CN1528126A - 欧洲七叶树体细胞胚胎发生和植株再生方法 - Google Patents

Abstract

欧洲七叶树具有很高的观赏和药用价值，采用传统的播种法繁殖，速度很慢，又极度耗费人力、物力和财力，远远不能满足市场对欧洲七叶树的需要。本发明提供了一种用欧洲七叶树的种子胚芽或春季植株萌发的新芽、种子胚芽培养出的叶片和体胚生长半个月后的子叶进行体细胞胚胎发生和植株再生的组培方法，为在林业生产中大规模推广种植欧洲七叶树提供了一种周期短，繁殖率高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的育苗方法。

Description

欧洲七叶树体细胞胚胎发生和植株再生方法

一、技术领域

本发明属于林业科学中林木组织培养技术中的细胞胚胎发生和克隆植株再生

技术领域。

二、背景技术

七叶树科(Hippocastanaceae)世界现存2属，其中七叶树属(Aesculus L)约有30余种，主要分布于北温带。我国约有10种，主要分布于西南部的亚热带地区，它们都是高大的落叶乔木，通常树高为20～30m，最高可达到45m。其中的七叶树、长柄七叶树、浙江七叶树、云南七叶树、天师栗、日本七叶树等，在我国分布的地域很广，陕西、河南、江苏、浙江等地都有栽培，在甘肃陇东尚存一棵树龄300多年的古树。因气候变迁，现在我国七叶树分布线南移，仅秦岭地区有自然分布在海拔700米以下山地的野生七叶树。

欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)是七叶树科七叶树属的一种，欧洲七叶树原产希腊北部和阿尔巴尼亚山区，1926年Kosanin在马其顿东南部发现了欧洲七叶树。欧洲七叶树代表了第三世纪植物群落的残余物种，含沙河流的淤积层腐殖质黏土和温带气候条件是其最好的适生土壤和环境，在凉爽温和的气候带中也能成功地生长。我国的北京、上海、青岛等城市已有引种栽培。

欧洲七叶树高大雄伟，干形通直，枝叶扶疏，冠如华盖，叶大而形美，遮荫效果很好。初夏开花时硕大的白色花序矗立于叶簇中，好似华丽的大烛台，蔚为奇观，是世界5大著名观赏树种之一，也是世界四大行道树(悬铃木、椴树、榆、七叶树)之一。在欧、美各国广泛栽作行道树及庭院观赏树，并有许多园艺变种，在建筑前对植、路边列植、或孤植、丛植于草坪、山坡都很合适。如以其它树种做陪衬，则更加雄伟壮丽。台湾著名文学艺术家罗青曾以《七叶树》为名，出版过一本诗集，以七叶树的美丽和旺盛的生命力点燃艺术之火，召唤人们对自然美和艺术美的向往与追求，开拓多元性的艺术视野，在人类艺术地认识世界、审美地体验世界的进程中发挥了积极作用。欧洲七叶树木材色白、面微黄、质柔软细致，虽不耐腐朽，但可供造纸及制作小工艺品和家具等。

欧洲七叶树具有很高的医疗药用价值，同属的七叶树用于医药，在我国的古籍中早有记载。我国传统医学中，七叶树种子以“娑罗子”入药，《本草纲目》中记载：“娑罗子，甘、温、利气宽中，和胃止痛”，用于“肝胃气痛，脘腹胀满，经前腹痛，乳胀，疳积虫痛，痢疾”，在《通雅》、《本草纲目拾遗》中也有详细记载。近年来，德国、日本的科学家对欧洲七叶树的药用价值进行了详尽的研究，开发生产的注射剂、片剂、栓剂、胶囊等药品已广泛用于临床。应用效果相当满意，具有良好的市场前景。

目前国内各地在七叶树的苗木生产中，一般采用传统的播种法进行繁殖，生长速度很慢，一年生的苗木仅可以长到20～40cm。七叶树属种子为顽拗型种子，不耐失水和低温。有关研究证明，去果皮种子自然风干15天就会因失去水分而丧失发芽能力，故不宜久藏。由于七叶树属种子的成熟季节在9月份，直接播种出苗后，幼苗越冬时需要采取防寒措施。况且七叶树的种子较大(平均粒重约16g)，播种时需要较多劳动力，采用带果皮湿沙保藏法，也需要经常检查翻晒，以防受干、霉烂或鼠害。此外，七叶树属结实大小年现象明显，一般周期为3～4年。所有这些都给七叶树的苗木生产带来极大的困难和繁重的工作量。

目前国内对欧洲七叶树的研究和引种栽培均很少，有限的文献记载仅限于七叶树的播种育苗、扦插繁殖和生态习性的研究上，对欧洲七叶树的组织培养技术研究尚未见有报道。国外对欧洲七叶树的研究较多(见表1)，据资料记载，1978年Radojevic曾使用欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)的花粉培育出了胚状体并得到完整的花粉植株；1989年使用未成熟胚胎诱导出了体细胞胚胎并获得完整植株。Profumo et al分别于1989年、1990年使用欧洲七叶树种子的胚轴、子叶等外植体成功地诱导出体细胞胚胎；Dameri et al于1986年使用叶片诱导出体细胞胚胎，但目前尚未形成大规模生产。

                    表1欧洲七叶树国外研究现状

外植体              结果                          作者及年代

花粉                体胚，植株                    Radojevic，1978

成熟种子的子叶      愈伤组织带有根                Profumo et al.，1976，1980

胚轴                胚性愈伤组织，体胚            Profumo et al.，1989

成熟种子的子叶      胚性愈伤，体胚，次生体胚      Profumo et al.，1990，1991

叶子                非胚性愈伤，胚性愈伤，体胚    Dameri et al.，1986

未成熟胚胎          非胚性愈伤，胚性愈伤，体胚    Radojevic，1988

                    器官发生，萌发的胚胎

花丝                非胚性愈伤，胚性愈伤，体胚    Jorgensen，1989，1991

未成熟胚珠          胚性愈伤，体胚                Radojevic，Marinkovic，1993

体胚顶端分生组织  叶簇，芽繁殖，根，植株          Radojevic et al.，1988

鉴于欧洲七叶树巨大的药用和观赏价值，国内市场对欧洲七叶树的需求量越来越大，而目前国内欧洲七叶树的引种栽培有限，其繁殖方式仅限于播种，繁殖速度极慢，又极度耗费人力、物力和财力，远远不能满足市场对欧洲七叶树的需要。

三、发明内容

本方法的发明目的是进行欧洲七叶树(Aesculus hippocastanum)的体细胞胚胎工程和克隆植株的再生技术研究，寻找适用于欧洲七叶树细胞工程快速繁殖的成熟技术体系，以满足市场对欧洲七叶树的需要。

由于种种原因，目前国内极难获得欧洲七叶树的种子，所用实验材料是通过以下过程逐步获得的：先采用种子的胚芽繁殖出无菌苗、再采用无菌苗的叶片或种子萌发幼苗的叶片诱导出不定芽和胚状体，并采用胚状体的子叶及萌发体胚的叶片再次诱导出不定芽和胚状体。克服了种源不足的困难，实验材料比较多，可以加快繁殖速度。

本发明的技术解决方案为采用欧洲七叶树的种子胚芽或春季植株萌发的新芽、种子胚芽培养出的叶片和体胚生长半个月后的子叶进行组织培养，其主要技术特征如下：

a.用种子的胚芽进行组织培养，胚芽生长和诱导不定芽所用的基本培养基是MS培养基(Murashing and Skoog medium，以下简称MS)，附加的植物激素为6-苄基氨基嘌呤(benzylaminopurine，以下简称为BA)、6-糠氨基嘌呤(6-Furfurylaminopurine，也称为Kinetin，即“激动素”，以下简称为KT)、玉米素(zeatin，以下简称为ZT)，奈乙酸(naphthylene acetic acid，以下简称为NAA)，去除BA、ZT浓度低于NAA的植物激素组合；

b.用春季植株萌发的新芽或种子胚芽培养出的叶片进行组织培养，离体叶片直接器官发生产生不定芽、间接器官发生产生不定芽和体胚发生所用的基本培养基是MS，附加的植物激素为NAA、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-dichlorophenoxyacetic acid，以下简称为2，4-D)、BA、ZT、KT、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，以下简称为IAA)、吲哚丁酸(indolebutyric acid，以下简称IBA)；

c.用体胚生长半个月后的子叶进行组织培养，所用的基本培养基为MS，附加的激素为NAA、IAA、KT、BA、ZT和TDZ(thidiazuron即噻重氮苯基脲)等。

组织培养全过程中主要使用以下两种基本培养基，其标准配方分别如下：

1.MS培养基(Murashing and Skoog medium)

          NH₄NO₃               1650mg/l

          KNO₃                  1900mg/l

          CaCl₂·2H₂O          440mg/l

          MgSO₄·7H₂O          370mg/l

          KH₂PO₄               170mg/l

          KI                      990mg/l

          H₃BO₃                6.2mg/l

          MgSO₄·H₂O           22.3mg/l

          ZnSO₄·7H₂O          8.6mg/l

          Na2MoO₄·2H₂O        0.25mg/l

          CuSO₄·5H₂O          0.025mg/l

          CoCl₂·6H₂O          0.025mg/l

          FeSO₄·7H₂O          27.8mg/l

          Na₂-EDTA              37.3mg/l

          肌醇                   100mg/l

          烟酸                   0.5mg/l

          盐酸硫胺素             0.1mg/l

          盐酸吡哆醇             0.5mg/l

          甘氨酸                 2mg/l

2.WPM(Woody Plant Medium)即木本植物组织培养基

          NH₄NO₃               400mg/l

          Ca(NO₃)₂·4H₂O      556mg/l

          CaCl₂·2H₂O          96mg/l

          MgSO₄·7H₂O          370mg/l

          KH₂PO₄               170mg/l

          K₂SO₄                990mg/l

          Na₂-EDTA              37.3mg/l

          FeSO₄·7H₂O          27.8mg/l

          MgSO₄·H₂O           22.3mg/l

          ZnSO₄·7H₂O          8.6mg/l

          H₃BO₃                6.2mg/l

          Na₂MoO₄·2H₂O       0.25mg/l

          CuSO₄·5H₂O          0.25mg/l

          肌醇                   100mg/l

          烟酸                   0.5mg/l

          盐酸硫胺素             1mg/l

          甘氨酸                 2mg/l

四、具体实施方式

实施例1：采用种子的胚芽进行组织培养

欧洲七叶树种子种皮坚厚光滑，很难切开，可先使其萌发。萌发时胚根先突出种皮，5d后露出种皮的部分可达到4cm，该部分内部包有胚芽，选择没有露出胚芽的掰下，自来水冲洗2小时，于超净工作台上用75％的酒精浸泡30s，0.1％HgCl₂浸泡8～12min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸吸干表面水分，切除胚芽外包物，取出胚芽，接种于MS中生长一段时间。由于种皮致密，子叶肥厚，胚芽不易受外界污染，熟练者亦可不使用消毒剂消毒，直接拨去胚芽的外包物取出胚芽接种，避免消毒剂对环境的污染。

胚芽生长和芽分化增殖所用到的基本培养基是MS培养基，附加植物激素为BA、KT、ZT、NAA等、蔗糖30g/L、琼脂粉6.5g/L(pH5.8)，灭菌前pH值调至5.8，121℃高温、高压灭菌18min，培养温度为24～26℃，光照(20001x)16h/d下培养。由于欧洲七叶树叶、种子的化学成分主要为皂苷、黄酮类化合物、七叶树苷等，所以培养时极易发生褐化，阻止幼苗吸取营养物质，影响生长甚至导致死亡，因此培养基中还可附加5mg/l的维生素C。弱光下培养5d再转入20001x的光照下培养，并及时切去变褐的部分，继代于新鲜的培养基中。

在BA或ZT浓度较高(0.8～1mg/L)的培养基上，诱导芽速率快、出芽时间短，但是分化出来的芽随时间的推移逐渐转化为透明、多水的玻璃化芽。当降低到0.6mg/L时，可防止玻璃化芽的产生。

培养15d左右，在幼苗的基部形成肉眼可见的不定芽，一个月之后可得到七叶树的诱导试管苗。

不同激素及不同激素组合对芽增殖的影响参见表2。

              表2不同激素及不同激素水平对芽增殖的影响

附加激素(MS)      接种数    诱导率(％)    平均诱导芽数    愈伤程度

BA 0.4            30          56.7            13.8           -

BA 0.6            30          100             21.2           -

BA 0.6+NAA 0.1    30          100             35.7           +

BA 0.6+NAA 0.2    30          50              8.5            ++

BA 0.8            30          100             67             -

KT 0.2            30          6.67            0.1            -

KT 0.4            30          10              0.3            -

KT 0.4+NAA 0.2    30          13.3            0.4            ++

KT 0.8            30          13.3            0.33           -

ZT 0.2            30          53              33.8           -

ZT 0.4            30          100             34             -

ZT 0.6             30         100             45             -

ZT 0.8             30         100             77             -

注：-无愈伤     +少量愈伤        ++较多愈伤

实施例2：采用春季枝条刚抽出或由胚芽诱导出的不定芽的叶片进行组织培养

本实施例中，外植体来源可有两种方式，一是在实施例1中得到的无菌苗上取叶片，接种于诱导培养基上，可省去消毒的步骤；二是从春季刚萌发的枝条上取材，选取颜色鲜绿生长状态良好的幼嫩叶片(连带叶柄)，洗洁精浸泡2h，流水冲洗2h，在超净工作台上消毒，消毒时每个三角瓶中可放入4～6个叶片，75％的无水乙醇1min，0.1％的84消毒液8min，无菌水冲洗5～6次，无菌滤纸洗干表面水分，剪去叶片边缘部分，剪成5mm×10mm的小方块，并在叶片的中脉部横切3刀，然后将背面朝下置床于准备好的培养基上，放置于25℃的黑暗条件下。叶片以三种方式进行增殖：直接器官发生产生不定芽、间接器官发生产生不定芽、间接器官发生产生体胚，现分述如下：

1.直接器官发生产生不定芽：所用的基本培养基是MS，附加的植物激素有NAA、IAA、IBA、BA、ZT等，黑暗处25℃条件下培养10d后移至20001x光下，其它培养条件同实施例1，叶片培养一个月可得到试管苗。

不同激素及不同激素组合对离体叶片分化的影响参见表3。

              表3不同激素及不同激素水平对叶片芽分化的影响

附加激素(MS)              接种数          诱导率(％)          平均诱导芽数

BA3+KT0.2+NAA0.2            30               23                    2.2

BA3+KT0.2+IAA0.2            30               21                    1.7

BA3+KT0.2+IBA0.2            30               19                    2.1

BA3+KT0.2+NAA0.4            30               32                    4.7

ZT2+NAA0.2                  30               75                    8

从表3中可以看出，在各个处理中以ZT2mg/L+NAA0.2mg/L为最合适。在这种培养基上，诱导率为75％，平均每个叶片可以诱导8个不定芽。

2.间接器官发生产生不定芽：所用的基本培养基是MS，附加的激素有2，4-D、NAA、KT、BA、ZT等，将叶片接种于MS+2，4-D2+KT0.2的培养基上，放置于黑暗处25℃条件下培养，20d后在叶脉和边缘及切口处产生乳白色愈伤，把愈伤转入细胞***素浓度较高的培养基上，移至光下培养，大约10d后，愈伤边缘逐渐出现绿色突起，渐渐成长为肉眼可见的芽点，随着培养时间的延长，芽点逐渐成长为绿色的不定芽，待不定芽长至2cm高时，可以切割下来接种于MS中，或接种于实施例1设计的培养基中进行增殖。

不同激素及不同激素组合对叶片间接器官发生影响很大，参见表4。

               表4不同激素及不同激素水平对叶片芽分化的影响

附加激素(MS)                接种数          诱导率(％)          平均诱导芽数

BA1+NAA0.2                    30              11                     1.2

BA3+NAA0.2                    30              46                     3.6

KT2+NAA0.2                    30              15                     0.9

ZT2+NAA0.2                    30              59                     5.6

可见MS+BA3+NAA0.2及ZT2+NAA0.2培养基诱导效果比较好，诱导率分别为46和59，每块愈伤分别产生3.6和5.6个芽。

3.间接器官发生产生体细胞胚胎(简称体胚)：在合适的条件下，由欧洲七叶树叶片诱导的愈伤上会出现大量的体胚，并且体胚分化次生胚的能力较强，能够在短时间内生产大量优质苗木。将叶片接种于MS+2，4-D2+KT0.2的培养基上，放置于黑暗处25℃条件下培养，5d后开始在叶片边缘及切口处出现皱褶，10d后开始产生愈伤，至20d时，100％的叶片全部形成了愈伤。诱导出的愈伤有三种类型，一类为乳白色，致密，生长速度较快，为粒状堆积物型，经过诱导可产生体胚；一类为乳黄色，松软，显微镜下观察，其细胞质稀薄，液泡较大，经过进一步诱导可产生少量体胚；第三类为雪花状白色愈伤，表面具有绒毛，干枯，不能诱导出体胚。三者在外观形态上很容易区别，可剔除第三类愈伤，减少后面不必要的工作量。

叶片在含有2，4-D的培养基上培养20d后，就要转入细胞***素浓度较高的培养基上，诱导胚性愈伤。此时必须去掉2，4-D，否则，在2，4-D的作用下，脱分化细胞不断进行***，使细胞处于不断的***状态，无法进行再分化和形态建成。细胞***素和生长素的不同浓度配比，对胚性愈伤的诱导影响很大，由表5可见，当BA浓度在5～10时，均可以诱导出胚性愈伤，其中MS+BA 8+NAA1的诱导效果最好，诱导率达到70％。欧洲七叶树叶片中酚类含量高，愈伤在光下容易褐变，干枯死亡，黑暗中诱导出的胚性愈伤移至光下后，也逐渐变褐丧失体胚发生能力，须在黑暗中培养。培养15d后将胚性愈伤接种于分化培养基上，至第3d时，显微镜下可观察到球形胚，很容易与周围愈伤组织分离，在接下来的5d内，球形胚依次经过鱼雷胚、心形胚后，胚体上端逐渐发育成子叶。在第10d时，肉眼可以观察到在愈伤组织表面形成了众多的白色体胚，色泽晶莹，光滑剔透，具2片对称子叶和膨大的胚根。在此阶段，激素的种类和浓度对体胚的发育和成熟很重要，见表6，综合诱导频率、平均出胚数和平均产生畸形胚数目三个方面来讲，以MS+BA5+NAA0.2和MS+ZT2+NAA0.2的浓度配比较好。待体胚长至5～10cm时，要及时把体胚转移到不添加任何激素的1/2MS中，使其萌发，或移至激素浓度进一步降低的培养基中，使其产生次生胚。

                表5不同激素浓度对诱导胚性愈伤的影响

附加激素(MS)                接种数          胚性愈伤数          诱导率(％)

BA5+NAA0.5                    50                13                 26

BA5+NAA1                      50                21                 42

BA5+NAA2                      50                15                 30

BA8+NAA0.5                    50                23                 46

BA8+NAA1                      50                35                 70

BA10+NAA1                     50                28                 56

                表6不同激素及激素浓度对体胚诱导的影响

附加激素(MS)    接种数    出胚愈伤数    诱导率(％)    平均出胚数    平均畸形胚数目

BA3+NAA0.2        30          1            3.3            4              1

BA5+NAA0.2        30          11           36.7           7              0.73

BA6+NAA0.2        30          8            26.7           5              0.325

ZT1+NAA0.2        30          13           43.3           8              0.15

ZT2+NAA0.2        30          21           70             14             0.06

ZT3+NAA0.2        30          14           46.7           7              0.24

欧洲七叶树多在胚性愈伤的褐化部位或靠近培养基的愈伤基部出现体胚，后该愈伤褐化加重最后死亡，这为体胚的增殖带来困难，研究中发现使用子叶胚诱导次生胚比较容易，在体胚的胚根部位产生次生胚，初始时与母体连接紧密，逐渐长大后开始与母体分离，最后自行脱离母体，可以独立吸收营养发育。在增殖阶段，维持体胚组织内的激素平衡很重要，见表7，低浓度的MS+KT0.1+NAA0.01及MS+ZT0.1+NAA0.01可使新产生的体胚数量达到最多，增殖频率分别为214、256，浓度过高或比例不适当时，增殖率反而下降，并且畸形胚也增加。

                 表7不同激素及激素浓度对次生胚诱导的影响

附加激素(MS)      接种数      继代体胚数      增殖数      增殖频率％

MS0                 50            73            23            46

KT0.05+NAA0.01      50            113           63            126

KT0.1+NAA0.01       50            157           107           214

KT0.5+NAA0.05       50            93            43            86

ZT0.1+NAA0.01       50            178           128           256

ZT0.5+NAA0.05       50            107           57            114

将5～8cm长的体胚移入1/2MS后，转入光照下进行萌发。10d左右可见生长点从两片乳白色膨大的子叶间伸出，15d后，展开第一对复叶，萌发率为98％，20d时胚根开始发育。子叶变大并开裂，产生很多缺刻，可以剪下用做实施例3的试验用材。约需要50d，体胚发育为具有2对复叶、硕大开裂子叶、根端发育良好、叶色鲜绿的小植株，开瓶炼苗一周，在温室中驯化15d后，即可移栽室外，加以肥水管理，获得了起源于叶片的完整体胚植株。

实施例3：用体胚生长半个月后的子叶进行组织培养

欧洲七叶树的体胚比较特殊，子叶不能象其它植物的体胚子叶那样发育为叶片，而是在体胚生长的过程中逐渐开裂，非常肥厚，是进行不定芽诱导和再次体胚发生的良好材料。在这个实施例中，MS是基本培养基，所用的激素是ZT、BA、KT、NAA、IAA并试用了新型细胞***素TDZ。直接剪下体胚的子叶，接种于准备好的培养基上，发现子叶以直接器官发生形式产生不定芽，以直接和间接器官发生两种形式产生体胚。不同激素组合对子叶直接器官发生产生不定芽还是产生体胚影响很大，见表8。

1.间接器官发生产生体胚：该过程即愈伤及胚性愈伤的诱导、体胚的发育及增殖同实施例2中产生的方法相同，结果相似。

2.直接器官发生诱导不定芽：单独附加BA、KT或TDZ的培养基对于诱导不定芽效果显著，而对于诱导体胚效果微弱，BA较KT诱导不定芽效果要好，MS+BA2+NAA0.2诱导率为88，平均诱导芽数为25.6。新型的细胞***素TDZ对于诱导不定芽效果极其明显，当浓度调至0.005时，诱导率达到100，平均出芽数为37，幼苗状态很好，生长迅速；浓度为0.01时，每块子叶出芽太多，平均可达到78，由于空间和营养的限制，不能发育为有效芽，且由于数量众多，呼吸旺盛，使培养瓶内温度和湿度升高，幼苗玻璃化严重，因此以MS+TDZ0.005+NAA0.2为合适的诱导培养基。

3.直接器官发生产生体胚：ZT对于子叶诱导体胚的作用很关键，表中所列培养基诱导率都达到80％，平均出胚数全部超过25。其中以MS+ZT2+NAA0.2效果最好，诱导率及平均出胚数分别为88和38，当浓度降为0.5并附以BA1时，诱导率及平均出胚数略有降低，分别为82和30，由于ZT价格较其它试剂价格高，从节省成本考虑，确定以MS+ZT0.5+BA1+NAA0.2为诱导体胚的合适培养基。体胚增殖方式同实施例2中相同。

               表8不同激素及激素浓度对子叶诱导分化的影响

附加激素(MS)      接种数    出芽诱导率％    平均出芽数    出胚诱导率％    平均出胚数

BA2+NAA0.2          50          88             25.6           2               1

KT2+NAA0.2          50          74             17.2           10              1.6

ZT2+NAA0.2          50          38             7              88              38

ZT1+BA1+NAA0.2      50          46             7.5            86              32

ZT0.5+BA1+NAA0.2    50          36             7.2            82              30

ZT1+KT1+NAA0.2      50          56             8.9            82              25

TDZ0.001+NAA0.2     50          74             21             4               1.5

TDZ0.005+NAA0.2     50          100            37             6               2

TDZ0.01+NAA0.2      50          100            78             4               3

通过各种途径分化出的不定芽，在附加0.4～0.6NAA的1/2MS或WPM培养基上，2周左右产生根系，生根率为75％。通过叶片和子叶诱导出的胚状体在1/2MS培养基上，一周左右开始萌发，20d后开始生根，发育状态很好。

采用本发明所提供的欧洲七叶树组织培养快速繁殖的成套技术方法进行欧洲七叶树组织培养和微繁技术的开发，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗繁殖出不定芽，也可以利用无菌苗的叶片诱导不定芽和胚状体，再利用胚状体的子叶诱导不定芽和胚状体，形成一个良好的生产循环体系，增加繁殖系数。直接器官发生的方式由于不经过愈伤组织阶段，可以减少变异植株的产生，为快繁中保持优树、保持种质资源的优良特性提供保障，而通过间接器官发生产生的不定芽及胚状体，可能产生变异植株，这又为林木的品种改良和选育新品种提供了挈机。本发明为在林业生产中大规模种植提供一种周期短，繁殖率高、成本低廉的育苗方法。

Claims (8)

1.一种用欧洲七叶树的种子胚芽或春季植株萌发的新芽、种子胚芽培养出的叶片和体胚生长半个月后的子叶进行细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：

a.用种子的胚芽进行组织培养，胚芽生长和诱导不定芽所用的基本培养基是MS培养基，附加的植物激素为BA、KT、ZT、NAA，去除BA、ZT浓度低于NAA的植物激素组合；

b.用春季植株萌发的新芽或种子胚芽培养出的叶片进行组织培养，离体叶片直接器官发生产生不定芽、间接器官发生产生不定芽和体胚发生所用的基本培养基是MS，附加的植物激素为NAA、2，4-D、BA、ZT、KT、IAA、IBA；

c.用体胚生长半个月后的子叶进行组织培养，所用的基本培养基为MS，附加的激素为NAA、IAA、KT、BA、ZT和TDZ。

2.如权利要求1.a所述，用欧洲七叶树种子的胚芽进行离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于：附加激素BA或ZT的最佳浓度为0.6mg/L。

3.如权利要求1.b所述，用欧洲七叶树春季植株萌发的幼嫩叶片或种子胚芽培养出的叶片诱导不定芽及体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：直接器官发生产生不定芽时，最佳的附加激素组合和浓度值为ZT2mg/L+NAA0.2mg/L。

4.如权利要求1.b所述，用欧洲七叶树春季植株萌发的幼嫩叶片或种子胚芽培养出的叶片诱导不定芽及体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：间接器官发生产生不定芽时，最佳的附加激素组合和浓度值为BA3mg/L+NAA0.2mg/L及ZT2mg/L+NAA0.2mg/L。

5.如权利要求1.b所述，用欧洲七叶树春季植株萌发的幼嫩叶片或种子胚芽培养出的叶片诱导不定芽及体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：间接器官发生产生体细胞胚胎时，诱导胚性愈伤阶段最佳的附加激素组合和浓度值为BA8mg/L+NAA1mg/L，体胚诱导阶段最佳的附加激素组合和浓度值为BA5mg/L+NAA0.2mg/L和ZT2mg/L+NAA0.2mg/L，次生胚诱导阶段最佳的附加激素组合和浓度值为KT0.1mg/L+NAA0.01mg/L及ZT0.1mg/L+NAA0.01mg/L。

6.如权利要求1.c所述，用欧洲七叶树体胚生长半个月后的子叶诱导不定芽及体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：直接器官发生诱导不定芽时，最佳的附加激素组合和浓度值为MS+BA2+NAA0.2或TDZ0.005mg/L+NAA0.2mg/L。

7.如权利要求1.c所述，用欧洲七叶树体胚生长半个月后的子叶诱导不定芽及体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：间接器官发生产生体细胞胚胎时，诱导胚性愈伤阶段最佳的附加激素组合和浓度值为BA8mg/L+NAA1mg/L，体胚诱导阶段最佳的附加激素组合和浓度值为BA5mg/L+NAA0.2mg/L和ZT2mg/L+NAA0.2mg/L，次生胚诱导阶段最佳的附加激素组合和浓度值为KT0.1mg/L+NAA0.01mg/L及ZT0.1mg/L+NAA0.01mg/L。

8.如权利要求1.c所述，用欧洲七叶树体胚生长半个月后的子叶诱导不定芽及体细胞胚胎发生和植株再生的方法，其特征在于：直接器官发生产生体细胞胚胎时，最佳的附加激素组合和浓度值为MS+ZT0.5+BA1+NAA0.2。