CN1557482A - 调节免疫功能、抗肿瘤的天然营养剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种调节免疫功能、抗肿瘤的天然营养剂，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶、乳浆及其相关产品中制备乳铁蛋白和生物活性多肽作为调节免疫、抗肿瘤天然营养剂的方法及应用。
Description
所属技术领域
本发明涉及一种调节免疫功能、抗肿瘤的天然营养剂，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶、乳浆及其相关产品中制备乳铁旦白和生物活性多肽作为调节免疫、抗肿瘤天然营养剂的方法。
发明技术背景
恶性肿瘤是人类健康的头号大敌，严重危害人类健康，全球每年约有850万新生肿瘤病人，中国每年约有350万新生肿瘤病人。目前恶性肿瘤居中国致死原因第一位。
人体肿瘤的发生、发展与人体免疫功能失衡有一定的关系，通常是由于人体的免疫监视功能及免疫清除功能降低而引发肿瘤生长，因此，通过补充某些具有生物活性的天然营养成份，提高人体免疫功能，对抗肿瘤的发生有重要意义。
现代研究证实，牛奶中的乳铁旦白和生物活性多肽有明确的调节人体免疫功能，增强人体免疫力，对抗肿瘤的作用。
乳铁旦白是一种含铁的糖旦白，具有明确的免疫调节功能，能有效刺激T淋巴细胞，主要是刺激CD4+、CD8+的增殖、成熟；刺激白介素，主要是刺激白介素18(IL-18)产生、释放；刺激细胞因子，主要是刺激GM-CSF的释放；激活自然杀伤细胞(NK-Cell)活性；刺激循环中各种免疫细胞增殖、成熟，包括嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。动物实验证实，乳铁旦白能有效地抑制各类肿瘤细胞成长和抑制肿瘤细胞扩散转移，其主要机理是吸附肿瘤细胞快速生长所需的铁离子，同时抑制肿瘤周围血管的生长，阻止肿瘤周围新生血管形成，从而阻碍肿瘤组织供血，并且通过激活杀伤T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞。
牛奶旦白经酶水解后，产生具有多种生物活性功能的多肽，其中含有丰富的免疫调节多肽，包括β-酪旦白f 54-59和α-乳白旦白f 51-53，β-酪旦白f 191-193，α-酪旦白f 194-199，β-酪旦白f 63-68，Tyr-Gly，Tyr-Gly-Gly，这些免疫调节多肽刺激人体免疫细胞增殖、成熟，提高免疫***对抗外来抗原及肿瘤细胞的能力，激发单核细胞-巨噬细胞***活性，提高免疫***的功能。
综合目前国外报导的文献，已经证实乳铁旦白和活性多肽可能帮助对抗结肠癌、***癌、胃癌及消化道其他恶性肿瘤、乳腺癌、皮肤癌等。
牛奶是人类长久以来的主要营养来源之一，来源丰富，价格便宜，安全可靠，长期服用无毒付作用，从牛奶中制备具有明确调节免疫功能，对抗肿瘤的天然营养剂容易推广和普及。
欧洲专利(EP-AO 253395)公布的技术中，介绍了从牛奶中制备乳铁旦白，但该项技术不适合大规模工业化制备，也未提及从牛奶中制备活性多肽。
本发明所要解决的技术问题是，同时从牛奶中制备乳铁旦白和活性多肽，并应用于调节人体免疫功能，对抗肿瘤。
发明内容
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案，其特征是，以牛初乳、牛奶、乳浆及其相关产品作为原材料，分别制备乳铁旦白和活性多肽。其程序和方法是，离心方法脱脂，用酸剂调PH至4.7～4.8并加热凝固酪旦白，用离心或过滤方式收获酪旦白，上清液过阳离子交换树脂装置的层析柱吸附乳铁旦白，用缓冲盐溶液洗脱乳铁旦白，除盐后冷冻干燥成乳铁旦白粉；通过层析柱的乳清液体用分子量为30,000～40,000D的超微滤膜过滤分离乳清旦白，收集超滤浓缩的旦白与酪旦白合并，采用复合旦白酶水解后，用分子量为10,000D的超微滤膜过滤分离后喷雾干燥成活性多肽粉。单独应用乳铁旦白粉或活性多肽粉，或者两者联合应用，制备多种形式食品或药剂以调节人体免疫功能，对抗肿瘤。
制备乳铁旦白和活性多肽所用的牛奶类原料，可以是牛初乳、牛奶，也可以是制备奶酪的付产品乳浆，或者以乳浆为原料制备的乳浆粉、乳浆浓缩旦白粉(WPC)、乳浆旦白分离粉(WPI)，为了保持其生物活性，最好选用的原料是未被高温处理过的，巴氏消毒的温度最好不要超过72℃持续15分钟，或者63℃持续30分钟，否则大部份生物活性物质(乳铁旦白)的生物活性将会丧失，最理想的原料是牛初乳，但是由于牛初乳来源相对较少，大规模工业化生产时，采用牛奶作为原料，也是一种可行的选择。
本发明的技术特征是，收集的牛奶需经过脱脂程序去除牛奶中脂肪，通常采用已知的离心方式脱脂，脱脂牛初乳或牛奶内加入酸剂调节PH值至4.6～4.8，加热30℃～40℃持续20～30分钟凝固酪旦白，已凝聚的酪旦白通过离心方式收集或通过滤布过滤的方法收集备用。
本发明的技术特征是，已经脱脂和去除酪旦白的乳清液体通过阳离子交换树脂灌装的层析柱，当液体以较高的表面速度和以较高的液体过柱率通过层析柱时，阳离子交换树脂吸附乳铁旦白，在过柱过程结束后，用盐溶液洗脱吸附在阳离子交换树脂上的旦白质，浓缩洗脱物后干燥，即可制备乳铁旦白的粉状物质。
本发明的技术特征是，可采用多种类型的阳离子交换树脂，但最好是采用在高压高流速状况下仍然能保持物理机械稳定性能的产品，例如琼脂糖凝胶(制药等级)，就符合上述条件，选择的阳离子交换树脂颗粒大小范围是100.mu.m～300.mu.m，最好范围是125.mu.m～150.mu.m，在吸收时能提供较高表面速率。
本发明的技术特征是，离子交换树脂最好首先用PH6.5的磷酸缓冲液(0.025molNa.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大约采用4倍床容量的缓冲液冲洗层析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳浆通过层析柱后，乳铁旦白被吸附在阳离子交换树脂上，这时再用缓冲盐溶液冲洗层析柱可洗脱已吸附的物质，洗脱层析柱的缓冲液浓度大约0.7～1.5mol NaCL，洗脱液可以除盐，也可以直接干燥，除盐方式包括离子交换、电透析或超滤，超滤是最首选的除盐方式，除盐后洗脱液采用冷冻干燥方法制备乳铁旦白干粉备用。
本发明的技术特征是，收集已通过层析柱的乳清液，采用交错切面流体超滤装置，应用分子量为30,000～40,000D的超微滤膜进行过滤分离，分离小分子的乳糖、矿物质、残余脂肪，超滤浓缩物中含有多种旦白质，包括β-乳球旦白、α-乳白旦白、免疫球旦白等，收集超滤浓缩物进一步处理。
本发明的技术特征是，合并收集已凝固沉淀的酪旦白和超滤分离的乳清旦白，加碱液(例如1N NaOH)调节PH至6.5～6.8溶解酪旦白，溶液通过稀释或浓缩至每升液体内含旦白质10克～60克，最好是40克～60克/升，在复合旦白溶液内加入胰旦白酶和胰凝乳旦白酶的混合物，胰旦白酶量等于或大于800USP单位/mg，优选等于或大于1000US单位/mg，最好等于或大于1800US单位/mg，胰凝乳旦白酶量等于或大于150USP单位/mg，优选等于或大于200USP单位/mg，最好等于或大于350USP单位/mg。
本发明的技术特征是，在水解混合旦白时，胰旦白酶和胰凝乳旦白酶混合物中以上述USP单位计算的胰旦白/胰凝乳旦白酶之比约1～18，较好的选择为1.5～12，最好的选择为4～6，酶混合物的用量占水解旦白总量的0.4～1.2％(重量百分比)，最好是0.6～0.8％(重量百分比)。
本发明的技术特征是，水解上述旦白混合液的过程是，加热到75℃～85℃维持10～30分钟，降温至30℃～50℃维持2～8小时，水解期间PH维持在6～8之间，最好是在6.5～6.8之间，在水解过程结束时，加热至80℃～90℃，最好85℃持续10分钟，通过热处理使酶灭活，还可以通过超高温灭菌(温度130℃维持30秒)使酶灭活，旦白水解后的溶液用分子量为10,000的超微滤膜在交错切面流体超滤设备过滤分离，去除大分子、未水解的旦白，超滤液直接喷雾干燥成为活性多肽粉。
本发明的技术特征是，制备乳铁旦白和活性多肽还可以采用另一种改良的方法，即省略酪旦白凝集程序，将脱脂的牛初乳或牛奶直接用分子量为30,000～40,000D的超微滤膜分离小分子量的乳糖、矿物质、脂溶性成份后，直接过层析柱吸附乳铁旦白，而通过层析柱的液体直接进行旦白水解程序，分离乳铁旦白和旦白水解程序方法相同，在应用乳清(奶酪生产付产品)、乳清粉、乳清旦白粉等作为原料时，也应采用这一程序和方法制备乳铁旦和活性多肽。
本发明的技术特征是，采用本发明方法制备的乳铁旦白和活性多肽既可以各自单独应用于调节人体免疫功能、对抗肿瘤，也可以联合应用，最好是两者联合应用，发挥互补作用，联合应用时，既可以单一制剂联合服用，也可以两种成份制备成复合制剂服用。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的乳铁旦白和活性多肽，可以应用于多种增强人体免疫功能和对抗肿瘤的天然营养剂中，可以让肿瘤高危人群或有肿瘤家族史的人群服用，调节免疫功能，预防肿瘤，也可以施用于结肠癌、***癌、胃癌及其他消化道肿瘤、乳腺癌、皮肤癌等多种癌症患者，应用各类已手术切除后进行化疗、放疗的癌症患者，增强免疫功能，发挥对抗肿瘤的协同作用。
本发明的技术特征是，本发明方法制备的调节人体免疫功能和对抗肿瘤的乳铁旦白和活性多肽，可以制备成多种食物形式或者药物形式施用，主要的应用方式为口服，可以直接以干粉形式用水冲服或以浓缩液形式直接服用，也可以作为食品添加剂添加在食品中进行施用，包括但不限于，奶粉、炼乳、速溶冲剂、速溶茶、饼干、糕点、糖果、蜂蜜等食品形式；也可以与各种医药等级辅料混合和制备各种药剂形式施用，包括但不限于，片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、冲剂、乳剂、软胶囊、口服液、喷剂等药剂形式。
本发明的有益效果是，从天然原料中同时制备多种调节人体免疫功能、对抗肿瘤的天然营养剂，可以长期服用，无毒付作用，在有效对抗肿瘤细胞的同时增强人体免疫功能。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例1
从牛初乳中制备乳铁旦白和活性多肽
收集母牛分娩后三天内的牛初乳15升，采用离心方式脱脂，离心速度5000转/分，离心时间20分钟，脱脂牛初乳通过交错切面流体分离过滤装置(Pall公司生产TFF装置)，选择超微滤膜分子量为40,000D，收集残余浓缩物准备过层析柱。
采用10cm自动控制生产的层析仪(Bioprocess system pharmacia)，装置琼脂糖凝胶阳离子交换树酯(SP Sepharose Big Beadsion exchanger)，层析柱直径为10cm，床高度为11cm，床容量为0.864升。
在室温下，用3.2升0.025M，PH6.5磷酸缓冲液对层析柱进行平衡，超滤浓缩物用泵抽方式，以180升/小时的流速通过层析柱，表面速度约2300cm/小时，过柱速率约208床容量/小时。
用1.0M NaCL缓冲液冲洗，冲洗液量为2.2升，获得乳铁旦白洗脱液，两种洗脱液分别用10,000D的超微滤膜超滤除盐浓缩后冷冻干燥，得到乳铁旦白干粉。
收集过层析柱的牛初乳，加热旦白溶液至50℃溶解而达到4～6％的旦白质浓度，加温至75℃下保持30分钟，降温至50℃时加入胰旦白酶和胰凝乳旦白酶混合物，酶混合物重量占旦白总重量0.8％(胰旦白酶为1800USP单位/mg，胰凝乳旦白酶为350USP单位/mg，购自Novo Nordisk Bioindustrids Inc.Danbury.CT.U.S.A.，胰旦白酶/胰凝乳旦白酶的USP单位之比为5)，维持温度50℃保持6小时，PH调节在6.5，在水解结束前，向水解产物内注入130℃蒸汽45秒钟，杀灭细菌同时使酶灭活。
已完成旦白水解过程的旦白水解液用真空泵抽入交错切面流体超滤装置用分子量为10,000D的超微滤膜分离过滤，收集过滤的上清液直接喷雾干燥成活性多肽干粉。
实施例2
测量活性多肽分子量
取实施例1制备的活性多肽粉末，用尺寸筛层析方法(SEC)，测定活性多肽分子量分布，在TSK G-2000SWXL柱中按分子尺寸将多肽分开，用UV检测器测出214nm的吸收性，并将其与已知分子量的多肽曲线比较。
摩尔质量 ％分子量分布
(g/mlo)
MM＞5000 7.8％
5000＞MM＞3000 13.7％
3000＞MM＞2000 14.6％
2000＞MM＞1000 25.8％
1000＞MM＞500 18.9％
MM＞500 19.2％
Claims (10)
1.本发明涉及一种调节免疫功能、抗肿瘤的天然营养剂，尤其涉及一种从牛初乳、牛奶、乳浆及其相关产品中制备乳铁旦白和生物活性多肽作为调节免疫、抗肿瘤天然营养剂的方法，其特征是，以牛初乳、牛奶、乳浆及其相关产品作为原材料，分别制备乳铁旦白和活性多肽。其程序和方法是，离心方法脱脂，用酸剂调PH至4.7～4.8并加热凝固酪旦白，用离心或过滤方式收获酪旦白，上清液过阳离子交换树脂装置的层析柱吸附乳铁旦白，用缓冲盐溶液洗脱乳铁旦白，除盐后冷冻干燥成乳铁旦白粉；通过层析柱的乳清液体用分子量为30,000～40,000D的超微滤膜过滤分离乳清旦白，收集超滤浓缩的旦白与酪旦白合并，采用复合旦白酶水解后，用分子量为10,000D的超微滤膜过滤分离后喷雾干燥成活性多肽粉。单独应用乳铁旦白粉或活性多肽粉，或者两者联合应用，制备多种形式食品或药剂以调节人体免疫功能，对抗肿瘤。
2.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，已经脱脂和去除酪旦白的乳清液体通过阳离子交换树脂灌装的层析柱，当液体以较高的表面速度和以较高的液体过柱率通过层析柱时，阳离子交换树脂吸附乳铁旦白，在过柱过程结束后，用盐溶液洗脱吸附在阳离子交换树脂上的旦白质，浓缩洗脱物后干燥，即可制备乳铁旦白的粉状物质。
3.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，离子交换树脂最好首先用PH6.5的磷酸缓冲液(0.025mol Na.sub2 PHO.sub.4/NaH.sub2 PO.sub.4)，大约采用4倍床容量的缓冲液冲洗层析柱足以平衡，在牛初乳、牛奶或乳浆通过层析柱后，乳铁旦白被吸附在阳离子交换树脂上，这时再用缓冲盐溶液冲洗层析柱可洗脱已吸附的物质，洗脱层析柱的缓冲液浓度大约0.7～1.5mol NaCL，洗脱液可以除盐，也可以直接干燥，除盐方式包括离子交换、电透析或超滤，超滤是最首选的除盐方式，除盐后洗脱液采用冷冻干燥方法制备乳铁旦白干粉备用。
4.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，收集已通过层析柱的乳清液，采用交错切面流体超滤装置，应用分子量为30,000～40,000D的超微滤膜进行过滤分离，分离小分子的乳糖、矿物质、残余脂肪，超滤浓缩物中含有多种旦白质，包括β-乳球旦白、α-乳白旦白、免疫球旦白等，收集超滤浓缩物进一步处理。
5.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，合并收集已凝固沉淀的酪旦白和超滤分离的乳清旦白，加碱液(例如1N NaOH)调节PH至6.5～6.8溶解酪旦白，溶液通过稀释或浓缩至每升液体内含旦白质10克～60克，最好是40克～60克/升，在复合旦白溶液内加入胰旦白酶和胰凝乳旦白酶的混合物，胰旦白酶量等于或大于800USP单位/mg，优选等于或大于1000US单位/mg，最好等于或大于1800US单位/mg，胰凝乳旦白酶量等于或大于150USP单位/mg，优选等于或大于200USP单位/mg，最好等于或大于350USP单位/mg。
6.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，在水解混合旦白时，胰旦白酶和胰凝乳旦白酶混合物中以上述USP单位计算的胰旦白/胰凝乳旦白酶之比约1～18，较好的选择为1.5～12，最好的选择为4～6，酶混合物的用量占水解旦白总量的0.4～1.2％(重量百分比)，最好是0.6～0.8％(重量百分比)。
7.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，制备乳铁旦白和活性多肽还可以采用另一种改良的方法，即省略酪旦白凝集程序，将脱脂的牛初乳或牛奶直接用分子量为30,000～40,000D的超微滤膜分离小分子量的乳糖、矿物质、脂溶性成份后，直接过层析柱吸附乳铁旦白，而通过层析柱的液体直接进行旦白水解程序，分离乳铁旦白和旦白水解程序方法相同，在应用乳清(奶酪生产付产品)、乳清粉、乳清旦白粉等作为原料时，也应采用这一程序和方法制备乳铁旦和活性多肽。
8.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，水解上述旦白混合液的过程是，加热到75℃～85℃维持10～30分钟，降温至30℃～50℃维持2～8小时，水解期间PH维持在6～8之间，最好是在6.5～6.8之间，在水解过程结束时，加热至80℃～90℃，最好85℃持续10分钟，通过热处理使酶灭活，还可以通过超高温灭菌(温度130℃维持30秒)使酶灭活，旦白水解后的溶液用分子量为10,000的超微滤膜在交错切面流体超滤设备过滤分离，去除大分子、未水解的旦白，超滤液直接喷雾干燥成为活性多肽粉。
9.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的乳铁旦白和活性多肽，可以应用于多种增强人体免疫功能和对抗肿瘤的天然营养剂中，可以让肿瘤高危人群或有肿瘤家族史的人群服用，调节免疫功能，预防肿瘤，也可以施用于结肠癌、***癌、胃癌及其他消化道肿瘤、乳腺癌、皮肤癌等多种癌症患者，应用各类已手术切除后进行化疗、放疗的癌症患者，增强免疫功能，发挥对抗肿瘤的协同作用。
10.按照权利要求1所述的方法，本发明的技术特征是，本发明方法制备的调节人体免疫功能和对抗肿瘤的乳铁旦白和活性多肽，可以制备成多种食物形式或者药物形式施用，主要的应用方式为口服，可以直接以干粉形式用水冲服或以浓缩液形式直接服用，也可以作为食品添加剂添加在食品中进行施用，包括但不限于，奶粉、炼乳、速溶冲剂、速溶茶、饼干、糕点、糖果、蜂蜜等食品形式；也可以与各种医药等级辅料混合和制备各种药剂形式施用，包括但不限于，片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、冲剂、乳剂、软胶囊、口服液、喷剂等药剂形式。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |