CN1552199A - 安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物快速繁殖技术，具体为安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法。包含如下步骤：取安祖花幼茎并将幼茎切成3－7mm长，无菌状态下接入到诱导培养基中，温度25－27℃，黑暗培养40－50天，将诱导出的体细胞胚转入形态生长培养基，温度25－27℃，，见光培养，光强3000Lx，12－16h/d，培养50－60天形成完整的植株；本发明所述的安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法具有遗传性相对稳定，所形成的再生植株变异性小于器官发生途径形成的再生植株，繁殖周期短，增殖量大的特点，该方法进行快繁比器官发生可以缩短时间50天。本发明为安祖花改良、转基因受体和突变体筛选等提供良好的无性繁殖实验体系。
Description
技术领域
本发明涉及植物快速繁殖技术，具体为安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法。
背景技术
安祖花原产于中南美洲热带雨林中，是近几年引入我国的名贵花卉。安祖花因其花形独特、花色艳丽、瓶插寿命长、周年开花、观赏价值高的特点成为倍受人们欢迎的高档花卉。在全球热带花卉贸易中，安祖花的销量仅次于兰花，名列第二。安祖花既可用于切花整体提高插花花蓝档次，又可用于盆花进行装饰。近几年由于不断培育出新的多花品种，其盆栽市场的需求量正急剧上升。
现有的安祖花繁殖方法主要有两种。一种是用实生苗进行专业化栽培，该方法利用常规的播种、分株法进行安祖花繁殖，繁殖率极低，播种繁殖所需时间长，且易产生变异。另一种方法是利用组织培养进行快速繁殖，即将安祖花的外植体在培养基中培养，通过诱导产生愈伤组织、发芽、生根、移植栽培等过程进行快速繁殖。实践证明，组培繁殖的安祖花无性系，在质量上和数量上都大大优于实生混合种。但由于目前安祖花组培繁殖技术是通过器官发生途径形成再生植株，其遗传稳定性相对较差，再生植株变异性几率相对较高，繁殖周期也相对较长。而利用植物体细胞胚诱导的方法进行组培快繁具有遗传性相对稳定，所形成的再生植株变异性小于器官发生途径形成的再生植株，繁殖周期短，增殖量大的特点。虽然体细胞胚诱导快速繁殖方法在其它植物上已有应用，但在安祖花上目前国内外尚无成功的报道。
发明内容
本发明解决目前尚无用体细胞胚诱导法快速繁殖安祖花的问题，提供一种安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法。
本发明是采用如下技术方案实现的：安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法，其包含如下步骤：取安祖花幼茎并将幼茎切成3-7mm长，无菌状态下接入到诱导培养基中，温度25-27℃，黑暗培养40-50天，将诱导出的体细胞胚转入形态生长培养基，温度25-27℃，见光培养，光强3000Lx，12-16h/d，培养50-60天形成完整的植株；所述的诱导培养基配方为：1/2MS+2.4-D1-2.5mg/L+TDZ0.05-0.5mg/L+肌醇25-100mg/L+酪蛋白25-100mg/L+蔗糖30-40g/L(2.4-D中文化学名称2，4-二氯苯氧乙酸，英文化学名称2，4-dichlorophenoxyacetic acid；TDZ中文化学名称塞苯隆，英文化学名称Thidiazuron；肌醇英文化学名称Inositol；酪蛋白英文化学名称Casein，acid hydrolysate)；所述的形态生长培养基配方为：1/2MS+KT0.05-0.5mg/L+TDZ0.05-0.5mg/L(KT中文化学名称6-糠氨基嘌呤，英文化学名称6-Furfurylaminopurine)。
一般情况下，体细胞胚(胚状体)的发育过程是：细胞经脱分化后，持续细胞***，形成小细胞团，并顺次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、梨形胚期和子叶期，进而形成完整的植株。下面通过对安祖花体细胞胚发生过程中组织细胞学观察结果进行分析，证明本发明所述的安祖花快繁方法符合体细胞胚发育过程的一般情况，其不经过明显的愈伤组织形成过程，其起始方式属于明显的直接体细胞胚胎发生途径。
(1)组织培养前幼茎的组织细胞学特征
培养前幼茎横切面由外向内分别为：第一层为表皮层，排列整齐，形状规则，呈长方形。细胞壁染色较深，可见明显的细胞核。表皮内为1-2层厚角细胞，增厚程度不明显。皮层细胞6-10层，为薄壁细胞，体积大、形状不规则，具较大的细胞间隙，细胞核小，分布在细胞边缘，整个皮层区域染色较浅。皮层内部有26个小维管束沿同心圆环状分布，每个维管束只有20个左右细胞组成，韧皮部在外方，木质部在内方，属外韧维管束。维管束中无典型的维管束鞘。韧皮部、木质部都已发育。导管具双层壁，外层壁多边形，内层壁近圆形。韧皮部区域可见明显的较大的细胞核，且细胞质较浓。髓部由5层薄壁细胞组成，这些细胞与皮层中细胞相似，形状较圆(见图1、图2)。
(2)幼茎组织启动***期的组织细胞学特征
对培养5天的幼茎观察发现，维管束区域细胞核增多，核仁明显，皮层中也出现一些具有明显核仁的细胞核。
对培养8天的幼茎观察发现，维管束区域横切面中部细胞核较密集，细胞核明显变大变圆，核仁位于细胞核中央。
对培养11天的幼茎观察发现，皮层与维管束交界处大量细胞发生破裂，维管束环带与髓部一起与皮层发生分离，贴近维管束的皮层细胞有较多的淀粉颗粒积累，完整独立的维管束结构已不存在(图3、图4)。
维管束内筛管细胞周围出现许多大核细胞，主要分布在靠近皮层一侧，形成胞质浓厚的小区域，区域中筛管与这些细胞接触紧密。这些小区域是胚性细胞的分生区，这类细胞应是前胚性决定细胞，可能是体细胞胚的起始细胞(图5、图6)。
(3)体细胞胚胎发育过程中组织与细胞结构的动态
从培养后21天开始，发现了不同细胞数目的多细胞原胚。原胚与周围细胞有明显界限，有厚壁将原胚包围。原胚中细胞小，但细胞核很大。原胚周围的细胞结构松散，细胞体积大、无核、壁薄、胞质稀少(图7)。
随着原胚细胞数目的增加，细胞的排列更加紧密，细胞的形状由近圆形变成多边形，该时期能够观察到大量的染色体行为。随着多细胞原胚的细胞***，胚体逐渐扩大为圆形，形成球形胚。
胚胎发育过程各时期的状态可以从图7到图12中看到，依次为8细胞原胚、32细胞原胚、单胚柄的早期原胚、球形胚、心形胚、梨形胚、子叶胚(盾片胚)。
观察到的体细胞胚主要是经过内发生途径形成的，是由茎内维管束中的胚性决定细胞产生体细胞胚。但是对培养34天的幼茎观察，发现了由幼茎表皮层向外产生的一个胚状体结构。而在横切面的其它部位，则保持着与原始茎相似的结构。该胚状体很明显是从外植体外层细胞直接产生的。结果说明，安祖花体细胞胚以内发生途径为主要方式的同时，也不排除外发生途径的存在(图19)。
(4)关于胚体分化特征
在胚体分化期，胚体中有的部位细胞***迅速，形成突起，成为盾片胚。此时胚根区胚体与周围细胞间出现较大空隙而处于孤立状态(图13)。胚中的组织已开始分化，胚根区形成原表皮层，其细胞形状规则、排列整齐，易与其它组织区别(图14)，其内为基本分生组织之间的细胞群，细胞核分布较松散。子叶中有原形成层，其细胞作纵向伸长，从子叶走向胚轴，有形成连续***的趋势，这部分区域胞质很浓。胚轴到胚根之间也有纵向伸长的细胞(图15)，与子叶中的原形成层相似。随着胚的进一步发育，子叶继续伸长，在高倍镜下可看到子叶区已有导管出现(图16)。
(5)形态建成期特征
成熟胚继续发育，形成植株雏形并长成完整植株(图17，图18)。
本发明所述的安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法具有遗传性相对稳定，所形成的再生植株变异性小于器官发生途径形成的再生植株，繁殖周期短，增殖量大的特点，该方法进行快繁比器官发生可以缩短时间50天。在理论上具有重演受精卵形态发生的特性，对于揭示细胞分化、发育、形态发生与合子胚发育等重大理论问题的机制以及真核细胞中基因表达和调控具有十分重要的意义。为安祖花改良、转基因受体和突变体筛选等提供良好的无性繁殖实验体系。
附图说明
图1为组织培养前幼茎的横切光学显微照片；
图2为组织培养前幼茎维管束光学显微照片
图3为培养11天后的幼茎光学显微照片
图4为维管束细胞开始***光学显微照片
图5为筛管周围的大核细胞 光学显微照片
图6为胚胎发生起始细胞光学显微照片
图7为8细胞原胚光学显微照片
图8为32细胞原胚胎光学显微照片
图9为早期原胚光学显微照片
图10为球形胚光学显微照片
图11为梨形胚光学显微照片
图12为盾形胚光学显微照片
图13为胚根结构光学显微照片
图14为胚根原表皮层光学显微照片
图15为子叶区原形成层光学显微照片
图16为子叶区导管光学显微照片
图17为成熟胚状体光学显微照片
图18为形态发生光学显微照片
图19为外发生的胚状体光学显微照片
具体实施方式
实施例1
安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法，其包含如下步骤：取安祖花幼茎并将幼茎切成3mm长，无菌状态下接入到诱导培养基中，温度25℃，黑暗培养40天，将诱导出的体细胞胚转入形态生长培养基配方，温度25-27℃，见光培养，光强3000Lx，12h/d，培养50天形成完整的植株；所述的诱导培养基配方为：1/2MS+2.4-D1mg/L+TDZ0.05mg/L+肌醇25mg/L+酪蛋白25mg/L+蔗糖30g/L；所述的形态生长培养基配方1/2MS+KT0.05mg/L+TDZ0.05mg/L。
诱导出的体细胞胚可以从幼茎上切下转入形态生长培养基；通过幼茎切片上诱导出的体细胞胚较少，可将整个幼茎切片转入形态生长培养基。
实施例2
安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法，其包含如下步骤：取安祖花幼茎并将幼茎切成7mm长，无菌状态下接入到诱导培养基中，温度27℃，黑暗培养50天，将诱导出的体细胞胚转入形态生长培养基配方，温度27℃，见光培养，光强3000Lx，16h/d，培养60天形成完整的植株；所述的诱导培养基配方为：1/2MS+2.4-D2.5mg/L+TDZ0.5mg/L+肌醇100mg/L+酪蛋白100mg/L+蔗糖40g/L；所述的形态生长培养基配方1/2MS+KT0.5mg/L+TDZ 0.5mg/L。
实施例3
安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法，其包含如下步骤：取安祖花幼茎并将幼茎切成5mm长，无菌状态下接入到诱导培养基中，温度26℃，黑暗培养45天，将诱导出的体细胞胚转入形态生长培养基配方，温度26℃，见光培养，光强3000Lx，14h/d，培养55天形成完整的植株；所述的诱导培养基配方为：1/2MS+2.4-D1.8mg/L+TDZ0.27mg/L+肌醇65mg/L+酪蛋白65mg/L+蔗糖35g/L；所述的形态生长培养基配方1/2MS+KT0.27mg/L+TDZ0.27mg/L。
Claims (1)
1、一种安祖花体细胞胚诱导快速繁殖方法，其特征为：其包含如下步骤：取安祖花幼茎并将幼茎切成3-7mm长，无菌状态下接入到诱导培养基中，温度25-27℃，黑暗培养40-50天，将诱导出的体细胞胚转入形态生长培养基，温度25-27℃，见光培养，光强3000Lx，12-16h/d，培养50-60天形成完整的植株；所述的诱导培养基配方为：1/2MS+2.4-D1-2.5mg/L+TDZ0.05-0.5mg/L+肌醇25-100mg/L+酪蛋白25-100mg/L+蔗糖30-40g/L；所述的形态生长培养基配方为：1/2MS+KT0.05-0.5mg/L+TDZ0.05-0.5mg/L。
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