CN1487080A - 碱性蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有前原序列的碱性蛋白酶，其前原序列为在如序列号1所示的氨基酸序列或者与其具有80％以上同源性的氨基酸序列中，该序列号1的(a)52位、(b)75位、(c)142位以及与这些位置相当的氨基酸残基用下述氨基酸残基(a)位置：天冬氨酸或者精氨酸(b)位置：丙氨酸或者精氨酸(c)位置：赖氨酸加以置换后得到的突变前原序列，其成熟酶含有序列号2表示的氨基酸序列或者与此具有80％以上同源性的氨基酸序列。

Description

碱性蛋白酶
技术领域
本发明涉及作为洗涤剂配合酶有用的碱性蛋白酶
背景技术
在工业领域中产量最大的碱性蛋白酶是添加到衣物洗涤剂等中的洗涤剂用碱性蛋白酶，例如：A1calase(注册商标；Novozymes公司)、Savinase(注册商标；Novozymes公司)、Maxacal(注册商标；Genencor公司)、Blap(注册商标；Henkel公司)和KAP(花王)等。
将蛋白酶配合到衣物洗涤剂中的目的是分解衣料上附着的污垢蛋白，实际上的污垢不仅包括蛋白质，还有皮脂来源的脂质和泥、尘埃污垢等，是由有机物和无机物等多种成分混合组成的复合污垢。人们盼望出现对这样的复合污垢具有高洗涤功能的洗涤剂。
从上述观点出发，本发明人等研制出多种碱性蛋白酶，这些蛋白酶即使在高浓度脂肪酸存在的条件下也能保持足够的酪蛋白分解活性，不仅对蛋白质而且对皮脂等的混合污垢也具有优异的洗涤能力，其分子量为43000。以前对此提交了专利申请(参见国际公开99/18218号文本)。并且，这组碱性蛋白酶的分子量、一级结构、酶学性质、尤其是具有很强的氧化剂耐受性的这个特点和已知的芽孢杆菌属细菌来源的丝氨酸蛋白酶的枯草杆菌蛋白酶不同，因此认为属于新型枯草杆菌蛋白酶的亚家族(参考Saeki等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，279，(2000)，313-319)。
不过，即使是这样的蛋白酶，当考虑工业水平的生产时，难以说其产量是充分的，需要寻求在培养基中可被有效分泌的碱性蛋白酶。
一方面，为了实现目的蛋白(酶)的大量分泌，人们尝试过通过宿主菌(生产菌)的诱变育种进行改良、改变编码酶的基因或者改变控制酶表达的基因以提高分泌量的方法；不过，对于枯草杆菌蛋白酶，还没有人做过通过改变对分泌和折叠起重要作用的前原序列(preprosequence)来提高酶的分泌量的尝试。
本发明目的在于，针对特定的碱性蛋白酶，提供提高其分泌能力的技术。
发明内容
本发明者进行了使上述碱性蛋白酶的特性得以保持、同时能高效地分泌在培养基中的新型酶的探索，结果发现当使该碱性蛋白酶的前原序列中特定位置的氨基酸残基突变成特定的氨基酸残基时，可以提高该碱性蛋白酶的生产能力。
本发明提供一种具有前原序列的碱性蛋白酶，其中前原序列为，在序列号1所示的氨基酸序列或与该序列有80％以上同源性的氨基酸序列中，用下述氨基酸残基：
(a)位置：天冬氨酸、精氨酸
(b)位置：丙氨酸、精氨酸
(c)位置：赖氨酸
替代序列号1的(a)52位、(b)75位、(c)142位或位置与这些相当的氨基酸残基后得到的突变前原序列；其成熟酶为具有序列号2所示的氨基酸序列以及与此具有80％以上同源性的氨基酸序列的碱性蛋白酶。本发明还提供编码该碱性蛋白酶的结构基因、含有该结构基因的载体、含有该载体的转化体。
此外，本发明还提供编码上述突变前原序列的基因。
另外，本发明还提供以使用上述转化体为特征的制备具有序列号2所示的氨基酸序列或与此有80％以上同源性的氨基酸序列的碱性蛋白酶的方法。
附图的简单说明
图1是序列号1所示的氨基酸序列组成的前原序列和与序列号1所示氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列组成的前原序列的并置图。
图2a以及2b是具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白酶和具有与序列号2所示氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列的蛋白酶的并置图。
具体实施方式
本发明的碱性蛋白酶的前原序列(称为“突变前原序列”)，是将序列号1所示的氨基酸序列或者与此有80％以上同源性的氨基酸序列的(a)52位、(b)75位、(c)142位或位置与此相当的氨基酸残基置换为，(a)位置：天冬氨酸、精氨酸、(b)位置：丙氨酸、精氨酸、(c)位置：赖氨酸，由此而得到的。本发明的前原序列可以是野生型的突变体或者人为进行突变的突变体。
这里的前原序列是与碱性蛋白酶的分泌、折叠相关的重要区域，前序列(pre sequence)是信号序列，当碱性蛋白酶的前体通过细胞膜时被信号肽酶所切断。此外，已知原序列(pro sequence)具有分子内伴侣作用，是碱性蛋白酶在通过细胞膜前后形成正确的立体结构所必须的区域。原序列最后被成熟的碱性蛋白酶所切断，分解成为更小的肽。即，从编码碱性蛋白酶的结构基因经转录、翻译得到的产物以含有前原序列的碱性蛋白酶前体的形式存在于细胞内。因此，本发明的含有前原序列的碱性蛋白酶指的是碱性蛋白酶前体。
在这里，作为突变前的前原序列的序列号1表示的氨基酸序列，例如：可举出KP43[来源于Bacillus sp.KSM-KP43(FERM BP-6532)，国际公开第99/18218号文本]的前原序列。
此外，作为和序列号1所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有87％以上，更优选具有90％以上、95％以上、进一步具有98％以上同源性的氨基酸序列，还优选具有与后述的序列号2所示氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列的碱性蛋白酶的前原序列。具体的讲，例如可举出：蛋白酶KP9860(GenBank AccessionNo.AB046403)[来源于Bacillus sp.KSM-9860(FERM BP-6534)，国际公开WO99/18218号文本]、蛋白酶KP 9865(GenBank AccessionNo.AB084155)[来源于Bacillus sp.KSM-9865(FERMP-18566)，特愿2002-2653号]的前原序列，其同源性分别为86.8％、97.6％(图1)  。
并且，氨基酸序列的同源性可以根据GENETYX WIN的最大匹配(maximum matching)或者同源性搜索(search homology)等程序(开发软件)等进行计算。
另外，确定“位置相当的氨基酸残基”的方法可通过如下方法进行：用Lipman-Person法等众所周知的运算法进行氨基酸序列的比较，赋予各个碱性蛋白酶的氨基酸序列中存在的保守氨基酸残基以最大的同源性。采用这样的方法对前原序列的氨基酸序列进行比对，不管氨基酸序列中的***、缺失如何，都可以确定同源氨基酸残基在各个前原序列中的位置。通常认为，同源氨基酸残基存在于三级结构的相同位置，可以推断具有与对象蛋白酶的特殊功能有关、相似的效果。
即，用上述方法对氨基酸序列比对的图1中，序列号1的(a)52位、(b)75位、(c)142位的氨基酸残基分别是赖氨酸、谷氨酰胺以及谷氨酸。与该位置相当位置的氨基酸残基可以用上述的方法进行确定。例如：蛋白酶KP9860、蛋白酶KP9865的前原序列中的(a)52位、(b)75位、(c)142位的氨基酸残基分别是赖氨酸、谷氨酰胺以及谷氨酸。
并且，在本发明突变前原序列中，序列号1的(a)52位或与该位置相当位置的氨基酸残基优选被天冬氨酸、精氨酸置换，特别优选精氨酸。(b)75位或与该位置相当位置的氨基酸残基优选被丙氨酸、精氨酸置换，特别优选精氨酸。(c)142位或与该位置相当位置的氨基酸残基优选被赖氨酸置换。
此外，对本发明的突变前原序列中(a)～(c)氨基酸残基进行选择时，只要不改变酶的特性，同时置换2个位置以上也可以。置换2个位置以上的情况的具体例子如：Lys52(Asp/Arg)+Gln75(Ala/Arg)、Lys52(Asp/Arg)+Glu142Lys、Lys52(Asp/Arg)+Glu142Lys、Gln75(Ala/Arg)+Lys52(Asp/Arg)+Glu142Lys。优选的组合是：Lys52Arg+Gln75Arg、Lys52Asp+Gln75Ala、Lys52Asp+Glu142Lys，特别优选Lys52Arg+Glu142Lys。这里需说明的是，氨基酸用3个字母表示、「+」表示对1个位置的置换再加的置换，[/」表示使用任一氨基酸都可以。
本发明的碱性蛋白酶具有上述的突变前原序列作为前原序列，其成熟酶具有序列号2所示的氨基酸序列或者与之具有80％以上同源性的氨基酸序列。
这里，与序列号2所示的氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有87％以上、更优选具有90％以上，更进一步优选具有95％以上同源性的序列，野生型或野生型的突变体都可以。此外，其性质优选具有氧化剂耐受性、经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)确认的分子量为43,000±2,000，尤其优选，在pH8以上碱性范围内作用、具有氧化剂耐受性、在高浓度脂肪酸存在下酶活性不受影响、对明胶具有很强的分解活性、在50℃、pH10下处理10分钟时残余活性达到80％以上，能被二异丙基氟磷酸(DFP)以及甲苯磺酰氟(PMSF)所阻断、而且其分子量经SDS-PAGE确定为43,000±2,000。
这里的具有氧化剂耐受性是指，将该碱性蛋白酶在含有50mM过氧化氢、5mM氯化钙的20mM Britton-Robinson缓冲液(pH10)中30℃下放置20分钟后，其残存活性至少保持50％以上。只要能够保持以上的性质，无论是野生型，还是野生型的突变体或者是人为突变的碱性蛋白酶都可以。
作为具有序列号2所示的氨基酸序列的碱性蛋白酶(成熟型碱性蛋白酶)，可举出例如：KP43[源自Bacillus sp.KSM-KP43(FERMBP-6532)、国际公开第99/18218号文本]，作为具有与序列号2所示氨基酸序列有80％以上同源性的氨基酸序列的碱性蛋白酶，可举出例如：蛋白酶KP9860(GenBank Accession No.AB046403)[源自Bacillus sp.KSM-9860(FERM BP-6534)、国际公开第99/18218号文本]，蛋白酶KP9865(GenBank Accession No.AB084155)[源自Bacillus sp.KSM-9865(FERM P-1592)、特愿2002-002653]、蛋白酶E-1(GenBank Accession No.AB046402)[源自Bacillus No.D-6(FERM P-1592)、特开昭49-71191]、蛋白酶Ya(GenBank AccessionNo.AB046404)[源自Bacillus sp.Y(FERM BP-1029)特开昭61-280268]、蛋白酶SD521(GenBank Accession No.AB046405)[源自Bacillus SD521(FERM P-11162)、特开平3-191781]、蛋白酶A-1(GenBank Accession No.AB046406)[源自NCIB12289、国际公开第88/01293号文本01293]、蛋白酶A-2[源自NCIB12513、国际公开第98/56927号文本]和对序列号2氨基酸序列用亮氨酸置换了第46位而得到的突变体、用丙氨酸置换了第57位而得到的突变体、用精氨酸置换了第103位而得到的突变体、用赖氨酸置换了第107位而得到的突变体、分别用赖氨酸和丙氨酸置换了第124位而得到的突变体、用丙氨酸置换了第136位而得到的突变体、用丙氨酸置换了第193位而得到的突变体、分别用天冬酰胺、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷胺酰胺、蛋氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸、或者苯丙氨酸置换了第195位而得到的突变体、分别用苏氨酸和精氨酸置换了第247位而得到的突变体、用缬氨酸置换了第257位而得到的突变体、用丙氨酸置换了第342位而得到的突变体、通过用天冬氨酸置换了第66位且用丝氨酸置换了第264位而得的双突变体(特愿2002-355166号公报)、对于序列号2的氨基酸序列用精氨酸置换了第84位而得到的突变体、用脯氨酸置换了第104位而得到的突变体，分别用丙氨酸和丝氨酸置换了256位而得到的突变体、用天冬酰胺置换了第369位得到的突变体(特开2002-306176号公报)、对于序列号2的氨基酸序列的第251位分别用天冬酰胺、苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、或者谷氨酰胺置换而得到的突变体、分别用丝氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、缬氨酸和丙氨酸置换第256位而得到的突变体(特愿平2001-329472号)、以及与这些序列具有80％以上、优选87％以上、更优选90％以上、更进一步优选95％以上同源性的碱性蛋白酶。对于上述部分碱性蛋白酶，将其氨基酸序列比对的结果示于图中(图2a以及图2b)。
编码本发明所用碱性蛋白酶的基因的克隆可以采用鸟枪法克隆和PCR法等。此外，也可以对被克隆的基因进行突变。按照这样的方法得到的基因碱基序列之一如序列号3所示。此外，对序列号1所示的前原序列或与此有80％以上同源性的前原序列的区域进行编码的基因也可以用PCR方法等进行克隆。
对编码前原序列基因进行突变的方法可以采用常规使用的随机突变或者定点突变的方法。具体地说，例如：可以使用Site-DirectedMutagenesis System Mutan-Super Express Km试剂盒(Takara)等。
作为用突变前原基因(prepro gene)生产本发明蛋白酶的方法，当对编码序列号3所示碱性蛋白酶的前原序列的基因实施了突变时，保持原状；当在突变前原基因的下游连接有对与序列号2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性的成熟酶进行编码的基因时，通过定点突变法赋予适当的限制性内切酶切割位点或者用重组PCR法等可以制备出合适的结构基因。然后，可以采用将该突变基因导入载体，并转化到能够稳定扩增并保持该质粒载体的宿主菌中；或者将该突变基因导入到能够稳定维持该突变基因的宿主菌的染色体DNA上等的方法。满足这个条件的宿主可举出，例如：芽孢杆菌属细菌、大肠杆菌、霉菌、酵母菌、放线菌等，使用这些菌株时，可以向含有可利用的碳源、氮源以及其它必须营养元素的培养基中接种，按照常规方法进行培养。
而且，含有本发明的前原序列的碱性蛋白酶在宿主菌中表达时，其从转化体中的分泌能力高。
这里“分泌能力高”是指，例如：对于与突变前的碱性蛋白酶在同一条件下(例如：向含有聚胨S8％(w/v)、酵母膏0.3％、麦芽糖10％、硫酸镁7水合物0.04％、磷酸二氢钾0.2％、无水碳酸钠1.5％、四环素30ppm的培养基中接种菌种，30℃下震荡培养3天)所产生的碱性蛋白酶突变体，测定其培养上清中的蛋白酶的活性量、蛋白质的量时，其表示活性量以及蛋白质的量为一定量以上，例如意味着：可以确认的活性量或蛋白质的量的增多量为亲本碱性蛋白酶的5％以上、优选10％以上、更优选15％以上。特别是如果不能确认比活性等的变化，则也可对活性量以及蛋白质的量中的任一方进行测定。
从该碱性蛋白酶中切断前原序列并分泌到菌体外，从而得到成熟酶，成熟酶的收集及纯化可以按照常规的酶收集以及纯化方法进行。例如：离心分离或者过滤培养液以去除菌体、从培养上清液中按照常规的纯化方法可以得到目的酶。这样得到的酶液，可以保持原状使用，也可以按照其他已知的方法进行纯化、结晶、粉末化或颗粒化。
这样得到的碱性蛋白酶具有氧化剂耐受性、在高浓度脂肪酸存在的情况下蛋白酶的分解活性不会受到阻碍，对明胶的分解力高。SDS-PAGE确认的分子量为43,000±2,000，具有碱性条件下保持活性的优点，可以作为衣物洗涤剂、漂白剂、硬质表面洗涤用洗涤剂、排水管洗涤剂、假牙洗涤剂、医疗器械用杀菌洗涤剂等使用。
实施例
实施例1
对来源于Bacillus sp-KSM-KP43菌株的碱性蛋白酶结构基因(序列号3)的包含终止密码子在内的约2.0kb的范围，进行随机突变。首先，使用可以使导入pKF18K(Takara)的多克隆位点的上述约2.0kb的DNA进行扩增的 BcaBEST Sequencing Primer RV-M(Takara)和 BcaBEST Sequencing Primer M13-47(Takara)进行PCR扩增。反应体系中，模板DNA30ng、每种引物20pmol、每种dNTP20nmol、适宜量的硫酸锰和二甲亚砜、Takara Taq附带的反应缓冲液10μL，以及Taq聚合酶2.5U(总量为100μL)。PCR条件为，以94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，共进行30个循环，最后72℃下恒温10分钟。PCR产物用High Pure PCR ProductPurification试剂盒(Roche)进行纯化，用100μL无菌水洗脱。用BamHI、 XbaI(Roche)切断所得的2.0kb的DNA片断后，与经相同的酶处理过的pKF18k混合，用DNA Ligation试剂盒ver.2(Takara)进行连接反应。用反应液转化大肠杆菌HB101菌株，在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB琼脂培养基上培养。将得到的转化株接种到含有卡那霉素(100μg/mL)的LB培养基中，30℃下震摇培养。用合成底物(Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA肽研究所)对培养上清进行活性测定，选择比亲本碱性蛋白酶活性高的培养液，用少量菌体以及 BcaBESTSequencing primer RV-M和 Bca BEST Sequencing Primer M13-47按照上述的PCR条件扩增突变基因。纯化扩增片断，用适当的引物和Big Dye DNA Sequencing试剂盒(Applied Biosystems)按照DNASeqencer 377型(Applied Biosystems)测定碱基序列。
结果表明蛋白酶活性上调的突变体为在序列号1的第52位的赖氨酸被精氨酸置换、第75位的谷氨酰胺被精氨酸置换、第142位的谷氨酸被赖氨酸置换后得到的各突变基因。经测定蛋白酶的活性上调了2～10％。然后，为了研究各个突变点用其它氨基酸实施置换后的效果，进行了突变。作为突变方法，采用Site-Directed Mutagenesis SystemMutan-Super Express Km试剂盒(Takara)，将第52位、75位、142位的氨基酸置换成任意的氨基酸。用模板质粒(pKF18k的 BamHI、 XbaI位点导入了蛋白酶结构基因的质粒)30ng、试剂盒附带的选择性引物、引物3～5(序列号4～6)各20pmol以及Takara LA Taq进行PCR。反应条件为，以94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下3分钟为一个循环，共进行30个循环。对所得PCR片断进行纯化，并以此作为引物，用模板质粒30ng和LA Taq再次进行PCR。反应条件是，以94℃下1分钟、55℃下2分钟、72℃下4分钟为一个循环，共进行30个循环。纯化所得的PCR产物，进行连接反应后，转化大肠杆菌MV1184菌株。从转化株中提取质粒DNA，转化大肠杆菌HB101。将得到的转化株接种到含有卡那霉素(100μg/mL)的LB培养基中，30℃下震摇培养。用合成底物对培养上清进行活性测定，选择比亲本碱性蛋白酶活性高的培养液，用菌体作为模板进行PCR反应，扩增突变基因，纯化后，测定碱基序列。结果表明，第52位的赖氨酸被天冬氨酸所置换得到的突变体、第75位的谷氨酰胺被丙氨酸所置换得到的突变体的活性分别比亲本蛋白酶提高了5％和10％。在142位除了赖氨酸外，未发现其他的氨基酸有此效果。
此外，将上述的突变部位进行组合，进行蛋白酶活性上调的研究。制备含有第52位突变部位的 BamHI- XhoI片断、含有第142位突变部位的 XhoI- AatII片断、含有编码成熟酶的基因的 AatII- XbaI片断，与经 BamHI、 XbaI处理的pKF18k混合，进行连接反应。使用得到的质粒DNA转化大肠杆菌HB101菌株，得到除了Lys52Arg突变点以外还存在Glu142Lys突变的双突变体。结果表明Lys52Arg+Glu142Lys突变体的活性比Lys52Arg突变体的活性增加10％。
实施例2
上述得到的各个突变前原序列是在以KP43蛋白酶为亲本碱性蛋白酶的情况下得到上述的活性增加结果的。因此，针对分泌能力和比活性上调的突变碱性蛋白酶(序列号2中Phe46Leu/Thr65Pro/Tyr195gly/Val273Ile/Thr359Ser/Asp369Asn/Ser387Ala置换的碱性蛋白酶KP43H)，探讨了本发明的前原序列是否有效果。
将编码各个突变前原序列的基因片断从pKF18k中用 BamHI和AatII切取，和同样用 AatII和 XbaI切取的KP43H编码基因用连接酶连接起来(不改变被编码的氨基酸，而是通过部位特异地置换碱基，由此重新制得AatII位点)。使用得到的质粒转化大肠杆菌HB101株。提取各个质粒后，用 BamHI和 XbaI切断。将所得片断导入到预先经同样的酶处理过的pHA64中，用SSH-10(岛津制作所)以及基因脉冲发生器(Bio-Rad)，根据电穿孔方法，转化Bacillus sp.KSM-KP43菌株。在含有脱脂乳的碱性琼脂培养基[脱脂乳(Difco)(1％(w/v))、胰酶解胨(Difco)(1％)、酵母膏(Difco)(0.5％)、氯化钠(0.5％)、琼脂(1.5％)、无水碳酸钠(0.05％)、四环素(15ppm)]上培养，根据转化株的脱脂乳溶解斑的形成状况判定是否导入了蛋白酶基因。选择含有***了蛋白酶基因的pHA64质粒的转化株，以供以后的培养。
对于各个转化体，进行单菌落分离、晕圈(ハロ-)形成的确认，接种到试管中的5mL种子培养基[聚胨S(日本制药)6.0％(w/v)、酵母膏0.1％、麦芽糖1.0％、硫酸镁7水合物0.02％、磷酸二氢钾0.1％、无水碳酸钠0.3％、四环素30ppm]中，30℃、320rpm下培养过夜。将该种子培养液按1％接种量(v/v)接种到含有20mL主要培养基[聚胨S8％(w/v)、酵母膏0.3％、麦芽糖10％、硫酸镁7水合物0.04％、磷酸二氢钾0.2％、无水碳酸钠1.5％、四环素30ppm]的500mL容量的坂口烧瓶中，30℃、121rpm下培养3天。将得到的培养液离心分离，测定培养上清中的蛋白酶活性。根据酪蛋白法测定蛋白活性、用蛋白分析试剂盒(和光纯制药公司)测定蛋白质的量。结果表明具有突变前原序列的碱性蛋白酶KP43H的培养活性比对照组(含有碱性蛋白酶KP43H基因的转化株在相同的条件下培养得到的产物)上调了5～25％(表1)。然后，由选择得到的转化株中回收质粒，测定碱基序列，确认目的突变体。
经确认，由上述突变位点得到的碱性蛋白酶除了使转化株的酶分泌能力上调之外，还具有亲本碱性蛋白酶的特性，即：具有氧化剂耐受性，对明胶有强分解活性，在高浓度脂肪酸存在的情况下蛋白酶的分解活性不会受到阻碍，SDS-PAGE确认的分子量为43,000±2,000，在碱性条件下仍能保持活性。
[蛋白酶活性测定法-合成底物法]
用合成底物(Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA：AAPL)测定酶活性，在96穴分析板(Iwaki)中加入100mM硼酸缓冲液(pH10.5)48.5μL和100mM AAPL 1.5μL组成的反应液，然后加入适当稀释的酶液或者培养液50μL，使用iEMS Reader MS(LABSYSTEMS)在30℃下反应15分钟。在414nm条件下测定游离的对硝基苯胺的吸光度。酶的1个unit表示在上述反应条件下1分钟内使吸光度上升0.001的量。
[蛋白酶活性测定法-酪蛋白法]
用含有酪蛋白1％(w/v)的50mM硼酸缓冲液(pH10.5)1.0mL在30℃下保温5分钟后，加入0.1mL酶液，反应15分钟。加入2.0mL反应中止液(0.11M三氯乙酸-0.22M乙酸钠-0.33M乙酸)，在室温放置30分钟后，进行过滤，对Lowry等人的方法进行适当修改，以此定量测定滤液中的酸可溶性蛋白质。即，向0.5mL滤液中加入2.5mL碱性铜溶液(1％酒石酸钠·钾∶1％硫酸铜5水合物∶2％碳酸钠·0.1N氢氧化钠＝1∶1∶100)，室温放置10分钟后，加入0.25mL酚溶液[将酚试剂(关东化学)用蒸馏水稀释2倍]，30℃下保温30分钟。之后，测定660nm的吸光度。蛋白酶的1个单位(1PU)指的是在上述反应条件下，1分钟内使相当于1mmol酪氨酸的酸可溶性蛋白质分解物游离出来所需要的酶量。
                表1
    突变体   相对活性(％)
 KP43H(对照)     100
 Lys52Asp     105
 Lys52Arg     119
 Gln75Ala     110
 Gln75Arg     110
 Gln142Lys     107
 Lys52Arg/Glu142Lys     125
实施例3
(1)洗涤剂的制备
向具有搅拌叶的1m3的混合槽中加入465kg水，水温达到55℃后，添加40％(w/v)聚丙烯酸钠水溶液135kg。搅拌15分钟后，加入碳酸钠120kg、硫酸钠60kg、亚硫酸钠9kg、荧光染料3kg。再次搅拌15分钟后，添加300kg沸石，搅拌30分钟后得到均匀的浆液(浆液中的水份为50质量％)。通过置于喷雾干燥塔塔顶附近的压力喷雾嘴对该浆液进行喷雾，得到基粒(供给喷雾干燥塔的高温气体以225℃的温度由塔下部送入，在以105℃的温度由塔顶排出)。
接着，向Lodige混合机(松阪科技研究股份公司制造，容量20L、配有套管)中投入上述100质量份的基粒，在主轴(150rpm)的搅拌下，在3分钟内投入非离子表面活性剂20质量份、直链烷基(碳数为10～13)苯磺酸钠22质量份、脂肪酸(碳数14～18)钠4质量份、聚乙二醇2质量份、水4质量份的混合液，之后搅拌5分钟。向混合机中加入20质量份的硅酸钠结晶和10质量份的沸石进行表面被覆，得到洗涤剂基料。
向洗涤剂基料99质量％中混入0.5质量％的本发明蛋白酶颗粒以及0.5质量％的香料，得到最终的颗粒状洗涤剂A。
(2)使用的原料
非离子表面活性剂：环氧乙烷平均加入摩尔数为8.5的Emulgen108KM(花王股份公司制造)
聚丙烯酸钠水溶液：平均分子量10000(按特公平2-24283号公报中实施例所记载的方法制造)。
碳酸钠：致密灰(Dense ash)(Central Glass公司制造)
沸石：平均粒径3.5μm的沸石4A型(Tosoh公司制造)
聚乙二醇：K-PEG6000(平均分子量8500，花王(股份)公司制造)
硅酸钠结晶：粉末SKS-6(Hoechst Tokuyama公司制造)
本发明的蛋白酶颗粒：由表1所记录的本发明碱性蛋白酶的各种纯化品，按照特开昭62-257990号公报的实施例1所记载的方法制备的颗粒物(6PU/g)。
荧光染料：天来宝CBS-X(Ciba-Geigy公司制造)
实施例4
(1)洗涤剂的制备
首先，将固态组分占50质量％的浆液在热风温度为250℃的条件下进行喷雾干燥，得到含聚丙烯酸钠(质量平均分子量为10000)7质量％、碳酸钠26质量％、硫酸钠20质量％、氯化钠6质量％、荧光染料0.5质量％、沸石40质量％、水0.5质量％的基粒。
接着，向Lodige混合机(松阪科技研究股份公司制造，容量20L、配有套管)中投入上述100质量份的基粒，在主轴(150rpm)的搅拌下，在3分钟时间内投入20质量份的非离子表面活性剂、直链烷基(碳数为10～13)苯磺酸钠22质量份、脂肪酸(碳数14～18)钠4质量份、聚乙二醇2质量份、水4质量份的混合液，之后搅拌5分钟。向混合机中加入20质量份的硅酸钠结晶和10质量份的沸石进行表面被覆，得到洗涤剂基料。
向95％质量洗涤剂基料中混入漂白剂颗粒2.8质量％、漂白活性剂颗粒1.2质量％、本发明的蛋白酶颗粒0.5质量％以及香料0.5质量％，得到最终的颗粒状洗涤剂B。
(2)使用的原料
非离子表面活性剂：环氧乙烷平均加入摩尔数为8.5的Emulgen108KM(花王股份公司制造)
聚丙烯酸钠水溶液：平均分子量10000(根据特公平2-24283号公报实施例所记载的方法制造)。
碳酸钠：致密灰(Central Glass公司制造)
沸石：平均粒径3.5μm的沸石4A型(Tosoh公司制造)
聚乙二醇：K-PEG6000(平均分子量8500，花王(股份)公司制造)
硅酸钠结晶：SKS-6(Hoechst Tokuyama公司制造)
本发明的蛋白酶颗粒：由表1所记录的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化品中，按照特开昭62-257990号公报的实施例1所记载的方法制备的颗粒物(6PU/g)。
荧光染料：天来宝CBS-X(Ciba-Geigy公司制造)
漂白剂颗粒：碳酸钠·过氧化氢加合物(与特开2000-256699号公报的[0019]部分记载的漂白剂颗粒同样的方法得到)
漂白活性剂颗粒：月桂酰氧基苯磺酸钠的颗粒(与特开2000-256699号公报的[0018]部分记载的漂白活性剂颗粒同样的方法得到)
实施例5
制备表2所示的液体洗涤剂组合物(洗涤剂C和洗涤剂D)
                              表2
    成分   洗涤剂C(质量％)   洗涤剂D(质量％)
非离子表面活性剂1)非离子表面活性剂2)非离子表面活性剂3)非离子表面活性剂4)非离子表面活性剂5)非离子表面活性剂6)阴离子表面活性剂7)硅酮8)羧酸系聚合物9)聚合物10)柠檬酸氯化钙单乙醇胺三甘醇苯基醚丙二醇乙醇亚硫酸钠本发明的蛋白酶11)香料水     25.05.010.0---1.0-2.0-0.20.054.03.03.02.00.20.50.5其余部分     ---9.09.02.5-0.8-0.8-----2.0-1.00.5其余部分
合计     100     100
使用浓度     20g/30L     40g/30L
洗涤液的pH     10.5     7.3
1)具有源自碳数12～14的仲醇的烷基的聚氧乙烯(加入平均7摩尔)烷基醚(softanol 70日本触媒化学工业公司制造)
2)具有源自碳数12～14的仲醇的烷基的聚氧乙烯(加入平均12摩尔)烷基醚(softanol 120日本触媒化学工业公司制造)
3)向碳数10～14的直链伯醇中依次嵌段加入了平均5摩尔EO、平均2摩尔PO、平均3摩尔EO后的产物。
4)聚氧乙烯十二烷基醚、加入平均8摩尔EO后的产物。
5)聚氧乙烯十二烷基醚、加入平均11.5摩尔EO后的产物。
6)窄范围(narrow range)的聚氧乙烯烷基(仲C12/C13)醚
7)碳数10～14的直链烷基苯磺酸钠
8)酰胺/醚修饰的硅酮聚合物(BY16-906，Dow Corning ToraySilicone公司制造)
9)特开平10-60476号公报的第11页第6～13行所记载的方法合成的苯氧基聚乙二醇-丙烯酸-马来酸共聚物(质量平均分子量为10000，固体组分占51.2％)
10)戊烯/马来酸(50/50摩尔比)共聚物的钠盐(质量平均分子量是7000)
11)表1所记载的本发明碱性蛋白酶的各种纯化制品(15PU/g)
实施例6
边搅拌混合下述表3的组成中的过碳酸钠和碳酸钠(致密灰)，边向其中加入聚丙烯酸钠40％水溶液、直链烷基苯磺酸钠、非离子表面活性剂、月桂酰氧基苯磺酸钠。接着，加入按特开昭62-257990号公报的实施例1所记载的方法制备得到的本发明蛋白酶颗粒，全部混合均匀后，制成漂白剂。
                              表3
    成分   漂白剂E(质量％)   漂白剂F(质量％)
过碳酸钠1)碳酸钠(致密灰)阴离子表面活性剂2)非离子表面活性剂3)聚丙烯酸钠4)月桂酰氧基苯磺酸钠本发明的蛋白酶5)     72.020.02.0-1.04.01.0     72.020.0-2.01.04.01.0
1)粒径500～700μm
2)碳数12～14的直链烷基苯磺酸钠
3)聚氧乙烯烷基醚(烷基的碳数12～14，EO平均加入摩尔数为12)
4)平均分子量8,000
5)由表1所记录的本发明碱性蛋白酶的各种纯化标准品按特开昭62-257990号公报的实施例1所记载的方法制备的颗粒物(6PU/g)。
实施例7
制备下表4所示的全自动餐具清洗机用洗涤剂组合物(洗涤剂G和H)。
                            表4
    成分 洗涤剂G(质量％) 洗涤剂H(质量％)
Pluronic L-611)Softanol EP-70852)柠檬酸三钠三聚磷酸钠过碳酸钠碳酸钠无定形硅酸盐3)AA-MA4)硫酸钠α-淀粉酶5)本发明的蛋白酶6)     -4.0-30.020.020.010.04.010.01.01.0     4.0-30.0-20.020.010.04.010.01.01.0
1)聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(平均分子量2,000)
2)碳数12～14的仲醇的7摩尔环氧乙烷和8.5摩尔环氧丙烷的加入物
3)JIS 2号硅酸钠
4)丙烯酸-马来酸共聚物
5)Duramyl 60T(TM)(novozymes公司制造)
6)由表1所记录的本发明碱性蛋白酶的各种纯化品按特开昭62-257990号公报的实施例1所记载的方法制备的颗粒物(6PU/g)。
实施例8
用下表5所示的各个成分，制得硬质表面用洗涤剂(洗涤剂J)
                       表5
    成分   洗涤剂J(质量％)
阴离子表面活性剂1)非离子表面活性剂2)非离子表面活性剂3)两性表面活性剂4)两性表面活性剂5)柠檬酸聚丙二醇6)乙醇本发明的蛋白酶7)香料、水、其它/pH调节剂合计     15.05.05.07.54.01.02.05.01.054.5100.0
1)聚氧乙烯(EOP＝4)烷基(C12)醚硫酸酯钠
2)聚氧乙烯(EOP＝8)烷基(C12)醚
3)烷基(C12)多聚葡萄糖(缩合度1.3)
4)单长链叔烷基(C12)二甲胺氧化物
5)烷基(C12)羟基二甲基磺基三甲铵乙内酯
6)分子量10000
7)表1所记载的本发明碱性蛋白酶的各种纯化品(15PU/mL)
实施例9
用上述洗涤剂A(参照实施例3)得到下述表6所记载的粒状洗涤剂。
                                表6
    组分(质量％)   洗涤剂K   洗涤剂L   洗涤剂M   洗涤剂N
实施例2的洗涤剂基料     98.4     98.3     98.5     97.2
  香料     0.5     0.5     0.5     0.5
  本发明的蛋白酶1)     0.5     0.5     0.5     0.5
  以往的蛋白酶2)     0.6     0.6
  纤维素酶3)     0.7     0.7
  脂酶4)     0.5     0.5
1)由表1所记录的本发明的碱性蛋白酶的各种纯化品，按照特开昭62-257990号公报的实施例1所记载的方法制备的颗粒物(6PU/g)。
2)将特开平5-25492号公报记载的蛋白酶K-16根据特开昭62-257990号公报的实施例1所记载的方法做成5PU/g。
3)KAC-500(花王股份公司制造)。
4)脂酶100T(TM)(Novazymes公司制造)
产业上应用的可能性
根据本发明，可以得到分泌能力上调的碱性蛋白酶，特别是能有效的生产即使在高浓度脂肪酸存在的情况下也可保持活性，即使对除了蛋白质之外还混有皮脂的复合污垢也具有优良的洗涤能力的碱性蛋白酶。
                            序列表<110>花王株式会社<120>碱性蛋白酶<130>KS0713<150>JP 2002-186387<151>2002-06-26<150>JP 2002-304232<151>2002-10-18<160>6<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>206<212>PRT<213>Bacillus sp.KSM-KP43<400>1Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala1               5                  10                  15Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly Ala Arg
         20                  25                  30Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Ala Lys
     35                  40                  45Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu
 50                  55                  60Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln Lys Lys Leu Glu Thr65                  70                  75                  80Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile Gln Phe Asn Gly Pro Ile
             85                  90                  95Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu
        100                 105                 110Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val
    115                 120                  125Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr
130                 135                 140Leu Pro Ile Tyr Arg Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser145                 150                 155                 160Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu
            165                 170                 175Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn
        180                 185                 190Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met<210>2<211>434<212>PRT<213>Bacillus sp.KSM-KP43<400>2Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser1               5                  10                  15Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
         20                  25                  30Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
     35                  40                  45Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
 50                  55                  60Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly65                  70                  75                  80Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser
             85                  90                  95Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln
        100                 105                 110Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn
    115                 120                 125Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn
130                 135                 140Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala145                 150                 155                 160Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala
            165                 170                 175Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
        180                 185                  190Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg
    195                 200                 205Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly
210                 215                 220Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe225                 230                 235                 240Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met
            245                 250                 255Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe
        260                 265                 270Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala
    275                 280                 285Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn
290                 295                 300Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr305                 310                 315                 320Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser
            325                 330                 335Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
        340                 345                 350Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu
    355                 360                 365Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp
370                 375                 380Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu385                 390                 395                 400Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val
            405                 410                 415Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile
        420                 425                 430Val Asn<210>3<211>1923<212>DNA<213>Bacillus sp.KSM-KP43<400>3atg aga aag aag aaa aag gtg ttt tta tct gtt tta tca gct gca gcg 48Met Arg Lys Lys Lys Lys Val Phe Leu Ser Val Leu Ser Ala Ala Ala1               5                  10                  15att ttg tcg act gtt gcg tta agt aat cca tct gca ggt ggt gca agg 96Ile Leu Ser Thr Val Ala Leu Ser Asn Pro Ser Ala Gly Gly Ala Arg
         20                  25                  30aat ttt gat ctg gat ttc aaa gga att cag aca aca act gat gct aaa 144Asn Phe Asp Leu Asp Phe Lys Gly Ile Gln Thr Thr Thr Asp Ala Lys
     35                  40                  45ggt ttc tcc aag cag ggg cag act ggt gct gct gct ttt ctg gtg gaa 192Gly Phe Ser Lys Gln Gly Gln Thr Gly Ala Ala Ala Phe Leu Val Glu
 50                  55                  60tct gaa aat gtg aaa ctc cca aaa ggt ttg cag aag aag ctt gaa aca 240Ser Glu Asn Val Lys Leu Pro Lys Gly Leu Gln Lys Lys Leu Glu Thr65                  70                  75                  80gtc ccg gca aat aat aaa ctc cat att atc caa ttc aat gga cca att 288Val Pro Ala Asn Asn Lys Leu His Ile Ile Gln Phe Asn Gly Pro Ile
             85                  90                  95tta gaa gaa aca aaa cag cag ctg gaa aaa aca ggg gca aag att ctc 336Leu Glu Glu Thr Lys Gln Gln Leu Glu Lys Thr Gly Ala Lys Ile Leu
        100                 105                 110gac tac ata cct gat tat gct tac att gtc gag tat gag ggc gat gtt 384Asp Tyr Ile Pro Asp Tyr Ala Tyr Ile Val Glu Tyr Glu Gly Asp Val
    115                 120                 125aag tca gca aca agc acc att gag cac gtg gaa tcc gtg gag cct tat 432Lys Ser Ala Thr Ser Thr Ile Glu His Val Glu Ser Val Glu Pro Tyr
130                 135                 140ttg ccg ata tac aga ata gat ccc cag ctt ttc aca aaa ggg gca tca 480Leu Pro Ile Tyr Arg Ile Asp Pro Gln Leu Phe Thr Lys Gly Ala Ser145                 150                 155                 160gag ctt gta aaa gca gtg gcg ctt gat aca aag cag aaa aat aaa gag 528Glu Leu Val Lys Ala Val Ala Leu Asp Thr Lys Gln Lys Asn Lys Glu
            165                 170                 175gtg caa tta aga ggc atc gaa caa atc gca caa ttc gca ata agc aat 576Val Gln Leu Arg Gly Ile Glu Gln Ile Ala Gln Phe Ala Ile Ser Asn
        180                 185                 190gat gtg cta tat att acg gca aag cct gag tat aag gtg atg aat gat 624Asp Val Leu Tyr Ile Thr Ala Lys Pro Glu Tyr Lys Val Met Asn Asp
    195                 200                 205gtt gcg cgt gga att gtc aaa gcg gat gtg gct cag agc agc tac ggg 672Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser Tyr Gly
210                 215                 220ttg tat gga caa gga cag atc gta gcg gtt gcc gat aca ggg ctt gat 720Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly Leu Asp225                 230                 235                 240aca ggt cgc aat gac agt tcg atg cat gaa gcc ttc cgc ggg aaa att 768Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly Lys Ile
            245                 250                 255act gca tta tat gca ttg gga cgg acg aat aat gcc aat gat acg aat 816Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp Thr Asn
        260                 265                 270ggt cat ggt acg cat gtg gct ggc tcc gta tta gga aac ggc tcc act 864Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly Ser Thr
    275                 280                 285aat aaa gga atg gcg cct cag gcg aat cta gtc ttc caa tct atc atg 912Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser Ile Met
290                 295                 300gat agc ggt ggg gga ctt gga gga cta cct tcg aat ctg caa acc tta 960Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln Thr Leu305                 310                 315                 320ttc agc caa gca tac agt gct ggt gcc aga att cat aca aac tcc tgg 1008Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn Ser Trp
            325                 330                 335gga gca gca gtg aat ggg gct tac aca aca gat tcc aga aat gtg gat 1056Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn Val Asp
        340                 345                 350gac tat gtg cgc aaa aat gat atg acg atc ctt ttc gct gcc ggg aat 1104Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala Gly Asn
    355                 360                 365gaa gga ccg aac ggc gga acc atc agt gca cca ggc aca gct aaa aat 1152Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala Lys Asn
370                 375                 380gca ata aca gtc gga gct acg gaa aac ctc cgc cca agc ttt ggg tct 1200Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe Gly Ser385                 390                 395                 400tat gcg gac aat atc aac cat gtg gca cag ttc tct tca cgt gga ccg 1248Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg Gly Pro
            405                 410                 415aca aag gat gga cgg atc aaa ccg gat gtc atg gca ccg gga acg ttc 1296Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly Thr Phe
        420                 425                 430ata cta tca gca aga tct tct ctt gca ccg gat tcc tcc ttc tgg gcg 1344Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe Trp Ala
    435                 440                 445aac cat gac agt aaa tat gca tac atg ggt gga acg tcc atg gct aca 1392Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met Ala Thr
450                 455                 460ccg atc gtt gct gga aac gtg gca cag ctt cgt gag cat ttt gtg aaa 1440Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe Val Lys465                 470                 475                 480aac aga ggc atc aca cca aag cct tct cta tta aaa gcg gca ctg att 1488Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala Leu Ile
            485                 490                 495gcc ggt gca gct gac atc ggc ctt ggc tac ccg aac ggt aac caa gga 1536Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn Gln Gly
        500                 505                 510tgg gga cga gtg aca ttg gat aaa tcc ctg aac gtt gcc tat gtg aac 1584Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr Val Asn
    515                 520                 525gag tcc agt tct cta tcc acc agc caa aaa gcg acg tac tcg ttt act 1632Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser Phe Thr
530                 535                 540gct act gcc ggc aag cct ttg aaa atc tcc ctg gta tgg tct gat gcc 1680Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser Asp Ala545                 550                 555                 560cct gcg agc aca act gct tcc gta acg ctt gtc aat gat ctg gac ctt 1728Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu Asp Leu
            565                 570                 575gtc att acc gct cca aat ggc aca cag tat gta gga aat gac ttt act 1776Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp Phe Thr
        580                 585                 590tcg cca tac aat gat aac tgg gat ggc cgc aat aac gta gaa aat gta 1824Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu Asn Val
    595                 600                 605ttt att aat gca cca caa agc ggg acg tat aca att gag gta cag gct 1872Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val Gln Ala
610                 615                 620tat aac gta ccg gtt gga cca cag acc ttc tcg ttg gca att gtg aat 1920Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile Val Asn625                 630                 635                 640taa                                                             1923<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>4gctaaaggtt tctccnnnca ggggcagact ggt 33<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>5ctcccaaaag gtttgnnnaa gaagcttgaa aca 33<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<400>6cacgtggaat ccgtgnnncc ttatttgccg ata 33

Claims (7)

1.具有前原序列的碱性蛋白酶，其前原序列为在如序列号1所示的氨基酸序列或者与其具有80％以上同源性的氨基酸序列中，该序列号1的(a)52位、(b)75位、(c)142位或与这些位置相当的氨基酸残基用下述氨基酸残基
(a)位置：天冬氨酸或者精氨酸
(b)位置：丙氨酸或者精氨酸
(c)位置：赖氨酸
加以置换后得到的突变前原序列，其成熟酶含有序列号2表示的氨基酸序列或者与此具有80％以上同源性的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述碱性蛋白酶的基因。
3.含有权利要求2所述基因的重组载体。
4.含有权利要求3所述载体的转化体。
5.根据权利要求4所述的转化体，其中，宿主为微生物。
6.编码权利要求1所述突变前原序列的基因。
7.制造含有序列号2表示的氨基酸序列或者与此具有80％以上同源性的氨基酸序列的碱性蛋白酶的方法，其特征在于，使用权利要求5所述的转化体。
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