CN1524949A

CN1524949A - 一种草酸青霉菌、其菌剂及其制备方法、以及其制剂在解磷防病提高土壤肥力方面的应用

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Publication number: CN1524949A
Application number: CNA031052258A
Authority: CN
Inventors: 唐文华; 余永年; 王祺
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-02-24
Filing date: 2003-02-24
Publication date: 2004-09-01
Anticipated expiration: 2023-02-24
Also published as: CN1252247C

Abstract

本发明涉及一种微生物、微生物菌剂及其应用，特别是涉及一种草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、草酸青霉菌菌剂及其制备方法、以及草酸青霉菌在制备植物解磷防病并提高土壤肥力菌剂的应用，尤其是能产生水溶性物质草酸和柠檬酸(2－羟基－1，2，3－丙烷三羧酸)的草酸青霉菌及其制剂、菌剂的制备方法和应用。本发明同时具有解磷和防病作用，在解磷方面，与现有国内使用的磷细菌相比，其解磷效果稳定；在防病方面，与现有国内使用的磷细菌相比，其有独特的防病作用。本发明可使有效磷的含量提高135.32ppm；在PDA培养基上经过对多种重要植物病原菌进行测定，发现本发明菌株对它们有显著抑制作用，本发明在我国为首次报道。

Description

一种草酸青霉菌、其菌剂及其制备方法、以及其制剂在解磷防病提高土壤肥力方面的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物、微生物菌剂及其应用，特别是涉及一种草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、草酸青霉菌菌剂及其制备方法、以及草酸青霉菌在制备解磷防病并提高土壤肥力菌剂的应用，尤其是能产生水溶性物质草酸和柠檬酸(2-羟基-1，2，3-丙烷三羧酸)的草酸青霉菌及其菌剂、菌剂的制备方法和应用。

背景技术

磷是植物必需的营养元素之一，土壤中全磷浓度在0.02％～0.5％范围，平均约为0.05％。但是土壤中95％以上的磷为无效形式，不能为植物吸收利用，因此，我国74％的耕地土壤缺磷。当季作物施用的磷肥，其利用率仅为5％～25％，大部分施入土壤中的磷被固定为不可利用态。因此，研究土壤中磷素的有效化过程，对提高土壤肥力、节约能源、降低农用开支以及对环保均有极其重要的意义。二十世纪30年代，前苏联从土壤中分离到解磷巨大芽孢杆菌(B.megatherium phospherium)，50年代Sperber在“自然”杂志上发表文章肯定了土壤细菌在磷素矿化中的作用；50至60年代，我国开展了解磷细菌的研究，并在大面上进行试验和应用；在继后的实际应用中，多数实例表明磷细菌具有解磷和增产作用，但有不稳定现象。这种现象在国外有许多报告，因此，对解磷微生物的研究和利用一直是国内外所关注的问题。90年代以来，国外连续对解磷真菌的研究表明，其解磷效率及稳定性均优于解磷细菌，并已开始向产业化方向发展。Kucey等人1989年评述了微生物在解磷方面的作用。Torre等人1993年评述了由真菌矿化磷素的机制。1992年Cunningham等研究了比拉氏青霉(Penicillium bilaii)的解磷作用及机制。晚近，1996年Vassilev等对变幻青霉Penicillium variabile、1999年Whitelaw等对放射青霉Penicillium radicum、1999年Reyes等对皱青霉Penicillium rugulosum等的解磷作用作过报道。2001年Reyes等报道了皱青霉Penicillium rugulosum野生菌株及UV-诱变菌株矿化磷的作用及应用前景。从以上这些研究可以看出，对解磷微生物研究热点已从细菌转向真菌，尤其是向青霉菌的研究和开发方向发展。Cunningham和Kuiack对青霉菌解磷机制研究证明，柠檬酸和草酸的生成是该菌解磷的机制(“Production ofCitric and Oxalic Acids and Solubilization of Calcium Phosphate byPenicillium bilaii”，此文发表于Applied and Environmental.Microbiology，May 1992，p.1451-1458；)。1993 Torre等研究了常见青霉Penicillium frequentans分化矿石的生物化学机制并证明，草酸、柠檬酸和葡萄糖酸的产生是关键因素(“Biochemical mechanisms of stone alterationcarried out by filamentous fungi licing in monuments”，此文发表于Biogeochemistry 19：129-147，1993；)。Kucey等评述了微生物提高植物可利用磷素的研究进展(Microbially mediated increases in plant-acailablephosphorus，此文发表于Advances in agronomy，vol，42，199-228；)。2001年Reyes等研究了皱青霉Penicillium rugulosum的野生菌株及紫外线诱变菌株分解磷矿石提高植物可利用磷含量(Solubilizaton of phosphate rocksand minerals by a wild-type strain and two UV-induced mutants ofPenicillium rugulosum”，此文发表于Soil Biology & Biochemistry 33：1741-1747)。1982年，Windels和Kommedahl利用草酸青霉Penicilliumoxalicum处理豌豆种子防治豌豆出苗前烂种和苗期病害(Rhizosphereeffects of pea seed treatment with Penicillium oxalicum”，此文发表于Phytopathology 72：198-194)。

在国外，对Penicillium bilaii已进行了生物学、生物化学及生产工艺研究，在澳大利亚及加拿大已登记商品化生产和应用。

综上所述，目前国内外用于解磷的真菌或细菌仅提及解磷作用，并未涉及其防病作用；而用于防病的有益真菌或细菌，也未见涉及其磷解作用。经查新，我国与本项研究相关的报告尚未发现。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物、微生物菌剂及其应用，特别是涉及一种草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)、含草酸青霉菌的菌剂及其制备方法、以及由草酸青霉菌制备的解磷防病并提高土壤肥力菌剂的应用。尤其是能产生水溶性物质草酸和柠檬酸(2-羟基-1，2，3-丙烷三羧酸)的草酸青霉菌及其菌剂、菌剂的制备方法和应用，本发明克服了目前用于解磷真菌或细菌仅涉及解磷作用，并未涉及其防病作用，或用于防病的有益真菌或细菌，而未见涉及其磷解作用的菌剂的缺点。本发明提供的草酸青霉菌菌剂同时具有解磷和防病作用。

本发明目的通过以下技术方案来实现的：

使用的微生物

用来生产本发明所述的菌剂是一种新的微生物，属于真菌的青霉属，草酸青霉菌种(Penicillium oxalicum)。名称为BGP-01，简称BGP-01菌。它能产生水溶性物质草酸和柠檬酸(2-羟基-1，2，3-丙烷三羧酸)，此水溶性物质是溶解非有效磷和防病的主要机制。BGP-01分离自河北省无农事活动的山地土壤及耕作土壤上的植物根际。该菌株已于2003年3月1日保藏在中国微生物保藏中心，保藏号为CGMCC 0891。

草酸青霉菌的分离方法

分离的方法为平板稀释分离法，用磷酸三钙选择性培养基培养，测量消解圈，应用高压液相色谱，证明该菌能够产生水溶性物质草酸和柠檬酸(2-羟基-1，2，3-丙烷三羧酸)。

BGP-01菌株具有以下性质

1、形态特征

该菌分生孢子梗直立(100-200um)、无色、有分隔、具有刷状小梗、小梗丛生于分枝顶端呈花瓶状、分生孢子常链状生长、球形至椭圆形、无色至着色、光滑(4.5-6.5×3.0-4.0um)。

2、菌落情况

该菌在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA)上菌落边缘白色，孢子形成后黄绿至深绿色。

本发明所述草酸青霉菌BGP-01的制备，所述制备可以为液体培养，也可以为固体培养，可使培养基中含有常用于微生物培养的碳源、氮源及其它营养液。其中碳源可为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖、蔗糖、肌醇、甘露醇等。氮源可为胨、大豆粉、肉膏、麦皮、尿素、玉米浆、铵盐、硝酸盐，及其他有机盐或无机盐含氮化合物。至于其他营养源则可适当添加一些无机盐。例如食盐、磷酸盐类及钾、钙、锌、锰、铁之类的金属盐。

优选为马铃薯，葡萄糖，琼胶粉，水配置的PDA培养基。将草酸青霉菌BGP-01(微生物包藏号为CGMCC No.0981)接种于该培养基中。

培养条件：适宜的生长温度为20-25℃，适宜的PH值为4.0-8.0，优选的PH值为7.0，一般可在PDA培养基培养。

培养的草酸青霉菌BGP-01菌株，贮存在-20℃冰箱内。

本发明还提供另一种所述草酸青霉菌的培养基，用于工业培养此真菌，所述培养基组分为：淀粉、植物蛋白、植物脂肪、粗纤维，优选为：玉米粉、豆饼粉、麸皮粉、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、花生油。

所述培养基各组分的配方包括：玉米粉1.5-4.5％、豆饼粉1.5-4.5％、麸皮粉1.5-4.5％、K₂HPO₄1.9-2.4％、KH₂PO₄0.5-1.0％、MgSO₄0.005-0.1％、花生油0.2-0.4％、水。

最隹配方为：玉米粉3％、豆饼粉3％、麸皮粉3％、K₂HPO₄2.15％、KH₂PO₄0.8％、MgSO₄0.075％、花生油0.3％、其余为水。

本发明的一种草酸青霉菌菌剂：所述菌剂包括草酸青霉菌BGP-01及其发酵基物、吸附剂、填充物、水。用于防治多种土传病害并且通过溶解土壤中非有效磷而提高土壤肥力。

所述填充物可以选用磷矿粉。

所述吸附剂可以选用蛭石、草炭。

本发明所述草酸青霉菌菌剂的制备方法，至少包括如下步骤：1)菌种活化；2)种子罐发酵；3)生产罐深层发酵；4)转入固体培养；5)收集孢子。

所述草酸青霉菌菌剂制备方法还进一步包括：1)培养斜面菌株和在茄瓶中培养种子菌株；2)加入填料后搅拌、供气、发酵；3)固体发酵基物灭菌；4)均匀加入发酵菌剂，保温培养；5)水洗过滤收集孢子；6)加入吸附剂、填充物，充分混匀；7)检验，包装。

所述种子罐到生产罐的草酸青霉菌菌种接种量为3～5％，优选为4％；起始PH为7.2～8.0，优选PH为7.5。

所述草酸青霉菌菌剂制备方法工艺条件为：

所述培养基PH为6.6～8.0，优选为7；

所述发酵罐内培养温度为20～25℃，优选为23℃，PH保持在6.4～8.0，优选为7，通风量为1∶0.5～0.8，优选为0.6，罐压为1.5～2.0/cm²，优选为1.8/cm²搅拌速度为220rpm，72～96小时，优选为80小时发酵完毕。

所述加入的填充料选自蛭石、草炭，优选配比为1∶1。

本发明所述草酸青霉菌菌剂可使用该技术领域中已知农药所通用的固相、液相及乳化分散剂等各种载体，并能制成颗粒剂、粉剂、乳化剂、可湿性粉剂、片剂、油剂、喷雾剂、烟雾剂等任意剂型。一般而言，各制剂中有效成分的配比在乳剂及可湿性粉剂中为10-90％；在、粉剂及油剂等中为0.1-10％；可根据不同的使用目的而适量增减。

本发明还提供了一种草酸青霉菌在制备植物解磷防病提高土壤肥力菌剂方面的应用。

本发明具有以下有益效果和优点：

本发明提供的草酸青霉菌菌剂同时具有解磷和防病作用，优于目前国内外用于解磷的真菌或细菌有解磷作用，并未涉及其防病作用；或用于防病的有益真菌或细菌，也未见提及其磷解作用。

1)在解磷方面：与现有国内使用的磷细菌相比，其解磷效果稳定。

2)在防病方面：与现有国内使用的磷细菌相比，其有独特的防病作用。

经过与磷矿粉混和发酵制备过程，本发明的菌株具有以下效果：可使有效磷的含量提高135.32ppm；在PDA培养基上经过对多种重要植物病原菌进行测定，发现本发明菌株对它们有显着抑制作用。

具体实施方式

实施例1

草酸青霉菌BGP-01的制备，步骤如下：

以马铃薯200g，葡萄糖20g，琼胶粉15g，水1000ml的比例制成培养基。将草酸青霉菌BGP-01(微生物包藏号为CGMCC No.0981)接种于该培养基中，培养条件：生长温度为23℃，PH值为7.0。

培养的草酸青霉菌BGP-01菌株，贮存在-20℃冰箱内。

实施例2

草酸青霉菌剂的制备

本发明所述的草酸青霉菌菌剂包括草酸青霉菌BGP-01及其发酵基物、吸附剂、填充物、水。

所述的培养基组分为：玉米粉3％、豆饼粉3％、麸皮粉3％、K₂HPO₄2.15％、KH₂PO₄0.8％、MgS0₄0.075％、花生油0.3％。

制备步骤如下：制备斜面种子菌株，制备茄瓶种子菌株，种子罐培养，发酵罐发酵，加填充料培养，收集孢子，加入助剂，检验，包装。

具体步骤如下：

1、制备斜面种子菌株：以实施例1，PDA培养基培养的草酸青霉菌BGP-01菌株，贮存在-20℃冰箱内，使用前取出并活化(即将纯菌种接种在平板上培养)两次。

2、在茄瓶中制备种子菌株：将上述培养的菌株用PDA培养基在250毫升茄瓶中培养，培养温度为23℃，96小时生长良好时用灭水菌洗下，作为种子罐的接种物。

3、按种子罐体积的2/3投培养基，培养基组成为玉米粉3％、豆饼粉3％、麸皮粉3％、K₂HPO₄2.15％、KH₂PO₄0.8％、MgSO₄0.075％、花生油0.3％。起始PH7.5。

4、从种子罐向生产罐接种，接种量4％，开始发酵。发酵条件控制：培养温度为23℃，通风量为1∶0.6，罐压为1.8/cm²，搅拌速度为220rpm，接种72小时后每隔4小时取样一次，观察菌体生长状况、是否有污染，待发现孢子生成后，液体发酵完成，将发酵物均匀混合于蛭石、草炭中，比例为1∶1。进行固体发酵。待孢子充分形成后，水洗法收集孢子。加磷矿粉填充料，检验，包装。

质量检验：按产品企业标准的有关规定进行各项指标的测定，菌数达到20亿/克。

经过与磷矿粉混和发酵实验，本发明的菌株具有以下效果：可使有效磷的含量提高135.32ppm；在PDA培养基上经过对多种重要植物病原菌进行测定，发现本发明菌株对它们有显着抑制作用。

有效磷含量测定方法：

1、土壤速效磷测定方法——碳酸氢钠法(根据Olsen et.al.，1954Eestimation of available P in soils by extraction with sodiumbicarbonate.USDA circ.939.)

2、磷矿粉速效磷测定方法——钒钼黄比色法(根据鲁如坤等《土壤化学分析方法》1999年372页)

对主要土传植物病原菌的测定方法及结果：

测定方法：采用平板对峙培养法，根据抑菌圈的大小记录抑菌作用的强弱。以下为草酸青霉菌对主要土传病原菌抑制作用的测定结果；

病原菌名称	抑菌强度
病原菌名称	抑菌强度	终极腐霉	+++
瓜果腐霉	+++	终极腐霉	+++
瓜果腐霉	+++	茄丝核菌	++++
小麦全蚀病菌	++++	茄丝核菌	++++
小麦全蚀病菌	++++	尖孢镰刀菌	+++
茄病镰刀菌	+++	尖孢镰刀菌	+++
茄病镰刀菌	+++	粉红镰刀菌	+++
黄萎病菌	+++	粉红镰刀菌	+++
黄萎病菌	+++	农杆菌	+++
番茄枯萎病菌	++++	农杆菌	+++

注：上表“+”号代表抑制强度，共分五级，由“0”至“4”。“0”表示无抑制作用，“4”表示完全抑制。

Claims

1、一种草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)(微生物包藏号为CGMCCNo.0891)，所述该菌分生孢子梗直立，高度为100-200um、无色、有分隔、具有刷状小梗、小梗丛生于分枝顶端呈花瓶状、分生孢子常链状生长、球形至椭圆形、无色至着色、光滑，大小为4.5-6.5×3.0-4.0um；菌落边缘白色，孢子形成后黄绿至深绿色。

2、一种草酸青霉菌的培养基，为由包括马铃薯、葡萄糖、琼胶粉、水配置成的PDA培养基；所述培养基PH为4.0-8.0；生长温度为20-25℃。

3、一种草酸青霉菌的培养基，所述培养基组分包括：玉米粉1.5-4.5％、豆饼粉1.5-4.5％、麸皮粉1.5-4.5％、K₂HPO₄1.9-2.4％、KH₂PO₄0.5-1.0％、MgSO₄0.005-0.1％、花生油0.2-0.4％、水。

4、根据权利要求3的草酸青霉菌的培养基，所述培养基组分为玉米粉3％、豆饼粉3％、麸皮粉3％、K₂HPO₄2.15％、KH₂PO₄0.8％、MgSO₄0.075％、花生油0.3％、其余为水。

5、一种草酸青霉菌剂，包括权利要求书1所述草酸青霉菌及其发酵基物、吸附剂、填充物、水。

6、根据权利要求2的草酸青霉菌剂，所述发酵基物可以为：玉米粉、豆饼粉、麸皮粉、K₂HPO₄、KH₂PO₄、MgSO₄，所述填充物可以为磷矿粉，所述吸附剂可以为蛭石和草炭混合物。

7、根据权利要求2的草酸青霉菌剂，所述吸附剂蛭石和草炭混合比例为1∶1。

8、一种草酸青霉菌剂的制备方法，至少包括如下步骤：菌种活化，种子罐发酵，生产罐深层发酵，转入固体培养，收集孢子。

方法工艺条件为：所述草酸青霉菌培养基PH为6.6～8.0；所述发酵罐内培养温度为20～25℃，PH保持在6.4～8.0，通风量为1∶0.5～0.8，罐压为1.5～2.0/cm²，搅拌速度为220rpm，72～96小时发酵完毕；

所述种子罐到生产罐的草酸青霉菌菌种接种量为3～5％，起始PH为7.2～8.0。

9、根据权利要求7的草酸青霉菌菌剂制备方法，所述步骤还进一步包括：培养斜面菌株和培养茄瓶种子菌株；加入填料后搅拌、供气、发酵；固体发酵基物灭菌；均匀加入发酵菌剂，保温培养；水洗过滤收集孢子；加入吸附剂、填充物，充分混匀；检验，包装。

方法工艺条件为：所述草酸青霉菌培养基PH为7；所述发酵罐内培养温度为23℃，PH为7，通风量为1∶0.6，罐压为1.8/cm²，80小时发酵完毕。

所述种子罐到生产罐的草酸青霉菌菌种接种量为4％，起始PH为7.5。

10、一种草酸青霉菌在制备植物解磷防病提高土壤肥力菌剂方面的应用，所述菌剂可加入辅料制成农药所通用的颗粒剂、粉剂、乳化剂、可湿性粉剂、片剂、油剂、喷雾剂、烟雾剂等任意剂型。