CN1508254A

CN1508254A - 新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L

Info

Publication number: CN1508254A
Application number: CNA021550255A
Authority: CN
Inventors: 卫潘; 潘卫; 沈毅君; 刘彦君; 戚中田
Original assignee: FUDAN ZHANGJIANG BIOLOGICAL MEDICINE Co Ltd SHANGHAI; Second Military Medical University SMMU
Current assignee: FUDAN ZHANGJIANG BIOLOGICAL MEDICINE Co Ltd SHANGHAI; Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2002-12-19
Filing date: 2002-12-19
Publication date: 2004-06-30
Anticipated expiration: 2022-12-19
Also published as: CN100457910C

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，是一种应用于噬菌体展示外源随机多肽的新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L。该载体通过在pCANTAB5X的SfiI和NotI酶切位点之间***衔接片段Xba I－Stu I－Sal I－Kpn I－[G4S]3－Not I而获得。该载体由于提供了Sfi I，Xba I，Stu I，Sal I和Kpn I 5个常用内切酶克隆位点，故方便了外源基因的定向克隆，提高了克隆效率，有利于扩大噬菌体展示肽库库容量；又由于在噬菌体PIII蛋白基因和外源展示蛋白基因之间引入了由15个氨基酸组成的柔性多肽接头基因[G4S]3，并在该基因中适当使用了大肠杆菌稀有密码子，从而降低了所展示的外源蛋白与PIII蛋白之间的相互干扰，保持了外源蛋白和PIII蛋白的功能与活性。本发明适用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量(＞300个氨基酸)功能蛋白。

Description

新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L

技术领域：

本发明涉及生物工程技术领域，是一种应用于噬菌体展示外源随机多肽的新型噬菌粒展示载体pCANTAB5L。

背景技术：

所谓噬菌体展示技术是利用噬菌体将外源多肽基因与噬菌体结构蛋白基因融合后用其将外源多肽展示于噬菌体表面的技术。由于噬菌体具有结构简单、体积小、单位体积个数多、易于复制、可悬浮于液体等特点，噬菌体展示技术已被广泛地应用于分子间相互作用的研究。其中主要包括利用亲和力选择从展示肽库中捕捉靶受体序列，进行表位鉴定或表位模拟，鉴定新的受体和天然配体，选择DNA结合蛋白，寻找新的药物，提供疫苗研制和疾病诊断的新途径，优化基因工程抗体等研究。

丝状噬菌体为长杆状，长约1000nm，管直径约6nm。管中心是一约6400核苷酸的单链线状DNA。长管由约2700个主要外壳蛋白(PVIII)分子螺旋排列而成，其一端是各为5个拷贝的次要外壳蛋白PIII和PVI，另一端则是各为5个拷贝的次要外壳蛋白PVII和PIX。噬菌体通过PIII蛋白N端的200个氨基酸与细菌的F菌毛结合而感染细菌。1985年，George Smith首先开展了噬菌体展示的研究，他将内切酶EcoR I基因片段***丝状噬菌体f1编码的噬菌体外壳蛋白III(PIII)基因的5’端，结果内切酶EcoR I被融合在外壳蛋白PIII的N端，从而展示在噬菌体表面。产生的重组噬菌体不仅仍具有感染性，而且能与EcoR I抗体结合，还能将EcoR I内切酶基因作为噬菌体基因组的一部分进行遗传和变异。目前，在噬菌体展示技术的应用中，外源多肽主要展示在PIII和PVIII两种外壳蛋白上，展示的主要方式有3型、8型、33型、88型、3+3型、8+8型6种形式，其中3+3型是被采用最多的展示方式。与Smith的展示方式不同的是，3+3型展示方式不是将外源基因直接***噬菌体的PIII基因中，而是先将外源基因***含有噬菌体PHI基因的噬菌粒中，再用野生型辅助噬菌体感染转化有上述重组噬菌粒的细菌，如此所得的重组噬菌体包裹有重组噬菌粒，其既含有部分野生型PIII蛋白，同时又有部分PIII蛋白的N端展示有外源多肽。由于重组噬菌体的5个PIII蛋白分子中仅有部分与外源展示多肽融合，所以减少了对噬菌体感染活性的影响。更重要的是噬菌粒的重组比在噬菌体基因组上进行基因重组操作来得简单，因而极大地方便了基因克隆操作过程，大大提高了外源多肽噬菌体展示的效率。

目前用于随机多肽噬菌体展示的噬菌粒载体pCANTAB5X是一种应用较好的3+3型展示载体，它是通过对商用噬菌体单链抗体展示载体pCANYAB5E噬菌粒进行了酶切位点改造获得的[潘卫等，第二军医大学学报，1999，20(10)：723]，其在pCANTAB5E的Sfi I和Not I内切酶位点间***了常用内切酶Xba I位点，有利于更多的DNA随机片段***PIII外壳蛋白基因的5’端，从而增加了随机肽库的库容量。例如，利用pCANTAB5X载体成功地展示了HCV以及HGV核心蛋白的随机肽库(潘卫等，中华微生物学和免疫学杂志，2001，21(4)：359；吴晓兰等，第二军医大学学报，2000，21(9)：842)。尽管如此，在用pCANTAB5X载体及其它噬菌粒载体进行外源多肽展示时，由于噬菌体的PIII外壳蛋白与被展示多肽直接融合，PIII蛋白会影响外源蛋白的正常折叠和空间构象，不利于保持被展示蛋白的原有活性和功能；同样，外源蛋白也会对PIII蛋白分子产生影响，因为5个PIII蛋白分子是聚集在一起的，尽管5个PIII蛋白中有野生型的PIII分子，但当展示大分子量的外源蛋白时，由于PIII分子与外源蛋白直接相连，其连接缺乏柔性，不能自由旋转，其巨大的空间结构也会对野生型PIII蛋白产生空间位阻，从而影响其感染活性，使重组噬菌体的产量降低；况且，pCANTAB5X仅含有Sfi I、XbaI和Not I 3个克隆位点，常用内切酶位点只有一个Xba I，所以它与其它商业化的噬菌粒载体同样存在着克隆位点尤其是常用内切酶位点数量少的问题，这给基因工程操作带来不便，特别是在构建随机展示肽库时限制了库容量。

发明内容：

本发明提供一种既不影响噬菌体感染活性，又能保持外源蛋白原有活性和功能，并能多位点克隆的噬菌粒展示载体pCANTAB5L。

本发明是对噬菌粒载体pCANTAB5X的一种改进。改进之一是增加了常用内切酶位点，由原来的含Sfi I、Xba I和Not I三个位点增加到含Sfi I、Xba I、Stu I、Sal I、Kpn I 5个位点，为外源展示多肽基因的克隆提供了更多可选择的克隆位点，这不仅方便了外源基因的定向克隆，提高了克隆效率，而且有利于扩大噬菌体展示肽库库容量；其二是引入了多肽接头基因[G4S]3，其表达的多肽由15个氨基酸组成，位于噬菌体PIII蛋白和外源蛋白之间，而且在多肽接头基因[G4S]3中适当使用了大肠杆菌稀有密码子，使外源蛋白和噬菌体PIII蛋白在蛋白质翻译过程中相隔一定时间，从而使外源蛋白在与之融合的噬菌体PIII蛋白被翻译之前有更多时间形成自己的空间构象，也正是因为多肽接头基因[G4S]3的引入，使PIII蛋白和外源蛋白间隔15个氨基酸的多肽，从而进一步降低了PIII蛋白和外源蛋白之间在形成空间构像中的相互干扰。此外，该多肽接头具有高度柔性空间结构，既可自由摆动，又可自由旋转，这就使展示的外源多肽或外源蛋白获得更大的活动空间，不仅有利于外源多肽或外源蛋白活性的保持，而且由于外源多肽或外源蛋白能自由活动，即使外源蛋白分子较大，也不至于总遮挡住PIII蛋白，这就使PIII蛋白的感染活性不会受到外源蛋白太大的影响，因而能更好地保证所展示的随机肽库、功能靶蛋白变异体库具有很好的随机性和足够的库容，展示大分子量功能蛋白时重组噬菌体的滴度不受影响，。

pCANTAB5L噬菌粒适用于展示随机肽库、功能蛋白、功能蛋白变异体和分子量较大(＞300个氨基酸)的功能蛋白。应用pCANTAB5L噬菌粒已成功地展示了重组人淋巴毒素(简称rhLT)变异体库、葡萄球菌A蛋白衍生物(简称Mu-proteinA)和人干扰素αA-2b(简称hIFNαA-2b)。

本发明噬菌粒展示载体pCANTAB5L的构建，是通过基因工程操作方法，在噬菌粒展示载体pCANTAB5X的内切酶位点Sfi I和Not I之间***一衔接片段来实现的。该衔接片段既包含Xba I、Stu I、Sal I和Kpn I内切酶位点，也包含[G4S]3多肽接头基因，而[G4S]3基因中又适当引入了大肠杆菌稀有密码子。将该噬菌粒转化细菌后，再用野生型辅助噬菌体感染该转化的细菌，就可得到包裹有pCANTAB5L噬菌粒的噬菌体。该噬菌粒载体就可用作展示外源多肽或外源蛋白的平台。

pCANTAB5L的构建过程如下：

一.制备衔接片段Xba I-Stu I-Sal I-Kpn I-[G4S]3-NotI(简称Linker)

1.合成引物

(1)正向引物Linker-U的核苷酸序列为：5’-TCTAGAGGCCTGTCGACGGTACCGGCGGTGGTGGATCTGGT-3’该引物中含有4个酶切位点，亦即引入了4个多克隆位点Xba I(-TCTAGA-)，Stu I(-AGGCCT-)，Sal I(-GTCGAC-)和Kpn I(-GGTACC-)。

(2)反向引物Linker-D的核苷酸序列为：5’-AATGCGGCCGCACTGCCGCCGCCACCGGA-3’此引物保留了pCANTAB5X载体的Not I酶切位点(-GCGGCCGC-)。

2.以[G4S]3/pGEM-T easy质粒为模板，以Linker-U和Linker-D为引物，PCR扩增得含79bp的衔接片段Xba I-Stu I-Sal I-Kpn I-[G4S]3-Not I

由于[G4S]3/pGEM-T easy质粒的多肽接头[G4S]3基因的DNA序列GGC GGTGGT GGA TCT GGT GGC GGT GGA TCC GGT GGC GGC GGC AGT中含有大肠杆菌稀有密码子GGA，因此扩增所得的衔接片段含有大肠杆菌稀有密码子，其编码的多肽接头由15个氨基酸组成，氨基酸序列为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。

二.构建含衔接片段的重组质粒Linker/pMD-18T

将上述衔接片段Linker用T4 DNA连接酶直接克隆于pMD-18T载体(TAKARA公司)，得到重组质粒Linker/pMD-18T。经序列测定，该重组质粒所含79bp的衔接片段和设计的完全一致。

三.构建pCANTAB5L重组噬菌粒

重组噬菌粒pCANTAB5X和重组质粒Linker/pMD-18T分别用限制性内切酶Xba I和Not I双酶切，分别回收4.5Kb的pCANTAB5X载体片段和79bp的衔接片段，用T4 DNA连接酶将两种片段连接，即为pCANTAB5L重组噬菌粒。

附图说明：

图1为本发明噬菌粒展示载体pCANTAB5L的构建流程图。

图2为本发明的衔接片段Linker PCR扩增产物电泳图。

图3为本发明噬菌粒展示载体pCANTAB5L的结构示意图。

图4为本发明噬菌粒展示载体pCANTAB5L的酶切片段电泳图。

具体实施方式：

pCANTAB5L的构建过程，首先合成含多克隆位点的正向引物及反向引物，再用其通过PCR扩增得到由多克隆位点和[G4S]3多肽接头组成的衔接片段，将该衔接片段的PCR产物克隆于T载体，经序列测定验证后，用Xba I和NotI双酶切将衔接片段克隆到pCANTAB5X噬菌粒载体的Xba I和Not I位点中，获得新噬菌粒展示载体pCANTAB5L，构建流程见图1。现结合附图进一步详细描述。

一：制备衔接片段Linker(即Xba I-Stu I-Sal I-KpnI-[G4S]3-Not I)

1.合成引物

(1)正向引物Linker-U的核苷酸序列为：5’-TCTAGAGGCCTGTCGACGGTACCGGCGGTGGTGGATCTGGT-3’该引物中含有4个酶切位点，亦即引入了4个多克隆位点Xba I(-TCTAGA-)，Stu I(-AGGCCT-)，Sal I(-GTCGAC-)和Kpn I(-GGTACC-)；

2.以[G4S]3/pGEM-T easy质粒为模板，PCR扩增衔接片段Linker

该质粒的克隆位点中含有多肽接头Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的DNA序列，其核苷酸序列为GGC GGTGGT GGA TCT GGT GGC GGT GGA TCC GGT GGC GGC GGC AGT，其中GGA为大肠杆菌稀有密码子。用Linker-U和Linker-D为引物，扩增得到DNA片段Xba I-StuI-Sal I-Kpn I-[G4S]3-NotI，即衔接片段Linker，由79bp组成。PCR反应体积50μl，PCR反应缓冲液为：氯化钾50mmol，氯化镁1.5mmol，三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸10mmol，pH8.3(以下所有PCR缓冲液均同此)，加[G4S]3/pGEM-T easy质粒5ng，Linker-U和Linker-D各1μmol，dNTP 100μmol，Taq酶1个单位。扩增条件为94℃ 30秒；65℃30秒；72℃30秒；35个循环。PCR扩增产物的电泳图谱见图2，衔接片段PCR产物用QIAGEN公司的胶回收试剂盒纯化回收(下同)。

二：验证衔接片的核苷酸序列

1.制备重组质粒Linker/pMD-18T

将纯化后的衔接片段PCR产物与pMD-18T载体(TAKARA公司，目录号：D504CA)连接，连接反应体积10μl，连接缓冲液为氯化镁10mmol，DTT 10mmol，ATP1mmol，三(羟甲基)氨基甲烷·盐酸30mmol，PH7.8(以下所有连接缓冲液均同此)，加衔接片段PCR产物100ng，pMD-18T载体50ng，T4 DNA连接酶1个单位。连接条件为16℃过夜。将连接产物转化DH5α感受态菌，转化条件为在上述连接液内加100μlDH5α感受态菌液(OD₆₀₀＝0.2)，冰浴30分钟、42℃1分钟、冰浴2分钟，加入900μl LB培养基(1.0％胰蛋白胨，0.5％酵母膏，1.0％氯化钠)37℃、150转/分钟活化培养1小时后取100μl培养菌液涂布含100ng/μl氨苄青霉素的LB平皿，37℃培养过夜。在转化平皿上挑取6个转化菌落，培养后用QIAGEN公司的小量质粒抽提试剂盒提取转化子质粒。

2.重组质粒的鉴定

由于***片段分子量较小，因此以上述Linker-U和Linker-D为引物PCR扩增鉴定转化子质粒，结果检测的转化子都为含79bp***片段的Linker/pMD-18T阳性克隆。委托上海生工生物技术服务有限公司对PCR鉴定为阳性的Linker/pMD-18T转化子克隆进行正向和反向序列测定，测序引物为pMD-18T的通用测序引物M13(+)/-。二者测定结果表明***的衔接序列与设计完全一致。

三：构建pCANTAB5L重组噬菌粒

1.pCANTAB5L重组噬菌粒的构建

将重组质粒Linker/pMD-18T用Xba I和NotI双酶切，回收79bp的衔接片段。同样用Xba I和NotI双酶切pCANTAB5X重组噬菌粒，回收4.5Kb的pCANTAB5X载体片段。二片段用T4 DNA连接酶连接，连接反应体积10μl，加衔接片段100ng，pCANTAB5X载体片段50ng，缓冲液同上，T4 DNA连接酶1个单位，连接条件为16℃过夜。用该连接产物转化DH5α感受态菌，转化条件为在上述连接液内加100μlDH5α感受态菌液(OD₆₀₀＝0.2)，冰浴30分钟、42℃1分钟、冰浴2分钟，加入900μl LB培养基，37℃、150转/分钟活化培养1小时后取100μl培养菌液涂布含100ng/μl氨苄青霉素的LB平皿，37℃培养过夜。在转化平皿上挑取6个转化菌落，培养后提取转化子质粒。

2.pCANTAB5L重组噬菌粒的筛选

以pCANTAB5E正向测序引物pCANTAB5-S 1(5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’)和pCANTAB5E反向测序引物pCANTAB5-S6(5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’)进行PCR扩增鉴定，反应体积50μl，加转化子质粒5ng，pCANTAB5-S1和pCANTAB5-S6各1μmol，dNTP 100μmol，缓冲液同上，Taq酶1个单位。扩增条件为94℃ 30秒；55℃30秒；72℃30秒；30个循环。确定转化子为含79bp***片段的Linker/pCANTAB5X阳性克隆，重组质粒命名为pCANTAB5L，pCANTAB5L的结构见图3，其中Plac为lac启动子；g3 signal为PIII基因的信号肽序列；MCS为多克隆位点，含SfiI、Xba I、Stu I、Sal I、Kpn I内切酶位点；(G4S)3Linker为[G4S]3多肽接头；Amber Stop Codon为琥珀酸突变终止密码子；fdgene 3为丝状噬菌体外壳蛋白PIII的基因序列；M13 ori为M13复制启始区；AMPr为氨苄青霉素抗性基因。

3.pCANTAB5L重组噬菌粒的鉴定

为了验证构建的pCANTAB5L重组噬菌粒所引入的多克隆位点和[G4S]3多肽接头是否正确，对重组噬菌粒进行进一步的酶切鉴定和序列测定。

(1)酶切鉴定

pCANTAB5L重组噬菌粒***的衔接序列中含有单酶切位点Xba I、Stu I、SalI、Kpn I，[G4S]3多肽接头后还保留了原pCANTAB5X上的Not I单酶切位点，分别用这些酶做单酶切分析，分别得到4547bp线性的pCANTAB5L片段，见电泳图谱图4中第3，4，5，6，7泳道；此外，因为原pCANTAB5X质粒中有一EcoR I单酶切位点，所以经EcoR I和Not I双酶切产生了3.26Kb和1.27Kb两个片段，见图4泳道1，经EcoR I和Stu I双酶切产生了3.19Kb和1.34Kb两个片段，见图4泳道2。酶切结果显示pCANTAB5L重组噬菌粒结构正确，确实含有Xba I、Stu I、Sal I、Kpn I、Not I酶切位点和[G4S]3多肽接头。

(2)测序鉴定

委托上海生工生物技术服务有限公司对酶切鉴定为阳性克隆的重组噬菌粒进行正向和反向序列测定，正向测序引物为以上所述的pCANTAB5-S1，反向测序引物为pCANTAB5-S6，二者测定结果表明***的衔接片段序列和设计完全一致，且***序列与周围的pCANTAB5X DNA序列的连接完全正确(见核苷酸序列表1)。

四：pCANTAB5L重组噬菌粒的展示应用

实施例1：应用重组噬菌粒载体pCANTAB5L展示重组人淋巴毒素(rhLT)随机变异体库

为了证实重组噬菌粒载体pCANTAB5L能否正确展示功能蛋白变异体库，将克隆在pGEM-T easy载体上的重组人淋巴毒素(rhLT)随机变异体库用Xba I和Kpn I双酶消化后定向克隆于pCANTAB5L的多克隆位点中，构建展示rhLT随机变异体的重组噬菌体库。具体操作过程如下：

(1)构建展示rhLT随机变异体库的重组噬菌体

rhLT/pGEM-T easy质粒上含有重组人淋巴毒素衍生物rhLT随机变异体库基因，库容量为1×10⁶，该rhLT基因表达的重组人淋巴毒素在N端缺失23个氨基酸，在rhLT基因的5’端含Xba I酶切位点、3’端含Kpn I酶切位点。rhLT/pGEM-T easy质粒用Xba I和Kpn I双酶切，试剂盒(同上)回收的rhLT随机变异体库DNA与预先用Xba I和Kpn I双酶切回收的pCANTAB5L重组噬菌粒片段连接，连接反应体积50μl，加入rhLT随机变异体库DNA 400ng，pCANTAB5L载体片段200ng，缓冲液同上，T4 DNA连接酶3个单位，连接条件为16℃过夜。连接产物转化大肠杆菌TG1，转化条件为在上述连接液内加1ml TG1感受态菌液(OD₆₀₀＝0.2)，冰浴30分钟、42℃1分钟、冰浴2分钟。将转化液加入8ml 2×YT培养基(1.6％胰蛋白胨，1％酵母膏，0.5％氯化钠)，37℃、150转/分钟活化培养1小时后加入1ml 4×10¹⁰TU/ml的M13KO7辅助噬菌体(含卡那霉素抗性)拯救，37℃，250转/分钟培养1小时，1000g离心10分钟，细菌沉淀用10ml 2×YT(含氨苄青霉素100ng/μl和卡那霉素50ng/μl)悬浮，37℃，250转/分钟培养过夜。培养液上清加入2ml PEG(20％)/NaCl(2.5mol)沉淀后悬浮于10ml 2×YT培养基中，经0.22μm滤膜过滤，获得展示rhLT随机变异体库的重组噬菌体。

(2)测定rhLT重组噬菌体的滴度

取1μl重组噬菌体10倍系列稀释，感染对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃培养1小时后涂LB(含氨苄青霉素100ng/μl)平板，置37℃培养过夜。计数不同稀释度平皿上的菌落数，生长菌落数的稀释倍数乘以100即为每毫升噬菌体的转化单位数(transformation unit，TU)。检测结果展示rhLT随机变异体库的重组噬菌体的滴度为2.2×10¹³TU/ml，用相同的方法在含卡那霉素抗性的平板上计数检测的M13KO7野生型噬菌体的滴度为3.1×10¹³TU/ml，重组噬菌体的滴度与野生型噬菌体的滴度水平基本一致。

(3)测序鉴定展示rhLT变异体库的随机性：

为了验证所展示的rhLT变异体是否具有随机性，在计数平皿上挑取30个单菌落，培养后提取转化子质粒，以Xba I+Kpn I双酶切鉴定均为阳性克隆。随机挑选10个阳性克隆质粒用pCANTAB5-S1和pCANTAB5-S6引物测序鉴定，测序结果经DNASTAR软件分析比较证实***的序列为rhLT变异体基因，对10个阳性克隆序列进行比较，发现10个rhLT变异体核苷酸序列均不相同，证明所构建的变异体库具有很好的随机性。

上述实验结果证明pCANTAB5L所提供的多克隆位点能方便地实现外源基因变异体库的定向克隆，简化了基因操作过程，获得了高滴度的重组噬菌体库，并能满足变异体库的随机性和多样性要求，因此该载体非常适合于展示功能蛋白变异体库。

实施例2：应用重组噬菌粒载体pCANTAB5L展示大分子多肽-葡萄球菌A蛋白衍生物(Mu-protein A)：

为了检验pCANTAB5L能否正确展示大分子多肽，将葡萄球菌A蛋白衍生物(Mu-protein A)的基因从pGEM-T easy载体上用Xba I和Kpn I双酶消化后克隆到pCANTAB5L的多克隆位点中，构建展示Mu-protein A的重组噬菌体。具体操作过程如下：

(1)构建展示Mu-protein A的重组噬菌体：

葡萄球菌A蛋白(Mu-protein A)由360个氨基酸组成，含5个抗体结合结构域。Mu-protein A/pGEM-T easy质粒上克隆有Mu-protein A基因，其5’端含Xba I酶切位点、3’端含Kpn I酶切位点。Mu-protein A/pGEM-T easy质粒用Xba I和Kpn I双酶切片段用试剂盒(同上)回收，回收的Mu-protein A片段与预先用Xba I和Kpn I双酶切回收的pCANTAB5L重组噬菌粒片段连接，连接反应体积10μl，加Mu-protein A片段200ng，pCANTAB5L载体100ng，缓冲液同上，T4 DNA连接酶2个单位，连接条件为16℃过夜。连接液转化大肠杆菌TG1(OD₆₀₀＝0.2)，活化培养1小时后加入1ml 4×10¹⁰TU/ml的M13KO7辅助噬菌体拯救，37℃，250转/分钟振荡培养1小时，1000g离心10分钟，细菌沉淀用10ml 2×YT(含氨苄青霉素100ng/μl和卡那霉素50ng/μl)悬浮，37℃，250转/分钟振荡培养过夜。培养液上清加入2ml PEG/NaCl沉淀后悬浮于10ml 2×YT培养基中，经0.22μm滤膜过滤，获得展示Mu-protein A的重组噬菌体。提取重组噬菌粒用pCANTAB5-S1和pCANTAB5-S6引物测序鉴定，测序结果经DNASTAR软件分析比较证实***的序列为Mu-protein A基因。

(2)测定重组噬菌体的滴度：

取1μl重组噬菌体10倍系列稀释，检测重组噬菌体滴度。具体操作步骤同上述展示rhLT变异体库的重组噬菌体滴度检测方法。结果，展示Mu-protein A的重组噬菌体的滴度为5×10¹²TU/ml，而同时检测的野生型M13KO7辅助噬菌体的滴度为3.5×10¹³TU/ml。结果表明展示了大分子多肽Mu-protein A的重组噬菌体的滴度与野生型噬菌体相差不到10倍，两者基本处于同-水平。说明该载体能有效展示大分子外源多肽。

(3)测定展示Mu-protein A的重组噬菌体的抗体结合活性：

为了测定重组噬菌体所展示的Mu-protein A与抗体的结合能力，将重组噬菌体和M13KO7辅助噬菌体用2×YT培养基调整至相同滴度(1.0×10¹²TU/ml)后再倍比稀释，分别取每个稀释度的噬菌体100μl加入人IgG抗体包板的反应孔中，37℃孵育3小时后洗涤50次。将反应后的样品分成两组，第一组在重组噬菌体和M13KO7与抗体结合后的样孔中每孔加入100μl大肠杆菌TG1(OD₆₀₀＝0.2)，37℃孵育1小时后，Mu-protein A重组噬菌体感染菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，对照的M13KO7辅助噬菌体感染菌液涂布于卡那霉素抗性平皿上计数，用于检测被人IgG特异吸附的重组噬菌体的数量，检测结果见表1。第二组在重组噬菌体和M13KO7与抗体结合后的样孔中每孔加入噬菌体抗体HRP/Anti-M13 conjugate(Amersham pharmacia biotech公司，工作浓度为1：5000稀释)，37℃孵育45分钟后加入TMB显色，测OD₄₅₀nm值，用于检测被人IgG特异吸附的重组噬菌体的数量，检测结果见表1。

表1 Mu-protein A噬菌体的人IgG抗体结合试验

大肠杆菌TG1感染菌落数 OD_450NM

TU/ml Mu-protein A M13KO7 Mu-protein A M13KO7

1.0×10¹² ＞1000 0 2.321 0.254

5.0×10¹¹ ＞1000 0 2.012 0.165

2.5×10¹¹ ＞1000 0 1.886 0.241

1.2×10¹¹ ＞1000 0 1.345 0.167

6.2×10¹⁰ 560 0 0.878 0.142

3.1×10¹⁰ 213 0 0.551 0.216

1.6×10¹⁰ 68 0 0.298 0.263

8.0×10⁹ 13 0 0.173 0.147

4.0×10⁹ 0 0 0.158 0.220

2.0×10⁹ 0 0 0.214 0.134

1.0×10⁹ 0 0 0.198 0.116

5.0×10⁸ 0 0 0.136 0.125

从表1的大肠杆菌TG1感染菌落数测定结果可见，展示有Mu-protein A的噬菌体能被人IgG结合固定，并在投入噬菌体滴度为1.0×10¹²～4.0×10⁹TU/ml范围内存在明显量效关系。而对照野生型噬菌体M13KO7即使在最高投入滴度时仍检测不到与人IgG结合的噬菌体。酶联检测显色的检测结果与上述大肠杆菌TG1感染菌落数测定结果完全一致。该结果说明了融合在PIII蛋白N端的大分子多肽能保持其生物学活性和功能。Mu-protein A的成功展示也证实了pCANTAB5L载体所展示外源蛋白和PIII蛋白之间的[G4S]3柔性多肽接头有效地在空间和时间上对两者进行分隔，保证了被展示多肽的活动自由度，体现了该载体在展示大分子量蛋白时的突出优势。

实施例3：应用重组噬菌粒载体pCANTAB5L展示人干扰素(hIFNαA-2b)：

为了比较含[G4S]3多肽接头的重组噬菌粒载体pCANTAB5L在展示功能蛋白时是否比原pCANTAB5X噬菌粒能更好地维持其生物学活性，将人干扰素αA-2b(hIFNαA-2b)克隆到pCANTAB5L的多克隆位点中，构建展示hIFNαA-2b的重组噬菌体，与利用pCANTAB5X载体展示hIFNαA-2b的重组噬菌体[吴晓兰等，第二军医大学学报，2000，23(4)：403]进行干扰素活性比较。具体操作过程如下：

(1)构建展示hIFNαA-2b的重组噬菌体：

hIFNαA-2b/pGEM-T easy质粒上含有人干扰素αA-2b基因，该基因编码的干扰素由166个氨基酸组成。在hIFNαA-2b基因的5’端含Xba I酶切位点、3’端含Kpn I酶切位点。hIFNαA-2b/pGEM-T easy质粒用Xba I和Kpn I双酶切，用试剂盒(同上)回收的hIFNαA-2b片段与预先用Xba I和Kpn I双酶切回收的pCANTAB5L重组噬菌粒片段连接，连接反应体积10μl，加hIFNαA-2b片段200ng，pCANTAB5L载体片段100ng，缓冲液同上，T4 DNA连接酶2个单位，连接条件为16℃过夜。连接液转化大肠杆菌TG1(OD₆₀₀＝0.2)，活化培养1小时后加入1ml 4×10¹⁰TU/ml的M13KO7辅助噬菌体拯救，37℃，250转/分钟振荡培养1小时，1000g离心10分钟，细菌沉淀用10ml 2×YT(含氨苄青霉素100ng/μl和卡那霉素50ng/μl)悬浮，37℃，250转/分钟振荡培养过夜。培养液上清加入2ml PEG/NaCl沉淀后悬浮于10ml 2×YT培养基中，经0.22μm滤膜过滤，获得展示hIFNαA-2b的重组噬菌体。提取重组噬菌粒用pCANTAB5-S1和pCANTAB5-S6引物进行双向测序鉴定，测序结果经DNASTAR软件分析比较证实***的序列为hIFNαA-2b基因。

(2)测定重组噬菌体的滴度和生物学活性：

取1μl重组噬菌体10倍系列稀释检测重组噬菌体滴度，检测结果展示于pCANTAB5L载体的hIFNαA-2b重组噬菌体的滴度为1.8×10¹³TU/ml，用相同的检测方法同时检测展示于pCANTAB5X载体的hIFNαA-2b重组噬菌体的滴度为1.2×10¹³TU/ml，两者的滴度基本处于同一水平，前者略高。用2×YT培养基将两者调整为相同的噬菌体滴度，再进行系列倍比稀释，分别在VSV-WISH***上用常规的细胞病变抑制法(CPE)测定生物学活性(具体操作见吴晓兰等，第二军医大学学报，2000，23(4)：403)，细胞病变结果用常规的MTT法测定，检测波长为570nm，检测结果见表2。

表2 hIFN α A-2b噬菌体的抗病毒活性检测结果

OD_570NM

hIFNαA-2b展示于

TU/ml pCANTAB5L pCANTAB5X

2.5×10⁹ 0.615 0.594

1.2×10⁹ 0.616 0.608

6.2×10⁸ 0.631 0.612

3.1×10⁸ 0.603 0.583

1.6×10⁸ 0.506 0.415

8.0×10⁷ 0.453 0.352

4.0×10⁷ 0.395 0.285

2.0×10⁶ 0.324 0.253

1.0×10⁶ 0.272 0.250

5.0×10⁵ 0.257 0.254

从表2看出，通过pCANTAB5L展示的hIFNαA-2b重组噬菌体抗病毒活性比通过pCANTAB5X展示的hIFNαA-2b重组噬菌体高出2-3倍，并有明显的量效关系。该结果说明展示在pCANTAB5L上比展示在pCANTAB5X上的hIFNαA-2b抗病毒活性更强。该结果进一步证实了[G4S]3柔性多肽接头的引入和大肠杆菌稀有密码子的使用，有利于展示多肽天然构象的形成和活性功能的维持。

核苷酸序列表1. pCANTAB5L衔接片段及其周围序列

Claims

1.一种噬菌粒展示载体，其特征在于在噬菌粒pCANTAB5X的Sfi I和Not I酶切位点之间***了含Xba I、Stu I、Sal I和Kpn I酶切位点的核苷酸片段，***片段的核苷酸序列为TCTAGAGGCCTGTCGACGGTACC。

2.按权利要求1所述的噬菌粒展示载体，其特征在于在Kpn I和Not I酶切位点之间***了柔性多肽接头基因[G4S]3。

3.按权利要求2所述的噬菌粒展示载体，其特征在于在[G4S]3基因中引入了大肠杆菌稀有密码子。

4.权利要求1、2、3所述的噬菌粒展示载体用于展示各种随机肽库、功能靶蛋白、功能靶蛋白变异体库和大分子量功能蛋白的用途。