CN1504484A - 修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法，包括a.无水苯的制备；b.三聚氯氰的重结晶；c.猪血清白蛋白结；d.PEG1900活化；e.活化PEG与猪血清白蛋白的偶联。以PEG为修饰剂，来修饰猪血白蛋白，当其氨基修饰率达50％时，其免疫原性完全解除，并作了毒理等较***的研究工作，表明PEG修饰猪血白蛋白成为人血白蛋白代用品。
Description
所属领域
本发明涉及白蛋白的制备方法，特别是修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法
背景技术
最近几年医学发展发现，献血人员，常常有不易被发现的肝炎病毒，如乙肝病毒、丙肝病毒、甲肝病毒，甚至艾滋病病毒携带者，血液制品有传播这些病毒性疾病的嫌疑，因此，血浆白蛋白的生产受到了限制，人血白蛋白的短缺问题将日趋明显。每年对白蛋白的需要量很大，每年产量就在200吨左右，需要数十万人献血，所以价格比较昂贵。
发明内容
本发明的目的是针对人血白蛋白的需求量大，价格昂贵，且易于传播病毒性疾病的不足，提供一种利用修饰猪血白蛋白替代人血白蛋白的制备方法。
血液是由血细胞和血浆组成的。人血浆白蛋白由575个氨基酸组成的单一肽链。在人体内具有独特的作用和功能，它是血液内多种物质运输的重要载体，也与多种药物的体内代谢相关。人们通过研究发现，华法令、安定和洋地黄毒甙，这三种药物在人血白蛋白上至少有三个结合位点，许多药物发挥作用与解毒都是通过与白蛋白结合后发生的。
人血白蛋白的分子量据估计约为65.00，由于分子量较小而含量多。故它的主要机能是维持血浆胶体渗透压。保留适当的水分在血浆里，维持血液循环，正常人血浆总蛋白量在6.5-7.5克％之间，其中白蛋白占3.9-4.5克％。余为球蛋白。
白蛋白低于3克％时，往往发生全身水肿，肝硬化和严重肾衰患者，由于肝脏合成白蛋白功能障碍或肝脏功能异常，血液胶体渗透压降低，造成腹水或水肿。如静脉输入白蛋白，提高其在血浆里的浓度，就能引起利尿，使水肿消失。
猪血白蛋白的PEG——修饰解除抗原性的基础
猪血白蛋白是猪血清中主要的蛋白质，其含量约占血清中蛋白质总量的一半左右，分子量67000，等电点为4.7在血液中参与维持渗透压以及物质运输等功能。其性质比较稳定，来源十分丰富，在分子生物学和细胞生物学等方面得到了广泛的应用。但多是在诊断和检测方法上的应用。将牛血清白蛋白作为一种放大载体，来增强免疫反应的灵敏度，常用的修饰剂有用三聚氨氰活化PEG，环氧溴丙烷活化的琼脂糖球。环氧氰丙烷活化羊甲氧基聚乙二醇，研究了环氧氯丙烷活化左右旋糖苷等，1977年Abraham etyal用聚乙二醇共价修饰牛血清白蛋白时免疫特性的变化，其基本原理是先把PEG的OH与三聚氯氰中氯连接，然后再通过三聚氯氰与蛋白质中的氨基相连。修饰后的牛血清白蛋白的性质发生了根本性的变化，如溶解度，丙烯酰胺电脉中的电泳移动性，高于交换层析图谱和沉降系数与天然牛血清白蛋白相比，都有明显的改变。另外，多聚物(聚乙二醇)结合到具有免疫屏障，导致蛋白无免疫原性。
近年来，人们对聚乙二醇结合的牛血清白蛋白酯酶活性免疫反应性的变化做了进一步探索研究。结果表明，在被修饰的白蛋白分子中，60个氨基其中15个被活性PEG偶联，结果其免疫反应性丧失而成为无免疫原性牛血清白蛋白，并且有63％的酯酶活性被保留。
随着生物工程的发展，许多蛋白质类药物的广泛使用成为可能。牛血清白蛋白有18个决定簇，而每一个瘊定簇又有由一事实上数量的残基所组成。一般是一种抗原决定簇具有一种抗原特异性。为此，人们利有化学物质修饰蛋白质掩盖异源蛋白质在人体内的抗原部位，避免在体内应用中的免疫反应取得了有益的效果。研究证明：聚乙二醇应用效果较好，应用聚乙二醇修饰的许多酶，蛋白质，在体内应用中抗原性显著降低，体内作用时间明显延长，药效也有了很大提高，目前，美国FDA已批准聚乙二醇修饰的腺苷脱氨酶(PEG——ADA)临术上治疗由于该酶缺陷而造成的严重综合免疫缺陷症(SCID)，从而确定了化学修饰在医药研究中的地位，因此用聚乙二醇修饰牛血清白蛋白降低其抗原性，从而代替人血浆白蛋白应用于临床。
人群病毒携带率逐年增多，如我国人群中乙肝病毒携带率高达12％；丙肝病毒携带率更高达15％；此外还有甲肝病毒、艾滋病病毒等等，使献血员的血液合格率下降，新献血员的血液合格率仅为50％，而老献血员血液合格率相当低，血源困难使代替人血白蛋白的研究势在必行，引起各国重视。
用基因工程手段来生产人血白蛋白，但纯化难度极大。
用动物血白蛋白来代替人血白蛋白，这需要解决的是动物血白蛋白对人体抗原性问题。
用PEG解除异体蛋白抗原性。据报导美国FDA到目前为止，至少批准了七种PEG修饰蛋白(酶)药物用于临床。
A、Abuchowski，A、Matsushima等用PEG修饰牛血白蛋白，其抗原性丧失，由于英国疯牛病使这项研究搁浅。
以PEG为修饰剂，来修饰猪血白蛋白，当其氨基修饰率达50％时，其免疫原性完全解除，并作了毒理等较***的研究工作，表明PEG修饰猪血白蛋白成为人血白蛋白代用品。
猪血白蛋白的制备：取无菌采取的猪血，先制成血清，再经生化分离精制手段，得到电泳纯的猪血白蛋白，冷冻干燥备用。具体按国家规定人血白蛋白低温乙醇法工艺操作细则要求进行，并同时按人血白蛋白的检定项目操作细则把好原料质量关。
修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法，包括
a、无水苯的制备；b、三聚氯氰的重结晶；c、猪血清白蛋白结；d、PEG1900活化；e、活化PEG与猪血清白蛋白的偶联。
具体的修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法，包括
a、无水苯的制备
取1000ml园底烧瓶，将优级纯苯700ml置入园底烧瓶中，加入金属钠片20片左右，上接一套回流装置，气体出口处装入无水氯化钙(目的防止水分进入)，下面把园底烧瓶放于电热套中回流3小时后，取下冷凝管，安置斜形冷凝管，右接温度计，温度保持30℃微沸，待冷凝管一端有液体滴出，用棕色玻璃瓶接收，即为无水苯，备用。
b、三聚氯氰的重结晶
取三聚氯氰80g，置于1000ml园底烧瓶中，再加入无水苯500ml，搅拌混合溶解，园底烧瓶放入电热套中上接一套回流冷凝装置，加热回流3小时，取下冷凝管，将液体趁热过滤，置入500ml带塞三角烧瓶中，放入40冰箱保存24小时以上，可以看到三聚氯氰的结晶。
将苯倾出后，取出结晶三聚氯氰置于园底烧瓶中，以上方法重复操作，得到重结晶的三聚氯氰。
c、猪血清白蛋白结晶
(1)2g猪血清白蛋白→溶解于20ml蒸馏水中(最后量体积V1)→加入饱和(NH4)3SO4V3ml(等体积)→室温放置20分钟→过滤→滤液V2继续滴加(NH4)2SO4不断搅拌→当沉淀溶解很慢时停止滴加→用0.2NH2SO4调PH4.6——4.8→放置24——48hr→有结晶。
(2)重结晶
将沉淀(结晶)于2000转/分10分钟。去上清→用少量蒸馏水溶解结晶沉淀→搅拌下滴加(NH4)2SO4溶液→沉淀溶解很慢时停止滴加→用0.2NH2SO4调PH4.6-4.8放置24——48hr→结晶。
将结晶用少量PBS液PH7.4溶解。装入透析袋中共4个。用100ml烧杯装800ml PBS缓冲液，进行透析共24h，间歇换液时间为3.3.6.6.6小时次日取出透析袋，将液体倒入冻干瓶中，冻干备用。
d、PEG1900。5000活化。
取制备重结晶三聚氯氰(5，7g0.03mol)溶解在400ml含有10g无水碳酸的(在干热箱中干热160℃2小时后使用)的无水苯溶液中，加PEG——1900(19g0.01mot在室温22-24℃)搅拌日上搅拌过液。
取搅拌过液(活化PEG)用三角玻璃漏斗过滤(上加滤纸)置于三角烧瓶中。过滤后澄明溶液400ml放在搅拌日上搅拌约30分钟后，缓慢加入石油醚600ml出现白色沉淀继续搅拌20分钟后用G4锤熔玻璃漏斗过滤。滤器上有白色粘筒沉淀滤液澄清透明，再将白色沉淀移入三角烧瓶中加无水苯400ml溶解，此过程重复操作多次，每次操作用紫外(UV-2201型)分光光度计监测，直到检测不到游离的三聚氯氰吸收峰为止，得到活化PEG——1900置于干燥器中抽真空，苯挥散尽，备用。PEG——5000采用上述相同的方法制备反应式为：
e、活化PEG与猪血清白蛋白的偶联
取四次重结晶猪血白蛋白(400mg.6.04.umol)溶解在40ml0.1MPH9.2四硼酸钠溶液中，将此液放在4℃冰箱中保存2小时后，取出，加入活化PEG-1000(3.55gl.74mol此量是氨基集团的5倍)，在置于4℃冰箱中在搅拌器上搅拌21小时后，取下搅拌液装入透析袋中，用0.01MPH7.4PBS缓冲液透析，透析时间早10.30至次10.30，24小时，每间歇3，3，6，6，.小时更换透析液，次日早9.30分，取出透析袋，将袋液体置入冻干瓶中冻干10小时后，呈白色粉末状，收集瓶中备用。
反应式为：
PEG——修饰猪血白蛋白的条件及影响程度
PEG——1900和PEG500两种PEG均在25℃18小时修饰率为最高，均可达到90％左右。而在37℃时次之。50％左右4℃时效果最差，可达30-40％。表明温度对PEG修饰猪血白蛋白反应有比较明显的影响。(见表1)
甲氧基聚乙二醇与白蛋白的共价偶联，用三聚氯氰作为偶联剂，反应式如下：
在此反应中，三聚氯氰分子中的氯原子是活性原子，可被亲核试剂取代。一个或二个氯原子可被提供电子基因取代。形成稳定的C-C1键]John Son等人报道三聚氯氰与氨基亚胺及氢氧基反应应形成稳定键。在接近40时，第一个氯原子迅速发生反应，第二个氨原子在25℃反应，第三个在80℃发生反应。这与实验结果相符。在4℃时，修饰率30-40℃，而到25℃时修修饰达到80-90％，修饰率可提高1倍多。但37℃时，修饰率却低于25℃修饰率，这可能是有两种原因(1)温度一下提到37℃，不利于延缓一个氯原子的反应，而又远末达到第三个氯原子参加反应的最佳30℃所以仅仅是第二个氯原子活性加强，而总体修饰率下降，37℃是猪血白蛋白最接近天然构象的温度在这种构象情况下，由于游离氨基的位置与此温度下的活化PEG中氯原子的位置不易形成C-C1键，而使修饰率降低。
PEG——修饰猪血白蛋白抗原性、安全性、有效化实验及检定结果。
PEG——修饰猪血白蛋白分子量5000，其氨基修饰率为50％。
1、PEG——白蛋白抗原性。
(1)免疫扩散琼脂板法：合格。
(2)过敏试验：实验动物为豚鼠，隔周注射抗原，连续四次，为合格。(见表2)
结果表明，猪血白蛋白有明显过敏反应，甚至引起动物死亡，而PEG—白蛋白组没有任何过敏反应。
(3)放射性标记PEG——白蛋白在家兔体上的清除试验(见表3)
结果发现只有白蛋白免疫动物对白蛋白迅速清除，其余各组的清除速率(未免疫动物对白蛋白、PEG——白蛋白，白蛋白免疫动物及PEG——白蛋白免疫动物对PEG——白蛋白，PEG——白蛋白免疫动物对白蛋白)基本相似，均未见迅速被清除现象，这说明，白蛋白注射到家兔后产生白蛋白抗体，当再注入白蛋白时白蛋白抗体迅速与其发生免疫反应而被清除，而PEG——白蛋白免疫家兔即不产生白蛋白抗体，也不产生PEG——白蛋白抗体，因此当再注入白蛋白或PEG——白蛋白时不产生免疫反应，也观察不到被迅速清除现象，也说明PEG——白蛋白与白蛋白抗体之间也不发生抗原抗体反应。
以上实验说明PEG——白蛋白完全被解除了抗原性。
2、毒性实验：
按中国药典方法，做了PEG——白蛋白的急性毒性试验及慢性毒性试验。慢性毒性实验观察了动物体重、白细胞、淋巴细胞、红细胞、血红蛋白、尿毒氮、转氨酶、脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑)重量，检查动物各脏器病理变化，均未见异常，说明PEG——白蛋白对动物无毒性作用。
3、安全试验：
按药典要求，以豚鼠为对象，作了PEG——白蛋白安全实验。结果表明PEG——白蛋白符合生物制品规程中安全试验要求。
4、动物体内清除率及其分布：
放射性同位素示踪实验表明PEG——白蛋白在动物体内清除率与天然白蛋白基本相似，均无明显积叠作用；31天后在各脏器残留百分率为肝脏3.8％，甲状腺0.95％、肾脏0.055％，脾脏及胸腺也有少量残留，而在脑及卵巢基本阴性。
5、渗透压试验：
以猪血白蛋白为对照，作了PEG——白蛋白渗透压试验，结果表明PEG——白蛋白为等摩尔浓度的猪血白蛋白是等渗的，说明PEG——白蛋白具有维持正常机体渗透压作用。
6、PEG——猪血白蛋白PH值、水份、类毒素、热原检查、无菌试验均合格。
7、其它：
PEG——白蛋白分子中蛋白含量测定、游离氨基测定、纯度、PEG——白蛋白的水份测定。符合白蛋白指标的要求。
猪血白蛋白的化学修饰将具有较好的应用价值，它有三点优势，第一、原料来源丰富，国内大多数屠宰加工厂都将猪血作为废弃物扔掉，所以，用猪血生产白蛋白有丰富的原料来源。同时又可减少废弃权物的污染；第二，成本低，由于原料价格低，用于修饰猪血白蛋白的化学试剂PEC价格及三聚氯氰价格也不高，所以，修饰后的猪血白蛋白的成本要明显低于人血白蛋白成本。成品价格预计可比人血白蛋白成品价格低2-3倍；第三，安全性高，以猪血为原料，可以完全排除甲肝、乙肝、丙肝、疯牛病、艾滋病等病毒的污染，不会传播由这些病毒引起的传染病。除此而外，修饰后的猪血白蛋白还可作为多种生物活性大分子制剂的保护剂。有广泛的应用前景和潜在的经济效益。
具体实施方式
实施例1：
1、健康检疫：新供采血猪必须健康检查同时采血作相关人畜共患病检疫，阴性者采血对象。
2、采血：
猪的选择较以黑色猪为宜。采血瓶为180℃干热，每个采血(3立升)瓶加入4％拘橼纳与2％氯化钠300毫升。用玻璃纸包扎的棉塞。经酸碱处理及纯水冲洗后玻璃管与胶管，干燥后包扎、消毒、备用。
将猪固定后，洗净颈部剪毛消毒，酒精擦试后，取颈动脉切口，***采血管边摇边接血，达6立升为止。拔掉胶管，将瓶严密包扎，静适于温水中，浆折出。之后将采血瓶放于冷库中静置使血浆分层。在放入冷库时用来苏尔或石炭酸纱布擦洗一下。
将采血瓶分离出的猪血血浆严格按人用白蛋白低温醇法工艺细则制出合格的冻干猪血白蛋白，质量标准余过敏原外完全符合人用注射白蛋白质量标准，具体蛋白含量达96％以上，纯度电脉一条。无菌安全、热原、内毒素含量、水分、PH等都要符合要求。
实施例2：
a、PEG——1900和PEG——5000的活化，取二次重结晶的三聚氯氰5.7g(0.03mol)，溶解于400ml含有10g无水碳酸钠的无水苯中，加19g(0.01mol)PEG——1900或50g(0.01mol)PEG——5000在室温(22——24℃)搅拌过夜后过滤，取澄清滤液400ml放在搅拌器上搅拌20min，缓慢加入石油醚600ml，出现白色沉淀后继续搅拌20min，用G4锤熔玻璃漏斗过滤，再将沉淀移入三角烧瓶中，加无水苯400ml溶解，此过程重复操作多次，每次操作多次，每次操作用紫外(UV-2201型)分光光度计监测，直到检测不到游离的三聚氯氰吸收峰为止，得到活化PEG置于干燥器中抽空，干燥备用。
b、活化PEG与猪血白蛋白的偶联取4次重结晶的猪血白蛋白400mg(6.04umol)，溶于40ml0.1mol/L，pH9.2的四硼酸钠溶液中，将此溶液放在4℃冰箱中保存2h后取出，加入活化PEG——19003.55g(1.87mmol)或活化PEG-50009.35g(1.87mmol)，于25℃水浴中搅拌21h，用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液透析。透析后置于冻干瓶中冻干10h，得呈白色粉末状的PEG——1900——BSA和PEG——5000——BSA。
实施例3：
用实施1和2的方法制备PEG——修饰合格三批中试样品，各3000克PEG——修饰的猪血白蛋白按新生物制品药新申报资料要求作各项实验和相关检定。
表1猪血白蛋白不同PEG及不同条件下修饰结果
| PEG——19004℃ 25℃ 37℃ | PEG——50004℃ 25℃ 37℃ | |
| 修饰氨基酸每分子 | 25 53 34 | 19 55 30 |
| 修饰率％ | 42 89 56 | 32 91 52 |
表2PEG——白蛋白过敏试验结果
| 豚鼠编号 | 色标 | 第一次注射 | 一周后 | 二周后 | 四周后 | 过敏反应 |
| 1 | 头兰 | 10mg | 10mg | 10mg | 20mg | —— |
| 2 | 花 | 10mg | 10mg | 10mg | 20mg | —— |
| 3 | 尾兰 | 10mg | 10mg | 10mg | 20mg | —— |
| 4 | 腰兰 | 10mg | 10mg | 10mg | 20mg | +死亡 |
| 5 | 腿兰 | 10mg | 10mg | 10mg | 20mg | + |
| 6 | 黑 | 10mg | 10mg | 10mg | 20mg | + |
说明：1，2，3号注射PEG—白蛋白
4，5，6号注射白蛋白
表3 PEG——I125——白蛋白在家兔体内清除试验
说明：1、未免疫动物；2、白蛋白免疫动物；3、PEG—白蛋白免疫动物。
Claims (2)
1.修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法，包括a、无水苯的制备；b、三聚氯氰的重结晶；c、猪血清白蛋白结；d、PEG活化；e、活化PEG与猪血清白蛋白的偶联。
2.根据权利要求1所述修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法，包括
a、无水苯的制备
取1000ml园底烧瓶，将优级纯苯700ml置入园底烧瓶中，加入金属钠片20片左右，上接一套回流装置，气体出口处装入无水氯化钙(目的防止水分进入)，下面把园底烧瓶放于电热套中回流3小时后，取下冷凝管，安置斜形冷凝管，右接温度计，温度保持30℃微沸，待冷凝管一端有液体滴出，用棕色玻璃瓶接收，即为无水苯，备用；
b、三聚氯氰的重结晶
取三聚氯氰80g，置于1000ml园底烧瓶中，再加入无水苯500ml，搅拌混合溶解，园底烧瓶放入电热套中上接一套回流冷凝装置，加热回流3小时，取下冷凝管，将液体趁热过滤，置入500ml带塞三角烧瓶中，放入40冰箱保存24小时以上，可以看到三聚氯氰的结晶；
将苯倾出后，取出结晶三聚氯氰置于园底烧瓶中，以上方法重复操作，得到重结晶的三聚氯氰；
c、猪血清白蛋白结晶
(1)2g猪血清白蛋白→溶解于20ml蒸馏水中(最后量体积V1)→加入饱和(NH4)3SO1V3ml(等体积)→室温放置20分钟→过滤→滤液V2继续滴加(NH1)2SO4不断搅拌→当沉淀溶解很慢时停止滴加→用0.2NH2SO4调PH4.6——4.8→放置24——48hr→有结晶；
(2)重结晶
将沉淀(结晶)于2000转/分10分钟，去上清→用少量蒸馏水溶解结晶沉淀→搅拌下滴加(NH4)2SO4溶液→沉淀溶解很慢时停止滴加→用0.2NH2SO4调PH4.6-4.8放置24——48hr→结晶；
将结晶用少量PBS液PH7.4溶解，装入透析袋中共4个；用100ml烧杯装800ml PBS缓冲液，进行透析共24h，间歇换液时间为3.3.6.6.6小时次日取出透析袋，将液体倒入冻干瓶中，冻干备用；
d、PEG1900活化
取制备重结晶三聚氯氰(5,7g 0.03mol)溶解在400ml含有10g无水碳酸的(在干热箱中干热160℃2小时后使用)的无水苯溶液中，加PEG——1900(19g0.01mot在室温22-24℃)搅拌日上搅拌过液；
取搅拌过液(活化PEG)用三角玻璃漏斗过滤(上加滤纸)置于三角烧瓶中，过滤后澄明溶液400ml放在搅拌日上搅拌约30分钟后，缓慢加入石油醚600ml出现白色沉淀继续搅拌20分钟后用G4锤熔玻璃漏斗过滤，滤器上有白色粘筒沉淀滤液澄清透明，再将白色沉淀移入三角烧瓶中加无水苯400ml溶解，此过程重复操作多次，每次操作用紫外(UV—2201型)分光光度计监测，直到检测不到游离的三聚氯氰吸收峰为止，得到活化PEG——1900置于干燥器中抽真空，苯挥散尽，备用；
e、活化PEG与猪血清白蛋白的偶联
取四次重结晶猪血白蛋白(400mg.6.04.umol)溶解在40ml0.1MPH9.2四硼酸钠溶液中，将此液放在4℃冰箱中保存2小时后，取出，加入活化PEG-1000，在置于4℃冰箱中在搅拌器上搅拌21小时后，取下搅拌液装入透析袋中，用0.01MPH7.4PBS缓冲液透析，透析时间早10.30至次10.30，24小时，每间歇3，3，6，6，.小时更换透析液，次日早9.30分，取出透析袋，将袋液体置入冻干瓶中冻干10小时后，呈白色粉末状，收集瓶中备用。
3.根据权利要求1或2所述修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法，a、PEG——1900的活化，取二次重结晶的三聚氯氰5.7g(0.03mol)，溶解于400ml含有10g无水碳酸钠的无水苯中，加19g(0.01mol)PEG——1900在室温(22——24℃)搅拌过夜后过滤，取澄清滤液400ml放在搅拌器上搅拌20min，缓慢加入石油醚600ml，出现白色沉淀后继续搅拌20min，用G4锤熔玻璃漏斗过滤，再将沉淀移入三角烧瓶中，加无水苯400ml溶解，此过程重复操作多次，每次操作多次，每次操作用紫外(UV-2201型)分光光度计监测，直到检测不到游离的三聚氯氰吸收峰为止，得到活化PEG置于干燥器中抽空，干燥备用；
b、活化PEG与猪血白蛋白的偶联取4次重结晶的猪血白蛋白400mg(6.04umol)，溶于40ml0.1mol/L，pH9.2的四硼酸钠溶液中，将此溶液放在4℃冰箱中保存2h后取出，加入活化PEG——19003.55g(1.87mmol)，于25℃水浴中搅拌21h，用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液透析；透析后置于冻干瓶中冻干10h，得呈白色粉末状的PEG——1900——BSA。
4.根据权利要求1所述修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法，PEG的活化，可为PEG——5000的活化。
5.根据权利要求1或4所述修饰猪血白蛋白代替人血白蛋白的制备方法，a、PEG——5000的活化，取二次重结晶的三聚氯氰5.7g(0.03mol)，溶解于400ml含有10g无水碳酸钠的无水苯中，加50g(0.01mol)PEG——5000在室温(22——24℃)搅拌过夜后过滤，取澄清滤液400ml放在搅拌器上搅拌20min，缓慢加入石油醚600ml，出现白色沉淀后继续搅拌20min，用G4锤熔玻璃漏斗过滤，再将沉淀移入三角烧瓶中，加无水苯400ml溶解，此过程重复操作多次，每次操作多次，每次操作用紫外(UV-2201型)分光光度计监测，直到检测不到游离的三聚氯氰吸收峰为止，得到活化PEG置于干燥器中抽空，干燥备用；
b、活化PEG与猪血白蛋白的偶联取4次重结晶的猪血白蛋白400mg(6.04umol)，溶于40ml0.1mol/L，pH9.2的四硼酸钠溶液中，将此溶液放在4℃冰箱中保存2h后取出，加入活化PEG-50009.35g(1.87mmol)，于25℃水浴中搅拌21h，用0.01mol/LpH7.4的PBS缓冲液透析；透析后置于冻干瓶中冻干10h，得呈白色粉末状的PEG——500——BSA。
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2002
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