CN1489476A - 生物材料制备方法及由此制备的制剂 - Google Patents

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Abstract

描述了制备包含包括生物材料如蛋白质、肽或活细胞在内的易潮材料的产品的方法，其至少包括下列步骤：(i)提供包含至少一种活性成分、糖聚合物和水溶性/易混合溶剂的包被液体；(ii)提供至少包含水溶性凝胶形成固体颗粒的一定量微颗粒；(iii)在适当装置的处理槽内使该一定量的微颗粒流态化从而形成该微颗粒的流化床；(iv)在饱和湿度条件下，从流化床下面向该流化床喷洒该包被液体以对该微颗粒进行包被；以及(vi)使包被的微颗粒进行干燥。也描述了组合物及多种应用。

Description

生物材料制备方法及由此制备的制剂
领域
本发明主要涉及生物材料的制备方法，并具体地、但并非唯一的涉及生物蛋白的制备方法。
背景
许多生物材料，例如蛋白质或完整细胞，它们可在如治疗和预防人和动物疾病或作为食物添加材料方面是有用的，但已知它们都存在有限的保存限期。一般认为，此限制是由于在贮存温度，如室温下蛋白质的不稳定性引起的。在冷藏温度(也即4℃-8℃)下保存，可延长某些蛋白质和/或细胞培养物的保存期，然而，即使是在这样的温度下，它们的保存期通常都少于18个月。
正如大家都意识到的，生物活性蛋白通常是以复杂的三维方式进行折叠，而每种蛋白的三维折叠方式都是唯一的。蛋白通常在三种水平上进行组织；一级结构，由以共价键结合的氨基酸残基组成的线性链组成(肽链)；二级结构，其中的肽链折叠成规则的模式(如α-螺旋，β-折叠片)；以及三级结构，其中折叠的链进一步进行自身折叠从而形成紧密的结构。此外，某些蛋白质由多条紧密排列的多肽链组成以形成所谓的四级结构。正是三级和/或四级结构赋予了蛋白质最终的生物活性。
蛋白的最终结构受多种环境因素所影响，例如，温度、pH、存在或不存在某些辅因子或金属、氧、酶、氧化或还原试剂的存在以及水或湿气的存在。如果条件不是最佳的，可能不会正确形成蛋白质或者蛋白质可能变性，这样其生物活性就会丧失或至少是受到了损失。
广义来讲，可认为动物、植物和微生物细胞为复杂的蛋白质材料，这是因为它们含有包被在细胞膜和/或细胞壁内的大量蛋白质，而细胞膜或细胞壁在细胞表面上展示额外的蛋白。与蛋白质一样，细胞的生存力依赖于它们存在的环境；例如，温度，pH，存在或不存在某些辅因子或金属，存在或不存在某些营养物、新陈代谢废物、氧、酶、氧化或还原剂，水的存在或潮湿程度可单独的或共同的作用来影响细胞的生存力。例如，由于它们在酸奶酪或作为人或动物健康营养产品中的普遍应用而具有重要商业价值的乳酸杆菌(Lactobacilli)和双歧杆菌(Bifidus)一般仅能在4℃下短时间存活。温度高于4℃时或在加热/冷冻干燥过程中，细菌会由于如脱水而死亡。一般认为，细菌细胞的主要死亡原因归因于细胞内和细胞表面上蛋白质的变性。
细胞培养物(包括细菌细胞培养物)和生物学蛋白质一般是溶液形式。然而，水可以时间和温度依赖型方式水解蛋白，使其变性和使其功能进行潜在丧失。对这样的培养物或蛋白质溶液脱水可能并不会增强它们的稳定性，因为在脱水过程中和在已知可发生脱水过程的高温下，蛋白质也可能变性。在解决这一问题的尝试中，应用了细胞培养物和蛋白质性溶液冷藏和冷冻干燥法。
工业上一般利用在真空下进行冷冻干燥(冷冻干燥)来制备用于疫苗等的蛋白。传统上，此方法包括通过在真空下将冰晶转化为水蒸汽(升华)，从生物蛋白溶液中去除冰晶从而对其进行冷冻。不幸的是此方法可对蛋白质的天然结构引起损伤。
为了帮助提高由冷冻干燥制备的生物蛋白的稳定性，可在产物制备中应用添加剂如缓冲液或稳定因子。然而，在冷冻干燥过程中，当经过几天时间溶液温度缓慢降至-20℃时，添加剂可在不同的冰点进行固化。结果，终产物变成了由不同层组成的良好而膨胀的蛋糕状物质，其中每一层表示一个单独的成分。其实，可利用物理和化学方法从中分离添加进来以保护生物蛋白的添加剂，从而使得它们在作为保护因子方面是没有用的。
另一种替代性方法为热喷雾干燥(spray-drying-using-heat)，其通常应用于食品和乳品工业中，以制备如干水果浓缩物和奶粉。此方法包括对着上升热气流从喷射塔顶端向下喷洒溶液薄雾。在小滴到达塔底之前，热空气去除了其中的水分。喷雾干燥一般是在入口空气温度超过190℃下进行操作的，产品温度可超过60℃。在此操作环境中，绝大多数生物蛋白或细胞，如细菌细胞都会变性。
本领域中已知的另一蛋白制备方法为超临界流体干燥法。在此方法中，生物制剂如肽、蛋白和核酸是维持在水溶液中，直至颗粒形成。当颗粒形成的时候，利用控制的氢键形成溶剂如乙醇、丙酮和异丙醇，在超临界流体溶剂混合物的临界点之上在二氧化碳中去除其中的水性溶剂。
流化床喷雾干燥是改动的热喷雾干燥技术。此方法一般用于药物和化学工业上来制备片剂颗粒和/或干燥热稳定性物质。此方法包括朝向大量干燥赋形剂从喷洒头上部向下喷洒含有活性物质的溶液的薄雾。同时，向上的热气流通过此赋形剂，以产生流化床。热空气在流化床底部除去了流态化的湿固体中的水分。
流化床喷雾干燥技术可用于制备在约50℃-60℃热稳定的药物蛋白。然而，蛋白的天然结构可能受到损害，相应的，蛋白可能会丧失所有的、或至少部分生物活性。
可能还有更多的问题与上述的流化床喷雾干燥相关；例如，安装在接近处理槽顶部的喷嘴需要在赋形剂物质流化床表面之上具有显著的清除率，这样这些物质才不会堵塞喷嘴；大量的包被物质或包含活性成分的液体可堵塞喷嘴的过滤***，从而导致处理损失；这样的顶部喷雾流化床操作仅仅对颗粒生产是理想的，而不适合用于喷雾包被目的。已经设计了流化床喷雾干燥装置，其可从处理槽底部喷出包含活性成分的液体。例如，设计了用于进行药丸包被(直径约为≥1mm的药丸)的Roto-processorTM(Aeromatic，Switzerland)以及用于包被核、颗粒、药丸和小片剂的AerocoaterTM processor(Aeromatic，Switzerland)。一般认为Roto-processorTM和AerocoaterTM都不适于用来进行微颗粒包被。
在本发明产生之前，在可用于制备生物蛋白和细胞的技术中，微包裹(microencapsulation)技术可为最有用的技术。一般来讲，其不需要较多的仪器，并且批量大小可小至10g-20g，从而使得其在制备并非大量的生物蛋白方面是有用的。此方法利用有机溶剂来溶解生物蛋白，随后可利用水包油包水(water-in-oil-in-water，w/o/w)或水包油包固体(solid-in-oil-in-water，s/o/w)乳剂法将生物蛋白包被在聚合微球体中。利用简单的过滤从中去除水分并蒸发掉溶剂后，蛋白被包被成固体微球体中。
微包裹技术已经用于在造纸工业中制备碳或自粘连纸，并且至少在日本，已经利用明胶微胶囊来包裹鱼或肉香料，由此生产食品如人造鱼卵及装饰性产品。
虽然大家认为微包裹法为制备用于储存和将来应用的生物蛋白和完整细胞的良好方法，但此技术在药物和生物技术工业仍然处于开发阶段。此技术有明显不足，这是因为蛋白很容易由于应用的溶剂和必需的乳化/匀浆处理而变性。此外，由于微胶囊核心中存留痕量溶剂，所以利用此方法制备的产品质量并不受欢迎；这些溶剂的痕量存在妨碍了利用此技术生产的产品的商品化。
如果能够生产在室温下基本稳定的生物活性蛋白和活细胞培养物，就可提高它们的保存期并避免进行冷藏。同时，可应用多种替代性药物投递方法，例如传统的口服投递、舌下投递、经鼻投递、经颊投递、经眼投递(occal)及甚至经皮投递。这些替代性给药方法可使通常应用的注射给药的侵害性最小化，从而创造大量商机来完全应用所有这些分子。
在说明书的最后收集了此处应用的出版物的详细目录。
发明目的
本发明的一个目的是提供改进的生物材料制备方法，以及利用此方法制备的生物材料，或至少为公众提供了有用的选择。
发明内容
本发明的一个方面提供了制备包含包括生物材料如蛋白质、肽或活体细胞在内的易潮材料的方法，其至少包括下列步骤：
(i)提供包含至少一种活性成分、糖聚合物和水溶性/易混合溶剂的包被液体；
(ii)提供至少包含水溶性凝胶形成固体颗粒的一定量微颗粒；
(iii)在适当仪器的处理槽内使该一定量的微颗粒流态化从而形成该微颗粒的流化床；
(iv)在饱和湿度条件下，从流化床下面向该流化床喷洒该包被液体以对该微颗粒进行包被；以及
(v)使包被的微颗粒进行干燥。
本发明中的方法进一步包含一或多个额外的包被步骤，其进一步利用肠衣、膜包衣、防潮包衣或掩味包衣来对微颗粒进行包被。
优选的，待包被的微颗粒是热干燥的。
优选的，活性成分包括蛋白、肽或细胞。
本发明中的包被液体优选的包括额外的组分如氨基酸、蛋白质、螯合剂、缓冲液、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、润滑剂和其他可补充其中包含的活性成分的功能或对活性成分进行稳定的添加剂。
优选的，该水溶性/易混合溶剂为甘油或丙二醇之一或两者皆选。
优选的，该糖聚合物选自下列之一：葡聚糖、果糖、水果糖(fruitose)、葡萄糖、转化糖(invert sugar)、乳糖醇(lactitol)、乳糖、麦芽糖醇(maltitol)、麦芽糖糊精(maltodextrin)、麦芽糖、甘露糖醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、异麦芽糖(isomalt)、木糖醇、聚葡萄糖(polydextrose)或它们的结合。
优选的，该水溶性凝胶形成固体颗粒包含下列至少一或多种：丙烯酸酯及衍生物、白蛋白、藻酸盐(或酯)、卡波姆(carbomers)、角叉菜胶、纤维素及衍生物、葡聚糖、糊精、明胶、聚乙烯吡咯烷酮及淀粉。
优选的，结合因子选自下列聚合物之一：丙烯酸酯及衍生物、白蛋白、藻酸盐(或酯)、卡波姆、角叉菜胶、纤维素及衍生物、葡聚糖、糊精、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉或它们的结合。
优选的，该方法是在Huttlin TurbojetTM涂层器中进行的。
优选的，产品处理重量超过流化床处理槽的50％w/v。更优选处理重量超过75％w/v。
优选的，此方法是在饱和湿度的环境中进行的。
优选的，此方法是在密闭无菌环境中的装置的处理槽内进行的。
优选的，此方法在无氧环境中进行。在这种情况下，处理槽内的空气可以氮气或另一合适的惰性气体来代替。
利用本文公开的方法制备了在室温下稳定的产物。优选的，该产物含有蛋白、肽或细胞中的至少一种。
优选的，该产物适合用于注射用组合物、舌下片剂、口服片剂、缓释舌下片剂、微胶囊、饲料预混物、子宫托、预先构成的固体剂型的鼻喷雾剂或滴剂、水性滴剂、洗眼液或滴眼剂、或皮肤清洗溶液。
此处描述了用于稳定生物材料的方法。
制备稳定的缓释片剂或微胶囊以利于包括人在内的动物摄取的方法。
制备用于对包括人在内的动物给药的片剂或微胶囊的方法，该片剂具有保护性肠衣。本发明中可应用的肠衣材料的示例包括醋酸邻苯二甲酸纤维素(cellulose acetate phthalate)、醋酸琥珀酸纤维素、醋酸偏苯三酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、醋酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素、醋酸邻苯二甲酸聚乙烯酯(polyvinyl acetatephthalate)、甲基丙烯酸/甲基丙烯酸甲酯共聚物及甲基丙烯酸/丙烯酸乙酯共聚物。
制备此处描述的在室温下基本稳定的抗腹泻药物的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定的生长促进剂制剂的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定的重量减轻药物的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定且含有β-1，3-葡聚糖的片剂或微胶囊的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定且含有红细胞生成素(EPO)的产物的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定且含有干扰素的产物的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定且含有双歧杆菌的产物的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定且含有乳酸杆菌(Lactobacilli)的产物的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定且含有乳酸杆菌和双歧杆菌的产物的方法。
制备此处描述的在室温下基本稳定且含有替代性益生菌(probiotics)或微生物的产物的方法。
利用此处描述的方法制备的在室温下基本稳定的产物。
包含由利用活性糖聚合物包衣层包被的微颗粒核心的组合物。
此处描述的组合物在投递生物材料至人或动物方面的应用。
本发明可广义的包括本申请说明书中提及的或指出的部分、成分及特征、两或多个该部分、成分或特征的任何或所有结合，若在本发明所属领域中已知等值的特定整数，则在此处这些等值整数都包含在本发明之内。
优选实施方案
本发明中所有新颖的方面中的这些和其他方面在仅以举例方式给出的下列描述中是显而易见的。虽然在此处没有明确的提及，但我们应当意识到在不偏离本发明的发明范围的情况下可对本发明作大量的改进。
背景
在利用流化床技术制造片剂的过程中，本发明的发明者们发现制备的片剂总是不含细菌，甚至是当原料中含有的细菌数目超过1000CFU/g(CFU＝菌落形成单位)时也如此。为了阐明对此明显的杀菌作用负责的处理参数，发明者们设计了下列概括描述的实验方案。
实验是在具有装备三底喷雾三组分喷嘴和标准的20微米滤袋的5L处理容器的Huttlin Turbojet流化床涂层器(BWI Huttlin，Daimlerstrasse 7，D-79585，Steinen，Germany)中进行的。乳酸杆菌的样本源自Chr.Hansen of 49 Barry Street，Bayswaster，Melbourne，Australia。1∶1的乳酸杆菌和双歧杆菌源自Gist-Brocade，Australia。这些细菌是厌氧菌，氧存在下很容易死亡。流化床的试验批量大小为4kg，两倍于适于5L Huttlin Turbojet处理容器的推荐重量，这样可保证流态物质与操作容器的过滤器紧密接触，从而给予细菌从20微米过滤器中逃脱的最好机会。固体核心(片剂颗粒核心材料)包含66％w/w葡萄糖、13％w/w明胶和15％w/w淀粉。包含细菌在内的喷雾液体包括1.16×1012CFU乳酸杆菌或3.5×1012CFU乳酸杆菌/双歧杆菌、3％w/w甘露糖醇、1％w/w白蛋白、1％w/w甘油、1％w/w磷酸钠缓冲液，并利用纯水补充体积至1000ml。
通过真空将固体核心材料装载到Huttlin Turbojet中并以250或300立方米空气/小时的速度进行流化。随后，以30g/分钟的速度将喷雾液体喷洒到处理容器中。此处理过程是在产品温度为40-45℃的条件下进行的。在40℃的产品温度下将材料干燥至水分含量少于5％。
研究者们发现，流态化速度设定在250立方米空气/小时的实验是不充分。当95％的液体喷洒到固体核心中时，在此速度下流态化的物质容易破碎。在300立方米空气/小时的速度下进行流态化克服了这个问题。
保留了在此处理过程中获得的颗粒样本，其他的颗粒在与标准的片剂润滑剂混合后压制成片剂。对颗粒和片剂进行分析以评估它们的活菌数量。得到的结果如下表1所示。
表1
样品描述 0时间时CFU/4kg中的理论活性 报导的0时间时CFU/4kg中的报导活性 在40℃下保存60天的CFU/4kg样品中的报导活性
Chr.Hansen颗粒 1.16×1012 1.70×1011 1.64×1011
Chr.Hansen片剂 1.12×1012 4.40×1011 4×1010
Gist-Brocade颗粒 3.52×1012 9.80×1010 4.80×1010(仅存在乳酸杆菌)(未检测到双歧杆菌)
Gist-Brocade片剂 3.44×1012 6.00×1010 1.2×1010(仅存在乳酸杆菌)(未检测到双歧杆菌)
发明者们非常吃惊地发现，在对细菌细胞进行颗粒和片剂制备、对细菌进行加热、通过20微米过滤器进行可能的完全通风、机械研磨、空气干燥和片剂压制处理后，在样品中检测到有活细菌细胞存在。这些实验中有大量细菌存活没有阐明为什么发明者们以前制备的片剂中不含任何细菌。另一方面，这些结果暗示了一种制备含有稳定形式的活体细菌的样品或产物的新颖方法。
乳酸杆菌和双歧杆菌培养物的供应者们指出这些细菌对温度极度敏感且热不稳定。当利用冷冻干燥法对这些培养物进行处理时，细菌数量可减少90-99％。此外，供应者也指出，这些细菌也对标准的片剂压制过程尤其敏感，相应的可观察到细菌活性进一步下降约99％。
因此，发明者们也发现了一种新颖的加热干燥法，其似乎优于已知的工业制备方法，如冷冻干燥。发明者们进一步发现，以此新颖的方式(也即在微胶囊中)处理的细菌可经受约5-8吨/平方英寸的片剂压制压力。
一般性描述
本发明提供了新颖的方法来干燥并保存易潮材料，尤其是包括微生物在内的生物材料如蛋白、肽和植物及动物细胞。概括来讲，此方法结合了流化床喷雾处理技术和微包裹(micro-encapsulation)技术。
概括来讲，此方法包括在高于室温的温度下，将包含至少一种感兴趣的活性成分、结合至少一种糖聚合物及易与水混合的/可溶的试剂的液体喷洒到在处理槽中被适当流态化的可接受的颗粒性赋形剂材料(微颗粒)上。该微颗粒的包被提供了活性成分的稳定的微包裹。
此处的“活性成分“一般包括蛋白质、肽和细胞。然而，与本发明相关的领域中的熟练技术人员可很容易的意识到可从本发明的制备中受益的其他材料或活性剂也可应用。我们应该意识到，此处的术语“蛋白质”、“肽”和“细胞”除了指这些物质的形式之外，还包括在实验室中利用化学合成或重组技术人工制得的形式。
微颗粒包括水溶性凝胶形成固体颗粒，优选具有粘附表面的微颗粒，这些颗粒是由可耐受相对高的湿度而不变成液体或半固体的天然或合成聚合物或单体组成。例如，这些微颗粒优选包含下述的至少一种：丙烯酸酯及其衍生物、白蛋白(例如卵清蛋白(卵白))、藻酸盐、卡波姆、角叉菜胶、纤维素及其衍生物、葡聚糖、糊精、明胶、聚乙烯吡咯烷酮(例如聚维酮(Povidone))、淀粉或其结合。优选的，微颗粒含有白蛋白、明胶及预凝胶(pregel)淀粉(例如预凝胶玉米淀粉)。微颗粒直径优选100微米，然而，我们意识到在发明中可应用其它大小；例如，50微米-1mm颗粒大小。应该指出，微颗粒的水溶性凝胶形成固体颗粒在此处成为“水凝胶核心”。
我们意识到，本发明中应用的微颗粒组合物确保了含有活性成分的液体喷雾物质有效结合到微颗粒表面而不产生聚集作用或损失。
在处理过程中，要求利用水蒸气对微颗粒进行饱和以确保不使颗粒表面过热并在其表面上形成一层薄膜。此组合物也具有优点，因为其以比硬表面颗粒相对慢的方式进行干燥并且也以连续的方式来形成完整的表面包被。
如上所简单描述的，喷雾或包被液体包含至少一种活性成分、糖聚合物和水溶性易混合溶剂。糖聚合物优选甘露糖醇、异麦芽糖(isomalt)、木糖醇、聚葡萄糖或葡聚糖。然而，依溶液中包含的活性成分的精确性质不同，可选用替代性的聚合物。合适的糖聚合物包括，如果糖、水果糖(fruitose)、葡萄糖、转化糖(invertsugar)、乳糖醇、乳糖、麦芽糖醇、麦芽糖、麦芽糖糊精、山梨醇、蔗糖、海藻糖、或它们的结合。水溶性/易混合溶剂优选甘油或丙二醇或两者；然而，与本发明相关的领域中普通的技术人员对本发明中适用的替代溶剂比较了解。
喷雾或包被液体也可含有额外的组分，例如其它蛋白质、氨基酸、稀释剂、螯合剂、缓冲液、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、润滑剂以及其他可进行反应来辅助其中含有的特定活性成分的功能或对其进行稳定的添加剂。这些额外的组分的性质要依赖于活性成分的性质。然而，每类组分的示例包括：氨基酸，赖氨酸、甘氨酸、L亮氨酸、异亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸；蛋白质，人血清蛋白、白蛋白(例如卵清蛋白(卵白))、明胶；缓冲液，多种磷酸钠缓冲液、柠檬酸/柠檬酸盐缓冲液、tris缓冲液；防腐剂，羟基苯甲酸衍生物；抗氧化剂，维生素E、抗坏血酸；润滑剂，可与水混合的硅氧烷/硅酸盐；螯合剂，柠檬酸、EDTA、EGTA。本领域中的那些熟练技术人员理解适于本发明中应用的大量其他的蛋白质、氨基酸、稀释剂、螯合剂、缓冲液、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、润滑剂。
此方法优选在封闭的无菌环境中进行。此处所用的“无菌环境”指基本上不含污染物的环境。一般来讲，“污染物”包括微生物等，然而，本领域中的熟练技术人员能理解也包括产品处理过程中最好不存在的其他一些物质。
实施此方法的环境中优选的不含有氧，以将如活性成分的氧化减少至最小。利用一种惰性气体，优选氮气来替代本发明方法中的处理过程实施的处理槽中含有的空气从而达到此目的。然而，我们应该意识到也可应用其它气体如二氧化碳。
如此前简述的，需要利用水分对微颗粒进行饱和。因此，此方法需要在饱和湿度的环境中实施。“饱和湿度环境”指使微颗粒表面开始溶解、从完全的固态变为基本为液态的环境。本发明中的水饱和是通过从上向水凝胶核心上喷洒包被液体来实现的。
本发明中的方法可在任何适当的流化床喷雾设备中施行。在此处的说明实施例中，应用了BWI Huttlin生产的CPU DrivenTurbojetTM Fluid Bed Coater(Daimlerstrasse 7，D-79585，Steinen，Germany)。与本发明相关的领域中的那些普通熟练技术人员熟悉这些设备。然而，如果需要，可从制造商处很容易的获得进一步的信息。
应该意识到，为了提高效率并有效的进行微包裹，可对本发明的工艺中应用的装置进行改进。例如，此处描述的实施例中应用的Huttlin Turbojet进行了如下常规改进：
·对喷嘴进行了重新设计，使得在设备操作过程中可取出喷嘴的中心部分(其可向处理槽传递液体喷雾)以进行清洗或清除喷嘴堵塞。此改进使得可进行连续操作。
·对标准的Huttlin Turbojet装置中的中心回气柱重排和换成圆锥样装置，使得在高速下流态化物质以旋涡样方式进行移动，而在低速下以涡流运动进行循环。这样的改进使得对微颗粒的包被得到改良。
·所有的接触表面皆进行了镜面抛光，使得在标准的原地清洗(Cleaning-In-Place)循环后可很容易的进行加热消毒。
·在现有的动力过滤***装置周围添加了朝向处理容器/槽壁内表面的额外的压缩空气喷嘴。此改进可提供从处理槽顶部沿处理槽内表面的连续压缩空气流，从而保证对处理容器内的工作表面进行连续清洗。此改进保证了此设备可进行连续操作而不需进行重复清洗。
·将处理空气设计成可在任何阶段导入再循环惰性气体如氮气而不是空气，进行流态化。此改进可降低生物蛋白氧化并提高厌氧菌的稳定性。
本发明的微包裹法采用了非传统的底部喷雾包***作。也即喷雾或包被液体是从处理容器底部向上喷射出去的。这样，实际上喷嘴是包埋在流化床内的。依赖于批量大小不同，可以有多达38个喷嘴同时运转。
以一定的方式对喷雾液体进行处理，使其转化为缠绕在流化床颗粒固体表面上的连续的玻璃膜(“生物玻璃”膜)。从液体到玻璃状固体的转化是迅速的，从而避免了生物蛋白或微生物体的变性。活性成分，例如生物蛋白或微生物体没有遭受热损害，因为热量随着水蒸发作用的潜伏热而带走了。
本发明中的方法优选的包括向处理槽内加入超重的微颗粒。在正常的流化床操作中，设备制造商推荐不要超过50％w/v的处理槽能力。例如，如果处理容器为100L，那处理物质的重量不应超过50kg。然而，本发明中的方法允许(并且优选)处理重量：容器体积大于50％w/v。这样，微颗粒的重量可作为筛子，这样当包被处理启动时，喷雾液体就不会穿过流态化微颗粒并穿过处理槽顶端的动力学过滤***。
本发明中的方法大体描述如下：
1利用真空将适当组成的固体水凝胶颗粒(微颗粒)装载到Turbojet中并进行流态化。可以200-500立方米/小时的速度进行流态化。
2在通高速处理空气的条件下，优选将微颗粒加热到30℃-80℃，更优选30℃-60℃，并持续1小时，使它们以旋涡样运动进行流态化，从而保证微颗粒内部干燥。
3将微颗粒温度优选降低到35℃-55℃，并且优选处理空气速度进行类似的降低，这样微颗粒以涡流型方式移动。
4当微颗粒温度达到优选的约40℃-50℃时，优选的利用惰性气体如氮气替代处理空气。此步骤优选的维持至少10分钟以保证所有空气为氮气所替代。
5将活性成分固定在适当的喷雾或包被溶液中。优选的将基础溶液加热到38℃以使固体完全溶解。在进行Turbojet喷雾包被前，将生物材料添加到基础溶液中(以大约60rpm进行混匀)并混合均匀。
6随后，优选的以高速(优选在可能达到的最高速度)将所需量的包被溶液经Turbojet喷雾包被到流态化的微颗粒上，这样微颗粒为水蒸气所饱和但仍可以涡流方式自由流动。优选的以30g-60g/分钟的速度进行喷雾包被。该包被溶液或液体是从流化床下喷洒到微颗粒上的。
7当微颗粒为水蒸气所饱和时，优选的将Turbojet包被速度下降到10g-20g/min，从而保证微颗粒流化床以涡流方式连续流动。这样，含有生物蛋白的包被溶液可在如不含水分的氮气环境中连续脱水。一般将产品干燥至水活度小于0.25。
大家应该意识到，可对上述处理步骤和参数进行改变以适应多种产品形式的生产或包含不同活性成分的产品的生产。例如可进行的变更为：入口处理空气温度、产品温度、流态化空气体积、液体喷雾温度、喷雾液体温度、喷雾液体粘度、喷雾液体的固体含量、总核心表面积、核心的水溶解度、入口空气的湿度、压缩空气喷雾压力、装置过滤器孔径、以及自动清尘频率。对一个参数进行改变时，与本发明相关的领域中的普通熟练技术人员可很容易的进行其他相应的调节以使另一参数对第一个参数改变进行补偿。此外，通过提高水凝胶核心的分子量可获得缓释固体制剂。
此外，为了获得具有所需特性的产品，可向本发明的上述一般步骤中添加额外的包被步骤。例如，在干燥步骤之前或之后，可利用另外的包衣对生成的产品或微胶囊进行包被。与本发明相关的领域中的那些熟练技术人员会立刻意识到如此处理将会受益的场合；例如，如果生成的产品需要进行口服给药，那可利用能保护产品免于在胃中降解的肠衣和/或使其中的活性成分持续释放或缓释的那些包被。一般来讲，这些额外的包被可在与利用最初的包被液体包被微颗粒的速率类似的速率实现的。
进行处理的批量大小可因选用的装置的处理槽体积以及是否需要过量装载而变化。在此处描述的实施例中，批量大小一般为4kg。“批量大小”指产品处理过程中应用的总的固体物，包括微颗粒、包被溶液以及用于进行产品配制的任何额外包被溶液中包含的组成固体物。因此，正如此处所用的，特定组分的百分比是以占总批量大小的百分比来表示的。
根据此处提供的实施例，显然可以作多种其他的改进。
通过参照下列特定非限制性实施例和图表，对本发明进行了进一步的阐述。
在下列图中：
图1：在大白鼠体内进行EPO舌下投递。将以从取出的血液样本中测定的以1010/L表示的网织红细胞计数相对于治疗时的天数或治疗后的天数作图。
正常范围以(两条粗线)来描述；
在第一天对治疗组进行50IU皮下注射(中间具有菱形的线)；
在第一、二和三天舌下投递125IU EPO(中间具有正方形的线)；
在第一、二、三、四和五天舌下投递125IU EPO(中间具有浅色三角形的线)。
图2：展示了在4℃(菱形贯穿其中的线)及室温(正方形贯穿其中的线)下EPO片剂在9个月内的稳定性。
实施例
实施例1：微生物的稳定性
实施例1A
从最初购自Sine Pharmaceutical Co.，Ltd.#905，Xinjinqiao Rd.，Pudong，Shanghai，P.R.China的3000L液体培养物中获得了8L活体双歧杆菌培养物。制造商提供的数据表明，3000L发酵液含有总共3×1016CFU(菌落形成单位)并且产生总共含有2.16×1014CFU双歧杆菌的约8.3kg冷冻干燥物质；也即，在冷冻干燥后，活体菌群大约减少了99％。
当培养物样本运达实验室后，在4℃对其进行稳定性测定。在0时间点时记录下2.43×1016CFU/3000L。在4℃下贮存14天后，数量减少到1.5×1014CPU/3000L；也即，在4℃下贮存贮存两周后，1500个细胞中约有1个细胞存活下来。
依照本发明，以下列方式对含有多种糖添加剂(如下所述)的液体培养基进行处理：
1利用真空将固体微颗粒核心(水凝胶核心)物质装载到HuttlinTurbojet中。
2对微颗粒进行流态化并加热至60℃ 1小时。
3将微颗粒核心温度降到40-45℃。
4利用氮气置换处理空气并持续通氮气10分钟。
5以300立方米空气/小时的速度使微颗粒流态化。
6在饱和湿度条件下，利用turbojet以30g/min的速度将双歧杆菌包被液包被到水凝胶核心颗粒上。
7将生成的产物干燥至小于0.25水活度。
8在0时间点和在4℃、25℃和40℃下贮存后测定包被的微胶囊样品。
利用下列微颗粒、或水凝胶核心及包被液配方的四种不同组合来进行此生物包裹(bioencapsulation)过程。
SINE RX1                  4kg批量
水凝胶核心1
葡萄糖                    2.64kg
明胶                      0.52kg
淀粉                      0.60kg
包被液体1
1×1010CFU双歧杆菌
甘露糖醇                  0.20kg
磷酸钠缓冲液              0.04kg
补充纯水至                1.00kg
SINE RX2                  4kg批量
水凝胶核心2
葡萄糖                  2.44kg
明胶                    0.52kg
淀粉                    0.60kg
卵清蛋白                0.20kg
包被液体2
1×1010CFU双歧杆菌
甘露糖醇                0.20kg
磷酸钠缓冲液            0.04kg
补充纯水至              1.00kg
SINE RX3                4kg批量
水凝胶核心3
葡萄糖                  2.44kg
明胶                    0.52kg
淀粉                    0.60kg
卵清蛋白                0.20kg
包被液体3
1×1010CFU双歧杆菌
葡聚糖                  0.20kg
磷酸钠缓冲液            0.04kg
补充纯水至              1.00kg
SINE RX4                4kg批量
水凝胺核心4
葡萄糖                  2.44kg
明胶                    0.52kg
淀粉                    0.60kg
    卵清蛋白            0.20kg
包被液体4
1×1010CFU双歧杆菌
卵清蛋白                0.20kg
磷酸钠缓冲液            0.04kg
补充纯水至              1.00kg
记录的结果如表2所列，并以等同于3000L初始浓度的CFU表示。
表2
  配方代码 生物包裹前0时间点 生物包裹后0时间点    生物包裹后4周
  SINE RX1，4℃     1.5×1014     6.00×1012     6.00×1013
  SINE RX2，4℃     1.5×1014     2.70×1012     3.69×1013
  SINE RX3，4℃     1.5×1014     2.70×1012     9.90×1012
  SINE RX4，4℃     1.5×1014     1.41×1013     1.29×1012
  平均值     2.99×1013
  SINE RX1，25℃     1.5×1014     6.00×1012     1.38×1013
  SINE RX2，25℃     1.5×1014     2.70×1012     2.04×1013
  SINE RX3，25℃     1.5×1014     2.70×1012     6.30×1011
  SINE RX4，25℃     1.5×1014     1.41×1013     6.00×1012
  平均值     1.02×1013
  SINE RX1，40℃     1.5×1014     6.00×1012     ＜10000
  SINE RX2，40℃     1.5×1014     2.70×1012     4.5×1011
  SINE RX3，40℃     1.5×1014     2.70×1012     ＜10000
  SINE RX4，40℃     1.5×1014     1.41×1013     ＜10000
结果表明，在本发明的处理后存活的活体双歧杆菌要较传统的冷冻干燥法多。SINE RX2反应给出了最好的稳定性结果。
研究者们发现，在对Sine RX1进行处理的过程中，水分并非有效的为水凝胶核心中的葡萄糖所吸收。当向水凝胶核心配方中添加白蛋白(见RX2-RX4)时，处理结果是令人满意的。
实施例1B
从Sine Pharmaceutical Co.，Ltd.#905，Xinjinqiao Rd.，Pudong，Shanghai，P.R.China进口了另外的双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)6-1。研究者们认为，实施例1A中应用的培养物含有某些可促成最终的生物包裹固体微胶囊中的细菌不稳定的废物。因此，本实施例中应用的培养物已经去除了所有废物，并进行了浓缩和重悬浮在缓冲溶液中。在培养物从制造商处运达实验室时进行检验，并且在应用前也对样本进行检验。结果表明细菌计数为4.1×108CFU/L。
SINE RX6                4kg批量
水凝胶核心6
预凝胶玉米淀粉          3.10kg
卵清蛋白                0.40kg
包被液体6
双歧杆菌8.2×108CFU
甘露糖醇                0.10kg
甘油                    0.30kg
海藻酸钠                0.06kg
磷酸钠缓冲液            0.04kg
补充纯水至              1.00kg.
SINE RX7                4kg批量
水凝胶核心7
预凝胶玉米淀粉          2.44kg
明胶                    0.52kg
淀粉                    0.60kg
卵清蛋白                0.20kg
包被液体7
双歧杆菌4.2×108CFU
甘露糖醇                0.05kg
甘油                    0.15kg
海藻酸钠                0.06kg
磷酸钠缓冲液            0.04kg
补充纯水至              1.00kg
SINE RX8                4kg批量
水凝胶核心8
预凝胶玉米淀粉          2.54kg
明胶                    0.52kg
淀粉                    0.60kg
卵清蛋白                0.20kg
包被液体8
双歧杆菌4.2×108CFU
甘露糖醇                0.025kg
甘油                    0.075kg
磷酸钠缓冲液            0.040kg
补充纯水至              1.00kg.
SINE RX9                4kg批量
水凝胶核心9
预凝胶玉米淀粉          2.52kg
明胶                    0.52kg
淀粉                    0.60kg
卵清蛋白                0.20kg
包被液体9
双歧杆菌4.2×108CFU
甘露糖醇                0.025kg
甘油                    0.075kg
海藻酸钠                0.020kg
磷酸钠缓冲液            0.040kg
补充纯水至              1.00kg
按照实施例1A中应用的实验操作实施此处理。
记录的结果如下表3所列，并以4kg微胶囊中的CFU表示。
表3
配方代码 生物包裹前0时间点 生物包裹后0时间点 生物包裹后2个月
SINE RX6，4℃     8.4×108     1.56×108     2.24×108
SINE RX7，4℃     4.2×108     5.32×107     6.00×107
SINE RX8，4℃     4.2×108     4.72×107     4.04×107
SINE RX9，4℃     4.2×108     4.48×107     2.36×107
SINE RX6，25℃     8.4×108     1.56×108     1.64×108
SINE RX7，25℃     4.2×108     5.32×107     1.56×107
SINE RX8，25℃     4.2×108     4.72×107     2.76×107
SINE RX9，25℃     4.2×108     4.48×107     1.40×107
SINE RX6，40℃     8.4×108     1.56×108     ＜100
SINE RX7，40℃     4.2×108     5.32×107     ＜100
SINE RX8，40℃     4.2×108     4.72×107     ＜100
SINE RX9，40℃     4.2×108     4.48×107     ＜100
结果表明，向水凝胶核心颗粒中添加甘油进一步增强了双歧杆菌的生物稳定性。研究者们观察到，向包被液体中添加藻酸盐可改善流态化，但并没有显著影响终产物中细菌的稳定性。
从本实施例获得的结果再一次表明，本发明中的方法优于目前应用的处理技术如冷冻干燥；在SINE RX6中，研究者们发现经过本发明的处理方法后有1/5的细菌存活下来，而利用传统的冷冻干燥法只有1/100的存活。
实施例2：酶的稳定性
酶为已经在多种工业中应用的生物蛋白；例如，它们可应用于食品加工业、作为动物饲料添加剂以及作为人和动物药物。
实施例2a：将稳定化的酶掺入饲料中作为生长促进剂(酶生长促进剂2).
酶如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及纤维素酶，是例如普通的动物饲料添加剂。这些酶有助于帮助提高饲料的生物利用率。
动物饲料常常被制成在其中混合有酶、以及维生素和矿物质如硫酸铜和铁。随后一般通过蒸汽注入和挤出而将饲料码垛堆积(palletisation)。饲料码垛堆积过程中的操作温度可达到高于80℃并持续约10分钟。在这样的条件下，混合物中添加的许多酶可能变性。此外，当这些饲料进入动物胃部，许多酶会由于其中的酸性环境而变性。
为了计算由于饲料码垛堆积和胃内酸性环境造成的酶活性损失，现行操作是向饲料预混物中添加大量的酶，以期至少某些酶能够保存活性。
因此，虽然动物饲料中应用酶在理论上是有益的，但已证明其效力并不与其经济投入相一致。
当添加的酶受到足够保护而免于遭受它们可能暴露于其中的有害环境因素时，才可能有显著的经济和生长收益。澳大利亚专利申请AU07872187中描述了包含具有包裹在水溶性膜中、并包被有保护性肠衣的核心的微颗粒的生长促进剂，此核心由一或多种固定化的酶组成。这样的产品可有助于克服与饲料酶的降解相关的问题。
AU07872187描述了上段描述的产物的制备方法，其通常包括冷冻干燥和研磨。本实施例证明，本发明中的方法可用于制备同样的产品，并可显著降低生产成本。
4kg批量大小(％w/w)的酶生长促进剂2的配方如下：
水凝胶核心：预凝胶玉米淀粉67.5％，聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)10％。
包被液体：蛋白酶2×105 Vitapharm蛋白酶单位，淀粉酶4.3×106 Vitapharm淀粉酶单位，脂肪酶50 Vitapharm脂肪酶单位，纤维素酶2×104 Vitapharm纤维素酶单位，甘露糖醇2.5％，甘油7.5％，聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)1.5％，pH7的磷酸钠缓冲液1％，补充纯水至1kg。
肠包衣溶液(1L批量)：醋酸邻苯二甲酸纤维素10％，加氢氧化钠调节pH6，100％纯水。
最后酸漂洗溶液：柠檬酸，调节至pH3，补充纯水至1L。
本实施例中的生长促进剂优选的以1kg/吨饲料的比率添加。
按照下列实验步骤对本发明中的生长促进剂进行制备：
1利用真空将水凝胶核心物质装载到Huttlin Turbojet处理槽中，进行流态化并加热至60℃ 1小时。
2将水凝胶核心产品温度降至45℃。
3以300立方米/小时的速度对处理槽内的物质进行流态化。
4在饱和湿度条件下，利用turbojet以30g/min的速度将包被溶液包被到水凝胶核心上。
5将产品干燥到少于5％的水分含量。
6利用turbojet以30g/min的速度将肠包衣溶液包被到核心上。
7利用turbojet以30g/min的速度将柠檬酸溶液包被到核心上。酸进行反应后将醋酸邻苯二甲酸纤维素钠重新转化为醋酸邻苯二甲酸纤维素，从而为酶提供了对胃的肠衣保护。
相对于前述AU07872187中描述的处理方法，发明者们发现本发明中的方法仅需1/10的处理时间，并且可降低高达50％的生产成本。
此外，值得注意并且观察到此方法不应用任何有机试剂或醛，整个生产可在密闭环境中一步完成，操作人员暴露于酶的时间大大减少，并且仅仅一半量的醋酸邻苯二甲酸纤维素即可提供同样的肠道保护。
此外，利用此方法获得的产物可在室温下两年内保持稳定。
通过提供如额外的最终5％w/w石蜡包被，如低熔点聚乙烯二醇(macrogol)或PEG，可对本实施例中的制剂和方法进行改进。在这种情况下，研究者们相信，微胶囊可在制粒过程之前掺入到饲料混合物中，而对酶结构的破坏很小，甚至没有；额外的石蜡包被能够抵抗短促的阵发蒸汽，从而可吸收制粒过程中应用的大部分热量。
实施例2b稳定的酶作为减重增补剂
在用以确定上述生长促进剂2的适当剂量比的研究过程中，研究者们观察到在1kg/吨饲料剂量时取得了最佳的饲料转化。然而，当剂量比升高并达到1kg/吨饲料时，研究者们注意到生长促进剂制剂诱导了显著的减重。
因此，制备了减重增补剂并在人身上进行了两次开放试验。
减重增补剂包括：                   4kg批量
水凝胶核心
预凝胶玉米淀粉                     2.70kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)             0.40kg
包被液体
蛋白酶2×106 Vitapharm蛋白酶单位
淀粉酶4.3×107 Vitapharm淀粉酶单位
脂肪酶500 Vitapharm脂肪酶单位
纤维素酶2×105 Vitapharm纤维素酶单位
甘露糖醇                           0.10kg
甘油                               0.30kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)             0.06kg
pH7的磷酸钠缓冲液                  0.04kg
补充纯水至                         1.00kg
肠包衣溶液
醋酸邻苯二甲酸纤维素               0.40kg
利用氢氧化钠调节至pH6
补充纯水至                         4kg
最终酸漂洗溶液
利用柠檬酸调节至pH3
补充纯水至                         1.00kg
利用上述用于制备酶生长促进剂2的实验步骤来加工本发明中的减重增补剂。
处理结束后，将微胶囊包装到防潮香袋中，每批1g。每次餐前取一香袋药剂与水混合服用。
实施例2b(i)：减重研究1
招募了9个志愿者来确定按上述方法进行服药时此组合物是否具有任何减重效应。
结果如下表4：
表4
  实验对象     体重(kg)第0周     体重(kg)6周后
  1     125     116.4
  2     107     101.5
  3     105     97
  4     100     97
  5     79     69
  6     78     72
  7     73.5     66.3
  8     73     69
  9     68.3     61.5
 合计     808.8     746.7
 平均     90     83
观察到每人每周的减重约为1.08kg，或6周内减重为7kg。
减重研究2
在医生的监督下，20个志愿者参与了第二次研究。剂量比与“减重研究1”一样。
此研究的结果如下表5。
表5
  实验对象     体重(kg)第0周     体重(kg)3周后
  1     128     120
  2     126     121
  3     115     109
  4     108     100
  5     102     101
  6     102     97
  7     97     92
  8     94     93
  9     92     90
  10     92     88
  11     89     85
  12     85     84
  13     83     81
  14     82     78
  15     78     76.5
  16     77     70
  17     77     70
  18     74     71
  19     73     72
  20     68     60
 合计     1842     1758.5
 平均     92.1     88
每人每周的平均减重约为1.37kg，或3周内的减重为4.1kg。
从上述两个单独的实验获得的结果表明，此处描述的酶制剂可作为有效的减重增补剂。
实施例2c：稳定的菠萝蛋白酶作为抗腹泻药物
以前已经证明，蛋白酶可用于治疗包括人在内的动物的肠道病原体；AU07858587和AU02367392。已经描述了用来投递这些蛋白酶的组合物，其中包含：(i)包含有与弱碱结合的生物活性物质并部分包被有可溶于肠液中的延迟释放物质的颗粒；(ii)pH为1.6-6的酸化剂；以及(iii)凝胶形成剂。生成的制剂能够改变宿主肠表面，使其不易于细菌建群。因此，此制剂可用于预防并治疗腹泻。
下述实施例提供了制备如抗腹泻制剂的改进的制备方法。
抗腹泻制剂包括：                 4kg批量
水凝胶核心
预凝胶玉米淀粉                   2.914kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)           0.40kg
包被液体
菠萝蛋白酶                       0.053kg
半胱氨酸                         0.053kg
甘露糖醇                         0.10kg
甘油                             0.30kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)           0.06kg
磷酸钠缓冲液，pH7                0.04kg
补充纯水至                       1.00kg
肠包衣溶液
醋酸邻苯二甲酸纤维素             0.08kg
利用氢氧化钠调节至pH6
补充纯水至总批量大小为           8kg
最终酸漂洗溶液
利用柠檬酸调节至pH3
补充纯水至                       1.00kg
利用下列实验步骤对本发明中的抗腹泻制剂进行加工：
1利用真空将水凝胶核心物质装载到Huttlin Turbojet处理槽中，进行流态化并加热至高达60℃ 1小时。
2将水凝胶核心产品温度降至45℃。
3以300立方米/小时的速度对水凝胶床进行流态化。
4在饱和湿度条件下，利用turbojet以30g/min的速度将包被溶液包被到水凝胶核心上。
5将产品干燥到少于5％的水分含量。
6利用turbojet以30g/min的速度将肠包衣溶液包被到核心上。
7利用turbojet以30g/min的速度将柠檬酸溶液包被到核心上；酸进行反应后将醋酸邻苯二甲酸纤维素钠重新转化为醋酸邻苯二甲酸纤维素，从而为制剂内的酶提供了肠道保护。
相对于制备这样的产物的传统方法，发明者们发现本发明中的方法仅需1/12的处理时间。此外，在制剂中仅要求1/20量的菠萝蛋白酶(由于生物玻璃基质中菠萝蛋白酶的稳定性提高)。
此外，值得注意的是整个生产可在密闭环境中一步完成，操作人员暴露于酶的时间大大减少，并且仅仅1/5量的醋酸邻苯二甲酸纤维素即可提供与上述已知产品同样的肠道保护。
总的来讲，生产成本估计可降低到用于生产等量抗腹泻制剂的传统方法中所需成本的1/5。
此外，研究者们观察到，利用本加工方法制得的产品可在室温下稳定存在至少两年时间。
实施例2c(i)：涉及抗腹泻制剂的动物研究
在Animal Husbandry Research Institute，Jinin Province，China进行了一项研究，其研究了实施例2c制备的制剂作为抗腹泻治疗药物的效力。本研究中选用了大约相同体重和年龄的90只新生小猪。
将这些小猪随机分为在性别、体重和年龄方面相等的两组。一组设计来利用实施例2c中的菠萝蛋白酶制剂进行治疗，另一组作为对照组。在进行应用的当天，将0.75g菠萝蛋白酶制剂(实施例2c)与8.5g水混合成浆。在出生后第7天将第一次的10ml剂量给予治疗组并在第10天重复给药。对照组不接受任何治疗。记录腹泻发生率，持续至第45天。
结果如表6所示：
表6
    治疗组     对照组
实验动物数量     45     45
出生体重(kg)的平均值     1.40     1.35
接种抗腹泻疫苗     是     是
断奶时体重(kg)的平均值     11.80     11.30
总体重增加     10.40     9.95
日体重增加     249g     237g
消耗的饲料     13kg     12.7kg
饲料转化     1.25     1.29
患腹泻动物的数目     3     8
腹泻发生率(％)     6.7     17.8
实验动物存活(％)     100     100
腹泻天数     3     5
应用的其他药物处理     6     10
本试验中选用的所有小猪都接种了抗腹泻疫苗。然而，相对于对照组，治疗组在两次菠萝蛋白酶制剂给药之后展示出显著的断奶体重增加(0.5kg)，腹泻发生率下降(6.7相比于17.8)，严重性下降(3天相比于5天)，并且应用的其他药物治疗数量减少(6相比于10)。
实施例2d：以稳定的菠萝蛋白酶加β葡聚糖 (B&B制剂)为抗腹泻 药物
向实施例2c中的菠萝蛋白酶制剂中添加β-1，3-葡聚糖增强了菠萝蛋白酶的抗腹泻作用。
β-1，3-葡聚糖被认为是具有自由基清除特性的一种有效的天然非特异性免疫刺激剂。研究人员认为其是通过激活在起始并维持包括人在内的动物的免疫反应中起必需且关键作用的巨噬细胞来发挥作用的。
已知β-1，3-葡聚糖口服有效、绝对安全且无毒性。存在多种具有不同活性水平的不同类型的β葡聚糖，其中绝大多数是惰性的并用作为简单的饲料填料。然而，β-1，3-葡聚糖是活性最强的β葡聚糖，并且可从酵母细胞壁获取。
β-1，3-葡聚糖被认为在治疗许多与免疫相关的适应症如与压力相关的免疫抑制方面是有用的，并且已经证明其可与抗生素和抗病毒药物协同作用且展示出抗真菌的特性。因此，β-1，3-葡聚糖被认为是用于改进生活方式的合适的佐剂。与本发明相关的领域中的那些普通技术人员会很容易的鉴定可从给予β-1，3-葡聚糖受益的动物适应症。
在本发明的8kg批量中，本实施例的B&B制剂包括：
                           4kg批量
菠萝蛋白酶水凝胶核心
预凝胶玉米淀粉             2.861kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)     0.40kg
包被液体
菠萝蛋白酶                   0.106kg
半胱氨酸                     0.106kg
甘露糖醇                     0.100kg
甘油                         0.300kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)       0.060kg
标准磷酸钠缓冲液，pH7        0.040kg
补充纯水至                   1.00kg.
β-1，3-葡聚糖的水凝胶核心
明胶                         2.861kg
卵清蛋白                     0.400kg
包被液体
β-1，3-葡聚糖               0.106kg
甘露糖醇                     0.100kg
甘油                         0.300kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)       0.060kg
标准磷酸钠缓冲液，pH7        0.040kg
补充纯水至                   1.00kg
肠包衣溶液
醋酸邻苯二甲酸纤维素2.00     0.16kg
利用氢氧化钠调节至pH6
补充纯水至总批量大小为       8kg
最终酸漂洗溶液
利用柠檬酸调节至pH3
补充纯水至                   2.00kg
利用下列实验步骤对本发明中的菠萝蛋白酶纤维素微胶囊进行加工：
1利用真空将用于菠萝蛋白酶的水凝胶核心物质装载到HuttlinTurbojet处理槽中，进行流态化并加热到高达60℃ 1小时。
2将水凝胶核心产品温度降至45℃。
3以300立方米/小时的速度对水凝胶床进行流态化。
4在饱和湿度条件下，利用turbojet以30g/min的速度将包被溶液包被到水凝胶核心上。
5将产品干燥到少于5％的水分含量。
6利用turbojet以30g/min的速度将醋酸邻苯二甲酸纤维素钠溶液包被到核心产物上。
7利用turbojet以30g/min的速度将柠檬酸溶液包被到核心上作为最终包衣；酸进行反应后将醋酸邻苯二甲酸纤维素钠重新转化为醋酸邻苯二甲酸纤维素，从而为制剂内的酶提供了肠道保护。
利用下列实验步骤对本发明中的β-1，3-葡聚糖微胶囊进行加工：
1利用真空将β-1，3-葡聚糖水凝胶核心物质装载到HuttlinTurbojet处理槽中，进行流态化并加热至高达60℃ 1小时。
2将水凝胶核心产品温度降至45℃。
3利用氮气取代处理空气并持续通氮气10分钟。
4以300立方米/小时的速度对流化床进行流态化。
5在饱和湿度条件下，利用turbojet以30g/min的速度将β-1，3-葡聚糖包被溶液包被到水凝胶核心上。
6将产品干燥到少于5％的水分含量。
7利用turbojet以30g/min的速度将醋酸邻苯二甲酸纤维素钠溶液包被到核心产物上。
8利用turbojet以30g/min的速度将柠檬酸溶液包被到核心上作为最终包衣；酸进行反应后将醋酸邻苯二甲酸纤维素钠转化为醋酸邻苯二甲酸纤维素，从而为制剂内的酶提供了肠道保护。
随后，通过将4kg菠萝蛋白酶微胶囊与4kg β-1，3葡聚糖微胶囊混合，制备了B&B制剂。
利用此实验步骤，每750mg B&B制剂含有10mg菠萝蛋白酶和10mg β-1，3-葡聚糖。
在本实施例描述的制备方法的操作过程中，值得注意的是β-1，3-葡聚糖原料是干燥的、颗粒大小小于5微米的、非常细的粉末。在液体状态下，其形成了颗粒大小小于2微米的细悬浮液。因此，为了完全捕获活性成分，就不得不应用基于更易溶解的水凝胶的明胶。
进一步应该注意，在绝大多数情况下可利用明胶获得更好的水凝胶。然而，明胶相对较昂贵，而预凝胶淀粉，如预凝胶玉米淀粉可为所述水凝胶提供更经济的基料。
通过将750mg B&B制剂与8.5g水混合成10ml浆糊制备了一个单位剂量。
用于预防小猪腹泻的推荐剂量为在出生第一天给药以10ml，并在第5天重复给药。在具有严重的腹泻史的农场中，可在第10天和第13天重复给药。
实施例2d(i)： 涉及利用B&B制剂的现场试验
在Shangdong，China进行了现场试验来检验菠萝蛋白酶加β葡聚糖制剂在预防和治疗小猪腹泻中的效力。
B&B制剂为实施例2d中制备的制剂。试验中应用的其他药物为动物饲养和管理领域中的标准药物。
此试验是在the Breeding Good Pig Farm(Dezhou HusbandryBureau)进行的，此农场年产超过10,000头猪，且腹泻发生率约为40％-50％。
将随机选出的9个小猪分为三个组(3只小猪/组)。指定两组为治疗组，第三组为对照组。总共有97只小猪(混合性别的Large WhiteYork小猪)参与了本试验。
从第一次给予B&B制剂后开始对小猪进行26天的监视。
对治疗组和对照组中的所有小猪进行接种，并且在生病(出现腹泻和/和相关症状)时给予相同的药物。
试验设计总结于下表7中。
表7
组别 猪的数目 给药剂量(5ml)     附注
治疗组1     34 第1天给药一剂，第5天重复 监测对黄色腹泻的功效
治疗组2     31 第1天给药一剂，第5、10和13天重复 监测对黄色和白色腹泻的功效
对照组     32 不给予任何菠萝蛋白酶制剂 正常治疗
试验结果总结于下表8中。
表8
组别 小猪数目 腹泻发生率(％) MDWG(g)(平均日体重增加) 死亡率 备注
治疗组1  34  5.1  164  1 腹泻
治疗组2  31  4.2  178  1 饥饿
对照组 32  17.59  169  1 腹泻
如从表8中观察到的，试验结果证明，试验组中的腹泻发生率在治疗组1、治疗组2和对照组分别为5.10％、4.2％和17.59％。换言之，观察到治疗组和对照组间的腹泻发生率下降了约70％。这表明B&B制剂在预防和/或治疗小猪腹泻方面具有显著的效力。
各组间的平均日体重增加(mean daily weight gains，MDWG)没有显著差异(164g/天，178g/天和169g/天)。
此外，结果表明对此制剂进行两次给药可更有效的改善动物的健康状况。
总的来讲，本试验表明本发明中的B&B制剂对断奶前腹泻以及抗非特异性大肠杆菌腹泻方面具有效力。发明者们认为此制剂可应用于其他动物，包括人在内。与本发明相关的领域中那些普通的熟练技术人员会很容易的对制剂进行改进或变动以使其适于对除猪外的其他动物进行给药。
实施例3：稳定的生物材料的舌下缓释
实施例3a：稳定的 β-1，3-葡聚糖片剂的舌下缓释
如前面所描述的，β葡聚糖口服给药是有效的。然而，当进行口服给药时，一般要求给予显著剂量以获得所需的免疫调节剂效应。依赖于β葡聚糖不同，推荐剂量范围为10mg-2000mg/天。推荐如此大的剂量范围的原因在于市场上的β葡聚糖产品在纯度和生物利用率方面存在差异。
本实施例提供了β-1，3-葡聚糖舌下缓释制剂，当对其进行适当的稳定化(例如通过本发明中的方法)并投递到特定粘膜表面时，其在10mg/天剂量下具有临床活性。
本实施例中的产品适于治疗或缓解过敏状况，如干草热的症状。
本发明中加工的缓释舌下β-1，3-葡聚糖片剂的例示性配方可包括下列组分：
                                  4kg批量
水凝胶核心
明胶                              2.527kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)            0.400kg
卵清蛋白                          0.400kg
包被液体
β-1，3-葡聚糖                    0.200kg
甘露糖醇                          0.200kg
丙二醇                            0.150kg
明胶(琥珀酰化，Succinylated)      0.050kg
标准磷酸钠缓冲液，pH7             0.073kg
补充纯水至                        2.000kg
本实施例中的缓释舌下β-1，3-葡聚糖片剂是利用本发明中下列处理方法制备的：
1按照设备制造商的指导，对Huttlin Turbojet进行热灭菌(180℃)。
2利用真空将水凝胶核心物质装载到Huttlin Turbojet处理槽中，进行流态化并加热至高达60℃ 1小时。
3将水凝胶核心温度降至40℃。
4以300立方米/小时的速度对处理槽内容物进行流态化。
5在饱和湿度条件下，利用turbojet以25g/min的速度将β-1，3-葡聚糖包被溶液包被到水凝胶核心上。
6将产品干燥到少于3％的水分含量。
7每200mg微胶囊含有10mg β-1，3-葡聚糖。
8按照本领域中应用的标准方法将产品压制为200mg的片剂。
9在氮气流中将产品包装在铝/铝箔包中并在不超过25℃下保存。
由于在水凝胶核心中含有高比例的明胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)和白蛋白，所以本实施例中的片剂具有缓慢的溶解速率(小于分钟)。此组合对缓释产品来讲是理想的，其使得活性物质与靶吸收位点，如口腔粘膜进行连续的接触。
本实施例中的产品在用于治疗或缓解过敏状况时的推荐给药方案为：春天来临前四周内每天在舌下溶解一片并随后持续6个月。研究者们建议在给药前后15分钟内不进食任何食物或饮料。
利用患花粉症多年的49岁女性(Y女士)和39岁男性(X先生)患者对本实施例中的产品进行试验。利用皮肤敏感性检验确定出这两个试验对象对黑麦草、花粉和室尘起过敏反应。
以推荐剂量服用本实施例中的片剂后，相对于前些年，这两位实验对象均报告春季喷嚏、眼睛发痒和鼻流涕的发生率降至最低。两位患者要求在下一年进行重复治疗以确定他们的症状是否可完全治愈。
虽然不希望囿于任何特定理论，本发明的发明者们认为舌下应用β-1，3-葡聚糖可能使免疫***不敏感，从而降低了炎症反应。
也对一位不得不持续应用支气管扩展喷雾剂和皮质类固醇药物的40岁(Z先生)严重哮喘病男性患者给以本实施例的β-1，3-葡聚糖舌下片剂。在给药(一片/天，舌下溶解)两周后，哮喘发生率显著降低并且需要应用支气管扩展喷雾剂和皮质类固醇药物的频率减半。然而，虽然药物对于缓解哮喘状况是有用的，但由于一些未知的原因，出现了流鼻血的情况。因此停止了β-1，3-葡聚糖给药。
实施例4：生物活性蛋白的稳定性
如前所述，生物活性蛋白和肽在包括制药工业在内的大量工业中具有广泛的应用。然而，很多这样的蛋白在贮存温度，如室温下是不稳定的。
在本实施例中，利用干扰素证明本发明在制备稳定的蛋白产品方面的效力，然而，我们应意识到其同样适用于制备其他蛋白或肽。
干扰素α、β和γ是抗病毒、抗肿瘤和免疫调节蛋白。通常用于将外源干扰素导入动物体内的方法为注射。可商业购买天然和重组干扰素α2a和2b，为3百万-1千万IU注射剂，以治疗病毒和肿瘤疾病。由于它们在升高的温度下不稳定，所有商业化干扰素注射剂产品需要在约4℃-8℃下贮存。
通过注射给以3百万-5百万IU剂量干扰素会产生显著的副作用。此外，由于干扰素不是天然血液蛋白，所以在多次注射后，患者可能会开始对其产生免疫反应，这是很常见的。因此，为了使干扰素产生效力，随后的剂量就需要显著提高。反过来，这将会加剧副作用。此外，通过注射进行给药时，外源干扰素会通过血液携带至肝脏并很快进行代谢。
实施例4a：稳定化的干扰素 α 3百万IU注射剂
本实施例提供了在室温下稳定的干扰素注射剂。
稳定化的干扰素注射剂配方包括下列组分：
                          4kg批量
水凝胶核心
明胶                      3.208kg
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)    0.400kg
包被液体
干扰素α＝2四百亿IU
甘露糖醇                  0.200kg
丙二醇                    0.075kg
明胶(琥珀酰化)            0.025kg
甘氨酸                    0.012kg
卵清蛋白                  0.001kg
标准磷酸钠缓冲液，pH7     0.073kg
补充用于注射的水至        2.000kg
我们应该明白术语“注射用水”为本领域中的一个标准术语。如标准药典中所述，其指适于制备注射用组合物的水的标准级别。
本实施例中的稳定化干扰素注射剂是按照本发明经下列步骤制备的：
1将干扰素α、甘氨酸、甘露糖醇、琥珀酰化明胶、丙二醇、抗坏血酸和缓冲液溶解在纯水中，随后利用0.22微米滤器进行过滤。向其中添加白蛋白并添加水至所需重量以用于注射。
2按照设备制造商的指导手册，对Huttlin Turbojet处理槽进行热灭菌(180℃)。
3将Huttlin装置调换到循环过滤氮气模式。
4利用真空将水凝胶核心物质装载到Huttlin Turbojet处理槽中，进行流态化并加热至高达60℃ 1小时。
5将水凝胶核心产品温度降至40℃。
6以300立方米/小时的速度对处理槽内容物进行流态化。
7在饱和湿度条件下，利用turbojet以25g/min的速度将干扰素α包被溶液喷洒到水凝胶核心上。
8将产品干燥到少于2％的水分含量。
9在无菌填充条件下，将产品包装在氮气流注射瓶中。
本实施例制备的每50mg微胶囊含有3百万IU干扰素α。
实施例4b： 稳定化的干扰素α60,000IU***栓剂
可制备室温下稳定的干扰素***栓剂来预防和治疗***状瘤感染和***表面的其他病毒性疾病。
本实施例中的稳定化干扰素***栓剂包含下列成分：
                       4kg批量
水凝胶核心
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)/乙酸乙烯聚合物3.508kg
包被液体
干扰素α-240百万单位IU
甘露糖醇                    0.200kg
丙二醇                      0.150kg
明胶(琥珀酰化)              0.050kg
甘氨酸                      0.012kg
卵清蛋白                    0.001kg
标准磷酸钠缓冲液，pH7       0.073kg
补充纯水至                  2.000kg
本实施例中的稳定化干扰素***栓剂是利用本发明中下列步骤制备的：
1将干扰素α、甘氨酸、甘露糖醇、琥珀酰化明胶、丙二醇和缓冲液溶解在水中，随后利用0.22微米膜滤器进行过滤。向其中添加白蛋白并添加水至所需重量以用于注射。
2按照设备制造商的指导手册，对Huttlin Turbojet处理槽进行热灭菌(180℃)。
3将Huttlin装置调换到循环过滤氮气模式。
4利用真空将水凝胶核心物质装载到Huttlin Turbojet处理槽中，进行流态化并加热至高达60℃ 1小时。
5将水凝胶核心产品温度降至40℃。
6以300立方米/小时的速度对处理槽内容物进行流态化
7在饱和湿度条件下，利用turbojet以25g/min的速度将干扰素α包被溶液喷洒到水凝胶核心上。
8将产品干燥到少于2％的水分含量。
9按照标准程序，将产品压制成1g***栓剂。
10在氮气流中利用铝/铝箔包对产品进行包装并在不超过25℃下保存。
本实施例制备的每1g微胶囊含有60,000IU干扰素α。
实施例4c：稳定化的干扰素 A 2000IU&胞壁质酶舌下片剂
已经证明，超低剂量(低于10,000IU/剂/成人)的干扰素α是治疗病毒和肿瘤疾病方面的有效药物。
现在认为，皮下给以干扰素α是用于控制乙肝和丙肝的标准方法，因此现在有大量的市售产品；例如Wellferon TM Injection(Glaxo Wellcome)，lntron-ATM Injection(Schering Plough)，Roferon ATM Injection(Hoffmann-La Roche)和Anferon(Hualida Tianjin，China)。然而，应用这些产品有大量缺陷，包括如：患者自我给药是疼痛的且需要接受训练；高剂量给药与包括呕吐、恶心、眩晕、鼻分泌物及其他与流感类似的症状相关；治疗成本相当高，例如，在澳大利亚，利用Roferon A Injection进行一个乙肝&丙肝的正常疗程要花费约AU$8000；并且产物室温下不稳定，需要冷藏贮存。
过去大约10年的研究已经表明，可通过口腔粘膜(oromucosal)路径对低剂量干扰素α进行有效给药(包括舌下给药)。
本实施例提供了可通过口腔粘膜路径(经颊或舌下)给药的剂型。
本发明的舌下缓释制剂含有干扰素α(2000IU)和胞壁质酶盐酸盐(50mg)，其在治疗或缓解慢性病毒疾病方面是有效的；胞壁质酶盐酸盐是在亚洲国家具有广泛应用历史的抗病毒药物。
本实施例的稳定化干扰素α和胞壁质酶舌下片剂配方包含下列组分：
                            4kg批量
水凝胶核心
明胶                        1.480k
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)      0.400kg
胞壁质酶盐酸盐              1.000kg
包被液体
干扰素α2b 40百万IU
甘露糖醇                    0.200kg
丙二醇                      0.150kg
明胶(琥珀酰化)              0.500kg
甘氨酸                      0.120kg
卵清蛋白                    0.020kg
维生素C                     0.057kg
标准磷酸钠缓冲液，pH7       0.073kg
补充纯水至                  4.000kg
本实施例中的稳定化干扰素α和胞壁质酶舌下片剂是利用本发明中下列步骤制备的：
1将干扰素α、甘氨酸、甘露糖醇、琥珀酰化明胶、丙二醇、抗坏血酸和缓冲液溶解在注射用水中，随后向其中添加白蛋白并添加注射用水至所需重量。
2按照设备制造商的指导手册，对Huttlin Turbojet处理槽进行热灭菌(180℃)。
3将Huttlin装置调换到循环过滤氮气模式。
4利用真空将水凝胶核心物质装载到改进的Huttlin Turbojet处理槽中，进行流态化并加热至高达60℃ 1小时。
5将水凝胶核心产品温度降至40℃。
6以300立方米/小时的速度对处理槽内容物进行流态化。
7在饱和湿度条件下，利用turbojet以25g/min的速度将干扰素α包被溶液喷洒到水凝胶核心上。
8.将产品干燥到少于2％的水分含量。
9.利用本领域中的标准方法将微胶囊压制成200mg片剂，在氮气流中利用铝/铝箔包对产品进行包装并在不超过25℃下保存。
本实施例中制备的每个200mg片剂含有2,000IU干扰素α2b和50mg胞壁质酶盐酸盐，其具有缓慢溶解的性质，并需要10分钟以上才溶解在嘴里。其设计为缓释舌下产物。
按照下列优选给药方案，推荐对本实施例中的产品给药以预防和/或治疗慢性病毒感染：每两天舌下溶解一片，持续6个月-1年。
在三个不同的温度下，对本实施例中制备的三批不同的片剂产品中活性成分(干扰素α2b和胞壁质酶)的稳定性进行了研究。结果如下表9所示。
利用本领域中的标准方法对每种活性成分的能力进行了评估。简单来讲，按如下步骤进行：
1将干扰素和胞壁质酶从现有的固体相中提取到稳定的缓冲液体介质中。
2对提取的液体进行致细胞病变效应检验(CPE)，以确定片剂中干扰素的抗病毒活性(按照英国/欧洲药典2000中的现有办法).
3对液体提取物进行HPLC分析，以确定片剂中存在的胞壁质酶量。
表9
IFN+MuBx 1 IFN+MuBx 2 IFN+MuBx 3 IFN+Mu Bx 1 IFN+Mu Bx 2 IFN+Mu Bx 3
IFNα2b IFNα2b IFNα2b 胞壁质酶HCl 胞壁质酶HCl 胞壁质酶HCl
4℃ IU IU IU 4℃ mg mg mg
0时间 2200 1800 2200 0时间 47.5 50.0 47.5
3个月 2400 2200 2200 3个月 47.5 50.0 47.5
6个月 1400 3200 3000 6个月 48.0 48.5 46.0
9个月 2000 2400 1800 9个月 48.0 49.0 47.5
12个月 3000 1600 3550 12个月 46.5 49.0 49.0
24个月 2400 2200 2400 24个月 47.0 48.5 47.5
25℃ IFNα2b IFNα2b IFNα2b 25℃ 胞壁质酶HCl 胞壁质酶HCl 胞壁质酶HCl
0时间 2200 1800 2200 0时间 47.5 50.0 47.5
3个月 2800 2200 2400 3个月 47.5 50.0 47.5
6个月 1000 1400 2850 6个月 48.0 49.0 48.0
9个月 1600 2200 1800 9个月 48.0 49.5 48.5
12个月 2200 1850 2000 12个月 49.0 46.5 48.5
24个月 2400 2200 2200 24个月 48.0 47.5 48.0
35℃ IFNα2b IFNα2b IFNα2b 35℃ 胞壁质酶HCl 胞壁质酶HCl 胞壁质酶HCl
0时间 2200 1800 2200 0时间 47.5 50.0 47.5
3个月 2400 2200 2000 3个月 47.5 50.0 47.5
6个月 2800 2000 2200 6个月 48.5 48.5 48.0
9个月 2000 1600 3800 9个月 48.0 48.5 47.5
12个月 2400 1800 3000 12个月 48.5 48.5 48.0
24个月 2000 2400 2000 24个月 48.0 48.5 48.0
实施例4d： 可用于预防感冒伤风、流感和其他呼吸疾病的稳定化 干扰素α鼻喷雾剂
已知干扰素α可有效的抗病毒性呼吸疾病。包括人在内的动物临床研究已经证明，约为数百单位到超过一百万单位的一剂干扰素α鼻喷雾可有效的抗包括那些与流感和感冒伤风相关疾病在内的呼吸感染。然而，高剂量给药时可观察到鼻出血和流感样症状。
按照干扰素α2b制造商提供的信息，水相中正确配制的干扰素α2b可在室温下稳定存在达一个月，但不会超过两个月。因此，并没有以即用型液体形式存在、具有有效销售保存期(例如大约12-18个月)的干扰素鼻喷雾剂可供利用来治疗和/或预防感冒伤风、流感及其他呼吸疾病。
可行的替代方案是将主要的活性成分(干扰素α)作为预先构成的室温稳定片剂。因此，在使用前将干扰素α片剂添加到含有可接受的液体稀释剂的鼻喷雾剂小瓶中。重新构成的溶液在室温下具有大约4周的保存期限；此期限与绝大多数呼吸感染的治疗时间相适合。使用者在治疗完成后可将小瓶丢弃。
因此，本实施例提供了含有两种组分的消费产品：
1.利用本发明中的方法制备的、含有50,000IU稳定化干扰素α的、铝箔包装的干扰素片剂；及
2.含有5ml可接受的稀释剂，并在鼻喷雾给药器上具有螺孔的瓶子。
优选的，鼻喷雾给药器喷射0.1ml的定量溶液。按照本实施例，在此剂量比率下，每次喷雾将给以1000IU干扰素α。
优选在感冒伤风和流感季节开始前，以0.1ml(1000IU)喷雾剂/鼻孔/天的比率对本实施例中的制剂给药。
本实施例的稳定化片剂包含下列组分：
                                         4kg批量
水凝胶核心
聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)/乙酸乙烯基聚合物  3.508kg
包被液体
干扰素α40百万IU
甘露糖醇                                 0.200kg
丙二醇                                   0.150kg
明胶(琥珀酰化)                           0.050kg
甘氨酸                                   0.012kg
卵清蛋白                                 0.001kg
标准磷酸钠缓冲液，pH7                    0.073kg
添加纯水至                               2.000kg
本实施例中的稳定化片剂是利用本发明中下列步骤制备的：
1将干扰素α、甘氨酸、甘露糖醇、琥珀酰化明胶、丙二醇和缓冲液溶解在注射用水中，随后利用0.22微米膜滤器进行过滤。向其中添加白蛋白并添加注射用水至所需重量。
2按照设备制造商的指导手册，对Huttlin Turbojet处理槽进行热灭菌(180℃)。
3将Huttlin装置调换到循环过滤氮气模式。
4利用真空将水凝胶核心装载到Huttlin Turbojet处理槽中，进行流态化并加热至高达60℃ 1小时。
5将水凝胶核心产品温度降至40℃。
6以300立方米/小时的速度对处理槽内容物进行流态化。
7在饱和湿度条件下，利用turbojet以25g/min的速度将干扰素α包被溶液喷洒到水凝胶核心上。
8将产品干燥到少于2％的水分含量。
9利用本领域中的标准方法将微胶囊压制成200mg片剂。
10在氮气流中利用铝/铝箔包对片剂进行包装并在不超过25℃下保存。
本实施例中制备的每个200mg片剂含有50,000IU干扰素α。
本实施例中的液体稀释剂配方的组分如下表10所示。
表10
％w/w
明胶BP/Eur.P 0.10
聚维酮BP/Eur.P 0.10
乙二胺四乙酸二钠BP/Eur.P 0.14
聚山梨酸酯80BP/Eur.P 0.20
萄聚糖45,000BP/Eur.P 0.22
磷酸二氢钠BP/Eur.P(无水重量) 0.27
磷酸氢二钠BP/Eur.P(无水重量) 0.58
甘氨酸BP/Eur.P 0.10
丙基羟基苯甲酸钠BP/Eur.P 0.03
丙基羟基苯甲酸钠BP/Eur.P 0.09
白蛋白BPC 0.05
合计 2.93
添加纯水BP/Eur.P至 100％
实施例4e： 可用于治疗感冒伤风、流感和其他呼吸疾病的稳定化 干扰素α鼻喷雾剂
本实施例提供了含有有助于缓解感冒伤风和流感症状的额外活性成分的替代性稀释剂配方。
本实施例中的消费产品含有实施例4d中所列的两种组分：喷雾给药器等中含有干扰素α和稀释剂的片剂。同样的，重新构成的干扰素鼻喷雾剂含有1000IU干扰素α/0.1ml。
本实施例的优选给药方案为：当轻微的流感或感冒伤风症状出现时，早晚各给以0.1ml(1000IU)喷雾剂/鼻孔。持续治疗5-10天。
本实施例中的片剂组分是利用实施例4d中的方法制备的。
本制剂的稀释剂配方如下表11所示：
表11
％w/w
盐酸羟甲唑啉USP 0.05
马来酸右氨苯那敏USP 1.00
明胶BP/Eur.P 0.10
聚维酮BP/Eur.P 0.10
乙二胺四乙酸二钠BP/Eur.P 0.14
聚山梨酸酯80BP/Eur.P 0.20
葡聚糖45,000BP/Eur.P 0.22
磷酸二氢钠BP/Eur.P(无水重量) 0.27
磷酸氢二钠BP/Eur.P(无水重量) 0.58
甘氨酸BP/Eur.P 0.10
丙基羟基苯甲酸钠BP/Eur.P 0.03
甲基羟基苯甲酸钠BP/Eur.P 0.09
白蛋白BPC 0.05
合计 2.93
添加纯水BP/Eur.P至 100％
实施例4f： 可用于预防红眼病的稳定化干扰素α洗眼液或滴眼剂
如前所述，正确制备的含水干扰素α可在室温下稳定存在达1个月，但不能达到两个月。因此，并没有以即用液体形式存在、商业保存期足够长(例如12-18个月)的干扰素洗眼液或滴眼剂可供利用。
可行的替代方案是将主要的活性成分(干扰素α)作为预先构成的室温下稳定的片剂提供。因此，在使用前将干扰素α片剂添加到含有可接受液体稀释剂的洗眼液或滴眼剂小瓶中。重新构成的溶液在室温下具有大约4周的保存期限。使用者在治疗完成后可将小瓶丢弃。
本实施例的消费产品含有实施例4d所列的两种组分；含有干扰素α片剂的片剂和稀释剂(虽然在本实施例中是存在于适当的洗眼液或滴眼剂瓶中)。同样的，重新构成的干扰素洗眼液或滴眼剂含有1000IU干扰素α/0.1ml，优选单次给药剂量为0.1ml。
本实施例的优选给药方案为：0.1ml(1000IU)喷雾剂/滴/眼，每天两次以治疗红眼。
本实施例中的干扰素α片剂是按照上述实施例4d中的描述进行制备和加工的。
本发明中的稀释剂配方如下表12所示。可以领会，此液体稀释剂优选的进行高压消毒或灭菌。
表12
％w/w
聚维酮BP/Eur.P 0.10
乙二胺四乙酸二钠BP/Eur.P 0.14
聚山梨酸酯80BP/Eur.P 0.20
葡聚糖45,000BP/Eur.P 0.22
磷酸二氢钠BP/Eur.P(无水重量) 0.27
磷酸氢二钠BP/Eur.P(无水重量) 0.58
甘氨酸BP/Eur.P 0.10
丙基羟基苯甲酸钠BP/Eur.P 0.03
甲基羟基苯甲酸钠BP/Eur.P 0.09
白蛋白BPC 0.05
合计 2.93
添加纯水BP/Eur.P至 100％
实施例4g：稳定化的干扰素皮肤喷雾剂—与洗眼液相同的配方
用于创伤治愈的皮肤喷雾剂是按照实施例4f进行制备的。然而，在本实施例中，液体稀释剂是置于适合投递到皮肤上的适当容器中。
实施例4h： 用于舌下给药的稳定化红细胞生成素(EPO)
按照下列方法制备片剂形式的EPO稳定化制剂：
水凝胶核心                          ％w/w
右旋糖(无水)BP                      46.52
淀粉BP(无水wt)                      20.00
明胶BP/Eur.P(无水wt)                20.00
羧甲纤维素BP(无水wt)                2.00
包被液体
EPO(Epoetin Alfa)250,00IU
葡聚糖40,000BP/Eur.P                0.600
磷酸二氢钠BP/Eur.P                  0.042
磷酸氢二钠BP/Eur.P(无水wt)          0.057
甘氨酸BP/Eur.P                      0.030
海藻糖                              0.600
乙二胺四乙酸钠BP                    0.025
丙二醇BP                            0.050
白蛋白BPC                           5.030
氯化钠BP                            0.046
亮氨酸USP                           3.000
合计                                100％
添加纯水BP/Eur.P至
本实施例中的舌下EPO片剂是利用本发明中下列步骤制备的：
1将EPO、葡聚糖、甘氨酸、海藻糖、乙二胺四乙酸钠、丙二醇、氯化钠、亮氨酸和缓冲液溶解在注射用水中，随后向其中添加白蛋白并添加注射用水至所需重量。
2按照设备制造商的指导手册，对Huttlin Turbojet处理槽进行热灭菌(180℃)。
3将装置调换到循环过滤氮气模式。
4利用真空将水凝胶核心物质装载到经过改进的HuttlinTurbojet处理槽中，进行流态化，并加热至高达60℃ 1小时。
5将水凝胶核心产品温度降至40℃。
6以300立方米/小时的速度对处理槽内容物进行流态化。
7在饱和湿度条件下，利用turbojet以25g/min的速度将EPO包被溶液喷洒到水凝胶核心上。
8将产品干燥到少于2％的水分含量。
9利用本领域中的标准方法将产品压制成200mg片剂。
利用上述步骤制备的制剂进行动物研究。将大鼠分为四组。在第一天时对第一组皮下注射给以50IU EPO，并在第2、4、6天采取血液样本进行网织红细胞测定。此给药模式模拟了现行的EPO治疗给药路径。
在第2组中，在第1、2和3天通过舌下投递本实施例中的制剂对大鼠给以日剂量125 IU EPO。在第2、4、6和8天采取血液样本进行网织红细胞测定。
在第3组中，在第1、2、3、4和5天通过舌下投递对大鼠给以日剂量125 IU EPO。在第2、4、6、8、10天采取血液样本进行网织红细胞测定。
对照组大鼠皮下注射与第1组中50 IU EPO皮下注射液相同体积的盐水。对照组2接受了不含EPO的本实施例制剂。
结果
结果如图1所示，其中对照组动物以“正常范围”图表示。给以舌下EPO的大鼠展示网织红细胞计数明显超过对照组动物的正常范围，这表明舌下投递的EPO是具有活性的。
两天后，皮下注射的EPO展示出峰值网织红细胞计数，第四天快速回落至正常范围之内。
对本实施例的制剂进行稳定性检测，结果如图2所示。如在此图中所示，含有EPO的舌下片剂在室温下至少可稳定存在9个月。利用EPO免疫检验法对EPO的活性进行确定，发现其具有完全的生物活性，正如大鼠中网织红细胞计数的测定结果所显示的。
本实施例表明，稳定化蛋白，如红细胞生成素通过与身体粘膜表面接触来实现释放和吸收，包括舌下投递、经鼻投递和***投递。这些粘膜区域富含淋巴组织，从而允许将蛋白运输到体内以治疗由如肾衰竭、AIDS、癌症、遗传疾病、手术和月经引起的贫血。
本领域中的技术人员会意识到除这些特定描述之外，可很容易对此处描述的本发明进行变更和改进。应该理解，本发明包括所有的变化和改进。本发明也个别的或共同的包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特点及组合物、以及任何两或多个所述步骤或特点的任何和所有组合。
特别的，与本发明相关的领域中的那些普通熟练技术人员会意识到，虽然已经针对特定蛋白和微生物的制备描述并示范了本发明，其同样适用于制备任何感兴趣细胞和/或蛋白或肽。例如，本发明中的方法可很容易的应用于制备激素、细胞因子和生长因子如人或动物生长激素或其衍生物；包括利用重组技术制备的红细胞生成素(EPO)在内的红细胞生成素(EPO)，如重组人肾红细胞生成素α、重组人肾红细胞生成素β和重组人红细胞生成素γ；降钙素；干扰素，包括α-和β-和γ-干扰素；白细胞介素如IL2；胰岛素；集落刺激因子如G-CSF和GM-CSF。可在本发明中应用的酶的示例包括链激酶、胞壁质酶、胰酶(pancreas)、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶等。这些制剂可包括两或多种不同的酶。
本说明书提供了优选剂量比率的实施例以使用本发明中制备的多种新颖的制剂。发明人可以预见其中的活性成分的可供选择的剂量和浓度，并且按照本发明，与发明相关的那些普通技术人员会很容易的制备其中含有其它浓度活性成分的产品。
当与身体的粘膜表面接触如舌下、鼻、***接触时，本发明中稳定化为微胶囊的生物蛋白可进行释放。这些粘膜区域富含淋巴组织，其可将蛋白运输到体内。Charman et al(J.pharm.Sci.，Vol 89，pages 168-177(2000))及后来的McLennan(APSA 2001 ConferenceProceedings)对将多种蛋白作为皮下注射剂的研究表明，随着蛋白分子量升高，蛋白的淋巴吸收提高，淋巴***在通过皮下注射给药的蛋白的整体***利用率方面具有重要作用。稳定化蛋白微胶囊较皮下注射可提供更多的患者可接受的剂量形式，例如舌下片剂、鼻喷雾剂或***栓剂。
此外，应该意识到，可对本发明中的产品进行操作或进一步制备以达到所需的剂量形式。例如，可将本发明中的微胶囊包被为标准的胶囊单位剂量，或例如与本领域中应用的多种标准赋形剂和稀释剂结合以形成片剂或液体制剂。本领域中的那些熟练技术人员能领会将本发明中的微胶囊进一步进行制备的其他多种途径，并且也涵盖在本发明内。
最后，本发明的发明者们也预见到此处描述的新颖方法可用于制备其他物质及按照特定目的对材料进行操作。特别的，预计本发明的创造性方法可处理成能利用溶剂或水性方法如醋酸邻苯二甲酸纤维素钠盐而对微胶囊进行肠衣包被、通过将核心物质聚合物改变为更高分子量的聚合物或结合利用水凝胶核心如高分子量明胶、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸盐、羧甲基纤维素、多种纤维素衍生物、聚乙二醇、白蛋白、角叉菜胶(karregreenin)(药物制备领域中的普通技术人员可提供多种结合以产生所需的释放特征)来产生缓释特性、通过改变应用的聚合物的性质和包衣厚度来产生时间释放特性及允许痕量物质微分布到大量固体物质中。
提供了发明名称、标题等以增强读者对本申请文件的理解，并且不应将其看作对本发明范围的限制。
如果存在，那上文和下文引用的所有申请、专利和出版物的所有公开内容在此处引入作为参考文献。
在本说明书中提及任何现有技术时并不是且不应看作认可或以任何形式暗示现有技术为本发明领域公知常识的一部分。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，可将词“包含”理解为意味着包括确定的整数或步骤或者整数组或步骤组，但并不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。

Claims (32)

1.制备包含包括生物材料如蛋白质、肽或活细胞在内的易潮材料的产品的方法，其至少包括下列步骤：
(i)提供包含至少一种活性成分、糖聚合物和水溶性/易混合溶剂的包被液体；
(ii)提供至少包含水溶性凝胶形成固体颗粒的一定量微颗粒；
(iii)在适当装置的处理槽内使该一定量的微颗粒流态化从而形成该微颗粒的流化床；
(iv)在饱和湿度条件下，从流化床下面向该流化床喷洒该包被液体以对该微颗粒进行包被；以及
(v)使包被的微颗粒进行干燥。
2.权利要求1中的方法，其进一步包含一或多个额外的包被步骤，利用肠衣、膜包衣、抗潮湿包衣或掩味包衣来对微颗粒进行进一步包被。
3.权利要求1或2中的方法，其中微颗粒是热干燥的。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中活性成分包括一或多种蛋白、肽或细胞。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述水溶性/易混合溶剂为甘油或丙二醇之一或两者的结合。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述糖聚合物选自下组：葡聚糖、果糖、水果糖、葡萄糖、转化糖、乳糖醇、乳糖、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖、甘露糖醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、异麦芽糖、木糖醇、聚葡萄糖或它们的结合。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中水溶性凝胶形成固体颗粒包含一或多种选自下组的水溶性凝胶形成固体颗粒：丙烯酸酯及衍生物、白蛋白、藻酸盐、卡波姆、角叉菜胶、纤维素及衍生物、葡聚糖、糊精、明胶、聚乙烯吡咯烷酮及淀粉。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述方法是在饱和湿度环境中进行的。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述方法在无氧环境中进行。
10.权利要求1-9中任一项的方法，其中该包被的微颗粒被制备成注射用组合物、舌下片剂、口服片剂、缓释舌下片剂、微胶囊、***栓剂、用于鼻喷雾剂或滴剂的预先构成固体剂型、水性滴剂、洗眼液或滴眼剂、皮肤冲洗液或饲料预混物。
11.权利要求1-9中任一项的方法，其中该方法是用于制备稳定化生物材料的方法。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中微颗粒大小为50微米至1毫米。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中活性成分为激素、细胞因子或生长因子。
14.权利要求13中的方法，其中的活性成分选自人或动物生长激素或其衍生物、红细胞生成素、降钙素、干扰素、白细胞介素、胰岛素或集落刺激因子。
15.权利要求1-12中任一项的方法，其中的活性成分为酶。
16.权利要求15中的方法，其中所述酶包括链激酶、胞壁质酶、胰酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、菠萝蛋白酶或木瓜蛋白酶。
17.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述活性成分为葡聚糖。
18.权利要求17中的方法，其中葡聚糖为β-1，3-葡聚糖。
19.权利要求1-12中任一项的方法，其中活性成分为微生物。
20.权利要求19中的方法，其中所述微生物为一或多种双歧杆菌(Bifidus)或乳酸杆菌(Lactobacilli)。
21.利用权利要求1-20中任一项的方法制备的产品。
22.包含有被活性成分和糖聚合物包被层所包被的颗粒核心的组合物。
23.权利要求22中的组合物，其包被有肠衣、膜包衣、防潮包衣、掩味包衣或者一或多种这样的包衣。
24.权利要求22或23中的组合物，其中活性成分包括蛋白质、肽或细胞。
25.权利要求24中的组合物，其中活性成分为激素、细胞因子或生长因子或者其两或多种的结合。
26.权利要求25中的组合物，其中活性成分选自由人或动物生长激素或其衍生物、红细胞生成素、降钙素、干扰素、白细胞介素、胰岛素和集落刺激因子组成的组。
27.权利要求24中的组合物，其中活性成分为微生物。
28.权利要求27中的组合物，其中微生物为一或多种双歧杆菌或乳酸杆菌。
29.权利要求22-24中任一项的组合物，其中活性成分为抗腹泻药剂。
30.权利要求22-24中任一项的组合物，其中活性成分为生长促进剂。
31.权利要求22-30中任一项的组合物，其包含丙烯酸酯或衍生物、白蛋白、藻酸盐、卡波姆、角叉菜胶、纤维素或衍生物、葡聚糖、糊精、明胶、聚乙烯吡咯烷酮或淀粉的微颗粒。
32.权利要求22-31中任一项的组合物，其中该组合物以注射剂、舌下片剂、口服片剂、缓释舌下片剂、微胶囊、***栓剂、用于鼻喷雾剂或滴剂的预先构成固体制剂、水性滴剂、洗眼液或滴眼剂、皮肤冲洗液或饲料预混物的形式存在。
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