CN1511848A - 支链聚乙二醇-集成干扰素复合物及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用支链PEG对干扰素进行化学修饰以制备支链PEG－干扰素复合物，以及这种复合物的冻干剂和水针剂。

Description

支链聚乙二醇-集成干扰素复合物及制剂

在本公开文本的上下文中参考了各种出版物、专利和专利申请。将这些出版物、专利和专利申请的公开内容引入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及用支链PEG对集成干扰素及其突变体进行化学修饰以制备支链PEG-干扰素复合物，以及这种复合物的冻干制剂和水针剂。

发明背景

各种天然和重组蛋白质具有治疗作用，一旦将他们纯化、分离并制备成药物，就可以将它们经非肠道途径进行给药，而用于不同的医疗适应症。然而，非肠道途径给药的蛋白质具有免疫原性，且血浆半衰期较短，因此，难以使药用蛋白质在患者体内达到有治疗作用的血药浓度。

通过将蛋白质与高分子聚合物结合成复合物，可以有效的克服这些难题。Davis等在美国专利4,179,337中公开了将聚乙二醇(PEG)与蛋白质诸如酶和胰岛素结合以获得具有生理活性的复合物的技术方案。Veronese等(《实用生物化学和生物技术》(Applied Biochemand Biotech)11：141-152，1985)公开了用氯甲酸苯酯使聚乙二醇活化以修饰核糖核酸酶和超氧化物歧化酶的技术方案。Katre等在美国专利4,766,106和4,917,888中还公开了通过聚合物结合重组蛋白质使蛋白质增溶的技术方案。同样，可以将PEG和其他聚合物与重组蛋白质结合以便降低免疫原性并延长半衰期，参见Nitecki等在美国专利4,902,502，；Enzon在国际专利申请PCT/US 990/02133；Nishimur等在欧洲专利申请154,316和Tomasi在国际专利申请PCT/US85/02572中所述。众所周知的α干扰素可有效的治疗急性和慢性乙型肝炎，卡波西肉瘤，黑色素瘤等疾病，提高α干扰素的血浆半衰期可以提高对这些疾病的治疗作用。

以往公开的PEG-干扰素复合物存在几个问题，其一是PEG的结合使干扰素的生物活性降低，在使用中必须提高干扰素的剂量。另外，在形成PEG-干扰素结合物时所用的某些连接键可能在体内水解断裂，使复合物失去了由PEG带来的优点。

发明内容

支链PEG-干扰素复合物是以共价键方式与PEG分子连接的干扰素分子。集成干扰素是通过测定天然干扰素分子的共有序列而确定的重组干扰素分子，又称复合干扰素；consensus IFN；IFN-con。集成干扰素的突变体包括：第6位氨基酸突变为谷氨酸；第11为氨基酸突变为天冬氨酸；第162位氨基酸突变为丝氨酸；第165位氨基酸突变为丝氨酸以及上述4个突变位点的组合突变情况。

支链PEG是带有两条聚乙二醇长链结构的分子，由于聚合物是以带有链长分布的混合物的形式制备的，因此，通常不能得到有精确和均匀分子量的聚合物，对其分子量的描述一般是指其平均分子量。这种聚合物的制备方法在本研究领域内是众所周知的。

按照本发明，PEG-IFN可按如下方法制备：用末端活化的支链PEG与集成干扰素中的一个或多个自由氨基反应，形成一个共价键连接，使集成干扰素至少保持部分生物活性而免疫原性降低，且这种共价连接使PEG干扰素复合物在体内不易水解断裂。当支链PEG与集成干扰素反应时，可能得到的是不同产物的混合物。这些产物是由于PEG可以与一个或多个自由氨基反应形成的。这些产物可以用如下通式表示：

由于混合物中不同的产物具有不同的分子量及等电点，这些产物可用传统的分离方法如色谱法进行分离。M＝1时，同一个自由氨基结合形成的单PEG化的复合物是本发明的优选方案。尽管集成干扰素有多个自由氨基，可以通过控制试剂浓度和反应条件得到单PEG化的产物。

当将单一集成干扰素分子与单一支链PEG结合时，所得的复合物可以是位点异构物得混合物形式。“位点异构物的混合物”是指可以在不同集成干扰素分子的不同氨基酸位点连接的各个支链PEG-干扰素的混合物。例如：在本发明的一个实施方案中，PEG-干扰素混合物含有至少一种在干扰素分子的组氨酸残基上连接的PEG-干扰素复合物，同时另一种PEG-干扰素复合物中，支链PEG被连接在干扰素分子的另一个位点(如：赖氨酸残基)

冻干法是一种对蛋白质类药物冷冻干燥的方法，将冷冻的含水混合物进行处理以处去水分。一般说来，冻干过程包括通常在减压条件下使水分升华的步骤。冻干后，可以将蛋白质类药物长期保存。然而，PEG-集成干扰素复合物在冻干过程中会受到破坏，如：蛋白质的损耗，生物活性的丧失和复合物的降解。

按照本发明，将PEG-干扰素复合物加入适当的制剂中，可以使其在冻干过程中免受破坏，本发明不限定于特定的制剂，在优选的实施方案中，除PEG-干扰素复合物外，还使用了缓冲体系，等渗剂，稳定剂，冻干保护剂。

缓冲体系适合于将所述制剂的pH维持在5.5～6.5的范围，优选的缓冲体系为醋酸钠-醋酸缓冲***，其pH值为6.0，浓度为0.005～0.1M。等渗剂用于调节注射剂的渗透压和血液的渗透压相同或接近，优选的等渗剂为0.7％的氯化钠。

稳定剂可以避免PEG-干扰素复合物吸附于用来储存的玻璃表面上，本发明将聚(氧-1，2-乙二基)衍生物作为稳定剂。聚(氧-1，2-乙二基)单-9-十八烯酸酯衍生物是一种优选的稳定剂，优选浓度为0.01～1mg/ml。

冻干保护剂是保护化合物，细胞或组织免受冻干过程中有害影响的试剂，就PEG-集成干扰素而言，冻干保护剂可以保护他们免受来自冻干过程中的真空条件的破坏、吸附和损耗。本发明的冻干保护剂包括但不限于碳水化合物、糖醇、表面活性剂及蛋白质。优选的冻干保护剂是白蛋白。

根据本发明，将PEG-干扰素加入适当的制剂中，可以使其可以长期在水溶液中保存而不失去其生物活性。本发明不限于特定制剂，在优选实施方案中PEG-干扰素水针剂包括缓冲体系，等渗剂，稳定剂和溶剂。优选的缓冲体系为醋酸钠-醋酸缓冲***，其pH值为6.0，浓度为0.005～0.1M。等渗剂用于调节注射剂的渗透压和血液的渗透压相同或接近，优选的等渗剂为0.7％的氯化钠。溶剂为注射用水。

                       实施例1

取6mg/ml集成干扰素，以5mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)，0.12M氯化钠透析。按蛋白质：PEG为1∶3的摩尔比加入活化的支链PEG试剂，加入0.5M氢氧化钠调节pH到9.0，在4℃条件下反应2小时，加入5％的pH7.5的1M甘氨酸终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积50mM的醋酸钠缓冲液调节pH到4.5。将样品上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，PEG-集成干扰素和未结合PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。280nm处紫外吸收检测，收集含PEG-集成干扰素的洗脱峰，以SDS-PAGE检测。

以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-集成干扰素进一步纯化，并更换缓冲体系，280nm处紫外吸收检测，收集含PEG-集成干扰素的洗脱峰，以SDS-PAGE检测。加入冻干保护剂和稳定剂，冻干后储存。最终冻干粉中的成分如下：

成分                           mg/小瓶

PEG-集成干扰素                 0.1

醋酸钠                         0.75

多乙氧基醚                     0.05

氯化钠                         0.007

白蛋白                         0.01

                       实施例2

取6mg/ml集成干扰素，以5mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)，0.12M氯化钠透析。按蛋白质：PEG为1∶3的摩尔比加入活化的支链PEG试剂，加入0.5M氢氧化钠调节pH到9.0，在4℃条件下反应2小时，加入5％的pH7.5的1M甘氨酸终止反应。3～5分钟后，加入10倍体积50mM的醋酸钠缓冲液调节pH到4.5。将样品上羧甲基纤维素柱(Waterman CM-52，)，以5倍体积pH4.5的醋酸钠缓冲液洗涤柱子后，PEG-集成干扰素和未结合PEG的干扰素分别用含0.2M氯化钠和0.4M氯化钠的醋酸钠缓冲液洗脱。280nm处紫外吸收检测，收集含PEG-集成干扰素的洗脱峰，以SDS-PAGE检测。

以Sephacryl S-200分子排阻色谱对PEG-集成干扰素进一步纯化，并更换缓冲体系，280nm处紫外吸收检测，收集含PEG-集成干扰素的洗脱峰，以SDS-PAGE检测。最终水针剂中的成分如下：

成分                           比例

PEG-集成干扰素                 0.1mg/ml

醋酸钠                         0.05mM

苯乙醇                         0.05％

氯化钠                         0.7％

Claims (14)

1、一种支链PEG-干扰素复合物。

2、权利要求1的复合物，其中所述的支链PEG具有以下结构：

3、权利要求2的复合物，其中所述的支链PEG分子量为10000，20000或40000

4、权利要求3的复合物，其中所述的干扰素分子选自下列物质组成：集成干扰素及其突变体。集成干扰素的突变体包括：第6位氨基酸突变为谷氨酸；第11为氨基酸突变为天冬氨酸；第162位氨基酸突变为丝氨酸；第165位氨基酸突变为丝氨酸以及上述4个突变位点的组合突变情况。

5、权利要求4的复合物，其中所述的支链PEG-干扰素复合物包括与单一干扰素分子结合的单一支链PEG分子。

6、权利要求5的制剂，其中所述的支链PEG-干扰素复合物包括位置异构的混合物。

7、一种含水制剂，包括支链PEG-干扰素复合物，缓冲体系，等渗剂，稳定剂，冻干保护剂和溶剂。

8、权利要求7的制剂，其中所述的缓冲体系是醋酸钠，等渗剂是氯化钠，稳定剂是聚(O-1，2-乙二基)衍生物，冻干保护剂是白蛋白且溶剂是注射用水。

9、权利要求8的制剂，其中所述的支链PEG-集成干扰素复合物的浓度为0.01～lmg/ml；所述的醋酸钠的浓度为0.005～0.1M；氯化钠浓度为0.6％～0.8％；所述白蛋白浓度为0.1％～5％；

10、一种冻干方法，该方法包括冻干权利要求9的制剂以便生成冻干粉的步骤

11、一种冻干粉，通过冻干权利要求10的制剂生产。

12、一种含水制剂，包括支链PEG-干扰素复合物，缓冲体系，等渗剂，稳定剂和溶剂。

13、权利要求12的制剂，其中所述的缓冲剂是醋酸钠，等渗剂是氯化钠，稳定剂是苯乙醇且溶剂是注射用水。

14、权利要求13的制剂，其中所述的支链PEG-干扰素复合物的浓度为0.1～1mg/ml；所述的醋酸钠的浓度为0.005～0.1M；氯化钠浓度为0.6％～0.8％；苯乙醇浓度为0.1％；