，10×LA PCR buffer with Mg²⁺ 5μL，10mmol·L^-1 dNTP 2μL，10μmol·L^-1 FSLO2μL，10μmol·L^-1 RVE685 2μL，LA Taq DNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH₂O 37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下：94℃预变性3min→30个扩增循环(94℃变性60sec→52℃退火90sec→72℃延伸3min)→72℃继续延伸10min。

5.SlVe1 3’cDNA末端的扩增(Ampiification of 3’end of SlVe1)

根据SlVe1主要编码区2.9kb片断的测序结果，设计了两条扩增SlVe1 3’cDNA末端的PCR引物FSL3-1(5’-CGATTGGGAAGCTACAAATGCTTGAATCAC-3’)和FSL3-2(5’-CCACCTGTCCGGGGAGATCCCATCAGAGCT-3’)。引物FSL3-1与文库试剂盒提供的CDS III/3’PCR Primer(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)₃₀N_-1N_-3’)联合进行SlVe1 3’cDNA末端的PCR初扩。50μL的反应体系中包括：文库dd-cDNA 1μL，10×PCR buffer 5μL，25mmol·L^-1 MgCl₂ 3μL，10mmol·L^-1 dNTP 1μL，10μmol·L^-1 FSL3-1 1μL，10μmol·L^-1 CDSIII/3’PCR Primer 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH₂O 37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下：94℃预变性3min→30个扩增循环(94℃变性1min→65℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。

初扩产物15μL经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，直接吸取0.25μL初扩产物为模板进入PCR巢式扩增，50μL的反应体系中包括：初扩产物0.25μL，10×PCR buffer 5μL，25mmol·L^-1MgCl₂ 3μL，10mmol·L^-1 dNTP 1μL，10μmol·L^-1 FSL3-2 1μL，10μmol·L^-1 CDS III/3’PCR Primer 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH₂O 38.25μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下：94℃预变性3min→28个扩增循环(94℃变性1min→68℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。

6.SlVe1 5’cDNA末端的扩增(Amplification of 5’end of SlVe1)

根据SlVe1主要编码区2.9kb片断的测序结果，设计了两条扩增SlVe1 5’cDNA末端的PCR引RSL5-1(5’-CCATCAAGGTAAAGCTCTCTAAGCTCTG-3’)and RSL5-2(5’-GAGTTCTCAATGAAATGTCTCAAATTGGGA-3’)。采用RSL5-1与文库试剂盒提供的5’PCRPrimer(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)联合进行SlVe1 5’cDNA末端的PCR初扩。50μL的反应体系中包括：文库dd-cDNA 1μL，10×PCR buffer 5μL，25mmol·L^-1 MgCl₂ 3μL，10mmol·L^-1 dNTP 1μL，10μmol·L^-1 RSL5-1 1μL，10μmol·L^-1 5’PCR Primer 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH₂O 37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下：94℃预变性3min→30个扩增循环(94℃变性1min→60℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。初扩产物15μL经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，直接吸取0.25μL初扩产物为模板进入PCR巢式扩增，50μL的反应体系中包括：初扩产物0.25μL，10×PCR buffer 5μL，25mmol·L^-1 MgCl₂ 3μL，10mmol·L^-1 dNTP 1μL，10μmol·L^-1RSL5-2 1μL，10μmol·L^-1 5’PCR Primer 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH₂O 38.25μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下：94℃预变性3min→28个扩增循环(94℃变性1min→60℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。

7.SlVe1 cDNA全长的扩增(Cloning of full-length SlVe1 cDNA)

将上面测序得到的SlVe1 cDNA 5’末端、3’末端及2.9kb主体编码区序列在Vector NTISuite 6上经拼接而成SlVe1 cDNA全长contig。我们据此序列设计了一对扩增SlVe1 cDNA全长(不含poly(dA)尾)的PCR引物FSL1(5’-CATATTCAAGCTAACAAGTTGCATGAAA-3’)和RSL1(5’-AAGCCATAATAAGTTTGGGATATCATTA-3’)。50μL的反应体系中包括：文库dd-cDNA 1μL，10×LA PCR buffer with Mg²⁺ 5μL，10mmol·L^-1 dNTP 2μL，10μmol·L^-1 FSL1 2μL，10μmol·L^-1 RSL1 2μL，LA Taq DNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH₂O 37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下：94℃预变性3min→30个扩增循环(94℃变性1min→55℃退火1min→72℃延伸4min)→72℃继续延伸10min。BLAST的结果证明从类番茄茄中新得到的基因确为一个与植物抗黄萎病相关的基因。因此通过研究最终获得了类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO.3)。

实施例2

类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)基因的序列信息与同源性分析

本发明新的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)全长cDNA的长度为3400bp(不计polyA)，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于23-3175位核苷酸。根据全长cDNA推导出SlVe1编码的氨基酸序列，共1050个氨基酸残基，分子量为116.97kDa，等电点(pI)为5.22。详细序列见SEQ ID NO.3。

将类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与普通番茄抗黄萎病基因(AF272307)在核苷酸水平上具有91％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与普通番茄抗黄萎病蛋白(AAK58682)也有84％的相同性(附表3)。由此可见，类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因与普通番茄抗黄萎病蛋白基因无论在核酸还是在蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因在抗黄萎病上也具有相似的作用。

实施例3

类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)基因的在类番茄茄中的拷贝数分析

采用常规方法从类番茄茄叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用DraI，EcoRV和HindIII酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上。采用Amersham Pharmacia公司的Gene Images^TM Contents CDP-Star^TM labelingmodule(PRN3540)杂交及检测***以SlVe1基因部分编码序列(685bp，利用FVE685和RVE685为引物经PCR扩增类番茄茄cDNA得到)为探针对杂交膜进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现在杂交膜上出现2-3杂交条带(附图1)，说明类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因在类番茄茄中属于低拷贝基因。

实施例4

类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白在烟草细胞中进行真核细胞表达及转基因植株的抗病性(抗黄萎病性)鉴定

含目的基因(类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因SlVe1)的表达载体的构建

含目的基因(类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因)的表达载体的构建，根据类番茄茄抗大丽轮枝菌受体的全长序列(SEQ ID NO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体pCAMBIA2301中，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌EHA105中，获得含有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体基因SlVe1表达载体pSL1(附图2)的农杆菌EHA105(pSL1)，利用叶盘法技术转化烟草。

利用叶盘法转化烟草

1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；

2.室温下4,000g离心10min；

3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；

4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+cb 250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；

9.待根系生长发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。

利用Southern blot检测类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)是否已整合入植物(烟草)基因组中

采用常规方法从转基因植株和非转基因对照植株中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，用SacI酶切植物DNA[8μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上，采用Amersham Pharmacia公司的Gene Images^TM Contents CDP-Star^TM labelingmodule(PRN3540)杂交及检测***以SlVe1基因部分编码序列(685bp，利用FVE685和RVE685为引物经PCR扩增类番茄茄cDNA得到)为探针对杂交膜进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照Roche DIG labeled试剂盒说明书)。结果(Southern blot)发现，不同转基因植株具有不同的杂交带型，证明SlVe1基因已整合入烟草基因组中，且所获得的转基因植株为不同的独立转基因植株(附图3。1：非转基因植株；2-4：不同的转基因植株)。为了研究外源基因(SlVe1)在转基因植株中是否表达，对转基因植株进一步进行了Northern blot分析。

利用Northern blot检测类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)在转基因烟草植株中的表达

1.RNA的提取：制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)

2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1 OD₂₆₀＝40μg/ml。

3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：1)取6ml 25*电泳缓冲液，假如117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液张，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(30μg)溶解于15mlRNA稀释溶液中，在55℃-65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2μl 10*上样缓冲液，混匀。9)在电泳液未盖过胶的条件下点样，80V电压电泳10分钟，待样品全部进入胶后，加电泳液盖过胶面约半厘米。80-100V电泳5小时。

4.RNA尼龙膜上转移：1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤1-2小时。

5.膜上RNA的检测：1)将膜浸在4*SSC中10分钟，取出膜置滤纸上吸去多余的液体，将膜放入预杂交液中(50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸钠(pH6.4)，5*Denhart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA)，42℃下预杂交过夜。2)倒出预杂交液，换入等量的杂交液，将用³²P标记的DNA探针(SlVe1基因部分编码序列，685bp，利用FVE685和RVE685为引物经PCR扩增类番茄茄cDNA得到)在沸水中变性5分钟，加入杂交液(50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸钠(pH6.4)，10％葡聚糖硫酸脂，1*Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA)中，于42℃杂交24-48小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于42℃漂洗3次，每次5分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于55℃-65℃漂洗1-3次。4)用X光片压片1-7天，然后显影、定影。结果(Northern blot)发现，类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)在不同转基因植株中的表达量不同(附图4。1：非转基因植株；2-4：不同转基因植株)，因此Northern blot分析证实了类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)在转基因植株中的表达。

表达类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)的转基因植株的抗病性鉴定

鉴于编码抗大丽轮枝菌受体蛋白如番茄的抗大丽轮枝菌受体蛋白的基因已被证明对植物病害特别是黄萎病具有抗性，而类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)与番茄的抗大丽轮枝菌受体蛋白具有较高的同源性，我们进一步对表达类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的转基因植株进行黄萎病抗性鉴定。接种大丽轮枝菌菌液3周后调查发现，转基因植株的受害程度比对照明显轻，少数植株未发现明显症状，且转基因植株对大丽轮枝菌的抗性与SlVe1的mRNA表达量成正相关，而非转基因对照植株普遍发病，表现出极度萎蔫(附图5)。研究证明，类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)对黄萎病确有抗性，因此类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)可应用于利用转基因技术改良植物抗病性特别是抗黄萎病的研究和产业化中。

                                      表2

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Query：3174 tgtgatccttaaacccataactaatgagtttatt 3207

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Sbjct：4651 agtgattattaaacccataaataatgagtttatt 4684

Query：类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的核苷酸序列

Sbjct：普通番茄抗黄萎病基因核苷酸序列(AF272367)

                                       表3

84％ identity in 1050 aa overlap，88％ similarity in 1050 aa overlap

Query：1    MKMMTTXXXXXXXXXXXXXXXSGNDIFLVXXXXXXXXXXXXXXXXGSFQYDSTLSNKLER 60

            MKMM T               SG  IFLV                GS QYDSTLS KL +

Sbjct：1    MKMMATLYFPMVLLIPSFQILSGYHIFLVSSQCLDDQKSLLLQFKGSLQYDSTLSKKLAK 60

Query：61   WNHNTSECCNWNGVTCDLSGHVIALELDDEKISSGIENASALFSLQYLESLNLAYNKFNV 120

            WN TSECCNWNGVTC+L GHVIALELDDE ISSGIEN+SALFSLQYLESLNLA N FNV

Sbjct：61   WNDMTSECCNWNGVTCNLFGHVIALELDDETISSGIENSSALFSLQYLESLNLADNMFNV 120

Query：121  GIPVGIGNLTNLKYLNLSNAGFVGQIPMMLSRLTRLVTLDLSTLFPDFDQPLKLENPNLR 180

            GIPYGI NLTNLKYLNLSNAGFVGQIP+ LSRLTRLVTLDLST+ P FDQPLKLENPNL

Sbjct：121  GIPVGIDNLTNLKYLNLSNAGFVGQIPITLSRLTRLVTLDLSTILPFFDQPLKLENPNLS 180

Query：181  HFIENSTELRELYLDGVDLSAQRTDWCQSLSSYLPNLTVLSLCACQISGPIDESLSKLQI 240

            HFIENSTELRELYLDGVDLS+QRT+WCQSLS +LPNLTVLSL  CQISGP+DESLSKL

Sbjct：181  HFIENSTELRELYLDGVDLSSQRTEWCQSLSLHLPNLTVLSLRDCQISGPLDESLSKLHF 240

Query：241  LSIIRLERNNLSTTVPGYFANFTNLTTLSLDSCNLQGAFPKKIFQVQVLESLDLSNNKLL 300

            LS ++L++NNLS+TVP YFANF+NLTTL+L SCNLQG FP++IFQV VLESLDLS NKLL

Sbjct：241  LSFVQLDQNNLSSTVPEYFANFSNLTTLTLGSCNLQGTFPERIFQVSVLESLDLSINKLL 300

Query：301  SGSIPSFPRNGSLRRISLSYTNFSGSLPESISNLQNLSRLGLSDFNFNGPIPSTMANLIN 360

             GSIP F RNGSLRRISLSYTNFSGSLPESISN QNLSRL LS+ NF G IPSTMANL N

Sbjct：301  RGSIPIFFRNGSLRRISLSYTNFSGSLPESISNHQNLSRLELSNCNFYGSIPSTMANLRN 360

Query：361  LGYLDFSRNNFTGSIPHFQRSKKLTYLDLSRNGLTGLLSRAHFEGLSELVYINVGDNSLN 420

            LGYLDFS NNFTGSIP+F+ SKKLTYLDLSRNGLTGLLSRAHFEGLSELV+IN+G+N L+

Sbjct：361  LGYLDFSFNNFTGSIPYFRLSKKLTYLDLSRNGLTGLLSRAHFEGLSELVHINLGNNLLS 420

Query：421  GTLPAYIFELPSLQQLFLNSNQFVGQVDEFRNASSSLLDTVDLRNNHLNGSIPKSTFEIG 480

            G+LPAYIFELPSLQQLFL  NQFVGQVDEFRNASSS LDTVDL NNHLNGSIPKS FEI

Sbjct：421  GSLPAYIFELPSLQQLFLYRNQFVGQVDEFRNASSSPLDTVDLTNNHLNGSIPKSMFEIE 480

Query：481  RLKVLSLSSNFFSGTVTLDLIGRLNNLSRLELSYNNLTVDASSSNSTSFTFPQLSILKLA 540

            RLKVLSLSSNFF GTV LDLIGRL+NLSRLELSYNNLTVDASSSNSTSFTFPQL+ILKLA

Sbjct：481  RLKVLSLSSNFFRGTVPLDLIGRLSNLSRLELSYNNLTVDASSSNSTSFTFPQLNILKLA 540

Query：541  SCRLQKFPDLMNQSMMIHLDLSDNQIRGAIPNWIWGIGDQGLTHLNLSFNQLEYMEQPYT 600

            SCRLQKFPDL NQS M+HLDLSDNQI GAIPNWIWGIG  GLTHLNLSFNQLEY+EQPYT

Sbjct：541  SCRLQKFPDLKNQSWMMHLDLSDNQILGAIPNWIWGIGGGGLTHLNLSFNQLEYVEQPYT 600

Query：601  ASSNLVVLDLHTNRLKGDLLIPPSSPIYVDYXXXXXXXXIPLDIGKSLGFASFFSVANNG 660

            ASSNLVVLDLH+NRLKGDLLIPP + IYVDY        IP DIGKSLGFASFFSVANNG

Sbjct：601  ASSNLVVLDLHSNRLKGDLLIPPCTAIYVDYSSNNLNNSIPTDIGKSLGFASFFSVANNG 660

Query：661  ITGIIPESICDVSYLQILDFSNNALSGTIPPCLLEYSTTLGVLNLGNNRLHGVIPDSFPI 720

            ITGIIPESIC+ SYLQ+LDFSNNALSGTIPPCLLEYST LGVLNLGNN+L+GVIPDSF I

Sbjct：661  ITGIIPESICNCSYLQVLDFSNNALSGTIPPCLLEYSTKLGVLNLGNNKLNGVIPDSFSI 720

Query：721  DCALNTLDLSENKLQGRLPKSLVNCKLLEVLNAGNNRLVDHFPCMLRNSNSLRVLVLRSN 780

             CAL TLDLS N LQGRLPKS+VNCKLLEVLN GNNRLVDHFPCMLRNSNSLRVLVLRSN

Sbjct：721  GCALQTLDLSANNLQGRLPKSIVNCKLLEVLNVGNNRLVDHFPCMLRNSNSLRVLVLRSN 780

Query：781  QFSGNLQCEVTINSWPNLQIIDIASNNFTGVLNAEFFSNWRGMMVADDYVETGRNHIQYK 840

            +F GNL C+VT NSW NLQIIDIASNNFTGVLNAEFFSNWRGMMVADDYVETGRNHIQY+

Sbjct：781  KFYGNLMCDVTRNSWQNLQIIDIASNNFTGVLNAEFFSNWRGMMVADDYVETGRNHIQYE 840

Query：841  FFELSNMYYQDTVTLTIKGMELELVKILRVFTSIDFSSNRFQGAIPDTIGNLSSLYVLNL 900

            F +LS +YYQDTVTLTIKGMELELVKILRVFTSIDFSSNRFQGAIPD IGNLSSLYVLNL

Sbjct：841  FLQLSKLYYQDTVTLTIKGMELELVKILRVFTSIDFSSNRFQGAIPDAIGNLSSLYVLNL 900

Query：901  SHNALEGPIPKSIGKLQMLESLDLSRNHLSGEIPSELASLTFLAALNLSFNKFFGKIPST 960

            SHNALEGPIPKSIGKLQMLESLDLS NHLSGEIPSELASLTFLAALNLSFNK FGKIPST

Sbjct：901  SHNALEGPIPKSIGKLQMLESLDLSTNHLSGEIPSELASLTFLAALNLSFNKLFGKIPST 960

Query：961  NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLNDSCQSNG--SESLPPLTSQSDSDDEWKFIFAAVGYLV 1018

            NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLN+SCQSNG  SESLPP T   DSDDEW+FIFAAVGY+V

Sbjct：961  NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLNNSCQSNGSASESLPPPTPLPDSDDEWEFIFAAVGYIV 1020

Query：1019 GAANTISPLWFYEPVKKWFDKHAEKWLLWFSR 1050

            GAANTIS +WFY+PVKKWFDKH EK LLWFSR

Sbjct：1021 GAANTISVVWFYKPVKKWFDKHMEKCLLWFSR 1052

Query：类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白氨基酸序列

Sbjct：普通番茄抗黄萎病基因蛋白氨基酸序列(AAK58682)

本发明涉及的序列及记号分列如下：

(1)SEQ ID NO.1的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：30bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.1

  GTTGTTGGAGGTCCTGAATGTTGGAAATAA

(2)SEQ ID NO.2的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：30bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：寡核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.2

  GTTTCCTTCAAAGGAATCTGCTGAGAATGT

(3)SEQ ID NO.3的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：3400bp

    (B)类型：核苷酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：核苷酸

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.3

  1    CATATTCAAG CTAACAAGTT GCATGAAAAT GATGACAACT CTGTACTTCC TATGGCTTCT

 61    CTTGGTTCCC TTGTTTCAAA TCCTGTCAGG AAATGACATT TTCTTGGTTT CCTCTCAATG

121    TCTTGATGAT CAAAAGTCAT TGTTGCTGCA GTTGAAGGGC AGCTTCCAAT ATGATTCTAC

181    TTTGTCGAAT AAATTGGAAA GATGGAACCA CAACACAAGT GAATGTTGCA ATTGGAATGG

241    GGTTACATGT GACCTCTCTG GTCATGTGAT TGCCTTGGAA CTGGATGATG AGAAAATTTC

301    TAGTGGAATT GAGAATGCAA GTGCTCTTTT CAGTCTTCAG TATCTTGAGA GCCTAAATTT

361    GGCTTACAAC AAGTTCAATG TTGGCATACC AGTTGGTATA GGCAACCTCA CCAACTTGAA

421    GTACCTGAAT TTATCCAATG CCGGTTTTGT TGGCCAAATT CCTATGATGT TATCAAGGTT

481    AACAAGGCTA GTTACTCTTG ATCTCTCAAC TCTTTTCCCT GACTTTGACC AGCCACTTAA

541    ACTTGAGAAT CCCAATTTGA GACATTTCAT TGAGAACTCA ACAGAGCTTA GAGAGCTTTA

601    CCTTGATGGT GTTGATCTTT CAGCTCAGAG GACTGACTGG TGTCAATCTT TATCTTCATA

661    TTTGCCTAAC TTGACCGTCT TGAGTTTGTG TGCTTGTCAA ATTTCAGGCC CTATTGATGA

721    ATCACTTTCT AAGCTTCAGA TTCTCTCTAT CATTCGTCTT GAACGGAACA ATCTCTCTAC

781    CACAGTTCCA GGATATTTTG CCAATTTCAC AAACTTGACT ACCTTGTCCC TCGACTCTTG

841    TAATCTGCAA GGAGCTTTTC CTAAAAAGAT CTTTCAGGTA CAAGTTTTAG AGAGTTTGGA

901    CTTGTCAAAT AACAAGTTGC TTAGTGGTAG TATTCCGAGT TTTCCTCGAA ATGGATCTTT

 961    GAGGAGGATA TCACTAAGCT ACACCAACTT TTCGGGTTCA TTACCAGAGT CCATTTCGAA

1021    CCTTCAGAAC CTGTCCAGGT TAGGGCTTTC TGATTTCAAT TTCAATGGAC CAATACCTTC

1081    CACAATGGCA AACCTTATCA ATCTTGGTTA TTTGGACTTC TCCCGGAACA ACTTCACTGG

1141    TTCTATCCCA CATTTTCAAC GGTCCAAGAA ACTCACCTAC TTGGACCTTT CACGTAATGG

1201    TCTAACTGGT CTCTTATCTA GAGCTCATTT TGAAGGACTC TCAGAGCTTG TCTACATAAA

1261    TGTAGGGGAC AATTCACTCA ACGGAACCCT TCCTGCATAT ATATTTGAGC TCCCCTCCTT

1321    GCAGCAGCTT TTTCTTAACA GCAATCAATT TGTTGGCCAA GTCGACGAAT TCCGCAATGC

1381    ATCCTCCTCT CTGTTGGATA CAGTTGATCT AAGAAACAAC CACCTGAATG GATCGATTCC

1441    CAAGTCCACA TTTGAAATTG GCAGGCTTAA GGTCCTCTCA CTTTCTTCCA ACTTCTTTAG

1501    CGGGACAGTG ACCCTTGATC TCATTGGGAG GCTGAACAAC CTTTCAAGAC TGGAGCTTTC

1561    TTACAATAAC TTGACTGTTG ATGCAAGTAG CAGCAATTCA ACCTCTTTCA CATTTCCTCA

1621    GTTGAGCATA TTGAAATTAG CTTCTTGCCG GTTGCAAAAG TTCCCTGATC TCATGAATCA

1681    GTCAATGATG ATCCACTTGG ACCTTTCAGA CAACCAAATA CGGGGGGCAA TACCAAATTG

1741    GATTTGGGGA ATTGGTGATC AAGGTTTGAC TCACCTGAAC CTTTCCTTCA ATCAGCTGGA

1801    GTACATGGAA CAACCTTACA CTGCTTCCAG CAATCTTGTA GTGCTTGACT TGCATACCAA

1861    CCGTTTGAAA GGTGACTTAC TAATTCCACC TTCCTCTCCC ATCTATGTGG ATTACTCGAG

1921    CAATAATTCA AATAATTCCA TCCCACTAGA TATTGGAAAG TCTCTTGGTT TTGCCTCCTT

1981    TTTCTCGGTA GCAAACAATG GCATTACTGG AATAATTCCT GAATCCATAT GCGATGTCAG

2041    CTACCTTCAA ATTCTTGATT TCTCTAACAA CGCCTTGAGT GGAACAATAC CACCATGTCT

2101    ACTGGAATAT AGTACAACTC TTGGAGTGCT GAATCTAGGG AACAATAGAC TCCATGGTGT

2161    TATTCCAGAT TCATTTCCGA TTGATTGTGC TCTAAATACT CTAGACCTCA GTGAGAATAA

2221    GTTACAAGGT AGGCTGCCAA AATCGCTTGT GAACTGCAAG TTGTTGGAGG TCCTGAATGC

2281    TGGAAATAAC AGACTTGTTG ATCATTTCCC ATGCATGCTG AGGAACTCAA ACAGTCTGAG

2341    GGTCCTTGTC TTGCGCTCCA ATCAATTCAG TGGAAATCTT CAGTGTGAAG TAACCATAAA

2401    TAGCTGGCCA AATCTCCAGA TCATAGATAT AGCTTCCAAC AACTTCACTG GTGTGTTGAA

2461    TGCAGAATTC TTTTCAAATT GGAGAGGAAT GATGGTTGCA GATGATTACG TGGAGACAGG

2521    ACGCAATCAT ATCCAGTATA AGTTCTTCGA ACTAAGTAAC ATGTACTATC AGGACACAGT

2581    GACATTAACC ATCAAAGGCA TGGAGCTGGA GCTTGTGAAG ATTCTCAGGG TCTTCACATC

2641    TATTGATTTC TCTTCAAATA GATTTCAAGG AGCGATACCA GATACTATCG GGAATCTCAG

2701    CTCACTTTAT GTTCTGAACT TGTCACACAA TGCCCTTGAG GGACCAATCC CAAAATCGAT

2761    TGGGAAGCTA CAAATGCTTG AATCACTAGA CCTGTCAAGA AACCACCTGT CCGGGGAGAT

2821    CCCATCAGAG CTTGCAAGTC TCACATTCTT AGCAGCTTTG AACTTATCGT TCAACAAATT

2881    TTTTGGCAAA ATCCCATCAA CTAATCAGTT TCAAACATTC TCAGCAGATT CCTTTGAAGG

2941    AAACAGTGGC CTATGCGGTC TCCCTCTCAA CGACAGTTGT CAGAGCAATG GTTCGGAGTC

3001    CCTGCCTCCA CTAACTTCGC AATCAGACTC AGATGATGAA TGGAAGTTCA TTTTTGCAGC

3061    AGTTGGATAC TTAGTAGGGG CAGCAAACAC CATTTCACCT CTGTGGTTTT ACGAGCCCGT

3121    GAAGAAATGG TTTGATAAGC ATGCGGAGAA ATGGTTGCTT TGGTTTTCAA GAATGTGATC

3181    CTTAAACCCA TAACTAATGA GTTTATTTAA TCCTTGCTTT GTAGTATTAA TAAACATCAG

3241    GATCCAAATT CAAGTTATTT CCCTTGATGA ATGTATACAA TCAGAAACAG CACCCACTTT

3301    TGGATTAAAT AGCTTGAGTG GGATATAGTA CATAGTATCA GACCACAGTG ATCGAATCAT

3361    TGTCTTCATG CATAATGATA TCCCAAACTT ATTATGGCTT 3400

(4)SEQ ID NO.4的信息

  (i)序列特征：

    (A)长度：1051氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链性：单链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii).分子类型：多肽

  (iii).序列描述：SEQ ID NO.4

   1    MKMMTTLYFL WLLLVPLFQI LSGNDIFLVS SQCLDDQKSL LLQLKGSFQY DSTLSNKLER

  61    WNHNTSECCN WNGVTCDLSG HVIALELDDE KISSGIENAS ALFSLQYLES LNLAYNKFNV

 121    GIPVGIGNLT NLKYLNLSNA GFVGQIPMML SRLTRLVTLD LSTLFPDFDQ PLKLENPNLR

 181    HFIENSTELR ELYLDGVDLS AQRTDWCQSL SSYLPNLTVL SLCACQISGP IDESLSKLQI

 241    LSIIRLERNN LSTTVPGYFA NFTNLTTLSL DSCNLQGAFP KKIFQVQVLE SLDLSNNKLL

 301    SGSIPSFPRN GSLRRISLSY TNFSGSLPES ISNLQNLSRL GLSDFNFNGP IPSTMANLIN

 361    LGYLDFSRNN FTGSIPHFQR SKKLTYLDLS RNGLTGLLSR AHFEGLSELV YINVGDNSLN

 421    GTLPAYIFEL PSLQQLFLNS NQFVGQVDEF RNASSSLLDT VDLRNNHLNG SIPKSTFEIG

 481    RLKVLSLSSN FFSGTVTLDL IGRLNNLSRL ELSYNNLTVD ASSSNSTSFT FPQLSILKLA

 541    SCRLQKFPDL MNQSMMIHLD LSDNQIRGAI PNWIWGIGDQ GLTHLNLSFN QLEYMEQPYT

 601    ASSNLVVLDL HTNRLKGDLL IPPSSPIYVD YSSNNSNNSI PLDIGKSLGF ASFFSVANNG

 661    ITGIIPESIC DVSYLQILDF SNNALSGTIP PCLLEYSTTL GVLNLGNNRL HGVIPDSFPI

 721    DCALNTLDLS ENKLQGRLPK SLVNCKLLEV LNAGNNRLVD HFPCMLRNSN SLRVLVLRSN

 781    QFSGNLQCEV TINSWPNLQI IDIASNNFTG VLNAEFFSNW RGMMVADDYV ETGRNHIQYK

 841    FFELSNMYYQ DTVTLTIKGM ELELVKILRV FTSIDFSSNR FQGAIPDTIG NLSSLYVLNL

 901    SHNALEGPIP KSIGKLQMLE SLDLSRNHLS GEIPSELASL TFLAALNLSF NKFFGKIPST

 961    NQFQTFSADS FEGNSGLCGL PLNDSCQSNG SESLPPLTSQ SDSDDEWKFI FAAVGYLVGA

1021    ANTISPLWFY EPVKKWFDKH AEKWLLWFSR M 1051

Claims (8)

1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括：编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列杂交。

2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。

3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列。

4.一种分离出的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽，其特征在于，它包括：具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。

5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。

7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是真核细胞。

8.一种利用转基因技术将编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物抗病特别是抗黄萎病的方法，以及类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因在改良植物抗病性特别是抗黄萎病上的应用，特征在于其步骤如下：

(1)将编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物细胞；

(3)通过筛选如抗生素筛选，获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。转基因植物及其后代对植物病害特别是黄萎病具有增强的抗性。

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