CN1491099A - [γ－羟基－N－甲基－L－亮氨酸9]环孢菌素A在毛发生长中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种包含[γ－羟基－N－甲基－L－亮氨酸9]环孢菌素A作为活性成分的毛发生长促进剂，所述的[γ－羟基－N－甲基－L－亮氨酸9]环孢菌素A中的环孢菌素A的第9位N－甲基－L－亮氨酸的γ碳原子上通过微生物的代谢作用添加了一个羟基。

Description

[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A在毛发生长中的用途
技术领域
本发明涉及一种毛发生长促进剂，其包含环孢菌素(cyclosporin)的衍生物作为活性成分。更具体地说，本发明涉及一种毛发生长促进剂，其包含[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A([Y-hydroxy-N-methyl-L-leucine9]cyclosporin A)的衍生物作为活性成分。
背景技术
人的头皮平均有大约100,000至150,000根毛发，每根毛发的生长可分为三个阶段：毛发生长初期(anagen)、毛发生长中期(catagen)和毛发生长终末期(telogen)，其后该毛发脱落。这种毛发生长的循环是重复性的，且每个循环与其他的循环在持续的时间上有所不同，大约为3～6年之间。因此，在正常情况下一个成年人平均每天有大约50～100根毛发脱落。通常，脱发症(alopecia)是指这样一种现象，其中毛发生长初期的时间缩短而处于毛发生长中期和毛发生长终末期的毛发的百分比增加，由此导致过度和异常的毛发脱落。
对于脱发的解释存在多种理论，包括例如血液循环不良、雄性激素功能过强、皮脂的产生和分泌过度、过氧化物以及细菌等对头皮的损害、遗传因素、老化、应激等等。然而，尚未找到确切的机制。近来，发生脱发的人群有增加的趋势，这是由于饮食习惯的改变以及现代的社会环境等对个体造成的应激在不断增加。同时，发生脱发症的个体的年龄在下降，此外女性脱发症者的人群在上升。
最常用于治疗和预防脱发症的制剂之一是含有米诺地尔(Minoxidil)的制剂。有两种毛发再生剂已经获得美国食品和药品管理局(FDA)的批准，米诺地尔是此类获得批准的毛发再生剂之一。米诺地尔最初被开发用作降低血压的药物。但是发现使用该药物的一种副作用为促毛发生长，其后，该药成为了一种著名的毛发再生剂。尽管米诺地尔作为毛发再生剂的作用机制还不十分清楚，但推测米诺地尔可通过扩张血管而增加血流，由此毛发的根部可得到更多的营养供应并最终促进了毛发的生长。
这一血流增加模型已经得到了间接的支持，最近的研究报告米诺地尔可增加血管内皮生长因子(VEGF)的表达，VEGF是一种与在真皮***(dermal papilla)的血管扩张相关的生长因子，真皮***是构成毛根的主要细胞。同时，除了米诺地尔在毛发恢复机制中的血管扩张作用，还有研究报道米诺地尔可促进体外培养的毛根真皮***细胞的激活，并可促进毛囊(follicle)组织体外培养物的毛囊的生长。这些提示米诺地尔可作为一种生长因子直接作用于毛根。
此外，非那雄胺(Finasteride)被用来治疗脱发症，它是Merck销售的Propecia的主要成分。非那雄胺抑制雄性激素睾酮向双氢睾酮的转化，双氢睾酮是比睾酮更加强效的雄性激素。1997年12月，1mg的非那雄胺片剂获得了美国FDA的批准，成为仅供男性使用的治疗男性型脱发的毛发再生剂，现在已有出售。临床研究证明其具有显著的促毛发生长作用。不过，有研究报道非那雄胺可出现抑制男性性功能的不良反应。由于非那雄胺和米诺地尔在临床实验中均并未显示出优越的效果，并且考虑到其不良反应，因此很多研究者正在致力于开发新的以及改进的毛发再生剂。
环孢菌素类药物具有免疫抑制活性，也能有效抑制病毒、真菌、原虫等的生长，并具有多种不良反应的生理效应，例如神经毒性、肝脏毒性、高血压、牙周组织增生、促毛发生长作用，等等。环孢菌素A是环孢菌素的代表，该环状的肽具有如下的化学式，其包含11个氨基酸，包括若干N-甲基氨基酸和第8位的D-丙氨酸。[化学结构式1]
其中
MeBmt是N-甲基-(4R)-4-[(E)-2-丁烯基]-4-甲基-L-苏氨酸，
Abu是L-α-氨基丁酸，
Sar是肌氨酸，
MeLeu是N-甲基-L-亮氨酸，
Val是L-缬氨酸，
Ala是L-丙氨酸，
Dala是D-丙氨酸，
MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。
除非另有说明，上述化学结构式1的环孢菌素A的氨基酸均为L-构型(L-configuration)。氨基酸残基的编号由MeBmt起始并按顺时针方向进行，也就是说，MeBmt为1号而最后一个的MeVal(N-甲基-L-缬氨酸)为11号，如化学结构式1所示。通过描述与环孢菌素A所不同的残基及其位置来对环孢菌素A的衍生物进行命名。例如，在一种衍生物中，环孢菌素A的第9位的N-甲基-L-亮氨酸被γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸所取代，则该衍生物被表示为[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A。同时，残基以通用的缩写形式来表示。即MeLeu代表N-甲基-L-亮氨酸，Melle代表N-甲基-L-异亮氨酸，MeVal代表N-甲基-L-缬氨酸，MeAla代表N-甲基-L-丙氨酸，MeNva代表N-甲基-L-正缬氨酸，Leu代表L-亮氨酸，Ile代表L-异亮氨酸，而Sar代表肌氨酸。
目前，很多研究组织已经在研究将环孢菌素开发为毛发再生剂的可能性。具体而言，有关动物毛发再生实验、人簇状脱发症(humanalopecia areata)(J.Am.Acad.Dermatol.，1990，22：242-250)、人类男性型脱发症(J.Am.Acad.Dermatol.，1990，22：251-253和SkinPharmacol.，1994，7：101-104)、以及抑制化疗引起的脱发的动物模型(Am.J.Pathol.，1997，150：1433-1441)等研究已经在广泛进行。在小鼠背部进行的对比实验已经证实环孢菌素的毛发再生作用大约是米诺地尔的100倍。基于这些发现，已经在尝试使用环孢菌素治疗男性型脱发症，相应的专利申请已有很多。
例如，日本专利出版物Kokai No.Sho 60-243008、Sho 62-19512和Sho 62-19513揭示了环孢菌素衍生物作为毛发再生剂的用途。同时，欧洲专利出版物No.0414632 B1揭示了一种第8位残基经过修饰的环孢菌素衍生物，PCT专利出版物No.WO 93/17039和PCT专利出版物No.WO 00/51558分别揭示了异环孢菌素(isocyclosporin)和免疫抑制性环孢菌素衍生物，其中所提供的这些环孢菌素及其衍生物是作为毛发再生剂。此外，美国专利No.5,807,820和英国专利No.2,218,334 A提示含有经皮良好吸收的环孢菌素的制剂具有毛发再生剂的新用途。但是，上述文件中使用的所有环孢菌素均具有强烈的免疫抑制活性，因此，其在通常的脱发治疗方面的用途具有局限性，尽管其具有优良的毛发再生作用。近来，WO 00/51558揭示了一种使用非免疫抑制性环孢菌素衍生物治疗脱发的方法，但是本发明所要求保护的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的结构并未包括在其中。
发明内容
因此，为找到一种不存在现有技术中的缺点的新的毛发生长促进剂，本发明人检测了环孢菌素的主要代谢产物的毛发生长作用，并考虑了它们潜在的免疫抑制特性。这些经过检测的主要代谢产物包括M17(在第一位残基的一个η碳原子上增加了一个羟基的代谢物)、MeBmt、M21(第四位残基MeLeu(N-甲基-L-亮氨酸)的一个N-甲基被去除的代谢物)、以及M1(在第九位残基(MeLeu)的一个γ碳原子上增加了一个羟基的代谢物)。结果发现仅有M1显示出极好的毛发生长作用且其免疫抑制作用是降低的。根据常规的命名法，该M1被命名为[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A，已知其免疫抑制作用低于环孢菌素A(见Transplantation 1987；43：123-127、Clin.Chem.1990；36：225-229、以及Transplant.Proc.1988；20：575-584)。
因此，本发明涉及一种毛发生长促进剂，其包含一种环孢菌素A的代谢物作为活性成分，所述代谢物为[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A，其中第九位残基MeLeu的一个γ碳原子上增加了一个羟基，并以如下化学式(I)表示：
Figure A0280496800071
其中
A是N-甲基-(4R)-4-[(E)-2-丁烯基]-4-甲基-L-苏氨酸(MeBmt)、(2S，3R，4R，6E)-3-巯基-4-甲基-2-(甲氨基)-6-辛烯酸、或(2S，4R，6E)-3-氧-4-甲基-2-(甲氨基)-6-辛烯酸；
B是L-α-氨基丁酸(Abu)、L-丙氨酸(Ala)、L-苏氨酸(Thr)、L-缬氨酸(Val)、或L-正缬氨酸(Nva)；
C是肌氨酸、N-甲基-D-丙氨酸((D)-N(CH3)-CH(CH3)-CO-)、(D)-2-(甲氨基)戊-4-烯酰基((D)-(CH3)-CH(CH2CHCH2)-CO-)、(D)-2-(甲氨基)戊-4-炔酰基((D)-N(CH3)-CH(CH2CCH)-CO-)、(D)-甲硫基肌氨酸((D)-Sar(2-Sme)、(D)-N(CH3)-CH(SCH3)-CO-)、N-甲基-D-丝氨酸((D)-N(CH3)-CH(CH2OH)-CO-)、(D)-2-(甲氨基)丁醇基((D)-N(CH3)-CH(CH2CH3)-CO-)、N-甲基-D-正缬氨酸((D)-N(CH3)-CH(CH2CH2CH3)-CO-)、(D)-2-(甲氨基)己-4-炔酰基((D)-N(CH3)-CH(CH2CCH3)-CO-)或O-丙烯基-N-甲基-D-丝氨酸((D)-N(CH3)-CH(CH2OCH2CHCH2)-CO-)；
D是N-甲基-L-亮氨酸、γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸、或L-缬氨酸；
E是L-缬氨酸、或L-正缬氨酸；
F是N-甲基-L-亮氨酸、γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸、或L-亮氨酸；
G是L-丙氨酸或L-α-氨基丁酸；
H是D-丙氨酸或D-丝氨酸；
OHMeLeu是γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸；
I是N-甲基-L-亮氨酸、γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸、或L-亮氨酸；以及
J是N-甲基-L-缬氨酸或L-缬氨酸。
优选的具有毛发再生活性的上述化学结构式1的环孢菌素的代谢物为以如下化学式(II)表示的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A化合物：
Figure A0280496800081
其中
MeBmt是N-甲基-(4R)-4-[(E)-2-丁烯基]-4-甲基-L-苏氨酸；
A’是L-α-氨基丁酸(Abu)、L-丙氨酸(Ala)、L-苏氨酸(Thr)、L-缬氨酸(Val)、或L-正缬氨酸(Nva)；
B’是肌氨酸、N-甲基-D-丙氨酸((D)-N(CH3)-CH(CH3)-CO-)、D-2-(甲氨基)戊-4-烯酰基((D)-N(CH3)-CH(CH2CHCH2)-CO-)、(D)-2-(甲氨基)戊-4-炔酰基((D)-N(CH3)-CH(CH2CCH)-CO-)、或D-甲硫基肌氨酸(D-Sar(2-Sme)、(D)-N(CH3)-CH(SCH3)-CO-)、N-甲基-D-丝氨酸((D)-N(CH3)-CH(CH2OH)-CO-)、(D)-2-(甲氨基)丁醇基((D)-N(CH3)-CH(CH2CH3)-CO-)、N-甲基-D-正缬氨酸((D)-N(CH3)-CH(CH2CH2CH3))-CO-)、(D)-2-(甲氨基)己-4-炔酰基((D)-N(CH3)-CH(CH2CCH3)-CO-)、或O-丙烯基-N-甲基-D-丝氨酸((D)-N(CH3)-CH(CH2OCH2CHCH2)-CO-)；
C’是N-甲基-L-亮氨酸、γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸、或L-缬氨酸；
D’是L-缬氨酸或L-正缬氨酸；
E’是N-甲基-L-亮氨酸、γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸、或L-亮氨酸；
F’是L-丙氨酸或L-α-氨基丁酸；
G’是D-丙氨酸或D-丝氨酸；
OHMeLeu是γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸；
H’是N-甲基-L-亮氨酸、γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸、或L-亮氨酸；以及
MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。
更优选的具有毛发再生活性的上述化学结构式1的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A为以如下化学式(III)表示的化合物：
Figure A0280496800101
其中
MeBmt是N-甲基-(4R)-4-[(E)-2-丁烯基]-4-甲基-L-苏氨酸；
A”是L-α-氨基丁酸(Abu)、L-丙氨酸(Ala)、L-苏氨酸(Thr)、L-缬氨酸(Val)、或L-正缬氨酸(Nva)；
Sar是肌氨酸；
MeLeu是N-甲基-L-亮氨酸；
Val是L-缬氨酸；
B”是N-甲基-L-亮氨酸或L-亮氨酸；
Ala是L-丙氨酸；
DAla是D-丙氨酸；
OHMeLeu是γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸；
C”是N-甲基-L-亮氨酸或L-亮氨酸；以及
MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。
而更优选的具有毛发再生活性的上述化学结构式1的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A为以如下化学式(IV)表示的化合物：
其中
MeBmt是N-甲基-(4R)-4-[(E)-2-丁烯基]-4-甲基-L-苏氨酸；
Abu是L-α-氨基丁酸；
Sar是肌氨酸；
MeLeu是N-甲基-L-亮氨酸；
Val是L-缬氨酸；
DAla是D-丙氨酸；
OHMeLeu是γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸；以及
MeVal是N-甲基-L-缬氨酸。
另一方面，本发明涉及以包含[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A作为具有毛发生长促进作用的活性成分的组合物所配制的液体配方、喷剂、凝胶、糊剂、乳剂、油剂、护发剂或洗发液。
附图说明
通过下面的详细描述结合附图，将使得本发明的上述以及其他的目的、特征和优点被更清楚的理解。在附图中：
图1是对[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A进行高压液相层析分析的一个结果；
图2是[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的1H-NMR频谱；
图3是[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的13C-NMR频谱；
图4是动物实验中的对照组的照片，该实验使用C57BL/6小鼠来测定环孢菌素A和[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发生长作用；
图5是动物实验中的环孢菌素A处理组的照片，该实验使用C57BL/6小鼠来测定环孢菌素A和[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发生长作用；以及
图6是动物实验中的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A处理组的照片，该实验使用C57BL/6小鼠来测定环孢菌素A和[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发生长作用。
具体实施方式
下面对本发明进行详细的描述。为研制一种新的毛发再生剂，
本发明人制备了多种环孢菌素的代谢物，并对这些代谢物进行了毛发再生评价测试。结果发现[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发再生(恢复)作用较其他的化合物更为出色。
以下的实施例例证性地说明了本发明人所预期的实施本发明的最佳方式。但是，本领域人员能够理解，可能出现的各种修饰、添加和取代并未脱离本发明的范围和精神。
对比例
对比例1
代谢产物M21([Leu4]环孢菌素A)的制备
使用沉淀剂苯并***-1-基-氧-tris-(二甲氨基)-鏻六氟磷酸盐(benzotriazol-l-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluoro-phosphate)和二甲基氨基吡啶对十肽(H-Val-MeLeu-Ala-(D)Ala-MeLeu-MeLeu-MeVal-MeBmt(Ac)-Abu-Sar-Ome)与Boc-Leu-OH进行浓缩(condense)。用氢氧化钠(NaOH)和三氟乙酸(TFA)对所得到的十一肽进行脱保护。然后以苯并***-1-基-氧-tris-(二甲氨基)-鏻六氟磷酸盐和二甲基氨基吡啶对产物进行环化反应以形成取代的环孢菌素A-乙酸盐，以甲氧基钠(NaOMe)处理后者以去除乙酰基。这样便制得了代谢物M21，即[Leu4]环孢菌素A，其中第四位的N-甲基-L-亮氨酸的一个甲基被去除。如测试例1中的实验所示，M21不具有毛发生长作用。
对比例2
代谢物M17(第一位的MeBmt的一个η碳原子上添加了一个羟基的代谢物)的制备
将环孢菌素A的第一位的羟基与乙酸酐反应以合成[O-乙酰基]1环孢菌素A。在存在催化剂偶氮二异丁腈(azobisisobutyronitrile)的条件下，将产物与N-溴代丁二酰亚胺(N-bromosuccinimide)进行回流加热以合成[O-乙酰基-6-溴]1环孢菌素A。将产物加入到溶剂乙基甲基酮中，在存在催化剂混合物四丁基乙酸铵(tetrabutylammonium acetate)和碘化钠的条件下加热，合成[6-乙酸基-O-乙酰基]1环孢菌素A。以0.5M甲氧基钠将产物去乙酰化而合成M17。通过质谱仪和NMR频谱分析鉴定所得到的M17。如测试例1的实验所示，M17不具有毛发生长作用(J.Org.Chem.1992；57：2689-2691)。
实施例1
[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的制备
在本实施例中，描述了经过微生物转化后具有毛发再生作用的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的制备。
使用自养假诺卡氏菌(Pseudonocardia autotrophica)KCTC 9441作为制备环孢菌素A代谢物的菌株。将该菌株培养于含0.7％葡萄糖、0.45％酵母提取物、0.5％麦芽膏、1.0％可溶淀粉以及0.005％CaCO3的培养基中，培养温度为27℃。
使用一个发酵罐来培养该菌株，正式的培养开始前先在Erlenmeyer培养瓶中进行为期4天的预培养。正式的培养在一个4L的发酵罐中进行，使用如上所述所培养基。正式培养开始后24小时，添加溶解于甲醇中的环孢菌素A至浓度达到100mg/l，接下去再培养72小时。届时，使用与全部培养基等量的乙酸乙酯对培养基进行抽提，然后对有机相进行浓缩。通过液相层析对浓缩物进行分离和分级(fractionate)。显示出环孢菌素衍生物的液相层析洗脱图如图1所示。图1中，在保留时间为22～23分钟时所观察到的峰相应于环孢菌素A，而15分钟时的峰相应于[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A。
在此，将变化的溶剂A和溶剂B的混合物通过C-18柱以分离所述的衍生物。首先，保持溶剂A的浓度在100％达2分钟，然后在4分钟时将浓度降至60％，再在60分钟时降至39％，然后在65分钟时回到100％。溶剂A为25％的甲醇水溶液，溶剂B为100％的乙腈。
同时，所述的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A可用微粒酶自兔肝脏制备。
首先，取新西兰白兔的肝脏并浸没于0.1M磷酸钾缓冲液中达5分钟。将切碎的肝组织用匀浆器进行研磨然后离心(9000g，4℃，20分钟)。分离上清液并在此离心(10,500g，1小时)。去上清液，将沉淀溶解于0.1M磷酸盐缓冲液(PBS)。所得溶液被用作酶的来源。所制备的微粒体酶(50mg)、环孢菌素(1mg)和NADPH(5mM)被加入到适量的蒸馏水中并在37℃水浴中反应1小时。以等体积的乙酸乙酯对反应物进行提取并进行分析。
[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的结构分析
根据FAB MS(ZMS AX 505H)对[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A(C62H111N11O13)进行分析，在m/z 1219[M+H]+观察到一个峰，说明该分子中添加了一个氧原子。同时，该产物的结构通过1H-NMR(Bruker NMR 600MHz)(图2)和13C-NMR(Bruker NMR 150MHz)(图3)进行鉴定。
配方
配方1：
含有[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发新生增强剂(hair revitalizing tonic)的制备
制备如表1所述的三种毛发新生增强剂。根据下面所述的测试例1的动物实验测定这些增强剂的毛发再生作用。该动物实验显示，组合物1具有与一种含0.1％的环孢菌素A的毛发新生增强剂相当的毛发再生作用。
表1
成分    组合物1   组合物2   组合物3
乙醇    40.0   40.0   40.0
[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A 0.1 1.0 8.0
维生素E醋酸盐    0.1   0.1   0.1
水杨酸    0.3   0.3   0.3
L-薄荷醇    0.3   0.3   0.3
吐温-20    0.5   0.5   0.5
芳香剂    适量   适量   适量
着色剂    适量   适量   适量
水    添加至100wt％
配方2：
含有[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的发乳的制备
制备如表2所述的三种发乳。将油相成分混合并在80℃加热，以使得这些成分形成一种均质的混合物。另将水相成分混合并在80℃加热，以使得这些成分形成一种均质的混合物。将所制备的这两种80℃的混合物合并，并进行乳化。令所得到的乳剂冷却至室温，再加入芳香剂和着色剂以形成发乳。此时再加入水以补足该发乳的体积。
根据下面所述的测试例1的动物实验测定这些发乳的毛发再生作用。该动物实验显示，表2中所述的、含有0.1％的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的组合物1具有与一种含0.1％的环孢菌素A的发乳相当的毛发再生作用。
表2
成分     组合物1   组合物2     组合物3
石蜡     5.0   5.0     5.0
Setostearylalcohol     5.5   5.5     5.5
矿物油     5.5   5.5     5.5
甘油-单硬脂酸     3.0   3.0     3.0
聚氧乙烯辛基十二烷醚     3.0   3.0     3.0
对羟苯甲酸丙酯     0.3   0.3     0.3
[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A     0.1   1.0     8.0
甘油     7.0   7.0     7.0
二丙二醇     20.0   20.0     20.0
聚乙二醇     5.0   5.0     5.0
水     添加至100wt％(不包括芳香剂及着色剂)
芳香剂     适量   适量     适量
着色剂     适量   适量     适量
配方3：
含有[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的洗发水的制备
制备如表3所述的洗发水。将除芳香剂、着色剂和水以外的成分混合并搅拌加热以使得这些成分形成均质的混合物。令所得到的乳剂冷却至室温，再加入芳香剂和着色剂。最后再加入水以补足洗发水的体积。
表3
成分   组合物1   组合物2   组合物3
Sodium POE十二烷基硫磺酸(30wt％水溶液) 40.0 40.0 40.0
棕榈油脂肪酸二乙醇胺 3.0 3.0 3.0
丙二醇   2.0   2.0   2.0
甲基对羟基苯甲酸   0.2   0.2   0.2
乙醇   2.0   2.0   2.0
[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A 1.0 3.0 10.0
水杨酸   0.3   0.3   0.3
L-薄荷醇   0.3   0.3   0.3
芳香剂   适量   适量   适量
着色剂   适量   适量   适量
水   添加至100wt％
配方4：
含有[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的护发剂的制备
制备如表4所述的三种护发剂。将油相成分混合并在80℃加热，以使得这些成分形成一种均质的混合物。另将水相成分混合并在80℃加热，以使得这些成分形成一种均质的混合物。将所制备的这两种80℃的混合物合并，并进行乳化。令所得到的乳剂冷却至室温，再加入芳香剂和着色剂以形成护发剂。此时再加入水以补足该护发剂的体积。
表4
成分   组合物1   组合物2   组合物3
十六烷醇   3.0   3.0   3.0
自行乳化的甘油-单硬脂酸   2.0   2.0   3.0
鲨烯   10.0   10.0   10.0
[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A 1.0 5.0 10.0
丙二醇   2.0   2.0   2.0
十八烷二甲苯氯铵(25wt％水溶液) 8.0 8.0 8.0
甲基对羟基苯甲酸   0.2   0.2   0.2
水杨酸   0.3   0.3   0.3
L-薄荷醇   0.3   0.3   0.3
水   添加至100wt％
芳香剂   适量   适量   适量
着色剂   适量   适量   适量
测试例1
检测[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发再生作用
使用鼠龄在42～49天C57BL/6小鼠(雌性)进行检测。
使用电剃须刀去除小鼠背部的毛发，并称量体重。将小鼠分成若干组，每组的体重分布相等。经过一天的适应，将环孢菌素A、环孢菌素A的主要代谢物例如[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A、M17、M21、和对照剂应用于毛发去除部位，每只小鼠每天用一次，共30天。在此，所用的环孢菌素A及其主要代谢物的量为100μl(0.05％w/v)。用肉眼判断毛发生长的程度，并拍摄小鼠侧面的照片。图4显示的为使用C57BL/6小鼠测量环孢菌素A和[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发生长作用的动物实验的对照组的照片。图5显示的为使用C57BL/6小鼠测量环孢菌素A和[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发生长作用的动物实验的环孢菌素A处理组的照片。图6显示的为使用C57BL/6小鼠测定环孢菌素A和[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的毛发生长作用的动物实验的[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A处理组的照片，发现其结果与未经转化的环孢菌素A的结果相当。而代谢物M17和M21未显示出明显的作用。
经过在为期20天的实验过程中对小鼠背部情况进行观察，在对照组和所有的处理组中均未观察到特殊的皮肤刺激。
测试例2
测定[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的免疫抑制作用
根据MLR方法(混合淋巴细胞反应方法，J.Antibiotics，1994，47：208-215)，使用得自健康正常成人并以植物血凝素(PHA，一种细胞***刺激物)处理过的外周血单核细胞(PBMC)进行免疫抑制测定。
将用丝裂霉素C处理(30μg/ml，30分钟)的一组细胞(4×106/ml)作为刺激细胞，与等量的未经处理的反应细胞组相混合。将混合的细胞培养4天。培养期间，用环孢菌素A及其衍生物处理混合的细胞，所述的衍生物包括[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A，浓度为10-6M～10-11M的系列稀释浓度。培养4天后，将3H-胸苷加入到混合物中，并继续培养16小时。然后测定掺入细胞内的胸苷的量(液体闪烁计数仪)，并计算各个环孢菌素的IC50(μg/ml)。
结果为，环孢菌素A的IC50(mg/ml)为0.035、0.025和0.030，而[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A为0.165、0.178和0.150。因此，可以看出[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的免疫抑制作用较环孢菌素A低，此结果与文献记载的数据一致(Transplantation 1987，43：123-127)。
同时，为测定对PHA刺激引起的细胞增殖的抑制能力，将系列稀释浓度为10-6M～10-11M的环孢菌素A及其衍生物(包括[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A)加入到预先经过PHA(10μg/ml)处理的单核细胞中(4×106/ml)，继续培养3天。然后，如同MLR方法，将3H-胸苷加入到细胞中，然后再培养16小时。培养后，计算各个环孢菌素的IC50(μg/ml)。环孢菌素A的IC50(μg/ml)为0.25、0.45和0.32，而[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A为1.23、2.25和1.50。因此，可以看出[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A的免疫抑制作用较环孢菌素A低。
根据以上结果，本发明的化合物被配制成液体配方、喷剂、凝胶、糊剂、乳剂、油剂、护发剂或洗发剂的形式。
本发明的毛发再生剂能够促进毛发再生的施用量为组合物总重量的0.01％至30％，优选地为0.1％至10％。
工业实用性
本发明的包含[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A作为活性成分的毛发生长促进剂具有极佳的毛发生长促进作用，其可产生出色的毛发恢复作用，而保持较低的免疫抑制作用。

Claims (2)

1、一种毛发生长促进剂，其包含[γ-羟基-N-甲基-L-亮氨酸9]环孢菌素A作为活性成分。
2、权利要求1的毛发生长促进剂，其配制形式选自由液体配方、喷剂、凝胶、糊剂、乳剂、油剂、护发剂和洗发剂组成的组。
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