CN1505637A

CN1505637A - 克罗恩氏病抗体结合性肽以及克罗恩氏病检查方法

Info

Publication number: CN1505637A
Application number: CNA028088166A
Authority: CN
Inventors: ��ٺ��; 齐藤宏; 葛城肃典; Ҳ; 立川哲也; 田中理纪; ��һ; 荻野晃一; 泷孝雄
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2004-06-16
Also published as: MXPA03009778A; WO2002088175A1; AU2002253564A2; KR20040015128A; EP1391462A4; CA2445309A1; JPWO2002088175A1; EP1391462A1; US20040175763A1

Abstract

本发明提供一种对于克罗恩氏病诊断有用的检查试剂，以及提供一种可以简便精确地检测克罗恩氏病的方法。本发明的检查试剂，以下述(a)或者(b)中的克罗恩氏病抗体结合性肽为有效成分：(a)由从SEQID NO：1～4所表示的氨基酸序列中选出的任何一个氨基酸序列组成的肽，(b)由上述(a)中所示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽。另外本方面的克罗恩氏病的检查方法是通过检测有无可以识别受验者生物体试样中的人液泡型H⁺转运性ATP酶、人细胞核内蛋白质(Homo sapiens kruppel－like zinc finger protein 300)或者稻***反应原的抗体来进行的。

Description

克罗恩氏病抗体结合性肽以及克罗恩氏病检查方法

技术领域

本发明涉及对克罗恩氏病(Crohn’s disease)的诊断有用的检查试剂及其有效成分。另外本发明涉及一种使用血液等生体试样作为被验试样可以简便实施的克罗恩氏病的检查方法。

技术背景

克罗恩氏病，可以理解为一种起于免疫学应答异常状态的局部炎症病变。一直以来，克罗恩氏病的诊断方法一般以临床症状、X射线照相、内窥镜检查或者病理学检查等综合进行。但是，采用这些方法不仅在判断中需要经验以及熟练的技术，而且会给患者带来精神或者肉体的痛苦。因此希望可以提供一种简单精确的克罗恩氏病的诊断方法。

克罗恩氏病的病因至今尚不明确，但是其与饮食性抗原的关联已被指明，事实上，有报告指出抗面包酵母抗体以及抗猪淀粉酶抗体等特定的抗体在克罗恩氏病患者的血清中显著增加。由此可见，最近对克罗恩氏病的诊断，是以检测在克罗恩氏病患者中特有的抗体进行的，例如抗面包酵母抗体(松本誊之等，“炎性肠疾患者的血清antisaccharomyces cerevisiae antibody测定的有效性”难治性炎性肠管障碍测定研究班，平成10年报告书；Main J等，BMJ，1988 Oct 29，297(6656)1105-6；Barnes RM等，Int Arch Allergy Appl Immunol，1990，92(1)：9-15；Giaffer MH等，Gut.，1992 Aug，33(8)，1071-5；sendid B等，Clin Diagn Lab Immunol，1996 Mar，3(2)，219-26；Quinton JF等，Gut.，1998 Jun，42(6)788-91)，抗猪淀粉酶抗体(户泽辰雄等，“克罗恩氏病患者血中抗猪淀粉酶抗体-基于ELISA的研究”难治性炎性肠管障碍测定研究班，平成10年报告书，特开平11-190734号公报)，抗副结核由来的蛋白抗体(Suenaga K等，Dig Dis Sci，1999，Jun 44(6)，1207-7；Kreuzpaintner G等，Gut.，1995 Sep，37(3)，361-6；Oudkerk Pool M等，J，Clin Pathol，1995，Apr，48(4)，346-50)，抗嗜中性抗体(Targan，S等，Gastroenterology，96，A505，1989)，抗小肠抗体(Bagchi，S等：Clin.Exp.Immunol.，55，44-48，1984)。

但是稻***反应原蛋白质可以作为稻过敏患者中IgE的主要抗原分离出来，并且根据DNA和氨基酸序列，已知是α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂(Izumi H等，FEBS Lett，1992 May，18；302(3)，213-6；NakamuraR等，Biosci Biotechnol Biochem，1996 Aug，60(8)，1215-21)。尽管如上所述，已指出克罗恩氏病与面包酵母以及猪淀粉酶等作为克罗恩氏病特异的自体抗原的食物性抗原相关联，但是并未指出与上述的稻***反应原蛋白质有关联。

另外，液泡型H⁺转运性ATP酶，是存在于属于细胞内液泡系(central vacuolar system)的细胞器中，并将细胞器内部调整为酸性的H⁺泵，如此形成的酸性pH与神经递质和离子的浓缩，蛋白质的分解等包含膜的动态过程的多种生命现象有着紧密的连接(生化学，第65卷，第6号，1993年6月，第413-436页)，但并不是很清楚其在生物体内的具体详细的机能。进一步，人细胞核内蛋白质(homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300(ZNF300))，虽然预测由于具有锌指区因而影响细胞核内的基因表达控制相关，但仍是一种机能尚不清楚的蛋白质。至今尚没有与该人细胞核内蛋白质相关的报告，唯一的也只不过是登录其氨基酸序列及其相应碱基序列的数据库。(Gou D.-MET等，Submitted(28-JUN-2001))to the EMBL/GenBank/DDBJ databases)。

对于这些蛋白质，虽然期待通过阐明其生物机能可以应用于新药开发和医疗保健，但并没有暗示这些功能的报告存在，另外也没有与克罗恩氏病相关的报告存在。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异检测有无患克罗恩氏病的有用的检测试剂，及其有效成分。另外本发明提供一种以受验者的生物试样为对象可以简便实施的克罗恩氏病的检查方法。

本发明人对上述的课题进行专心研究，发现特定的肽具有特异识别克罗恩氏病患者体内特异存在的抗体并与其结合的性质，确认了通过利用这些肽的一种、或者两种以上肽组合使用，可以对受验者有无患克罗恩氏病进行简单而且精确的检测。另外，本发明人在上述的研究过程中，发现在克罗恩氏病患者的体内，存在有可以识别液泡型H⁺转运性ATP酶(特别是其亚基E)、稻***反应原蛋白质、或者人细胞核内蛋白质(homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300(ZNF300))的抗体。确定此蛋白质作为克罗恩氏病的特异自体抗原的可能性，通过检测有无上述的抗体从而高精度地确认受验者有无患克罗恩氏病。

本发明是在以上发现的基础上开发的。

本发明的第一方面是以下的可以有效用于检查克罗恩氏病的克罗恩氏病抗体结合性肽(1)-(9)：

(1)下述(a)或者(b)任何一项的克罗恩氏病抗体结合性肽。

(a)由从SEQ ID NO：1～4所表示的氨基酸序列选择的氨基酸序列组成的肽，

(b)由经过上述(a)所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸的取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且克罗恩氏病抗体结合性肽。

(2)(1)中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中上述(b)所述的肽是部分含有氨基酸SEQ ID NO：1～4或者SEQ ID NO：7所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

(3)(1)中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中由SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中的1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且克罗恩氏病抗体结合性肽，是含有SEQ ID NO：5～14所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

(4)在(1)中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中由SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且克罗恩氏病抗体结合性肽，是至少含有LIAQQM的氨基酸序列的氨基酸数为6-226的肽。

(5)在(1)中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中由SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，是含有SEQ ID NO：15～19所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

(6)在(1)中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中由SEQ ID NO：3所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，是含有SEQ ID NO：20～32所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

(7)在(1)中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中由SEQ ID NO：3所表示的氨基酸序列中的1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，是至少含有SEQ ID NO：51所表示的氨基酸序列，氨基酸数为7-604的肽。

(8)在(1)中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中由SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，是含有SEQ ID NO：33～48所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

(9)在(1)中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中由SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，是至少含有L(V)GGIYXD(E)L(X为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列，氨基酸数为8-165的肽。

另外本发明的克罗恩氏病抗体结合性肽，也可以是在一分子中含有选自上述(1)～(9)所述的各种肽的多个氨基酸序列的肽。

作为具有这种形态的肽，本发明提供下述(10)～(11)所述的分支状多抗原性肽：

(10)一种分支状多抗原性肽，在一个分子中含有多个相同或者不同的下述的氨基酸序列作为分支状氨基酸序列：

(a)由从SEQ ID NO：1～4所表示的氨基酸序列选择的氨基酸序列组成的肽，或者

(b)由上述(a)所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽。

(11)在(10)中所述的分支状多抗原性肽，其支链上含有从以下至少两组中选择的两个以上不同的克罗恩氏病抗体结合性肽的氨基酸序列：(i)含有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，(ii)含有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，(iii)含有SEQ IDNO：3所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，和(iv)含有SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列的肽及其等效物。

另外，这里所说的“等效物”，是指由各个SEQ ID NO：1～4所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成，而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽(与下述(13)中相同)。

本发明的第二方面以下的可以有效用于诊断克罗恩氏病的(12)-(15)所述的克罗恩氏病检查试剂以及含该试剂的试剂盒：

(12)一种克罗恩氏病检查试剂，其中作为有效成分，含有从上述(1)～(9)的任一项所述的克罗恩氏病抗体结合性肽；(10)所述的分支状多抗原性肽；以及人液泡型H+转运性ATP酶的亚基E与从亚基A、亚基B、亚基C、亚基D、115kDa亚基、39kDa亚基、20kDa亚基和16kDa亚基中选择的至少一种其他亚基的复合物中选择的至少一种。

(13)在(12)中所述的克罗恩氏病检查试剂，其中所述的克罗恩氏病抗体结合性肽包括选自以下至少两组的两种以上不同的克罗恩氏病抗体结合性肽：(i)含有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，(ii)含有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，(iii)含有SEQ ID NO：3所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，以及(iv)含有SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，并且所述的分支状多抗原性肽为(11)中所述的肽。

(14)一种克罗恩氏病检查试剂盒，含有以(12)或者(13)中所述的检查试剂作为与克罗恩氏病抗体结合的抗原物质。

(15)在(14)中所述的克罗恩氏病检查试剂盒，含有从抗人IgG抗体，以及(12)或者(13)中所述的检查试剂，以及根据需要从试样稀释液、标记物质、载体(固相)、抗人IgG抗体稀释液、酶底物溶液以及反应停止液选择的至少一种。

本发明的第三方面是以下(A)～(C)所述的克罗恩氏病的检查方法：

(A)一种克罗恩氏病的检查方法，包括检测受验者的生物试样中有无识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的抗体的步骤。

上述的克罗恩氏病的检查方法包括以下形式：

(A-1)(A)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中所述的抗体是识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E的抗体。

(A-2)(A)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中所述的抗体是识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E与从亚基A、亚基B、亚基C、亚基D、115kDa亚基、39kDa亚基、20kDa亚基和16kDa亚基中选择的至少一种其他亚基的复合物的抗体。

(A-3)(A)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中所述的抗体是识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E的199～212位氨基酸区域的抗体。

(A-4)在(A)～(A-3)任何一项中所述的克罗恩氏病的检查方法，包括使用由LIAQQM的氨基酸序列组成的肽或者其等效物、或者在一分子中含有多个这些肽或者其等效物的相同或者不同的氨基酸序列的分支状多抗原性肽作为抗原物质，以及检测通过其与识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的抗体之间的抗体-抗原反应生成的复合物的步骤。

(A-5)(A-4)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中由LIAQQM的氨基酸序列组成的肽或者其等效物，是含有LIAQQM的氨基酸序列，氨基酸数为6-227的肽。

(A-6)(A-4)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中由LIAQQM的氨基酸序列组成的肽或者其等效物，是从含有SEQ ID NO：1以及5～14所表示的各氨基酸序列的肽中选出的。

(A-7)在(A)～(A-3)任何一项中所述的克罗恩氏病的检查方法，包含检测通过人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E与从亚基A、亚基B、亚基C、亚基D、115kDa亚基、39kDa亚基、20kDa亚基和16kDa亚基中选择的至少一种其它亚基的复合物所生成的复合物的步骤。

(B)一种克罗恩氏病的检查方法，包括检测有无识别受验者的生物试样中的人细胞核内蛋白质(homo sapiens kruppel-like zinc fingerprotein 300)的抗体的步骤。

上述的克罗恩氏病的检查方法包括以下形式：

(B-1)(B)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中所述的抗体为识别人细胞核内蛋白质(homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)的126～138位氨基酸区域的抗体。

(B-2)(B)或者(B-1)中所述的克罗恩氏病的检查方法，包括使用SEQID NO：51所表示的肽或者其等效物、或者在同一分子中含有多个这些肽或者其等效物的相同或者不同的氨基酸序列的分支状多抗原性肽作为抗原，以及检测通过其与识别人细胞核内蛋白质(homo sapienskruppel-like zinc finger protein 300)的抗体之间的抗体-抗原反应生成的复合物的步骤。

(B-3)(B-2)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中含有SEQ IDNO：51所表示的氨基酸序列的肽或者其等效物，是至少包含SEQ IDNO：51所表示的氨基酸序列，氨基酸数为7～604的肽。

(B-4)在(B-2)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中SEQ ID NO：51所表示的肽的等效物，是含有从SEQ ID NO：3，21～32中选出的任何一个氨基酸序列的肽。

(C)一种克罗恩氏病的检查方法，包括检测在受验者的生物试样中有无识别稻***反应原蛋白质的抗体的步骤。

(C-1)在(C)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中所述的稻***反应原蛋白质属于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的基因组。

(C-2)在(C)或者(C-1)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中所述的稻***反应原蛋白质，是从稻***反应原(Rice allergen)、稻种***反应原RA5(Rice seed allergen RA5)、稻***反应原RA5B前体(Riceallergen RA5B precursor)、稻种***反应原RA 14(Rice seed allergenRA14)、稻***反应原RA14B前体(Rice allergen RA14B precursor)和稻种***反应原RAG2(Rice seed allergen RAG2)组成的组中选出的至少一种。

(C-3)(C)～(C-2)任何一项所述的克罗恩氏病的检查方法，其中所述的识别稻***反应原蛋白质的抗体，是识别稻种***反应原RA14的99-111位氨基酸区域的抗体。

(C-4)(C)～(C-3)任何一项所述的克罗恩氏病的检查方法，其中所述的识别稻***反应原蛋白质的抗体，是识别含有α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的基因组的L(V)GGIYREL氨基酸序列的氨基酸区域的抗体。

(C-5)(C)～(C-4)中任一项所述的克罗恩氏病的检查方法，包括使用由L(V)GGIYXD(E)L(X相同或者不同，为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列组成的肽或者其等效物、或者在同一分子中含有多个这些肽或者其等效物的相同或者不同的氨基酸序列的分支状多抗原性肽作为抗原物质，以及检测通过其与识别稻***反应原蛋白质的抗体之间的抗原-抗体反应生成的复合物的步骤。

(C-6)在(C-5)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中由L(V)GGIYXD(E)L(X相同或者不同，为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列组成的肽或者其等效物，是至少含有L(V)GGIYXD(E)L(X相同或者不同，为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列，氨基酸数为8～166的肽。

(C-7)在(C-5)中所述的克罗恩氏病的检查方法，其中由L(V)GGIYXD(E)L(X相同或者不同，为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列组成的肽的等效物，是从含有SEQ ID NO：4，33～48所表示的氨基酸序列的肽中选择的肽。

本发明进一步包括下述的发明：

(a)上述的(1)～(11)任何一项中所述的肽在克罗恩氏病的检查中作为与克罗恩氏病抗体进行反应的抗原物质的应用。

(b)上述的(1)～(11)任何一项中所述的肽在制造克罗恩氏病检查试剂中的应用。

下面本发明说明书中的氨基酸，肽，碱基序列，核酸等的缩写，均为根据IUPAC、IUB的规定，“含有碱基序列或者氨基酸序列说明书等的写作指南”(日本特许厅编)以及该领域中的惯用记号书写的。另外，本发明的肽包含氨基酸数为10个以下的寡肽以及氨基酸数超过10个的多肽。

“克罗恩氏病抗体”，是克罗恩氏病患者体内生成的克罗恩氏病特有的抗体。本发明中，不管造成其原因的抗原物质，也不管如何去识别，广意上是表示在克罗恩氏病患者中可以特异发现的克罗恩氏病患者特有的抗体。更为详细地，表示至少在与健康人、溃疡性结肠炎患者、其他的自体免疫病患者、十二指肠溃疡患者以及胃溃疡患者与克罗恩氏病患者进行比较的时候，在克罗恩氏病患者中所特异发现的抗体。另外，克罗恩氏病抗体通常含在克罗恩氏病患者的血液(血清、血浆)、尿、汗、唾液、***以及骨髓液等的各种生物试样中。

附图说明

图1所示是实施例1(2)的结果。具体的，表示了使用根据与克罗恩氏病患者血清的特异性选择的5个克隆(CD-1，CD-2，CD-3，CD-4，CD-5)，通过ELISA调查了对各血清试样(克罗恩氏病患者血清，溃疡性结肠炎患者血清以及健康人血清)的反应性的结果。

图2所示的是CDP-1，CDP-2，CDP-3以及CDP-4的各MAP肽的结构图。

图3所示的实施例2(1)的结果。具体的，表示了通过ELISA调查了各种血清试样(克罗恩氏病患者血清，溃疡性结肠炎患者血清以及健康人血清)对于各MAP肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，CDP-4的MAP肽)的反应性的结果。

图4所示的是实施例2(2)的结果。具体的，使用混和抗原板，通过ELISA调查了克罗恩氏病(CD)患者的550个血清试样，溃疡性结肠炎(UC)患者的20个血清试样，健康人120个血清试样，十二指肠溃疡患者25例以及胃溃疡患者的15个血清试样对于混和MAP肽的反应性的结果表示在图中。

图5所示的是实施例2(3)的结果。具体的，图A所示的是各种血清试样(克罗恩氏病(CD)患者血清，溃疡性结肠炎(UC)患者血清，以及健康人血清)对于混和MAP肽的的反应性。图B以及图C所示的是使用面包酵母代替混和MAP肽作为抗原，各种血清试样(克罗恩氏病(CD)患者血清，溃疡性结肠炎(UC)患者血清以及健康人血清)对于面包酵母的的反应性(使用市售的Anti-Saccharomyces cerevisiaeantibodies(ASCA)检测试剂盒)。图B使用的是ASCA IgG，图C使用的是ASCA IgA。

图6所示的是克罗恩氏病患者特异的肽(克罗恩氏病抗体结合性肽：CD1肽，CD2肽，CD3肽，CD4肽)与已经报告说与克罗恩氏病有关联的蛋白质((CDX、pig pancreatic alpha amylase)(猪胰腺α-淀粉酶)、M.paratuberculosis HSP65(M.副结核HSP65)、human HSP60(人HSP60)、M.paratuberculosis p36(M.副结核p36))的氨基酸序列的同源性图。另外，图中“：”表示氨基酸一致，另外“.”表示氨基酸类似。

图7是表示从蛋白质数据库中进行homology(同源性)检索得到的、与克罗恩氏病患者的特异肽(克罗恩氏病抗体结合性肽：CD1肽，CD3肽，CD4肽)在氨基酸序列方面具有同源性的各种生物(细菌，菌类，动物，节肢动物，植物，藻类)由来的蛋白质的图。

图8是表示人液泡H⁺转运性ATP酶的亚基E的氨基酸序列与CD1肽的等效物(CDP-1肽，CDP-5肽)的氨基酸序列的同源性的图。另外，图中，“‖”表示V-ATP酶亚基E的氨基酸序列与CDP-1以及CDP-5肽两者或者任何一方的氨基酸序列一致。“|”表示的是V-ATP酶亚基E的氨基酸序列与CDP-1以及CDP-5肽两者或者任何一方的氨基酸序列类似。另外，用“：”表示的是CDP-1和CDP-5肽的氨基酸一致，“·”表示的是CDP-1和CDP-5肽的氨基酸类似。另外有下划线的序列表示的是噬菌体pVIII-蛋白质由来的氨基酸序列。

图9所示的是VATE-201，CDP-1a，以及CDP-5a的各MAP肽结构图。

图10所示的是实施例4的结果。具体显示的是通过ELISA调查CDP-1a肽，CDP-5a肽以及人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E由来的肽(VATE-201肽)与各血清试样(克罗恩氏病患者血清，溃疡性结肠炎患者血清以及健康人血清)的反应性的结果。

图11所示的是实施例5的结果。具体所示的是利用CDP-1a的MAP肽抗原(图A)或者VATE-201的MAP肽抗原(图B)抑制克罗恩氏病患者的血清试样8号，9号，14号对于CDP-1a的MAP肽的反应性的试验结果。图中，-■-表示的是克罗恩氏病患者血清8号，-●-表示的是克罗恩氏病患者血清9号，以及-▲-表示的是克罗恩氏病患者血清14号的结果。

图12所示的是人细胞核内蛋白质(homo sapiens kruppel-like zincfinger protein 300)的氨基酸序列、以及含有其126-138位的氨基酸区域的氨基酸序列的Z300肽的位置关系。

图13所示的是实施例6(4)的结果。具体是通过ELISA调查CDP3肽(上部)以及Z300肽(下部)对于各血清试样(克罗恩氏病患者血清、溃疡性结肠炎患者血清以及健康人血清)的反应性的结果。

图14所示的是实施例6(5)的结果。具体所示的是利用CDP3的MAP肽抗原(图A)或者Z300的MAP肽抗原(图B)抑制克罗恩氏病患者的血清试样2号，7号，8号对于CDP-3的MAP肽的反应性试验的结果。图中，-■-表示的是克罗恩氏病患者血清2号，-●-表示的是克罗恩氏病患者血清7号，以及-▲-表示的是克罗恩氏病血清患者8号的结果。

图15所示的是属于稻***反应原蛋白质( α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂)的基因组的稻***反应原(Rice allergen)、稻种***反应原RA5(Rice seed allergen RA5)、稻***反应原RA5B前体(Rice allergenRA5 B precursor)、稻种***反应原RA14(Rice seed allergen RA14)、稻***反应原RA14B前体(Rice allergen RA14B precursor)以及稻种***反应原RAG2(Rice seed allergen RAG2)与95～110位的氨基酸区域的同源性比较的结果示意图。

图16所示的是稻种***反应原蛋白质(Rice seed allergen RA14)的氨基酸序列、以及含有其99～111位的氨基酸区域的氨基酸序列的TO3965肽的位置关系。

图17所示的是实施例7(4)的结果。具体是通过ELISA调查CDP4肽(上部)以及TO3965肽(下部)对于各血清试样(克罗恩氏病患者血清、溃疡性结肠炎患者血清以及健康人血清)的反应性的结果。

图18所示的是实施例7(5)的结果。具体所示的是利用CDP4的MAP肽抗原(图A)或者TO3965的MAP肽抗原(图B)抑制克罗恩氏病患者的血清试样3号，6号，15号，17号，20号对于CDP-4的MAP肽反应性的试验结果。图中，-■-表示的是克罗恩氏病患者血清3号，-●-表示的是克罗恩氏病患者血清6号，以及-▲-表示的是克罗恩氏病患者血清15号，-◆-所示的克罗恩氏病患者血清17号，以及-口-表示的是克罗恩氏病患者血清20号的结果。

发明的最佳实施方式

(1)克罗恩氏病抗体结合性肽

本发明中作为对象的“克罗恩氏病抗体结合性肽”(以下简称作“CD结合性肽”)，是指与克罗恩氏病抗体即在克罗恩氏病患者中特异发现的克罗恩氏病特异抗体特异结合的肽。

本发明的CD结合性肽，具体的可以举例由SEQ ID NO：1～4中所表示的任何一个氨基酸序列组成的肽(SEQ ID NO：1：CD1肽，SEQ IDNO：2：CD2肽，SEQ ID NO：3：CD3肽，SEQ ID NO：4：CD4肽)。这些肽任何一种的不变特征是均对克罗恩氏病抗体具有特异结合性。

进一步，本发明的肽不仅包括由上述SEQ ID NO：1～4中所表示的任何一种的氨基酸序列组成的肽之外，还包括由在这些氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列组成、而且对克罗恩氏病抗体具有结合性的肽。本发明中，这些肽有时称为含有SEQ ID NO：1～4所表示的任何一个氨基酸序列的肽的“等效物”。

这里，对于氨基酸的“取代、缺失或者添加”的程度及其位置等没有特别的限定，只要修饰肽是具有与由SEQ ID NO：1～4所表示的氨基酸序列中任何一个组成的肽(CD1肽，CD2肽，CD3肽，CD4肽)一样对克罗恩氏病抗体具有特异结合性的特征的等效物即可。氨基酸序列的改变(变异)，例如通过突然变异或者转译之后的修饰等产生，但也可以人为改变。另外，氨基酸序列的改变(变异)方法是本领域技术人员已知的方法(例如サィトスペシフィック？ミュ一タゲネシス[Methods in Enzymology，154，350，367-382(1987)；Methods in Enzymology，100，468(1983)；Nucleic Acids Res.，12，9441(1984)；生物化学实验讲座1“基因研究法II”，日本生物化学会编，p105(1986)]等的基因工程技术，或者磷酸三酯法或磷酸酰胺法等的化学合成方法[J.Am.Chem.Soc.，89，4801(1967)；J.Am.Chem.Soc.91，3350(1969)；Science，150，178(1968)；Tetrahedron Lett.，22，1859(1981)；Tetrahedron Lett.，24，245(1983)]等)。

本发明与这些改变以及变异的原因以及手段等无关，包括对克罗恩氏病抗体具有特异结合性的全部修饰肽。

所涉及到的等效物可以使用利用噬菌体呈现文库(phage displaylibrary)，优选随机肽噬菌体呈现文库的筛选技术取得。该利用噬菌体呈现文库的筛选，称作噬菌体呈现法，是迄今使用的鉴定与各种细胞表面受体特异结合的配体以及识别各种抗体的抗原决定位的公知方法。对这些噬菌体呈现文库的构建方法以及体外筛选方法，可以参照Scott以及Smith的方法。(Scott，J.M.和Smith，GP.，Science，249，386-390(1990)；Smith，G.P.，和Scott，J，K.，Methods in Enzymology，217，228-257(1993))。

为了筛选和鉴定与克罗恩氏病抗体具有特异结合性的肽，该文库中的随机肽呈现噬菌体可用于试管内表达作为筛选对象的大量肽(寡肽或者多肽)。另外所用的噬菌体文库，可以使用在此方法中使用的任何一种公知的噬菌体文库，举一个优选的例子，可以是随机肽呈现噬菌体(丝状噬菌体)，其通过在噬菌体的编码蛋白质PIII基因上***随机DNA，以使得可以在噬菌体衣壳表面上表达具有由随机的15个氨基酸组成的氨基酸序列的肽而构筑的。(特开平10-237098号公报，特开平10-237099号公报以及石川大，泷孝雄，细胞工程学，16(12)1821-1828(1997)，特开平2000-253900号公报)。

利用该筛选方法可以得到上述的CD1肽(SEQ ID NO：1)，CD2肽(SEQ ID NO：2)，CD3肽(SEQ ID NO：3)，CD4肽(SEQ ID NO：4)的各种等效物。具体如下所述：

首先通过在噬菌体载体中***随机DNA序列，使得可以在噬菌体衣壳的表面上表达具有与该DNA序列对应的随机氨基酸序列的肽，构筑随机肽呈现噬菌体。该噬菌体文库预先与通过抗人IgG抗体在微板等的固相表面上固定化的克罗恩氏病患者血清抗体(IgG)进行反应，并回收与该克罗恩氏病患者的血清抗体特异结合的噬菌体(biopanning)。另外，***到噬菌体载体中的随机DNA序列，可以选择编码通过作为获得等效物的对象的肽(CD1肽，CD2肽，CD3肽，或者CD4肽)的氨基酸序列的至少一个氨基酸缺失、取代或者添加得到的修饰氨基酸序列的DNA序列。

这里，作为在微板等上固定化的克罗恩氏病患者的血清抗体(IgG)，只要是至少具有抗原结合能力则没有特别的限定。例如从克罗恩氏病患者身上采集的血清本身，或者可以是将该血清利用蛋白质A精制得到的精制抗体、或利用硫酸镁溶液进行沉淀处理得到的精制抗体。

另外，与克罗恩氏病抗体特异结合的噬菌体的回收可以通过使具有抑制克罗恩氏病抗体与噬菌体的结合的能力的物质作用于所述的固化的抗体来进行。即，通过加入上述物质，与在微板上通过抗人IgG抗体固定化的克罗恩氏病抗体特异结合的噬菌体从克罗恩氏病抗体脱离或溶出，进行回收。反复进行几次这样的筛选，优选的是进行2～3次，这样可以选出可以表达与克罗恩氏病抗体特异结合的肽的噬菌体。

这里，作为具有抑制破坏克罗恩氏病抗体与噬菌体之间结合的能力的物质，并没有特别的限定，例如可以使用酸性溶液或碱性溶液，高浓度的盐，尿素，硫化氰等。

接着，利用通过上述方法得到的噬菌体感染大肠杆菌，然后大量培养，分离，精制，得到可以表达与克罗恩氏病抗体特异结合的肽的噬菌体。这样得到的噬菌体，通过抗噬菌体抗体在载体上固定化，供筛选与克罗恩氏病抗体特异结合的噬菌体的操作之用。这里提到的筛选，具体的是如下实施：使通过上述方法得到的噬菌体与在任意载体上固定化的抗噬菌体抗体反应而固定化，该固定化的噬菌体与克罗恩氏病患者的血清以及作为对照血清的健康人的血清、或溃疡性结肠炎及其他的自体免疫病患者、胃溃疡或者十二指肠溃疡等患者的血清进行反应，根据反应性选择与克罗恩氏病患者的血清特异反应的噬菌体。接着，通过从选择的噬菌体中提取分离出DNA，确定其碱基序列，据此确定氨基酸序列，从而可以鉴定、取得选定的噬菌体表达的肽，即与克罗恩氏病抗体特异结合的CD1肽，CD2肽，CD3肽，或者CD4肽的各种等效物(CD结合性肽)。

另外，对于通过上述的方法提取分离出的DNA序列的确定，可以利用本领域内公知的方法进行，例如双脱氧法，[Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，74，5463-5467(1977)]或Maxam-Gilbert法[Method in Enzymology，65，499(1980)]等。涉及的碱基序列的确定，可以使用市售的序列试剂盒等比较容易地进行。

例如，作为通过上述的方法得到的CD1肽(SEQ ID NO：1)的等效物，可以例举表1所示的CDP-1a肽(SEQ ID NO：5，)，CDP-1肽(SEQ IDNO：6)，CD5肽(SEQ ID NO：7)，CDP-5a肽(SEQ ID NO：8)，CDP-5肽(SEQID NO：9)，VATE-201c肽(SEQ ID NO：10)，VATE-201肽(SEQ IDNO：11)，CD1s肽(SEQ ID NO：12)以及CDP-1s肽(SEQ ID NO：13)。，关于在表1中所示的各种肽，利用四方形将与CD1肽的氨基酸序列共有的部分围起来，或者类似的氨基酸残基利用下划线表示(以下对于表2～4一样)。

表1

肽氨基酸序列 SEQ ID NO：

CD1 GLLAQQMDY 1

另外作为CD2肽的(SEQ ID NO：2)的等效物，可以例举表2所示的CDP-2肽(SEQ ID NO：15)，CD2s肽(SEQ ID NO：16)，CDP-2s肽(SEQID NO：17)，CD2s1肽(SEQ ID NO：18)以及CDP-2s1肽(SEQ ID NO：19)。

表2

肽氨基酸序列 SEQ ID NO：

CD2 YRWLPPSSA 2

进一步，作为CD3肽(SEQ ID NO：3)的等效物，可以例举表3所示的CDP-3肽(SEQ ID NO：20)，CDP3肽(SEQ ID NO：21)，CDP3-1肽(SEQ ID NO：22)，CDP3-2肽(SEQ ID NO：23)，CDP3-3肽(SEQ IDNO：24)，CDP3-4肽(SEQ ID NO：25)，CDP3-5肽(SEQ ID NO：26)，CDP3-6肽(SEQ ID NO：27)，CDP3-8肽(SEQ ID NO：28)，CDP3-12肽(SEQ IDNO：29)，CDP3-14肽(SEQ ID NO：30)以及Z300肽(SEQ ID NO：31)。

表3

肽氨基酸序列 SEQ ID NO：

CD3 RQSDGQYQM 3

进一步，作为CD4肽(SEQ ID NO：4)的等效物，可以例举表4所示的CDP-4肽(SEQ ID NO：33)，CDP4肽(SEQ ID NO：34)，CDP4-1肽(SEQ ID NO：35)，CDP4-2肽(SEQ ID NO：36)，CDP4-3肽(SEQ IDNO：37)，CDP4-4肽(SEQ ID NO：38)，CDP4-10肽(SEQ ID NO：39)，CDP4-13肽(SEQ ID NO：40)，CDP4-14肽(SEQ ID NO：41)以及TO3965肽(SEQ ID NO：42)。

表3

肽氨基酸序列 SEQ ID NO：

CD4 GGIYQDLVS 4

这些CD结合性肽可以根据其氨基酸序列利用一般的化学合成方法制备。该方法包括用于肽合成的普通的液相法以及固相法。更详细地，所述的肽的合成方法包括根据本发明中提供的氨基酸序列信息，将各氨基酸一个一个逐次结合使链增长的逐步增长法(stepwiseelongation)，以及预先合成由几个氨基酸构成的片段，接着将各片段进行偶合反应的片段缩合法。本发明的肽的合成，可以利用上述的任何一种方法进行。

上述的肽的合成中使用的缩合法，可以利用公知的各种方法。具体的例如叠氮化物法，混和酸酐法，DCC法，活泼酯法，氧化还原法，DPPA(二苯基磷酰基叠氮化物)法，DCC+添加物(1-羟基苯并***，N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二羧酰亚胺等)法，Woodward法等。对于可在这些方法中使用的溶剂可以适宜选自在这种肽的缩合反应中使用的我们所熟知的溶剂，例如二甲基甲酰胺(DMF)，二甲亚砜(DMSO)，六甲基磷酰胺(hexaphosphoramide)，二氧杂环己烷，四氢呋喃(THF)，醋酸乙酯等以及它们的混和溶剂等也可以。

在进行上述的肽合成反应的时候，对于与反应无关的氨基酸或者肽中的羧基，一般预先利用酯化反应，以低级烷基酯的形式例如甲酯，乙酯，叔丁酯等，或者芳烷基酯的形式例如苄基酯，对甲氧基苄基酯，对硝基苄基酯等将其保护。另外，对于侧链上有官能团的氨基酸，例如Tyr的羟基，可以利用乙酰基，苄基，苄氧羰基，叔丁基等预先保护起来，当然也可以不必保护。进一步例如Arg的胍基，可以利用如硝基，对甲苯磺酰基，2-甲氧基苯磺酰基，亚甲基-2-磺酰基，苄氧羰基，异冰片基氧羰基，金刚烷基氧羰基等适当的保护基团保护起来。上述有保护基的氨基酸，在肽以及最终得到的本发明的肽中这些保护基的脱保护反应，可以利用惯用的方法，例如催化还原法，以及使用液体氨/钠，氟化氢，溴化氢，氯化氢，三氟乙酸，乙酸，甲酸，甲磺酸等的方法实施。

这样得到的本发明的CD结合性肽，根据通常的方法，例如离子交换树脂，分配色谱分离法，凝胶色谱法，亲合色谱分离法，高效液体色谱法，逆流分配法等的肽化学领域中通用的方法进行适当的精制。

另外本发明中所谓的CD结合性肽，在与克罗恩氏病抗体具有特异结合性的范围内，不仅包括上述的各种肽，也包含含有这些肽的氨基酸序列的一部分的寡肽以及多肽。

这些多肽，可以例举部分含有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：31，或者SEQ ID NO：42任何一个所表示的氨基酸序列的多肽。另外部分含有通过上述SEQ IDNO任何一个所表示的氨基酸序列中的一个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的的修饰氨基酸序列的多肽也可以。

一般考虑在抗原-抗体反应中抗体识别抗原所需的最小氨基酸数为4。因此，从抗原性的观点出发，只要是由四个以上氨基酸组成的肽，则对其氨基酸数没有特别的限定。虽然没有限定，但是氨基酸数一般是4～700个。另外，如后述制备在一分子中具有所述的CD结合性肽的多个氨基酸序列作为支链的分支状多抗原性肽时，该支链的氨基酸数通常优选在9～14的范围内。

更为具体的，可以例举至少含SEQ ID NO：10所表示的氨基酸序列中的LIAQQM的氨基酸序列的多肽。SEQ ID NO：10中所表示的氨基酸序列是作为CD1肽的等效物的VATE-201c的氨基酸序列，并且作为部分含有该氨基酸序列(LIAQQM)的多肽，可以例举的有如含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VATE-201肽，液泡型H⁺转运性ATP酶(以下称作“V-ATP酶”)，或者其亚基E。另外，V-ATP酶的氨基酸序列的亚基E的氨基酸序列由SEQ ID NO：14表示。

V-ATP酶，是属于真核细胞的细胞内膜***(central vacuolarsystem)的一种具有可以维持细胞器(高尔基体，溶酶体，分泌颗粒，突触小泡，酵母液泡等)的内部酸性的功能的H⁺泵。已知该V-ATP酶是由亚基A、B、C、D和E，115kDa亚基，39kDa亚基，20kDa亚基和16kDa亚基九个亚基构成的。各个亚基的一级结构已经为我们所知，另外也可以推定这些亚基所构成的V-ATP酶的结构(生化学，第65卷，第6期，1993年6月，第413-436页)。

本发明的CD结合性肽，不仅包括由这些亚基构成的V-ATP酶的全序列的多肽(蛋白质)，而且包括V-ATP酶的片段(包括各亚基以及各亚基的片段)，只要这些片段能够与克罗恩氏病抗体特异结合即可，包含。另外本发明的CD结合性肽也包括人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E与选自其它亚基，即亚基A，亚基B，亚基C，亚基D，115kDa亚基，39kDa亚基，20kDa单位和16kDa亚基的至少一种亚基形成的复合物。

作为V-ATP酶的片段，可以例举亚基E(33kDa多肽，氨基酸数226个)，含有该亚基E区域的多肽(包含含有亚基E的各种亚基的复合物)，含有该亚基E的氨基酸序列的202-208区域的氨基酸数为7-226的多肽，或者含有亚基E的氨基酸序列的199-212区域的氨基酸数14-226个的多肽。进一步，这些V-ATP酶及其片段(例如含亚基E的各种亚基的复合物，亚基E或者其一部分)，只要与克罗恩氏病抗体具有特异结合性，则可通过其氨基酸序列中的一个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加而进行修改。这些修饰蛋白质，各自可以定义为V-ATP酶及其片段(例如亚基E)的等效物。

另外，作为CD结合性的多肽，可以例举至少含有SEQ ID NO：51所表示的氨基酸序列的多肽。在SEQ ID NO：51所表示的氨基酸与CD3肽的等效物Z300肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：31)相当。作为部分含有该氨基酸序列的多肽，可以例举人细胞核内蛋白质(智人kruppel样锌指蛋白300(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)；以下称作“人细胞核内蛋白质(HZF300)”)。另外人细胞核内蛋白质(HZF300)的氨基酸序列以SEQ ID NO：32表示。本发明的CD结合性肽，只要与克罗恩氏病抗体具有特异结合性，将由SEQ ID NO：32表示的人细胞核内蛋白质(HZF300)的氨基酸序列中一个或者氨基酸经过取代、缺失或者添加进行修饰也可以。作为该修饰物，可以例举含有人细胞核内蛋白质(HZF300)的氨基酸序列的129-135区域的氨基酸数为7-604的多肽，或者人细胞核内蛋白质(HZF300)的氨基酸序列的126-139区域的氨基酸数为14-604的多肽。这些修饰物，可以定义为人细胞核内蛋白质(HZF300)的等效物。

进一步，作为CD结合性的多肽，可以例举至少含有L(V)GGIYXE(D)L(X为任意的氨基酸序列)的氨基酸序列的多肽。至少含有该氨基酸序列的多肽，包括SEQ ID NO：4，33～42所表示的CD4肽及其等效物。另外，作为至少含有该氨基酸序列的多肽，也可以例举属于稻***反应原蛋白质的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的基因组的稻种***反应原RA14(Rice seed allergen RA14)。另外Rice seed allergenRA14的氨基酸序列以SEQ ID NO：46所表示。

本发明的CD结合性肽，只要与克罗恩氏病抗体具有特异结合性，也可以是Rice seed allergen RA14(SEQ ID NO：46)的氨基酸序列中一个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰肽。作为该修饰物，可以例举含有Rice seed allergen RA14的氨基酸序列(SEQ ID NO：46)的101-108区域的氨基酸数为8-165个的多肽，或者含有Rice seedallergen RA14的氨基酸序列的99-111区域的氨基酸数为13-165的多肽。这些修饰物，可以定义为Rice seed allergen RA14的等效物。

另外，本发明的CD结合性肽，包括至少含有通过SEQ ID NO：42中所表示的氨基酸序列中一个或者各个氨基酸经过取代、缺失或者添加而得到的修饰氨基酸序列的多肽，只要它们与克罗恩氏病抗体具有特异结合性即可。提到的多肽可以例举与Rice seed allergen RA14一样属于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的基因组的稻***反应原(Riceallergen)(SEQ ID NO：43)，稻种***反应原RA45(Rice seed allergenRA45)(SEQ ID NO：44)，稻***反应原RA5B前体(Rice allergen RA5Bprecursor)(SEQ ID NO：45)，稻***反应原RA14B·前体(Rice allergenRA14B precursor)(SEQ ID NO：47)，以及稻种***反应原RAG2(Riceseed allergen RAG2)(SEQ ID NO：48)。另外，这些稻***反应原蛋白质只要与克罗恩氏病抗体具有特别的结合性，在其氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加进行修饰也可以。作为这样的稻***反应原蛋白质的等效物，例如至少含有位于各稻***反应原蛋白质的95-110位的氨基酸序列的L(V)GGIYREL的氨基酸序列(SEQ IDNO：49、50)的蛋白质。具体的，可以例举含有Rice allergen的氨基酸序列的99-106区域的氨基酸数8-157个的多肽，含有Rice seed allergenRA5的氨基酸序列的99-106区域的氨基酸数8-157个的多肽，含有Riceseed allergen RA5B前体的氨基酸序列的102-109区域的氨基酸数8-160的多肽，含有Rice allergen RA14B前体的氨基酸序列102-109区域的氨基酸数位8-166的多肽，以及含有Rice seed allergen RAG2的氨基酸序列的102-109区域的氨基酸数8-166个的多肽。这些修饰蛋白质，各自定义为Rice allergen、Rice seed allergen RA5，Rice allergen RA 5B前体，Rice allergen RA14B前体，以及Rice seed allergen RAG2的等效物。

以上，作为CD1肽的等效物的V-ATP酶、其亚基E(SEQ ID NO：14)及其等效物，作为CD3肽等效物的人细胞核内蛋白质(HZF300)(SEQ IDNO：32)及其等效物，以及作为CD4肽的等效物的属于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的基因组的各种稻***反应原蛋白质(SEQ ID NO：43-48)以及它们的等效物，均包含在本发明的CD结合性肽中。

进一步，本发明的CD结合性肽，也可以呈多抗原性肽(mutipleantigen peptide：以下称作“MAP肽”或者“分支状多抗原性肽”)的形态。此MAP肽的特征在于，由SEQ ID NO：1～4所表示的肽(CD1肽～CD4肽)或者它们的等效物的氨基酸序列作为支链，多个呈分支状与基本分子结合。含有上述的CD结合性肽的氨基酸序列的支链的数目并没有特别限定，但优选的是2-16个，更为优选的是4-16个，进一步优选的是8个。

对于呈MAP形态的本发明的CD结合性肽(分支状多抗原性肽)的较为合适的例子，例如具有树枝状高分子(dendrimer)结构的基本分子(骨架)的肽。

该树枝状高分子，已知一般是指那些具有树枝状到星形的立体构型的球状或其他结构的分子，该分子另外的特征在于其多个具有官能团的分支(重复单元)(参见例如特表昭60-500295号公报；特开昭63-99233号公报；特开平3-263431号公报；US4507466说明书，US4568737说明书；Polymer Journal，17，117页(1985)；AngewandteChem.Int.Engl.，29，138-175(1990)；Macromolecules，25，3247页(1992)等)。

本发明中利用的树枝状高分子，只要具有由作为起始部分的核结构、该起始核上结合的重复单元(支)构成的内层(代)以及在各支上结合的官能基团所构成的外表面，则没有特别的限定。该树枝状高分子的大小、形态、反应性等，可以通过适宜选择起始核部分，代数以及各代中所用的重复单元进行调整，对此也没有特别的限定。对于具有适当大小的树枝状高分子的制备，可以根据后述的方法进行，另外不同大小的树枝状高分子，可以通过增加将利用的代数较为容易的得到(例如参照US4694064说明书)。

作为本发明的具有树枝状高分子结构的CD结合性肽(分支状多抗原性肽)的一例，可以例举，以氮原子作为起始核部分，具有由在该核部分上结合的-CH₂CH₂CONHCH₂CH₂-结构组成的重复单元(支)的树枝状高分子的各枝最外侧末端上结合多个CD结合性肽的特定的氨基酸序列。其它例子是以Lys，Arg，Glu，Asp等的氨基酸中的任何一个作为起始核部分，利用同样的各氨基酸作为在该核上直接结合的重复单元，同样在其各枝的末端上结合CD结合性肽的氨基酸序列。

上述以氮原子作为起始核部分的树枝状高分子，可以利用常规方法制备。另外其构造物(树枝状高分子原料)，可以在市场上购到(Polysciences，Inc.，400 Vally Road，warrington，PA，18976 USA)。利用其他的氨基酸作为起始核部分的树枝状高分子，例如利用上述的肽合成法制备。另外例如可以使用Fmoc8-Lys4-Lys2-Lys-αAla-Alko树脂(渡边化学工业社制)等市售的树枝状高分子原料进行制备。

更为具体的，上述的树枝状高分子的原料可以通过如下的方法进行制备。即在固相肽合成用的树脂上，预先使用间隔物或者不使用间隔物，使由两个相同或者不同的氨基保护基保护的α，ω-二氨基酸进行缩合，然后去掉保护基，进一步重复进行同样的保护的α，ω-二氨基酸的缩合反应以及脱保护基反应。

对于固相肽合成用树脂，可以使用在通常肽合成中使用的任何一种树脂。例如聚苯乙烯树脂，聚丙烯酰胺树脂，聚苯乙烯聚乙二醇树脂等末端具有氯甲基，4-(羟甲基)苯氧基，4-((α-2’，4’-二甲氧基苯基)-9-芴基甲氧基羰基氨基甲基)苯氧基等基团的树脂。作为间隔物可以使用一个或者多个氨基酸。另外对于α，ω-二氨基酸，可以使用赖氨酸，鸟氨酸，1，4-二氨基丁酸，1，3-二氨基丙酸等。

作为保护基，可以使用Boc基，Fmoc基，Z基等。作为官能基团，有氨基，羧基以及羟基等。除去保护基的反应，可以根据上述的肽合成法进行。枝的数目在重复单元的缩合以及除去保护基反应重复进行n次时为2n。此枝数具体的优选是2-16。

通过在这样得到的树枝状高分子原料的各枝末端的官能团上结合CD结合性肽的特定氨基酸序列，可以得到具有所希望的MAP形态的本发明的肽(分支状多抗原性肽)。此结合反应，可以根据上述的肽合成方法进行。

MAP形态的本发明的肽(分支状多抗原性肽)，可以根据常规方法，利用适当的基质，例如セファクリ一ル S-300(ファルマシァ社制)等树脂的层析操作等进行精制。

关于本发明的分支状的多抗原性肽，构成各枝末端的氨基酸序列不必相同，而是可以是任意不同的CD结合性肽的氨基酸序列进行组合得到的肽。作为不同的CD结合性肽的氨基酸序列的组合的例子，可以举出，例如，从(i)CD1肽及其等效物，(ii)CD2肽及其等效物，(iii)CD3肽及其等效物，和(iv)CD4肽及其等效物构成的四组中的至少2组，优选3组，更优选4组中选择的的2种以上、优选3种以上、更优选是4种以上的不同肽的氨基酸序列的组合。通过使用这样的复合型分支状多抗原性肽，可以高精度检测每个受验者有无患克罗恩氏病。

本发明的CD结合性肽，具有选择性地识别和结合克罗恩氏病患者特异发现的克罗恩氏病特异抗体(克罗恩氏病抗体)的性质。因此，本发明的含有CD结合性的肽及其氨基酸序列的分支状多抗原性肽，可以有效的进行克罗恩氏病有无的检查以及诊断。

(2)克罗恩氏病检查试剂以及试剂盒

如上所述，本发明提供一种以上述的CD结合性肽或/和含有其氨基酸序列的分支状多抗原性肽为有效成分的克罗恩氏病检查试剂。

具体的，本发明的克罗恩氏病检查试剂含有，从上述的(i)CD1肽或者其等效物，(ii)CD2肽或者其等效物，(iii)CD3肽或者其等效物和(iv)CD4肽或者其等效物组成的各种CD结合性肽中选出的至少一种肽，或者在一分子中呈分支状含有多个从(i)CD1肽或者其等效物，(ii)CD2肽或者其等效物，(iii)CD3肽或者其等效物和(iv)CD4肽或者其等效物组成的组中选择出的至少一种肽的相同或者不同的氨基酸序列的分支状多抗原性肽，作为有效成分。

另外，上述的CD1肽的等效物包括人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E，与从其他亚基，即亚基A，亚基B，亚基C，亚基D，115kDa亚基，39kDa亚基，20kDa亚基和16kDa亚基组成的组中选择的至少一种亚基的复合物。

这里作为有效成分的这些CD结合性肽或者分支状多抗原性肽，起着抗原的作用，即利用与克罗恩氏病抗体的特异结合性，与受验者的生物试样中存在的克罗恩氏病抗体结合，从而捕捉或者标记该抗体。

作为克罗恩氏病检查试剂的有效成分，可以单独使用一种上述的CD结合性肽，也可以两种以上任意组合使用。从提高精度(判定的信赖度)方面来说，较为理想的是两种以上组合使用。对于其组合的方式并没有特别的限定，但是优选的是(i)CD1肽或者其等效物(例如CDP-1a肽，CDP-1肽，CD5肽，CDP-5a肽，CDP-5肽，VATE-201c肽，VATE-201肽，CD1s肽，CDP-1s肽，V-ATP酶，亚基E或者它们的等效物)，(ii)CD2肽或者其等效物(例如，CDP-2肽，CD2s肽，CDP-2s肽，CD2s1肽，CDP-2s1肽或者它们的等效物)，(iii)CD3肽或者其等效物(例如CDP-3肽，CDP3肽，CDP3-1肽，CDP3-2肽，CDP3-3肽，CDP3-4肽，CDP3-5肽，CDP3-6肽，CDP3-8肽，CDP3-12肽，CDP3-14肽，Z300肽或者它们的等效物)和(iv)CD4肽或者其等效物(例如CDP-4肽，CDP4肽，CDP4-1肽，CDP4-2肽，CDP4-3肽，CDP4-4肽，CDP4-10肽，CDP4-13肽，CDP4-14肽，TO3965肽，Rice allergen，Rice seed allergenRA5，Rice allergen RA5 B前体，Rice seed allergen RA 14，Rice allergenRA14B前体，Rice seed allergen RAG2或者它们的等效物)的各组(i)～(iv)中至少2组，优选3组，更优选4组中任意选择的2种以上，优选3种以上，更优选4种以上的肽进行组合使用。

本发明的克罗恩氏病检查试剂是如上所述含有两种以上CD结合性肽的组合物的时候，对各CD结合性肽的配合比例并没有特别的限定。例如，各CD结合性肽相互之间可以以相同的比例进行配合使用，另外考虑到含有对克罗恩氏病抗体的反应性(结合性)弱的肽等的时候，配合的方式是该反应性弱的肽的比例可以较多。例如，虽然没有特别限定，但是使用各自属于上述的CD结合性肽组(i)、(ii)、(iii)和(iv)的所述(i)CD1肽，(ii)CD2肽，(iii)CD3肽和(iv)CD4肽作为有效成分时，其配合比例为1∶2∶2∶1。

另外，作为克罗恩氏病检查试剂的有效成分，使用上述的分支状多抗原性肽的时候，该多抗原性肽是这样的：构成分支的氨基酸序列可以由同一种CD结合性肽的氨基酸序列组成，也可以是包含两种以上不同CD结合性肽的氨基酸序列。对于后者，将用作所述分支的CD结合性肽的氨基酸序列的组合方式并没有特别的限定，但优选的是，从上述的各组(i)～(iv)中的至少2组，优选3组，更优选4组中任意选择的2种以上，优选3种以上，更优选4种以上的CD结合性肽的氨基酸序列进行组合作为支链。

本发明的克罗恩氏病检查试剂，可以作为与克罗恩氏病特异结合的抗原物质用于在克罗恩氏病抗体的捕捉或者标记。因此只要不偏离此目的，该检查试剂的有效成分可以由一种或者两种以上的CD结合性肽或者分支状多抗原性肽所组成，也可以含有其他的一些成分。另外，为了标记克罗恩氏病抗体，这些CD结合性肽或者分支状多抗原性肽优选用任意的标记物质进行标记。作为在该标记中所使用的标记物质，可以使用在本领域内广泛使用的通常的标记物质，并没有特别的限定，但具体的如³H或¹⁴C等的放射性同位素；碱性磷酸酶，过氧化物酶(POX)，微过氧化物酶，胰凝乳蛋白酶原，羧肽酶原，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，淀粉酶，磷酸化酶，脱氧核糖核酸酶以及肽核酸酶等酶；荧光素异硫氰酸酯(FITC)，以及四甲基若丹明异硫氰酸酯(RITC)等的荧光物质；及1N-(2，2，6，6-四甲基-1-氧基-4哌啶基)-5N-(天门冬氨酸酯)-2，4-二硝基苯(TOPA)，染料溶胶，金属溶胶，胶乳粒子等。另外对于上述的本发明中的CD结合性肽或者分支状多抗原性肽，也包含这样的标记化的CD结合性肽。

以被试验者的生物试样作为被验试样进行克罗恩氏病的检查时，一般简便地利用含有CD结合性肽或者分支状多抗原性肽作为有效成分的上述的检查试剂的试剂盒。因此，本发明另外提供可以有效进行克罗恩氏病检查(诊断)的试剂盒。

本发明的克罗恩氏病检查试剂盒，既可以是含有所述的检查试剂作为克罗恩氏病抗体的捕捉剂的试剂盒，也可以是含有所述的检查试剂作为克罗恩氏病抗体的标记剂的试剂盒，只要是为以与克罗恩氏病抗体进行结合而含有它即可。另外上述的检查试剂作为克罗恩氏病抗体的捕捉剂使用时，也可以作为预先在任意的载体(固相)上固定化的固定化物使用。另外作为克罗恩氏病抗体的标记剂使用时，优选使用用上述的任意标记物质标记的CD结合性肽或者多抗原性肽。

与检查试剂在本发明的检查试剂盒中组合使用的其他成分可以根据克罗恩氏病检查中利用的免疫测定法的种类或采用的检测手段，以常规方式适当选择。优选的是，本发明的检查试剂盒中，作为以CD结合性肽或者多抗原性肽为有效成分的检查试剂以外的成分，可以含有用于检测人IgG的二次抗体(例如抗人IgG抗体)。另外，该抗人IgG抗体既可以用上述的标记物质进行了标记，也可以预先在任意的载体(固相)上固定化。

另外，对于检查试剂的试剂盒，可以进一步含有与标记物质对应的基质，或者用于检测标记物质与基质之间的反应的检测试剂，并且进一步为了测定实施的方便也可以包含适当的试样稀释液，二次抗体稀释液(例如抗人IgG抗体稀释液)，标准抗体，缓冲液，清洗液，酶底物液，反应停止液等。进一步，对于检查试剂或抗人IgG抗体未标记或者未固定化时，也可以含有载体(固相)或标记物质作为检查试剂的其它成分。

即，本发明的克罗恩氏病检查试剂盒是用于检查克罗恩氏病的一组试剂，含有以上述的CD结合性肽或者分支状多抗原性肽为有效成分的检测试剂，其与从可被固定化的或/和标记的抗人IgG抗体，与标记物质对应的底物，抗体稀释液，标准抗体，缓冲液，清洗液，底物溶解液，反应停止液，载体(固相)和标记物质中任意选择出的至少一种组合使用。从简单性，安全性，敏感度等观点出发，优选的标记物质是酶。从该角度考虑，本发明的克罗恩氏病检查试剂盒是用于克罗恩氏病的一组试剂，含有以上述的CD结合性肽或者分支状多抗原性肽为有效成分的检测试剂(可以固定化或/和酶标记)，其与从可以固定化或/和标记的抗人IgG抗体，酶底物，抗体稀释液，标准抗体，缓冲液，清洗液，酶底物溶解液，酶反应停止液，载体(固相)和标记物质中任意选择出的至少一种进行组合使用。另外，作为酶标记中所用的酶标记物质，可以例举，例如，微过氧化物酶，胰凝乳蛋白酶原，羧肽酶原，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，淀粉酶，磷酸化酶，脱氧核糖核酸酶，以及肽核酸酶等酶。

(3)克罗恩氏病的检查方法

另外，本发明提供克罗恩氏病的检查方法。该检查方法是使用受验者的生物试样作为检查用的被验试样，检测各受验者有无患克罗恩氏病。更为具体的，对于本发明的克罗恩氏病的检查方法，是以克罗恩氏病患者的生物试样中特异存在的特定的抗体的存在为指标，检测各受验者是否患有克罗恩氏病。

这里的被验试样可以使用受验者(人)的血液(血清、血浆)，尿，汗，唾液，***或者骨髓液等各种生物试样，优选血清。

作为克罗恩氏病的检查方法，可以列举以下(3-1)～(3-3)的三种方法。

(3-1)如后述的实施例所示，克罗恩氏病患者中特异存在识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的抗体。

因此，作为本发明的克罗恩氏病的检查方法，可以列举以受验者的生物试样作为对象，包括检测识别人液泡型H⁺转运性ATP酶(V-ATP酶)的抗体的步骤的方法。作为上述的检测对象的抗体，优选是识别V-ATP酶的亚基E的抗体，更优选的是识别V-ATP酶的亚基E的199～212位的氨基酸区域的抗体。

这些抗体的检测可以利用迄今已知的利用抗原-抗体反应的免疫学测定方法进行。具体的，从怀疑患有克罗恩氏病的受验者身上取上述的各种生物试样，优选的是血清，使该生物试样与对识别上述的V-ATP酶抗体有结合性的抗原物质进行反应，通过检测此抗体-抗原反应生成的复合物来进行。

这里作为对识别V-ATP酶的抗体有结合性的抗原物质，只要是可以与识别V-ATP酶的抗体特异结合，则没有特别的限定。优选的是具有与V-ATP酶的亚基E的抗体特异结合的性质的抗原物质，更为优选的是具有与V-ATP酶亚基E的199～212位的氨基酸区域的抗体特异结合的性质的抗原物质。作为具有该性质的物质，具体的如由LIAQQM的氨基酸序列组成的肽及其等效物。这里的等效物，包括由上述的氨基酸序列(LIAQQM)中一个或者几个氨基酸经过缺失、取代或者添加得到、并且具有与识别V-ATP酶亚基E的抗体特异结合的性质的修饰肽。作为这样的肽，可以列举，例如，含有由SEQ ID NO：1、5～15所表示的氨基酸序列的肽(CD肽，CDP-1a肽，CDP-1肽，CD5肽，CDP-5a肽，CDP-5肽，VATE-201c肽，VATE-201肽，CD1s肽，CDP-1s肽，V-ATP酶，V-ATP酶的亚基E)。另外，不限于此，例如可以利用含有上述氨基酸序列(LIAQQM)、氨基酸数为6～226，优选为6～14的多肽。

另外，作为与识别V-ATP酶抗体具有结合性的抗原物质，可以使用从V-ATP酶的亚基E与从其他亚基，即亚基A，亚基B，亚基C，亚基D，115kDa亚基，39kDa亚基，20kDa亚基和16kDa亚基组成的组中选择的至少一种亚基形成的复合物。进一步，作为与识别V-ATP酶的抗体具有结合性的抗原物质，可以使用在一分子中含有多个相同或者不同的由上述的氨基酸序列(LIAQQM)组成的肽或者其等效物的分支状多抗原性肽。

(3-2)另外如后述的实施例6所示，在克罗恩氏病患者中特异存在识别人细胞核内蛋白质(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein300(HZF300))的抗体。

因此，作为本发明的克罗恩氏病的检查方法，可以列举以受验者的生物试样作为对象，包括检测识别人细胞核内蛋白质(HZF300)的抗体的步骤的方法。作为上述的检测对象的抗体，优选的是识别人细胞核内蛋白质(HZF300)的126-138位的氨基酸区域的抗体。

这些抗体的检测，可以利用迄今已知的利用抗原-抗体反应的免疫学测定方法进行。具体的，从怀疑患有克罗恩氏病的受验者身上取上述的各种生物试样，优选血清，使该生物试样与对识别上述的人细胞核内蛋白质(HZF300)的抗体具有结合性的抗原物质进行反应，然后通过检测此抗原-抗体反应所生成的复合物来进行。

这里作为与识别上述的人细胞核内蛋白质的抗体具有结合性的抗原物质，只要与识别该人细胞核内蛋白质(HZF300)的抗体特异结合则没有特别地限定。优选的是具有与识别该人细胞核内蛋白质(HZF300)的126～138位的氨基酸区域的抗体特异结合的性质的物质。作为具有该性质的物质，具体的如由SEQ ID NO：51所表示的氨基酸序列组成的肽或者其等效物。这里的等效物，包括由通过SEQ ID NO：51中添加一个或者几个氨基酸而得到、并且具有与识别人细胞核内蛋白质(HZF300)的抗体特异结合的性质的肽或者蛋白质。作为所说的肽，例如含有SEQ ID NO：3以及20～32所表示的氨基酸序列的肽(CD3肽，CDP-3肽，CDP3-1肽，CDP3-2肽，CDP3-3肽，CDP3-4肽，CDP3-5肽，CDP3-6肽，CDP3-8肽，CDP3-12肽，CDP3-14肽，Z300肽，人细胞核内蛋白质(HZF300))。另外，也不限于此，可以使用例如部分含有SEQ ID NO：51所表示的氨基酸序列、氨基酸数7～604的多肽。

进一步，作为与识别人细胞核内蛋白质(HZF300)的抗体具有结合性的抗原物质，可以使用在同一分子中含有多个相同或者不同的由上述的SEQ ID NO：51所表示的氨基酸序列组成的肽或者其等效物的分支状多抗原性肽。

(3-3)另外如后述的实施例7所示的那样，在克罗恩氏病患者中特异存在识别稻***反应原的抗体。

因此，作为本发明的克罗恩氏病的检查方法，可以列举以受验者的生物试样作为对象，包括检测识别稻***反应原蛋白质的抗体的步骤的方法。另外，作为这里的稻***反应原蛋白质，可以列举属于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂的基因组的那些，具体的有Riceallergen(158aa)，Rice seed allergen RA5(157aa)，Rice allergen RA5 B前体(160aa)，Rice seed allergen RA14(165aa)，Rice allergen RA14B前体(166aa)以及Rice seed allergen RAG2(166aa)。作为上述的检测对象的抗体，优选的是识别位于这些各种稻***反应原蛋白质的95～110位的氨基酸区域的至少L(或者V)GGIYREL氨基酸序列的抗体。

这些抗体的检测，可以利用迄今已知的利用抗原-抗体反应的免疫学测定方法进行。具体的，从怀疑患有克罗恩氏病的受验者身上取上述的各种生物试样，优选血清，使该生物试样与对识别上述的稻***反应原蛋白质的抗体具有结合性的抗原物质进行反应，通过检测此抗原-抗体反应所生成的复合物来进行。

这里，作为上述与识别人细胞核内蛋白质的抗体具有结合性的抗原物质，只要与属于该稻***反应原蛋白质(α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂)的基因组的蛋白质的抗体特异结合，则没有特别的限制。优选的是具有与识别位于各种稻***反应原蛋白质的95～110位的氨基酸区域的至少L(或者V)GGIYREL的氨基酸序列(SEQ ID NO：49、50)的抗体特异结合的性质的物质。

作为具有所述性质的物质，具体的有由L(V)GGIYXD(E)L(X为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列组成的肽或者其等效物。这里的等效物，包括通过上述的L(V)GGIYXD(E)L(X为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列中添加一个或者几个氨基酸而得到、并且具有与识别稻***反应原蛋白质的抗体特异结合的性质的肽。作为所说的肽，例如含有SEQ ID NO：4以及33-48各自所表示的氨基酸序列的肽(CD4肽，CDP-4肽，CDP4-1肽，CDP4-2肽，CDP4-3肽，CDP4-4肽，CDP4-10肽，CDP4-13肽，CDP4-14肽，TO3965肽，Rice allergen，Rice seed allergenRA5，Rice allergen RA5B前体，Rice seed allergen RA14，Rice allergenRA14B前体和Rice seed allergen RAG2)。另外，也不仅限于此，也可以使用含有L(V)GGIYXD(E)L(X为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列、氨基酸数8～166，优选氨基酸数8～14的多肽。

另外，作为与识别稻***反应原蛋白质具有结合性的抗原物质，可以使用在同一分子中含有多个相同或者不同的由上述的L(V)GGIYXD(E)L(X为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列组成的肽或者其等效物的分支状多抗原性肽。

关于通过这样的抗原物质与克罗恩氏病患者中特异存在的抗体之间的反应生成的抗原-抗体复合物的检测方法，并没有特别的限定，可以广泛使用惯用的方法。具体的，可适当例举利用上述的各种CD结合性肽或者含有所述肽的分支状多抗原性肽作为抗原物质的各种免疫测定法。例如以利用人血清作为被验试样的固相化夹心法为例，目标抗体可通过下面的方法测定。

首先将作为抗原物质使用的上述肽固相化，(以下为方便起见称作“固相化肽”)，在其中加入作为被验试样的生物试样(例如血清试样)。结果，固相化肽与被验试样中的克罗恩氏病患者的特异抗体之间发生了抗原-抗体反应，被验试样中存在的目标抗体与固相化肽结合。接着通过利用人抗体(IgG)检测试剂检测有无结合的目标抗体及其抗体量(抗体滴度)，从而可以定量检测在被验试样中，即受验者的生物试样(血清等)中存在的目标抗体。

另外，如上述，通过将人抗体(IgG)检测试剂预先固相化，在其中加入被验试样以捕捉在生物试样中的目标抗体，接着在其中加入上述的抗原物质使其与目标抗体的结合，检测在被验试样中存在的克罗恩氏病患者的特异目标抗体，也可以测定其抗体量(抗体滴度)。另外，通过与目标抗体结合的抗原物质上进一步与该抗原物质的特异抗体进行结合，这样可以通过以该抗体作为指标检测克罗恩氏病患者的特异抗体，也可以测定其抗体量(抗体滴度)。在这些测定方法中所使用的各种手段的选择及其改变等均为本领域人员所熟知，在本发明中可以采用任何一种方法。[参见“临床检查法手册”，金原出版，1995年等]。]

这里，对于用于检测克罗恩氏病抗体的人抗体(IgG)检测试剂，没有特别的限定，可以使用一般所用的各种试剂。例如，比较适合使用的有与IgG特异结合的抗IgG抗体等。这些可以在市场比较容易买到，也可以通过常规方法制得。

另外，利用这些人抗体(IgG)检测试剂作为指标检测目标抗体的时候，优选的是将该人抗体(IgG)检测试剂进行标记。在标记中所用的标记物质，具体的有³H或¹⁴C等的放射性同位素；碱性磷酸酶，过氧化物酶(POX)等的酶；荧光素异硫氰酸酯(FITC)、四甲基若丹明异硫氰酸酯(RITC)等的荧光物质；及1N-(2，2，6，6-四甲基-1-氧基-4-哌啶基)-5N-(天门冬氨酸酯)-2，4-二硝基苯(TOPA)，染料溶胶，金属溶胶，胶乳粒子等。另外，使用通过这些标记物质标记的检测试剂的免疫测定法，各自分别被称作放射免疫测定法，酶免疫测定法，荧光免疫测定法，自旋免疫测定法，流通式免疫测定法(flow-throughimmunoassay)，免疫色谱测定法。

在本发明中，从简便性，安全性，灵敏度方面考虑，优选的采用的是利用酶作为标记物质的酶免疫测定法。作为用于酶标记的标记物质，可以举出，例如微过氧化物酶，胰凝乳蛋白酶原，羧肽酶原，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，淀粉酶，磷酸化酶，脱氧核糖核酸酶，以及肽核酸酶等酶。另外，利用这些标记物质的标记方法，可以根据公知的方法进行。(“单克隆抗体”岩崎辰夫等著，讲谈社サィエティフィク，1984；(酶免疫测定法)第二版，石川荣治等著，医学书院，1982年等)。

另外，以抗原物质(CD结合性肽或者含其氨基酸序列的分支状多抗原性肽)为指标检测目标抗体的时候，优选的是利用标记的肽作为抗原物质。这里抗原物质的标记，与上述的抗人IgG抗体的标记一样，也可以根据常规方法利用任意的标记物质进行。

另外，在上述的测定方法中采用固相法时，为了捕捉目标抗体，优选预先将抗原物质或者抗人IgG抗体固定化在载体(固相)上后使用。这里的载体，只要是不溶性惰性载体均可以，可以广泛使用通常使用的那些，例如玻璃，纤维素粉末，Sephadex(交联葡萄糖凝胶)，Sepharose(琼脂糖)，聚苯乙烯，滤纸，羧甲基纤维素，离子交换树脂，葡聚糖，塑料膜，塑料管，尼龙，玻璃珠，丝，多胺-甲基乙烯基醚-马来酸共聚物，氨基酸共聚物，乙烯-马来酸共聚物等各种原材料制成的棒，珠，微板，试管等。

对于将抗原物质或者抗人IgG抗体固定在固相上的固定化方法也没有特别的限定，物理结合和化学结合均可。具体的，例如，作为共价键法的叠氮化物法，肽法(酰胺衍生物法，羧基氯化物树脂法，碳化二亚胺树脂法，马来酸酐衍生物法，异氰酸酯衍生物法，溴化氰活化的多糖法，纤维素碳酸酯衍生物法，使用缩合试剂的方法等)、烷基化法，利用交联剂的载体结合法(可以使用例如戊二醛，六亚甲基异氰酸酯等作为交联剂)，利用Ugi反应的载体结合法等的化学反应；或者利用如离子交换树脂的载体的离子结合法；利用玻璃珠等的多孔玻璃作为载体的物理吸附法等。

作为上述的测定方法中使用的溶剂，可以使用那些不会对反应造成不良影响的一般使用的任一种溶剂。具体的如柠檬酸缓冲液，磷酸缓冲液，Tris-HCl缓冲液，醋酸缓冲液等pH值大约为5～9的缓冲液。

对于免疫反应(抗原-抗体反应)的条件并没有特别的限定，一般采用该种测定方法通常所用的条件。一般在45℃以下，优选约4～40℃温度的条件下，反应进行1～40个小时左右。

对于由抗原-抗体反应生成的抗原-抗体复合物的测定，可以根据与欲使用的标记物质的种类对应的惯用方法进行。

另外，使用酶作为标记物质时，可以通过测定该酶活性的方法进行。对于酶活性的测定，可以根据与所使用的酶种类对应的公知的方法进行。例如使用过氧化物酶作为标记酶时，使用ABTS[2，2-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)]作为酶底物，或使用碱性硫酸酶时，可以使用对硝基苯基磷酸酯作为酶底物，各自培养之后，利用分光光度计等来测定各酶底物的分解的方法等(参见“酶免疫测定法”第二版，石川荣治等著，医学书院，1982年等)。另外，代替上述的酶标记，利用放射性同位素或荧光物质作为标记物的时候，可以根据公知的方法进行测定。

【实施例】

以下结合实施例对本发明进行进一步详细的说明。但是本发明并不仅仅限于这些实施例。

实施例1 克罗恩氏病抗体结合性肽的筛选以及鉴定

(1)噬菌体呈现文库的制备

在Franco的报告(Franco Felici等，J.Mol.Biol.，222，301-310(1991))中加入一些更改，作成噬菌体呈现文库(1.0×10E8克隆)。该噬菌体呈现文库，具体的为含有通过基因工程学方法***了NNK(N表示A，C，G，T任何一个，K表示G或者T。)9次重复的序列的DNA的丝状噬菌体，另外，在主要衣壳蛋白pVIII基因的N末端部分中***了编码由9个随机氨基酸残基组成的肽，以使得在噬菌体衣壳表面上可以表达具有9个随机残基的氨基酸序列的肽。

(2)克罗恩氏病抗体结合性肽(CD结合性肽)的选择

(i)血清抗体的固定化

利用血清抗体作为抗体。使用克罗恩氏病患者的20个血清试样，以及作为对照血清试样的溃疡性结肠炎患者的20个血清试样和健康人的20个血清试样。

如下所述将血清中的抗体(IgG)固定在磁珠上。首先在磁珠(Dynabeads M-450对甲苯磺酰活化)上加入利用0.1M硼酸缓冲液制备的浓度200μg/ml的抗人IgG(Fc)特异抗体(Biodesign)，在4℃下反应一夜。反应后，利用含有0.1％的牛血清白蛋白(BSA)的(D)-PBS(Dulbecco磷酸缓冲液)洗净该磁珠，然后利用含有0.1％BSA的0.2M三(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)(Tris-HCl)进行封阻，得到抗人IgG(Fc)特异抗体固相化的磁珠。

接着，在此抗人IgG(Fc)的特异抗体固相化的磁珠上，分别添加从克罗恩氏病患者的20个血清试样中随机选出的3例血清库2种(CDG1以及CDG2)，以及从健康人的20个血清试样随机选出的5例血清库，反应一夜之后，制作了在表面上通过抗人IgG(Fc)特异抗体固定了各血清IgG(健康人的血清IgG或者克罗恩氏病患者的血清IgG)的磁珠。

(ii)CD结合性肽呈现噬菌体的筛选(生物淘洗)

在固定了健康人血清IgG的磁珠上，加入约1×10¹¹的噬菌体呈现文库(phage display library)(M13噬菌体的pVIII区域中呈现9个随机氨基酸的噬菌体文库)并在4℃下反应一夜，接着，将没有结合的噬菌体加入到将克罗恩氏病患者的血清IgG固定化的磁珠上并在4℃下反应一个晚上。反应之后，利用含0.1％BSA的(D)-PBS洗净磁珠，然后利用洗脱缓冲液(用甘氨酸将pH调整到2.2的含有1mg/ml的BSA的0.1M盐酸)，洗脱出在磁珠上结合的噬菌体。利用1M的Tris中和洗脱得到的噬菌体，中和之后的噬菌体用大肠菌JM109感染，然后将其涂布在含有150μg/ml的氨比西林，1％葡萄糖的LB琼脂培养基上，在37℃下培养一夜。培养之后，将增殖的培养基上的大肠菌全部刮取并使其感染辅助噬菌体(M13KO7)，加入IPTG(异丙基-β-D(-)-硫代吡喃半乳糖苷)以及卡那霉素之后，在37℃下震荡培养一晚上。离心分离培养液除去不溶物，在其中加入含有聚乙二醇的氯化钠溶液，搅拌几次之后，再次离心分离回收小球，利用含有0.02％叠氮化钠的(D)-PBS溶解，得到浓缩噬菌体溶液。

利用如此得到的噬菌体溶液，进一步如上所述反复进行两次生物淘洗(biopanning)。用大肠菌JM109感染该经过三次生物淘洗得到的噬菌体溶液，然后将其涂布在含有150μg/ml氨比西林、1％葡萄糖的LB琼脂培养基上，在37℃下培养一晚上。然后将在培养基上形成的单菌落的大肠菌全部刮取，然后在含有150μg/ml氨比西林的LB液体培养基中在37℃下震荡培养3个小时，之后使其感染辅助噬菌体(M13KO7)，加入IPTG以及卡那霉素之后，在37℃下震荡培养一晚上。

这样，得到了单克隆的CD结合性肽呈现噬菌体。

(iii)噬菌体ELISA

对于上述的单克隆的CD结合性肽呈现噬菌体，利用上述的生物淘洗中使用的健康人血清库以及克罗恩氏病患者的血清库(参照(i))进行噬菌体ELISA。

在ELISA中，首先将抗噬菌体抗体(Pharmacia)在96孔微量滴定板(96孔板)上固定化。具体的，将100μl的利用(D)-PBS制备得到的浓度1μg/ml的抗噬菌体抗体(Pharmacia)溶液加入到板上的各孔中，在4℃下静置一个晚上，洗净后加入300μl的封阻剂(含有1％BSA、5％山梨糖醇的(D)-PBS)在4℃下静置一个晚上。

一次反应是通过在90μl的噬菌体ELISA缓冲液(含有1％BSA、0.05％的Tween20、10％正常山羊血清的(D)-PBS)中加入上述(ii)制备的噬菌体培养液，然后添加到将上述的抗噬菌体抗体固定化的各孔中，之后在37℃下反应一个小时来进行的。在一次反应结束之后，洗4次，进行二次反应。二次反应是通过将1μl血清(健康人血清或者克罗恩氏病患者的血清)加入到100μl的噬菌体ELISA缓冲液中，加入到各孔中之后，在37℃下反应一个小时来进行的。接着在二次反应结束之后，洗4次，进行三次反应。三次反应是通过在各孔中加入100μl的利用噬菌体ELISA缓冲液稀释40000倍得到的稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗人IgG(Fc)特异抗体(20ng/ml)后，在37℃下反应一个小时来进行的。三次反应结束之后，洗净，进行显色反应。显色是通过加入TMB(3，3’，5，5’-四甲基联苯胺)溶液，并在室温下反应10分钟之后，通过加入停止液(1N硫酸)停止反应。使反应停止后的板利用板读数器(plate-reader)测定其吸光度(OD450nm)，调查了与血清抗体的反应性。

如此，选择不与健康人的血清抗体不反应而只与克罗恩氏病患者的血清抗体表现出反应性的噬菌体克隆体。接着对于选定的噬菌体克隆体，利用上述的同样的方法对克罗恩氏病患者的20个血清试样，溃疡性结肠炎患者的20个血清试样以及健康人的20个血清试样分别进行ELISA，根据反应性选择了与克罗恩氏病患者的血清具有高特异性的5个克隆体(CD-1，CD-2，CD-3，CD-4，CD-5)。此选出的5个克隆体对各血清试样(克罗恩氏病患者血清，溃疡性结肠炎患者血清以及健康人的血清)的反应性如图1所示。

(3)CD结合性肽的氨基酸序列的确定

确定利用上述的各噬菌体ELISA选出的5个克隆体(CD-1，CD-2，CD-3，CD-4，CD-5)的氨基酸序列。首先，从上述选出的噬菌体克隆体中抽出DNA。具体的，使噬菌体克隆体感染大肠菌JM109，涂布在含有氨比西林的LB琼脂培养基上，经过一晚上的培养，刮取在培养基上形成的菌落，在含有2ml氨比西林的LB琼脂培养基上经过一晚上的震荡培养，利用キァプレップDNA抽出试剂盒(キァゲン)抽出质粒DNA。

噬菌体DNA的碱基序列的确定是通过双脱氧(dideoxy)法(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463-5467(1977))，ァマシャ公司的Cycle Sequencing Kit(Amersham pharmacia biotech，code；2438)，根据试剂盒的使用说明书实施的。DNA序列可以利用ファルマシァ公司制的DNA序列分析仪(ALF DNA序列分析仪)进行测定。

由得到的碱基序列决定的各克隆体(CD-1，CD-2，CD-3，CD-4，CD-5)的氨基酸序列用文字表述如表5所示。

表5

克隆体No. 氨基酸序列 SEQ ID NO：

CD-1 AEGEL GLLAQQMDY ADPA 6

：..：：

CD-2 AEGEL RLVGQQVMQ GDPA 9

CD-3 AEGEL YRWLPPSSA GDPA 15

CD-4 AEGEL RQSDGQYQM GDPA 20

CD-5 AEGEL GGIYQDLVS GDPA 33

另外在表中，位于各肽的N末端以及C末端区域的各AEGEL以及ADPA或者GDPA，来源于位于噬菌体载体的随机肽的两端的氨基酸序列。

除了-5克隆体外，对于CD-1，CD-2，CD-3和CD-4克隆体，以分支状多抗原性肽(MAP肽)的形式合成含有上述的噬菌体载体由来的氨基酸序列的18残基氨基酸，并用于下面的实验中。具体的，利用市售的Fmoc8-Lys4-Lys-2-βAla-Alko(渡边化学工业公司制)，通过ATC-357肽合成器(Advanced ChemTech制)合成具有下述的氨基酸序列的肽。

CDP-1：AEGELGLLAQQMDYADPA(SEQ ID NO：6)

CDP-2：AEGELYRWLPPSSAGDPA(SEQ ID NO：15)

CDP-3：AEGELRQSDGQYQMGDPA(SEQ ID NO：20)

CDP-4：AEGELGGIYQDLVSGDPA(SEQ ID NO：33)

通过该合成法，各分支状多抗原性肽(MAP肽)在一分子中以分支状含有8个CD结合性肽的氨基酸序列(图2)。

实施例2 CD结合性肽对血清抗体的反应性

(1)每个分支状多抗原性肽(MAP肽)作为抗原的ELISA

利用在实施例1中得到的各MAP肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，以及CDP-4的MAP肽：参照图3)作为抗原肽使用，利用ELISA调查了对各血清试样(克罗恩氏病患者血清，溃疡性结肠炎患者血清以及健康人的血清)的反应性。

首先，将各MAP肽在96孔微量滴定板上固定化。具体的，利用碳酸氢盐缓冲液(50mM，pH9.6)将各MAP肽制备成浓度1μg/ml的MAP溶液，然后在板的每个孔中加入100μl，在4℃下放置一个晚上，之后洗净，加入300μl的酪蛋白溶液(含有0.1％酪蛋白以及1％TritonX-100的(D)-PBS)，再次在4℃下放置一个晚上。

(i)使用将各MAP肽固定化的MAP板，通过ELISA来确认克罗恩氏病患者的20个血清试样，溃疡性结肠炎患者的20个血清试样以及健康人的48个血清试样的对于各MAP肽的反应性。

具体的，首先进行一次反应，将含有100μl的酪蛋白溶液和1μl血清抗体的混合物加入到MAP板的各孔中，在37℃下反应一个小时。一次反应结束之后，洗4次，在该孔中加入利用酪蛋白溶液稀释20000倍的稀释的HRP标记的抗人IgG(Fc)特异抗体，在37℃下反应一个小时。二次反应结束之后，洗4次进行显色反应。为进行检测，加入100μl的TMB溶液，在室温下反应10分钟之后，加入100μl的TMB停止液(1N硫酸)停止反应，利用板读数器(plate reader)测定OD450nm的吸光度，从而调查了各血清对于各MAP板的反应性。结果如图3所示。如图3所示，对于四种MAP肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，以及CDP-4的MAP肽)，任何一种与溃疡性结肠炎患者或者健康人的血清几乎不反应，与克罗恩氏病患者的血清显示20％-40％比例的反应性。另外从图3可以看出，各MAP肽对于克罗恩氏病患者血清的反应性在不同种类的MAP肽之间有所不同，没有发现什么一致性。这些发现暗示这四种肽是在与克罗恩氏病患者特异反应性方面不同种类的肽。

(ii)接着使用大量血清试样(克罗恩氏病患者96个血清试样，溃疡性结肠炎患者20个血清试样以及健康人的48个血清试样)，通过如(i)相同的方法调查上述的各MAP肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，以及CDP-4的MAP肽)的反应性，评价该肽对于克罗恩氏病患者血清的特异性。结果如表6所示。

表6

MAP肽	阳性率	假阳性率
	阳性率	假阳性率		克罗恩氏病患者	克罗恩氏病患者	健康人
	CDP-1CDP-2CDP-3CDP-4	31.3％(30/96)27.1％(26/96)51.0％(49/96)31.3％(30/96)	0％(0/20)5％(1/20)0％(0/20)5％(1/20)	克罗恩氏病患者	克罗恩氏病患者	健康人	4.2％(2/48)2.1％(1/48)0％(0/48)4.2％(2/48)

如表6所示，当以健康人的48个血清试样的平均OD值+5SD作为截止值(cutoff value)的时候，对克罗恩氏病患者的96个血清试样的阳性率是：CDP-1肽为31.3％，CDP-2肽为27.1％，CDP-3肽为51.0％，CDP-4肽为31.3％。另外，对健康人以及溃疡性结肠炎患者的血清的假阳性率每一种肽均在5％以下。由此，这些肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，以及CDP-4肽)与克罗恩氏病患者所特有的抗体(克罗恩氏病抗体)特异结合，利用这一点，可以高精度地检测有无患克罗恩氏病。

(2)以混和MAP肽作为抗原的ELISA

将实施例1中所制备的MAP肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，以及CDP-4的MAP肽)混和，得到混和MAP肽，将此作为抗原使用，通过ELISA调查了对于多种血清试样(克罗恩氏病患者血清，溃疡性结肠炎患者血清，十二指肠溃疡患者血清，胃溃疡患者血清以及健康人血清)的反应性。

另外，用于检测的抗原板，是通过将CDP-1的MAP肽以及CDP-4的MAP肽各自制备为1.5μg/ml，CDP-2MAP肽以及CDP-3的MAP肽各自制备为3μg/ml后，将它们等量混和得到的混合物与(1)中所述的MAP板的制备同样地在96孔微量滴定板上固定化而提供的。

(i)使用此混和抗原板，通过ELISA测定克罗恩氏病患者的550个血清试样，溃疡性结肠炎患者的20个血清试样，健康人的120个血清试样，十二指肠溃疡患者的25个血清试样以及胃溃疡患者的15个血清试样对于混和MAP肽的反应性。另外，除了使用用酪蛋白溶液(含有0.1％酪蛋白以及1％TritonX-100的(D)-PBS)稀释10000倍得到的溶液作为在二次反应中使用的HRP标记的抗人IgG(Fc)特异抗体以外，与上述的(1)(i)中所述的方法同样地进行了ELISA。结果如图4以及表7所示。

表7

截止值

健康人平均值+5SD 健康人平均值+3SD

阳性率克罗恩氏病患者 61.3％(337/550) 67.1％(369/550)

假阳性率溃疡性结肠炎患者 5.0％(1/20) 5.0％(1/20)

健康人 0.8％(1/120) 1.7％(2/120)

十二指肠溃疡患者 0％(0/25) 0％(0/25)

胃溃疡患者 0％(0/15) 0％(0/15)

如图4以及表7所示，对于以健康人的120个血清试样的平均单位值+3SD作为截止值的时候，对克罗恩氏病血清的阳性率为67.1％(369/550)，对于假阳性率而言，溃疡性结肠炎患者的血清为5％(1/20)，健康人血清为1.7％(2/120)，十二指肠溃疡患者血清以及胃溃疡患者血清为0％(0/25，0/15)。

此结果与(1)的结果进行比较，与各克罗恩氏病抗体结合性肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，以及CDP-4肽)单独使用相比，将它们进行组合使用的时候可以提高其对克罗恩氏病特有抗体的特异性，由此可以高精度诊断有无患克罗恩氏病。

(3)以混和MAP肽与面包酵母作为抗原的ELISA的比较

与(2)一样，将实施例1中制备的MAP肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，以及CDP-4的MAP肽)混和后作为抗原使用，通过ELISA调查了其对于各血清试样(克罗恩氏病患者血清，溃疡性结肠炎患者血清，以及健康人血清)的反应性。另外对于被指出与克罗恩氏病有关联的面包酵母( saccharomyces cerevisiae)(Gut 1998，42，788-791页，Gastroenterology 1999，116，1001-1003页，Am J Gastroenterol 2001，96，730-734页)也同样，调查了其对于上述血清的反应性，比较两者对于克罗恩氏病诊断的有用性。另外用作抗原板的MAP板是通过将CDP-1的MAP肽以及CDP-4的MAP肽各自制备为1.5μg/ml，CDP-2MAP肽以及CDP-3的MAP肽各自制备为3μg/ml后将它们等量混和，将得到的混合物与(1)中所述的MAP板的制备一样在96孔微量滴定板上固定化而制备的。另外对于面包酵母的反应性可以使用市售的测定仪Anti-saccharomyces cerevisiae antibodies检测试剂盒(ASCA IgG检测试剂盒以及ASCA IgA检测试剂盒、使用的抗原：面包酵母细胞膜的葡甘露聚糖，Medizyme制)进行测定。

(i)用混和MAP板，通过ELISA确认96例克罗恩氏病患者血清，20例溃疡性结肠炎患者血清，以及48例健康人血清对于混和MAP的反应性。另外，同上述(2)(i)所述的方法同样地进行ELISA。

(ii)另外，对面包酵母的反应性根据测定试剂盒的说明书进行。结果如图5所示。在如图5A所示使用混和MAP肽作为抗原的ELISA中，使用健康人的48个血清试样的平均单位值+3SD作为截止值，以及在如图5B以及图5C所示使用ASCA IgG以及ASCA IgA的测定试剂盒作为抗原的ELISA中，根据操作说明书以bindingindex(结合指数)＝1.0作为截止值，算出了阳性率以及假阳性率。阳性率以及假阳性率的结果如表8所示。

表8

抗原阳性率假阳性率

克罗恩氏病患者溃疡性结肠炎患者健康人

混和MAP 66.7％(64/96) 5.0％(1/20) 2.1％(1/48)

ASCA IgG 30.2％(29/96) 10.0％(2/20) 10.4％(5/48)

ASCA IgA 13.5％(13/96) 5.0％(1/20) 0％(0/48)

从这些结果可知，与被指出作为克罗恩氏病抗体的识别抗原的面包酵母相比，通过将各MAP肽组合起来作为混和MAP肽使用，可以更特异地识别克罗恩氏病抗体，从而得到具有很高精度检测有无克罗恩氏病的方法。

实施例3 解析CD结合性肽的同源性

对于得到的MAP肽(CDP-1，CDP-2，CDP-3，以及CDP-4的MAP肽)，利用DNA SIS软件(日立制作所)分析其与已报告与克罗恩氏病有关联的蛋白质[CDX(measles related antigen)<Gut 2000 Feb；46(2)：163-9>、porcine pancreatic alpha amylase<Annual report of the researchcommittee of inflammatory bowel disease.Japan：The misistry of healthand welfare of Japan，1999：98-100>、M.paratuberculosis HSP65(horseradish peroxidase 65)<Clin Diagn Lab Immunol.1995Nov；2(6)：657-64>、human HSP60<Digestion.1997；58(5)：469-75>、M.paratuberculosis p36<Curr Microbiol.1999 Aug；39(2)：115-9>]的氨基酸序列的同源性。结果如图6所示。从此结果可以知道，在各种的蛋白质中，虽然可以辨认出较弱的同源性，但是却不能辨认出更高的同源性。

接着，对于这些氨基酸序列，利用FASTA程序(Genome Net site使用的)，通过蛋白质数据库检索与克罗恩氏病抗体结合性肽在氨基酸序列中有同源性的蛋白质。此检索只取出Z-score在130以上的同源性较高的蛋白质。结果如图7所示，从图7中可以知道，关于CD1肽，CD3肽以及CD4肽，不仅与已经报告指出与克罗恩氏病有关联的yeast或mycobacterium的蛋白质，而且与迄今未发现与克罗恩氏病有关联的病原性微生物或食物(Zea myze等)的蛋白质等、细菌、动物以及植物等的多种蛋白质均发现有同源性。

实施例4

从实施例1中利用噬菌体ELISA得到的对于各种血清的反应性(图1)以及氨基酸序列的类似性(表2)可以看出，具有CD-1以及CD-5克隆体的氨基酸序列的各种肽(CDP-1肽(SEQ ID NO：6)、以及CDP-5肽(SEQ ID NO：9))可以识别同一抗体。另外该CDP-1肽与CDP-5肽与位于人液泡型H⁺转运性ATP酶(V-ATP酶)的亚基E的199-212区域的肽(VATE-201肽：SEQ ID NO：11)的氨基酸序列有同源性。(图8)

因此，通过与上述实施例1(3)中所述的同样的方法以MAP肽(Multiple antigen peptide)的形式合成了下述的肽(CDP-1a肽，CDP-5a肽，以及VATE-201肽)(图9)。根据实施例2(1)的方法，通过ELISA测定各MAP肽对于各血清试样(克罗恩氏病患者血清，溃疡性结肠炎患者血清以及健康人血清)的反应性。

CDP-1a：AEGELGLLAQQMDYADP (SEQ ID NO：5)

CDP-5a：AEGELRLVGQQVMQGDP (SEQ ID NO：8)

VATE-210： RLDLIAQQMMPEVR (SEQ ID NO：11)

使用克罗恩氏病患者的20个血清试样作为血清试样，以及使用溃疡性结肠炎患者的20个血清试样以及健康人的20个血清试样作为比较血清试样。结果如图10所示，从图10中可以看出，CDP-1a肽，CDP-5a肽，以及VATE-201肽相互之间表现出同样的ELISA反应性。

实施例5 使用VATE-201肽对抗原-抗体反应的抑制试验

为了确认在实施例4中得到的VATE-201的反应性，利用VATE-201肽进行CDP-1a肽与克罗恩氏病抗体之间的抗原-抗体反应的抑制试验。作为血清抗体试样，使用对各MAP肽(CDP-1a肽、CDP-5a肽，VATE-201肽)上显示强反应性的克罗恩氏病患者的第8号，9号，以及14号血清(参照图11)。

具体的，作为抗原板，使用将CDP-1a的MAP肽(图10)在板上固定化得到的MAP板(参照实施例2(1))，在100μl含有浓度为100μg/ml的VATE-201的MAP肽(反应抑制物质)的酪蛋白溶液中加入1μl的各血清抗体，在37℃下反应一个小时，与实施例2(1)同样地进行ELISA。另一方面，作为比较实验，利用CDP-1a的MAP肽代替VATE-201的MAP肽作为上述反应抑制物质，同样地进行ELISA。结果如图11所示。

如图11B所示，通过在反应体系中添加VATE-201的MAP肽，将各克罗恩氏病患者血清(8号，9号，14号)与CDP-1a的MAP板的反应性全部抑制。另外，利用CDP-1a的MAP肽代替VATE-201的MAP肽同样进行ELISA时，也可以得到同样的结果(结果未示出)。

以上从实施例4以及5的结果可以看出，无论对于VATE-201肽，以及CDP-1a肽或者CDP-5a肽，都可以识别在克罗恩氏病患者的血清中特异存在的抗体。另外从与VATE-201肽的氨基酸序列的类似性以及与血清抗体的反应性的共同性来看，以CDP-1a肽以及CDP-5a肽为主的本发明CD1肽及其等效物，可以认为模拟人液泡型H⁺转运性ATP酶(V-ATP酶)的亚基E。

即，上述实施例的结果表明，在克罗恩氏病患者中特异存在着对于人液泡型H⁺转运性ATP酶亚基E的抗体。认为通过以识别人液泡型H⁺转运性ATP酶，尤其是可以识别其亚基E的抗体为指标，可以诊断每个受验者有无患克罗恩氏病。

实施例6 CD3肽及其等效物的模拟蛋白质的探索、及其评价

从实施例5的结果可以看出，CD1肽及其等效物模拟的人液泡型H⁺转运性ATP酶(V-ATP酶)的亚基E。因此同样可以探索CD3肽及其等效物的模拟蛋白质，并评价其与克罗恩氏病抗体的反应性。

(1)MAP肽的制备

作为CDP3肽的修饰物，通过用丙氨酸取代CDP3肽(SEQ IDNO：21)的氨基酸序列中各1个氨基酸残基制备了14种肽(表9)。另外，对于CDP3-1，由于第一个氨基酸为丙氨酸，利用丝氨酸进行取代。接着，使用这15种肽，根据实施例1(3)的方法，制备成每一分子有8个肽的MAP肽(1个氨基酸取代的MAP肽)。

(2)CDP3抗原决定基序列的确定

对于CDP肽的氨基酸序列，为了确定与克罗恩氏病抗体的特异反应性所需要的序列，利用上述制备得到的1氨基酸取代的MAP肽作为反应抑制物质，进行下面的反应抑制试验。使用在实施例2中的与CDP-3肽表现出强反应性的克罗恩氏病患者的2号、7号以及8号血清作为反应血清抗体试样(参照图3)。

具体的，使用将CDP3的MAP肽在板上固定化的MAP板作为抗原板(参照实施例2(1))通过3段反应进行。一次反应是通过将克罗恩氏病患者血清，利用含浓度为100μg/ml的1氨基酸取代的MAP的试样稀释液(含0.5M食盐，1.5％酪蛋白，2％正常山羊血清，0.2％Tween的0.1M Tris缓冲液)稀释100倍之后，在25℃下反应一个小时进行的。二次反应是通过将100μl的一次反应液加入到MAP板的孔中之后，在25℃下反应一个小时，然后洗净3次进行的。三次反应是通过加入100μl的利用酶标记的抗体稀释溶液(含有0.14M食盐，0.5％BSA，5％正常山羊血清，0.05％Tween20的Tris缓冲液)稀释至5000倍的HRP标记的抗人IgG(Fc)特异抗体，在25℃下反应一个小时后，洗3次进行的。根据实施例2(1)进行检测，测定利用1氨基酸取代的MAP肽的反应抑制活性。结果如表9所示。

表9

1氨基酸取代的MAP 患者血清试样

名称氨基酸序列 2 7 8

CDP3 AEGEL RQSDGQYQM +++ +++ +++

CDP3-1 SEGEL RQSDGQYQM +++ +++ +++

CDP3-2 AAGEL RQSDGQYQM +++ +++ +++

CDP3-3 AEAEL RQSDGQYQM +++ +++ +++

CDP3-4 AEGAL RQSDGQYQM +++ +++ +++

CDP3-5 AEGEA RQSDGQYQM +++ +++ +++

CDP3-6 AEGEL AQSDGQYQM +++ +++ +++

CDP3-7 AEGEL RASDGQYQM - - -

CDP3-8 AEGEL RQADGQYQM +++ +++ +++

CDP3-9 AEGEL RQSAGQYQM - + -

CDP3-10 AEGEL RQSDAQYQM + +++ +++

CDP3-11 AEGEL RQSDGAYQM - + -

CDP3-12 AEGEL RQSDGQAQM +++ +++ +++

CDP3-13 AEGEL RQSDGQYAM + +++ ++

CDP3-14 AEGEL RQSDGQYQA +++ +++ +++

+++：反应抑制活性为70％以上

++：反应抑制活性在50％～70％之间

+：反应抑制活性在30％～50％之间

-：反应抑制活性为30％以下

结果，对于克罗恩氏病患者的2号血清，在使用CDP3-7，CDP3-9，CDP3-10，CDP3-11以及CDP3-13的各MAP肽作为反应抑制物质的时候，对于克罗恩氏病患者血清与CDP3肽之间的反应的抑制活性在50％以下。另外，对于克罗恩氏病患者的7号和8号血清，使用CDP3-7，CDP3-9，CDP3-10，以及CDP3-11的各MAP肽作为反应抑制物质的时候，对于克罗恩氏病患者血清与CDP3肽之间的反应的抑制活性在50％以下。由以上的结果可以判断在CDP3的氨基酸序列中与克罗恩氏病抗体进行反应(抗体识别)所需要的序列为QXDGQXQ(X为相同或者不同的任意的氨基酸残基)(SEQ ID NO：51)。

(3)CDP3肽模拟蛋白质的探索

如上述，利用考虑对克罗恩氏病抗体的识别重要的氨基酸序列(QXDGQXQ(X为相同或者不同的任意的氨基酸残基))分析其与蛋白质数据库的同源性。结果，确认其与人细胞核内蛋白质(Homo sapienskruppel-like zinc finger protein 300(HZF300))的129-135位的氨基酸区域具有同源性(图12)。

因此，为了确认人细胞核内蛋白质(HZF300)为CDP3肽的模拟蛋白质，以MAP肽的形式制备具有其126-138位氨基酸区域的氨基酸序列的肽(Z300肽)，之后利用克罗恩氏病患者20例血清，溃疡性结肠炎患者20例血清，以及健康人20例血清进行MAP抗原ELISA。

(4)MAP抗原ELISA

首先，利用试样稀释液将人血清稀释101倍，然后将其100μl添加到MAP板的孔中，之后根据实施例6(2)的两次反应以后的操作进行测定，调查了MAP肽与各种血清抗体之间的反应性。结果如图13所示，结果表明与CDP3肽显现强反应性的克罗恩氏病患者的2，7以及8号血清也表现出了对Z300肽同样的反应性。另一方面，对于溃疡性结肠炎患者以及健康人血清，Z300肽并没有表现出明确的反应性。

(5)抗原-抗体反应的抑制试验

为了确认Z300肽对克罗恩氏病抗体的反应性，利用Z300肽进行抑制CDP3肽与克罗恩氏病抗体之间的反应的试验。使用与CDP3肽具有强反应性的克罗恩氏病患者的2号，7以及8号血清作为血清抗体试样。

具体的，使用将CDP3的MAP肽在板上固定化的MAP板作为抗原板(参照实施例2(1))，在100μl的包含浓度为100μg/ml的Z300的MAP肽(反应抑制物质)的试样稀释溶液(如上述)中加入1μl的血清抗体，在25℃下反应一个小时得到溶液。将全部溶液加入到MAP板上，利用如实施例6(2)相同的方法进行ELISA。另一方面，作为比较实验，利用CDP3的MAP肽代替Z300的MAP肽作为所述的反应抑制物质进行同样的ELISA操作。结果如图14所示。

如图14的B所示，通过在反应体系中加入Z300的MAP肽，全部破坏了克罗恩氏病患者的各血清试样(2号，7号，8号)与CDP3的MAP肽的反应性。

从上述的结果看出，Z300肽以及CDP3肽均可以识别在克罗恩氏病患者的血清中特异存在的抗体。另外从与Z300肽之间的氨基酸序列的类似性以及与血清抗体的反应性的共同性来看，本发明的CD3肽及其等效物，可以认为是人细胞核内蛋白质(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)的模拟物。

即，上述实施例的结果说明，在克罗恩氏病患者中特异存在对人细胞核内蛋白质(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)的抗体。由此，通过以识别人细胞核内蛋白质(Zinc finger protein 300)的抗体为指标，可以诊断每个受验者是否患有克罗恩氏病。

实施例7 CD4肽及其等效物的模拟蛋白质的探索及其评价

接着探索CD4肽及其等效物的模拟蛋白质，并评价其与克罗恩氏病抗体的反应性。

(1)MAP肽的制备

作为CDP4肽的修饰物，制备了CDP4肽(SEQ ID NO：33)的氨基酸序列各有1个氨基酸残基被丙氨酸取代得到的15种肽(表10)。另外在CDP4-1中为了使第一个氨基酸为丙氨酸，用丝氨酸进行取代。接着，使用该14种肽，根据实施例1(3)的方法，制备了每个分子有8个肽的MAP肽(1氨基酸取代的MAP肽)。

(2)CDP4抗原决定基序列的确定

关于CDP肽的氨基酸序列，为了确定与克罗恩氏病抗体具有特异反应性所必要的序列，利用上述制备得到的1氨基酸取代的MAP肽作为反应抑制物质，与实施例6(2)一样进行反应抑制试验。使用在实施例2中对CDP-4肽表现出强反应性的克罗恩氏病患者的3号、6号、15号、17号以及20号血清(参照图3)作为反应血清试样。结果如表10所示。

表10

1氨基酸取代的MAP 患者血清试样

名称氨基酸序列 3 6 15 17 20

CDP4 AEGEL GGIYQDLVS +++ +++ +++ +++ +++

CDP4-1 SEGEL GGIYQDLVS +++ +++ +++ +++ +++

CDP4-2 AAGEL GGIYQDLVS +++ +++ +++ +++ +++

CDP4-3 AEAEL GGIYQDLVS +++ +++ +++ +++ +++

CDP4-4 AEGAL GGIYQDLVS +++ +++ +++ +++ +++

CDP4-5 AEGEA GGIYQDLVS +++ - + +++ ++

CDP4-6 AEGEL AGIYQDLVS ++ - - - -

CDP4-7 AEGEL GAIYQDLVS - - - - -

CDP4-8 AEGEL GGAYQDLVS - - - - -

CDP4-9 AEGEL GGIAQDLVS - - - - -

CDP4-10 AEGEL GGIYADLVS +++ +++ +++ +++ +++

CDP4-11 AEGEL GGIYQALVS +++ +++ - +++ +++

CDP4-12 AEGEL GGIYQDAVS - - - - -

CDP4-13 AEGEL GGIYQDLAS +++ +++ +++ +++ +++

CDP4-14 AEGEL GGIYQDLVA +++ +++ +++ +++ +++

+++：反应抑制活性为70％以上

++：反应抑制活性在50％～70％之间

+：反应抑制活性在30％～50％之间

-：反应抑制活性为30％以下

结果，对于克罗恩氏病患者的第3号、6号、15号、17号以及20号血清，使用CDP4-7，CDP4-8，CDP4-9，以及CDP8-12的各MAP肽作为反应抑制物质的时候，对克罗恩氏病患者血清与CDP3肽之间的反应的抑制活性在30％以下。另外，对于克罗恩氏病患者的第6号、15号、17号以及20号血清，使用CDP4-6的MAP肽作为反应抑制物质的时候，对于克罗恩氏病患者血清与CDP3肽之间的反应的抑制活性在30％以下。进一步，使用CDP4-5以及CDP4-11的各MAP肽作为反应抑制物质的时候，对于克罗恩氏病患者的6号以及15号血清，对于克罗恩氏病患者血清与CDP4肽之间的反应的抑制活性在30％以下。

由以上的结果可以判断，在CDP4的氨基酸序列中与克罗恩氏病抗体进行反应(抗体识别)所必须地序列为LGGIYXDL(X为任意的氨基酸残基)(SEQ ID NO：49)。

(3)CDP4肽模拟蛋白质的探索

根据以上发现，利用对克罗恩氏病抗体的识别重要的氨基酸序列(LGGIYXDL(X为任意的氨基酸残基))分析其与蛋白质数据库的同源性。结果，确认其与稻***反应原蛋白质具有同源性(图15)。如图15所示，稻***反应原蛋白质为α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂，形成基因组。这些相互之间具有相源同性的α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂，任何一个均具有可以与克罗恩氏病抗体进行反应(抗体识别)的氨基酸序列L(或者V)GGIYXD(或者E)L区域(SEQ ID NO：49、50)。另外L与V是类似的，其均为脂肪族氨基酸，D与E是类似的，其均为酸性氨基酸。

因此，为了确认稻***反应原蛋白质为CDP4蛋白质的模拟蛋白质，以MAP肽的形式制备含有Rice seed allergen RA14(图16)的99-111号的氨基酸区域的氨基酸序列的肽(TO3965肽)，之后利用克罗恩氏病患者20例血清，溃疡性结肠炎患者20例血清，以及健康人20例血清进行MAP抗原ELISA。

(4)MAP抗原ELISA

除了利用将TO365的MAP肽固定化而制备成的MAP抗原板作为抗原板之外，利用如实施例6(4)同样的方法进行MAP抗原ELISA。结果如图17所示，结果表明与CDP4肽具有强反应性的克罗恩氏病患者的第3，6，15，17以及20号血清，对TO3965肽也表现出了同样的反应性。另一方面，与CDP4肽一样，TO3965肽对于溃疡性结肠炎患者以及健康人血清，并没有表现出明确的反应性。

(5)抗原-抗体反应的破坏试验

为了确认TO3965肽与克罗恩氏病抗体之间的反应性，与实施例6(5)一样，利用TO3965进行CDP4肽与克罗恩氏病抗体之间的抗原-抗体反应的抑制试验。作为血清抗体试样，使用与CDP4肽具有强反应性的克罗恩氏病患者的第3，6，15，17以及20号血清。结果如图18所示。

如图18所示，通过在反应***中添加TO3965的MPA肽，全部抑制了各克罗恩氏病患者的各血清抗体(3，6，15，17以及20号血清)对于CDP4的MAP肽的反应性。

从上述的结果可以看出，TO3965肽以及CDP4肽均可以识别在克罗恩氏病患者血清中特异存在的抗体。另外从与TO3965肽的氨基酸序列的类似性以及与血清抗体的反应性的共同性来看，本发明的CD4肽及其等效物，可以认为是稻***反应原蛋白质(α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂基因组)的模拟物。

即，上述实施例的结果说明，在克罗恩氏病患者中特异存在对稻***反应原蛋白质(α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂)的抗体。由此，通过以识别稻***反应原蛋白质(α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂)的基因组的抗体为指标，可以诊断每个受验者是否患有克罗恩氏病。

产业上利用的可能性

根据本发明，提供了与克罗恩氏病患者中特异存在的抗体特异结合的肽。本发明的肽作为克罗恩氏病检查试剂是有用的，通过该肽以及包含此肽的检查试剂，可以保证较高精度地诊断有无患克罗恩氏病。

另外，本发明提供了一种新的发现，就是在克罗恩氏病患者的体内，特异存在可以识别人液泡型H⁺转运性ATP酶，尤其是人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E的抗体，识别人细胞核内蛋白质(Homosapiens kruppel-like zinc finger protein 300)的抗体，识别稻***反应原蛋白质(α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂)的基因组的抗体。基于这些发现，本发明以其中的至少一种抗体作为指标，提供了包括检测在受验者的生物试样中该抗体的存在与否的克罗恩氏病检查方法。使用该方法，通过以生物试样(例如血清等)为对象，可以简便地而且高精度地诊断每一个受验者有无患克罗恩氏病。

序列表

<110>大塚制药株式会社(OTSUKA PHARMACEUTICAL CO.，LTD.)

<120>克罗恩氏病抗体结合性肽以及克罗恩氏病检查方法(Crohn′s disease antibody-bindingpeptide and method for detectmg Crohn′s disease)

<130>SCT033077-25

<150>JP 2001/126121

<151>2001-04-24

<150>JP2002/47384

<151>2002-02-25

<160>51

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>9

<212>PRT

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<400>1

Gly Leu Leu Ala Gln Gln Met Asp Tyr

1 5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

<400>2

Tyr Arg Trp Leu Pro Pro Ser Ser Ala

1 5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>噬菌体文库库(phage library)

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Arg Gln Ser Asp Gly Gln Tyr Gln Met

1 5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

<400>4

Gly Gly Ile Tyt Gln Asp Leu Val Ser

1 5

<210>5

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<212>PRT

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<400>5

Ala Glu Gly Glu Leu Gly Leu Leu Ala Gln Gln Met Asp Tyr Ala

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Asp Pro

17

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<400>6

Ala Glu Gly Glu Leu Gly Leu Leu Ala Gln Gln Met Asp Tyr Ala

1 5 10 15

Asp Pro Ala

18

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

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Arg Leu Val Gly Gln Gln Val Met Gln

1 5

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<211>17

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Ala Glu Gly Glu Leu Arg Leu Val Gly Gln Gln Val Met Gln Gly

1 5 10 15

Asp Pro

17

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<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

<400>9

Ala Glu Gly Glu Leu Arg Leu Val Gly Gln Gln Val Met Gln Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala

18

<210>10

<211>7

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>液泡型ATP酶亚基E(Vacuolar ATPase subunit E)

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<400>10

Leu Ile Ala Gln Gin Met Met

1 5

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<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>液泡型ATP酶亚基E(Vacuolar ATPase subunit E)

<222>199…212

<400>11

Arg Leu Asp Leu Ile Ala Gln Gln Met Met Pro Glu Val Arg

1 5 10 14

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<400>12

Arg Ala Gln Gln Val Val Glu Phe Ser

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<213>噬菌体文库(phage library)

<400>13

Ala Glu Gly Glu Leu Arg Ala Gln Gln Val Val Glu Phe Ser Gly

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Asp Pro Ala

18

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<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>液泡型ATP酶亚基E(Vacuolar ATPase subunit E)

<400>14

Met Ala Leu Ser Asp Ala Asp Val Gln Lys Gln Ile Lys His Met Met

1 5 10 15

Ala Phe Ile Glu Gln Glu Ala Asn Glu Lys Ala Glu Glu Ile Asp Ala

20 25 30

Lys Ala Glu Glu Glu Phe Asn Ile Glu Lys Gly Arg Leu Val Gln Thr

35 40 45

Gln Arg Leu Lys Ile Met Glu Tyr Tyr Glu Lys Lys Glu Lys Gln Ile

50 55 60

Glu Gln Gln Lys Lys Ile Gln Met Ser Asn Leu Met Asn Gln Ala Arg

65 70 75 80

Leu Lys Val Leu Arg Ala Arg Asp Asp Leu Ile Thr Asp Leu Leu Asn

85 90 95

Glu Ala Lys Gln Arg Leu Ser Lys Val Lys Lys Asp Thr Thr Arg Tyr

100 105 110

Gln Val Leu Leu Asp Gly Leu Val Leu Gln Gly Leu Tyr Gln Leu Leu

115 120 125

Glu Pro Arg Met Ile Val Arg Cys Arg Lys Gln Asp Phe Pro Leu Val

130 135 140

Lys Ala Ala Val Gln Lys Ala Ile Pro Met Tyr Lys Ile Ala Thr Lys

145 150 155 160

Asn Asp Val Asp Val Gln Ile Asp Gln Glu Ser Tyr Leu Pro Glu Asp

165 170 175

Ile Ala Gly Gly Val Glu Ile Tyr Asn Gly Asp Arg Lys Ile Lys Val

180 185 190

Ser Asn Thr Leu Glu Ser Arg Leu Asp Leu Ile Ala Gln Gln Met Met

195 200 205

Pro Glu Val Arg Gly Ala Leu Phe Gly Ala Asn Ala Asn Arg Lys Phe

210 215 220

Leu Asp

226

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<400>15

Ala Glu Gly Glu Leu Tyr Arg Trp Leu Pro Pro Ser Ser Ala Gly

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Asp Pro Ala

18

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<211>9

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

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Asp Arg Trp Leu Pro Glu Gly Asp Gly

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<211>18

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

<400>17

Ala Glu Gly Glu Leu Asp Arg Trp Leu Pro Glu Gly Asp Gly Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala

18

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His Glu Trp Leu Pro Leu Tyr Asp Ala

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<212>PRT

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Ala Glu Gly Glu Leu His Glu Trn Leu Pro Leu Tyr Asp Ala Gly

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Ala Glu Gly Glu Leu Arg Gln Ser Asp Gly Gln Tyr Gln Met Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala

18

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5 10

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<211>14

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<211>13

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<213>智人(Homo sapiens)

<220>kruppel样锌指蛋白300(kruppel-like zinc fmger protein 300)

<222>126…138

<400>31

Lys Val Cys Gln Gly Asp Gly Gln Leu Gln Arg Phe Leu

5 10

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<211>604

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>kruppel样锌指蛋白300(kruppel-like zinc finger protein 300)

<400>32

<400>1

Met Met Lys Ser Gln Gly Leu Val Ser Phe Lys Asp Val Ala Val Asp

1 5 10 15

Phe Thr Gln Glu Glu Trp Gln Gln Leu Asp Pro Ser Gln Arg Thr Leu

20 25 30

Tyr Arg Asp Val Met Leu Glu Asn Tyr Ser His Leu Val Ser Met Gly

35 40 45

Tyr Pro Val Ser Lys Pro Asp Val Ile Ser Lys Leu Glu Gln Gly Glu

50 55 60

Glu Pro Trp Ile Ile Lys Gly Asp Ile Ser Asn Trp Ile Tyr Pro Asp

65 70 75 80

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85 90 95

Ser Gln Ser Cys Ile Leu Gly Thr Val Ser Phe His His Lys Ile Leu

100 105 110

Lys Gly Val Thr Arg Asp Gly Ser Leu Cys Ser Ile Leu Lys Val Cys

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Gln Gly Asp Gly Gln Leu Gln Arg Phe Leu Glu Asn Gln Asp Lys Leu

130 135 140

Phe Arg Gln Val Thr Phe Val Asn Ser Lys Thr Val Thr Glu Ala Ser

145 150 155 160

Gly His Lys Tyr Asn Pro Leu Gly Lys Ile Phe Gln Glu Cys Ile Glu

165 170 175

Thr Asp Ile Ser Ile Gln Arg Phe His Lys Tyr Asp Ala Phe Lys Lys

180 185 190

Asn Leu Lys Pro Asn Ile Asp Leu Pro Ser Cys Tyr Lys Ser Asn Ser

195 200 205

Arg Lys Lys Pro Asp Gln Ser Phe Gly Gly Gly Lys Ser Ser Ser Gln

210 215 220

Ser Glu Pro Asn Ser Asn Leu Glu Lys Ile His Asn Gly Val Ile Pro

225 230 235 240

Phe Asp Asp Asn Gln Cys Gly Asn Val Phe Arg Asn Thr Gln Ser Leu

245 250 255

Ile Gln Tyr Gln Asn Val Glu Thr Lys Glu Lys Ser Cys Val Cys Val

260 265 270

Thr Cys Gly Lys Ala Phe Ala Lys Lys Ser Gln Leu Ile Val His Gln

275 280 285

Arg Ile His Thr Gly Lys Lys Pro Tyr Asp Cys Gly Ala Cys Gly Lys

290 295 300

Ala Phe Ser Glu Lys Phe His Leu Val Val His Gln Arg Thr His Thr

305 310 315 320

Gly Glu Lys Pro Tyr Asp Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Gln

325 330 335

Lys Ser Ser Leu Ile Ile His Gln Arg Val His Thr Gly Glu Lys Pro

340 345 350

Tyr Glu Cys Ser Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Gln Lys Ser Pro Leu

355 360 365

Ile Ile His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Arg

370 375 380

Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Gln Lys Ser Gln Leu Ile Ile His His

385 390 395 400

Arg Ala His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Thr Glu Cys Gly Lys

405 410 415

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420 425 430

Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Ala Gln Cys Glu Glu Ala Phe Ser Arg

435 440 445

Lys Thr Glu Leu Ile Thr His Gln Leu Val His Thr Gly Glu Lys Pro

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Tyr Glu Cys Thr Glu Cys Gly Lys Thr Phe Ser Arg Lys Ser Gln Leu

465 470 475 480

Ile Ile His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Ser

485 490 495

Glu Cys Gly Lys Ala Phe Cys Gln Lys Ser His Leu Ile Gly His Gln

500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

Gly Glu Lys Pro Tyr Ile Cys Ala Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser Gln

545 550 555 560

Lys Ser Asp Leu Aal Leu His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Arg Pro

565 570 575

Tyr Gln Cys Ala Ile Cys Gly Lys Ala Phe Ile Gln Lys Ser Gln Leu

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Thr Val His Gln Arg Ile His Thr Val Val Lys Ser

595 600

<210>33

<211>18

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

<400>33

Ala Glu Gly Glu Leu Gly Gly Ile Tyr Gln Asp Leu Val Ser Gly

1 5 10 15

Asp Pro Ala

18

<210>34

<211>14

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

<400>34

Ala Glu Gly Glu Leu Gly Gly Ile Tyr Gln Asp Leu Val Ser

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<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

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Ser Glu Gly Glu Leu Gly Gly Ile Tyr Gln Asp Leu Val Ser

5 10

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<211>14

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

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<211>14

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<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

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<211>14

<212>PRT

<213>噬菌体文库(phage library)

<400>41

Ala Glu Gly Glu Leu Gly Gly Ile Tyr Gln Asp Leu Val Ala

5 10

<210>42

<211>13

<212>PRT

<213>稻种(Rice seed)

<220>稻种***反应原RA14(Rice seed allergen RA14)

<222>99…111

<400>42

His Met Val Gly Gly Ile Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Thr

5 10

<210>43

<211>157

<212>PRT

<213>稻(Rice)

<220>稻***反应原(ice allergen)

<400>43

Met Ala Ser Asn Lys Val Val Phe Ser Val Leu Leu Leu Ala Val Val

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Ala Thr Ala Thr Met Ala Glu Tyr His His Gln Asp

20 25 30

Gln Val Val Tyr Thr Pro Gly Pro Leu Cys Gln Pro Gly Met Gly Tyr

35 40 45

Pro Met Tyr Pro Leu Arg Val Ala Gly Val Gly Glu Ala Pro Leu Leu

50 55 60

Gly Arg Ala Arg Pro Arg Arg Arg Ala Val Pro Gly Asp Cys Cys Arg

65 70 75 80

Gln Phe Pro Pro Val Asp Tyr Ser Trp Cys Arg Cys Glu Ala Ile Ser

85 90 95

His Met Leu Gly Gly Ile Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Pro Asp Val Gly

100 105 110

His Pro Met Ser Glu Val Phe Arg Gly Cys Arg Arg Gly Thr Trp Ser

115 120 125

Ala Arg Arg Arg Ala Pro Gly Val Leu Gln Val Asp Ile Pro Asn Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Val Cys Tyr Trp Leu Ala Arg Ser Gly Tyr

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<210>44

<211>157

<212>PRT

<213>稻种(Rice seed)

<220>稻种***反应原RA5(Rice seed allergen RA5)

<400>44

Met Ala Ser Asn Lys Val Val Phe Ser Val Leu Leu Leu Ala Val Val

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Ala Thr Ala Thr Met Ala Glu Tyr His His Gln Asp

20 25 30

Gln Val Val Tyr Thr Arg Ala Arg Cys Gln Pro Gly Met Gly Tyr Pro

35 40 45

Met Tyr Ser Leu Pro Arg Cys Arg Ala Leu Val Lys Arg Gln Cys Arg

50 55 60

Gly Ser Ala Ala Ala Ala Glu Gln Val Arg Arg Asp Cys Cys Arg Gln

65 70 75 80

Leu Ala Ala Val Asp Asp Ser Trp Cys Arg Cys Glu Ala Ile Ser His

85 90 95

Met Leu Gly Gly Ile Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Pro Asp Val Gly His

100 105 110

Pro Met Ser Glu Val Phe Arg Gly Cys Arg Arg Gly Asp Leu Glu Arg

115 120 125

Ala Ala Ala Ser Leu Pro Ala Phe Cys Asn Val Asp Ile Pro Asn Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Val Cys Tyr Trp Leu Ala Arg Ser Gly Tyr

145 150 155

<210>45

<211>160

<212>PRT

<213>稻(Rice)

<220>稻***反应原RA5B前体(Rice allergen allergen RA5B precursor)

<400>45

Met Ala Ser Asn Lys Val Val Phe Ser Val Leu Leu Leu Ala Val Val

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Ala Thr Ala Thr Met Ala Glu Tyr His His Gln Asp

20 25 30

Gln Val Val Tyr Thr Pro Ala Pro Leu Cys Gln Pro Gly Met Gly Tyr

35 40 45

Pro Met Tyr Pro Leu Pro Arg Cys Arg Ala Leu Val Lys Arg Gln Cys

50 55 60

Val Gly Arg Gly Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln Val Arg Arg Asp Cys

65 70 75 80

Cys Arg Gln Leu Ala Ala Val Asp Asp Ser Trp Cys Arg Cys Glu Ala

85 90 95

Ile Ser His Met Leu Gly Gly Ile Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Pro Asp

100 105 110

Val Gly His Pro Met Ser Glu Val Phe Arg Gly Cys Arg Arg Gly Asp

115 120 125

Leu Glu Arg Ala Ala Ala Ser Leu Pro Ala Phe Cys Asn Val Asp Ile

130 135 140

Pro Asn Gly Gly Gly Gly Val Cys Tyr Trp Leu Ala Arg Ser Gly Tyr

145 150 155 160

<210>46

<211>165

<212>PRT

<213>稻种(Rice seed)

<220>稻种***反应原RA14(Rice seed allergen RA14)

<400>46

Met Ala Ser Asn Lys Val Val Phe Ser Ala Leu Leu Leu Ile Ile Val

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Ala Thr Thr Arg Met Ala Asp His His Lys Asp Gln

20 25 30

Val Val Tyr Ser Leu Gly Glu Arg Cys Gln Pro Gly Met Gly Tyr Pro

35 40 45

Met Tyr Ser Leu Pro Arg Cys Arg Ala Val Val Lys Arg Gln Cys Val

50 55 60

Gly Thr Arg Ser Pro Gly Ala Val Asp Glu Gln Leu Ala Gln Asp Cys

65 70 75 80

Cys Arg Glu Leu Ala Ala Val Asp Asp Ser Trp Cys Arg Cys Ser Ala

85 90 95

Leu Asn His Met Val Gly Gly Ile Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Thr Asp

100 105 110

Val Gly His Pro Met Ala Glu Val Phe Pro Gly Cys Arg Arg Gly Asp

115 120 125

Leu Glu Arg Ala Ala Ala Ser Leu Pro Ala Phe Cys Asn Val Asp Ile

130 135 140

Pro Asn Gly Thr Gly Gly Val Cys Tyr Teu Leu Gly Tyr Pro Arg Thr

145 150 155 160

Pro Arg Thr Gly His

165

<210>47

<211>166

<212>PRt

<213>稻(Rice)

<220>稻***反应原RA14B前体(Rice allergen RA14B precursor)

<400>47

Met Ala Ser Asn Lys Val Val Phe Ser Ala Leu Leu Leu Ile Ile Val

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Ala Thr Gly Pro Met Ala Asp His His Lys Asp Gln

20 25 30

Val Val Tyr Ser Leu Gly Glu Arg Cys Gln Pro Gly Met Gly Tyr Pro

35 40 45

Met Tyr Ser Leu Pro Arg Cys Arg Ala Val Val Lys Arg Gln Cys Val

50 55 60

Ala Thr Ala His Pro Ala Ala Arg Gly Asn Glu Gln Leu Arg Gln Asp

65 70 75 80

Cys Cys Arg Gln Leu Ala Ala Val Asp Asp Ser Trp Cys Arg Cys Ser

85 90 95

Ala Leu Asn His Met Val Gly Gly Ile Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Thr

100 105 110

Asp Val Gly His Pro Met Ala Glu Val Phe Pro Gly Cys Arg Arg Gly

115 120 125

Asp Leu Glu Arg Ala Ala Ala Ser Leu Pro Ala Phe Cys Asn Val Asp

130 135 140

Ile Pro Asn Gly Thr Gly Gly Cyl Cys Trp Teu Leu Gly Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Thr Pro Arg Thr Gly His

165

<210>48

<211>166

<212>PRT

<213>稻种(Rice seed)

<220>稻种***反应原RAG2(Rice seed allergen RAG2)

<400>48

Met Ala Ser Asn Lys Val Val Phe Ser Ala Leu Leu Leu Ile Ile Val

1 5 10 15

Ser Val Leu Ala Ala Thr Ala Thr Met Ala Asp His His Lys Asp Gln

20 25 30

Val Val Tyr Ser Leu Gly Glu Arg Cys Gln Pro Gly Met Gly Tyr Pro

35 40 45

Met Tyr Ser Leu Pro Arg Cys Arg Ala Val Val Lys Arg Gln Cys Val

50 55 60

Gly His Gly Ala Pro Gly Gly Ala Val Asp Glu Gln Leu Arg Gln Asp

65 70 75 80

Cys Cys Arg Gln Leu Ala Ala Val Asp Asp Ser Trp Cys Arg Cys Ser

85 90 95

Ala Leu Asn His Met Val Gly Gly Ile Tyr Arg Glu Leu Gly Ala Thr

100 105 110

Asp Val Gly His Pro Met Ala Glu Val Phe Pro Gly Cys Arg Arg Gly

115 120 125

Asp Leu Glu Arg Ala Ala Ala Ser Leu Pro Ala Phe Cys Asn Val Asp

130 135 140

Ile Pro Asn Gly Thr Gly Gly Val Cys Tyr Trp Leu Gly Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Thr Pro Arg Thr Gly His

165

<210>49

<211>8

<212>PRT

<213>稻(Rice)

<220>稻***反应原(Rice allergen)

<222>96…106

<400>49

Leu Gly Gly Ile Tyr Xaa Glu Leu

1 5

<210>50

<211>8

<212>PRT

<213>稻(Rice)

<220>稻种***反应原RA14(Rice seed allergen RA14)

<222>101…108

<400>50

Val Gly Gly Ile Tyr Xaa Glu Leu

1 5

<210>51

<211>7

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<220>锌指蛋白300(Zinc finger protein 300)

<222>129…135

<400>51

Gln Xaa Asp Gly Gln Xaa Gln

1 5

Claims

1.一种下述(a)或者(b)的克罗恩氏病抗体结合性肽：

(a)由从SEQ ID NO：1～4所表示的氨基酸序列中选出的任何一个氨基酸序列组成的肽，

(b)由上述(a)中所示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽。

2.如权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中，(b)记载的肽为部分含有由SEQ ID NO：1～4或者SEQ ID NO：7所表示的氨基酸序列的肽。

3.如权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中，由SEQID NO：1所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，为含有SEQ ID NO：5～14所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

4.如权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中，由SEQID NO：1所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，为至少含有SEQ ID NO：10所表示的氨基酸序列中的LIAQQM氨基酸序列，氨基酸数为6～226的肽。

5.如权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中，由SEQID NO：2所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，为含有SEQ ID NO：15～19所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

6.如权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中，由SEQID NO：3所表示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，为包含SEQ ID NO：20～32所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

7.如权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中，由SEQID NO：3所示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，为至少包括SEQ ID NO：51所表示的氨基酸序列，氨基酸数为7～604的肽。

8.如权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中，由SEQID NO：4所瑶示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，为包含SEQ ID NO：33～48所表示的任何一个氨基酸序列的肽。

9.如权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽，其中，由SEQID NO：4所示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽，为至少包含L(V)GGIYXD(E)L(X为任意的氨基酸残基)的氨基酸序列，氨基酸数为8～165的肽。

10.一种分支状多抗原性肽，在一个分子中含有多个相同或者不同的如下述：

(a)由从SEQ ID NO：1～4所表示的氨基酸序列中选出的任何一个氨基酸序列组成的肽，或者

(b)由上述(a)中所示的氨基酸序列中1个或者几个氨基酸经过取代、缺失或者添加得到的修饰氨基酸序列组成、而且与克罗恩氏病抗体具有结合性的肽

的氨基酸序列作为支链氨基酸序列。

11.如权利要求10所述的分支状多抗原性肽，其中，在其支链上含有从以下至少两组中选出的两个以上不同的克罗恩氏病抗体结合性肽的氨基酸序列：(i)含有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，(ii)含有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，(iii)含有SEQ ID NO：3所表示的氨基酸序列的肽及其等效物和(iv)含有SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列及其等效物。

12.一种克罗恩氏病检查试剂，含有从由下组中选择的至少一种作为有效成分：权利要求1所述的克罗恩氏病抗体结合性肽；权利要求10中所述的分支状多抗原性肽；以及人液泡型H⁺转运性ATP酶亚基E与从其他亚基，即亚基A，亚基B，亚基C，亚基D，115kDa亚基，39kDa亚基，20kDa亚基和16kDa亚基的组中选出的至少一种亚基形成的复合物。

13.如权利要求12所述的克罗恩氏病检查试剂，其中，所述的克罗恩氏病抗体结合性肽为从(i)含有SEQ ID NO：1所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，(ii)含有SEQ ID NO：2所表示的氨基酸序列的肽及其等效物，(iii)含有SEQ ID NO：3所表示的氨基酸序列的肽及其等效物和(iv)含有SEQ ID NO：4所表示的氨基酸序列的肽及其等效物中的至少两组中选出的两种以上的克罗恩氏病抗体结合性肽，所述的分支状多抗原性肽为权利要求11所述的分支状多抗原性肽。

14.一种克罗恩氏病检查试剂盒，其中，含有权利要求12所述的检查试剂作为克罗恩氏病抗体结合用的抗原物质。

15.在权利要求14所述的克罗恩氏病检查试剂盒，含有抗人IgG抗体、以及权利要求12所述的检查试剂、以及根据需要从试样稀释液、标记物质、载体(固相)、抗人IgG抗体稀释液、酶底物以及反应停止液的组中选出的至少一种。

16.一种克罗恩氏病检查方法，包括检测受验者的生物试样中的识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的抗体的步骤。

17.权利要求16所述的克罗恩氏病检查方法，其中，所述的抗体为识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E的抗体。

18.权利要求16所述的克罗恩氏病检查方法，其中，所述的抗体是识别人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E与从亚基A，亚基B，亚基C，亚基D，115kDa亚基，39kDa亚基，20kDa亚基和16kDa亚基的组中选择的至少一种其它亚基的复合物的抗体。

19.权利要求16所述的克罗恩氏病检查方法，其中，所述的抗体是识别人液泡型转运性ATP酶亚基E的199～212位的氨基酸区域的抗体。

20.权利要求16所述的克罗恩氏病检查方法，其包括使用由LIAQQM的氨基酸序列组成的肽或者其等效物，或者在一分子中含有多个相同或者不同的这些肽或者其等效物的氨基酸序列的分支状多抗原性肽作为抗原物质，检测通过与人液泡型H⁺转运性ATP酶的抗体进行的抗体-抗原反应生成的复合物的步骤。

21.权利要求20所述的克罗恩氏病检查方法，其中，由LIAQQM的氨基酸序列组成的肽或者其等效物，为含有LIAQQM的氨基酸序列，氨基酸数为6～227的肽。

22.权利要求20所述的克罗恩氏病检查方法，其中，由LIAQQM的氨基酸序列组成的肽或者其等效物，为选自含有SEQ ID NO：1以及5～14所表示的各氨基酸序列的肽。

23.权利要求16所述的克罗恩氏病检查方法，其包括使用以人液泡型H⁺转运性ATP酶的亚基E与从亚基A，亚基B，亚基C，亚基D，115kDa亚基，39kDa亚基，20kDa亚基和16kDa亚基的组中选择的至少一种其它亚基的复合物作为抗原物质，检测识别通过与人液泡型H⁺转运性ATP酶的抗体进行的抗体-抗原反应生成的复合物的步骤。

24.一种克罗恩氏病检查方法，包括检测可以识别受验者的生物试样中的人细胞核内蛋白质(Homo sapiens kruppel-like zinc fingerprotein 300)的抗体的步骤。

25.权利要求24所述的克罗恩氏病检查方法，其中，所述的抗体为识别人细胞核内蛋白质(Homo sapiens kruppel-like zinc fingerprotein 300)的126～138位的氨基酸区域的抗体。

26.权利要求24所述的克罗恩氏病检查方法，其包括使用含有SEQ ID NO：51所表示的氨基酸序列的肽或者其等效物、或者在同一分子中含有多个这些肽或者其等效物的氨基酸序列的分支状多抗原性肽作为抗原，检测识别通过与人细胞核内蛋白质(Homo sapiens kruppel-like zinc finger protein 300)的抗体进行的抗体-抗原反应生成的复合物的步骤。

27.权利要求26所述的克罗恩氏病检查方法，其中，含有SEQ IDNO：51所表示的氨基酸序列的肽或者其等效物，为包含SEQ ID NO：51中所表示的氨基酸序列，氨基酸数为7～604的肽。

28.权利要求26所述的克罗恩氏病检查方法，其中，含有SEQ IDNO：51所表示的氨基酸序列的肽的等效物，选自含有SEQ ID NO：3、及21～32所表示的各氨基酸序列的肽。

29.一种克罗恩氏病检查方法，包括检测受验者的生物试样中的识别稻***反应原蛋白质的抗体的步骤。

30.权利要求29所述的克罗恩氏病检查方法，其中，所述的稻***反应原蛋白质属于α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂(alpha-amylase/trypsin inhibitor)的基因组。

31.权利要求29所述的克罗恩氏病检查方法，其中所述的稻***反应原蛋白质，是从稻***反应原(Rice allergen)、稻种***反应原RA5(Rice seed allergen RA5)、稻***反应原RA5B前体(Rice allergenRA5 B precursor)、稻种***反应原RA14(Rice seed allergen RA14)、稻***反应原RA14B前体(Rice allergen RA14B precursor)和稻种***反应原RAG2(Rice seed allergen RAG2)组成的组中选出的至少一种。

32.权利要求29所述的克罗恩氏病检查方法，其中，所述的识别稻***反应原蛋白质的抗体，为识别稻种***反应原RA14(Rice seedallergen RA14)的99-111位的氨基酸区域的抗体。

33.权利要求29所述的克罗恩氏病检查方法，其中，所述的识别稻***反应原蛋白质的抗体，为识别含有α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂(alpha-amylase/trypsin inhibitor)的基因组的L(V)GGIYREL氨基酸序列的氨基酸区域的抗体。

34.权利要求29所述的克罗恩氏病检查方法，其包括使用由L(V)GGIYXD(E)L(X为相同或者不同，任意的氨基酸残基)的氨基酸序列组成的肽或者其等效物、或者在一个分子中含有多个相同或者不同的这些肽或者其等效物的氨基酸序列的分支状多抗原性肽作为抗原物质，检测识别通过与稻***反应原蛋白质的抗体进行的抗原-抗体反应生成的复合物的步骤。

35.权利要求34所述的克罗恩氏病检查方法，其中，由L(V)GGIYXD(E)L(X为相同或者不同的任意氨基酸残基)的氨基酸序列组成的肽或者其等效物，为含有L(V)GGIYXD(E)L(X为相同或者不同的任意氨基酸残基)氨基酸序列，氨基酸数为8～166的肽。

36.权利要求34所述的克罗恩氏病检查方法，其中，由L(V)GGIYXD(E)L(X为相同或者不同，任意的氨基酸残基)的氨基酸序列组成的肽的等效物，选自含有SEQ ID NO：4、33～48所表示的氨基酸序列的肽。

37.权利要求1～11任何一项所述的肽在克罗恩氏病的检查中作为与克罗恩氏病抗体反应的抗原物质的应用。

38.权利要求1～11中任何一项所述的肽在制备克罗恩氏病检查试剂中的应用。