CN1480110A - 口腔生物膜模型装置及其口腔生物膜形成方法 - Google Patents

Abstract

一种口腔生物膜模型装置及其口腔生物膜的形成方法，其特点是该装置由碱液罐(1)、培养基罐(2)、发酵罐(3)、恒流培养室(4)和加样瓶(7)组成，碱液罐(1)和培养基罐(2)安装在发酵罐(3)的前极，发酵罐(3)和加样瓶(7)安装在恒流培养室(4)的前极，通过管路***及其连接件将各装置和器件连接构成整体。口腔生物膜则由模型装置无菌连接完成后，向发酵罐内接种实验菌株混合连续培养，由pH控制仪保持pH＝7.0，恒速加入人工唾液培养基作为实验菌的营养来源；待各菌生长稳定后，由蠕动泵P6将发酵罐中的菌悬液引入各并联的恒流培养室内，并持续加入培养基，介导在羟磷灰石片上形成口腔生物膜。它为龋病学与口腔材料学提供了科学的研究方法和治疗依据，取得了显著的医疗效果。

Description

口腔生物膜模型装置及其口腔生物膜形成方法

一、技术领域

本发明涉及一种口腔生物膜模型装置及其口腔生物膜形成方法，属于生物膜口腔医疗模型器械或者口腔医学研究领域。

二、背景技术

作为单细胞的生命形式，细菌在长期以来的研究中始终以游离于液体培养基中的单细胞状态作为研究对象，这样做在最大程度上简化了外界环境的影响，也获得了大量的研究成果，为现代微生物学奠定了基础。然而在自然状态下，细菌很少以这种游离于纯培养中的形式而存在。生物膜是细菌最常见的生存形式，是指在固态的有机或无机介质表面，大量微生物集聚于胞外多糖构成的基质内并互相交联而形成的微生物生态环境。

在医学领域中，生物膜病占据了80％以上的微生物感染性疾病。生物膜通过其理化屏障的作用，给致病菌提供了抵御外部刺激的优良生态环境，而在其中发展的基因传导与接合。也有利于不同微生物间对耐药基因的水平传递从而对传统的抗生素疗法造成很大的困难。危害人类口腔健康的主要疾病龋病，其主要致病因素也是以变形链球菌为主构成的致龋性生物膜(牙菌斑)。

建立起模拟口内环境的口腔生物膜模型，有利于在体外进行高可信度的口腔微生物学研究。将能获得比体外实验更加准确和全面的结果。生物膜模型能在体外创造一种与体内近似的生态环境，调控细菌的生长代谢条件，使之既具有与天然环境的一致性，又具有标准化和可调控性的显著优点，用生物膜模型来进行口腔生物学实验与简单的体外实验相比，可信度更高，可重复性更好，是一种很有潜力的实验手段。

生物膜模型***主要目的在于尽可能地模拟出口腔内生态环境，以及将此一人工环境维持于稳定的状态。目前国内刘正等报道的相关的生物膜模型(中华口腔医学杂志.1996；31(2)：110-112.)仅为简易的恒化器细菌培养***，虽能满足基本的微生物连续培养要求，但其结构庞杂，核心部件为发酵罐连续静态培养，仍不能有效模拟出口腔内部唾液等营养液持续不断的流动环境，且对于污染的控制欠佳；而国外的同类产品，如Sissons等于Journal ofDental Research，1991，70(11)：1409-16报道多工作站人工口腔***(MAM)与Kinniment等建立的恒厚生物膜模型(Microbiology，1996，142，631-638)，尽管对环境条件的控制精度高，但其结构复杂，对***设备的精度要求相应也高，故其价格昂贵，应用成本居高不下，尽管对口腔环境模拟良好但仍无法获得推广应用。

三、发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种口腔生物膜模型装置及其口腔生物膜形成方法，其特点是采用羟磷灰石片置于含有定量实验菌株的连续培养***中，通过定时给以蔗糖溶液以补充各菌无氧酵解所需的底物。

本发明的目的由以下技术措施实现：

口腔生物膜模型装置由碱液罐、培养基罐、发酵罐、恒流培养室和加样瓶组成。碱液罐和培养基罐安装在发酵罐的前极，发酵罐和加样瓶安装在恒流培养室前极，通过管路***及其连接件将装置和各器件连接构成整体。

碱液罐通过蠕动泵与发酵罐连接，培养基罐通过蠕动泵与发酵罐连接，发酵罐通过滤器和泵引入惰性气体N₂和CO₂，发酵罐通过蠕动泵和过滤器向外排出废液、废气，发酵罐通过蠕动泵和多个恒流培养室连接，每个恒流培养室通过蠕动泵和过滤器向外排出废液、废气，培养基罐和加样瓶分别通过蠕动泵与多个并联恒流培养室连接。

发酵罐为夹层，夹层设有循环水进口和出口，发酵罐置于电磁搅拌器上。

发酵罐为玻璃、塑料或金属制作。

每个恒流培养室内置羟磷灰石片，羟磷灰石片垂直固定于平台上，恒流培养室内还设有多通道pH记录仪电极和废液废气排出口，恒流培养室置于恒温培养箱内恒温孵育，由循环管经蠕动泵P8保持模拟口腔环境内唾液的流动循环。

恒流培养室和平台材料为玻璃、塑料或金属。

羟磷灰石片由四川大学华西口腔医学院口腔生物医学工程重点实验室材料研究室提供。

口腔生物膜的形成方法

1、模型装置无菌连接完成后，将发酵罐置于电磁搅拌器上，获得30-100rpm的搅拌速度，温度由循环水浴箱维持在37℃左右，碱液罐提供碱性溶液使发酵罐内的pH＝7.0左右，由pH控制仪和蠕动泵调节。

2、培养基罐内盛人工唾液培养基作为实验菌的主要营养来源由蠕动泵向发酵罐和恒流培养室内恒速加入。

3、加样瓶内盛药物和蔗糖，并向恒流培养室内实验生物膜提供致龋的底物蔗糖以及所需研究的防龋药物，根据研究目的的差别可采用不同的药物以及浓度。

4、恒流培养室置于密封的恒温培养箱内，由循环管经蠕动泵保持50～100ml/min的循环流速以模拟口腔环境内唾液流动的动态环境。

本发明具有如下优点：

1、能有效模拟出口内生态环境与稳定地形成实验生物膜，已通过大量研究验证了其在龋病学与口腔材料学的应用效能；

2、采用多通道并联培养技术，能同时比较不同生物膜处理措施的差别，也极大的简化了工作流程，更便于使用；

3、选用的主要设备均为市场上常用产品，成本控制良好，与国际同类产品相比较，具有相当好的价格优势；

4、采用密闭培养方式从而有效的控制环境的污染。

四、附图说明

图1为口腔生物膜模型装置示意图

1.碱液罐  2.培养基罐  3.发酵罐  4.恒流培养室  5.羟磷灰石片  6.平台  7.加样瓶  8.电磁搅拌器  9.恒温水浴箱  10.多通道pH测量仪

P1～P8为蠕动泵

F1～F3为过滤器

图2为发酵罐结构示意图

图3为恒流培养室结构示意图

图4为连续培养中的pH反应曲线图

图5为羟磷灰石片上生物膜活菌计数图

图6为实验组与对照组生物膜中各实验菌的构成比

图7为阴性对照组生物膜扫描电镜观SEM X5000

图8为阳性对照组生物膜扫描电镜观SEM X5000

图9为实验组扫描电镜观SEM X5000

五、具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，但不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

实施例：

口腔生物膜模型装置如图1～3所示，由碱液瓶1、培养基罐2、发酵罐3、恒流培养室4、和加样瓶7组成，碱液罐1和培养基罐2安装在发酵罐3的前极，发酵罐3和加样瓶7安装在恒流培养室的4的前极，通过管路***及其连接件将各装置和器件连接构成整体。碱液罐1通过蠕动泵P1与发酵罐3连接；培养基罐2通过蠕动泵P2与发酵罐3连接；发酵罐3通过滤器F2和泵P4引入惰性气体N2和CO2；发酵罐3通过蠕动泵P5和滤器F1排出废液、废气，发酵罐3通过蠕动泵P6与多个恒流培养室4连接，每个恒流培养室4通过蠕动泵P7和过滤器F3向外排出废液、废气，培养基罐2和加样瓶7分别通过蠕动泵P2，P3与多个并联的恒流培养室4连接。发酵罐3为夹层，夹层设循环水进口和出口，通过循环水浴保持发酵罐内温度为37℃左右，发酵罐置于电磁搅拌器8上。发酵罐可用玻璃、塑料或金属制作。每个恒流培养室4内置羟磷灰石片5，羟磷灰石片5垂直固定于平台6上，恒流培养室4内设多通道pH测量记录仪电极和废液、废气排出口，恒流培养室至于恒温培养箱9内恒温孵育，由循环管经蠕动泵P8保持模拟口腔环境内唾液的流动循环，保持温度为37℃左右。恒流培养室和平台可用玻璃、塑料或金属制作。羟磷灰石片由四川大学华西口腔医学院口腔生物医学工程重点实验室材料研究室制作提供。

口腔生物膜的形成方法：

1、模型装置无菌连接完成后，将发酵罐3置于电磁搅拌器8上，获得30～100rpm的搅拌速度，温度由循环水浴箱维持在37℃左右，碱液罐1提供0.1N NaOH碱性溶液使发酵罐内的pH＝7.0左右，由pH控制仪和蠕动泵P1调节，待各实验菌生长稳定后备用。

2、培养基罐2内盛人工唾液培养基作为实验菌的主要营养来源由蠕动泵P2向发酵罐3和恒流培养室4内恒速加入。

3、加样瓶7内盛药物和蔗糖，并向恒流培养室4内实验生物膜提供致龋的底物蔗糖以及所需研究的防龋药物，根据研究目的的差别可采用不同的药物以及浓度。

4、恒流培养室4置于密封的恒温培养箱内，由循环管经蠕动泵P8保持50～100ml/min的循环流速以模拟口腔环境内唾液流动的动态环境。

人工唾液培养基为BM系列微生物培养基。

以下为本模型装置的在龋病学研究中的应用实例：1.实验菌株

变形链球菌  Streptococcus mutans ATCC25175

血链球菌    Streptococcus sanguis SB 179

唾液链球菌  Streptococcus salivarius SS 196

内氏放线菌  Actinomyces naeslundii WVU 627

以上菌株均由华西口腔医学院口腔生物医学工程重点实验室微生物室提供。2.培养条件2.1发酵罐培养条件

温度：37℃由循环水浴箱维持；

搅拌：低速，由磁力搅拌器8控制，以使发酵罐中菌悬液混匀；

厌氧环境：95％N2，5％CO2，流速10ml/min，由蠕动泵P4控制；

pH：用0.1N NaOH溶液维持在7.0左右，由pH控制仪与蠕动泵P4调节；

清除率：D＝0.1/hr由蠕动泵P5控制。2.2恒流培养室培养条件

温度：37℃由恒温培养箱维持；

循环：60ml/min，由蠕动泵P8控制；

清除率：D＝0.75/hr由蠕动泵P7控制；

蔗糖(以蒸馏水作对照)：每12小时给予1次，每次10ml，使其达到一定终浓度，由蠕动泵P3及分配器控制。3.实验流程

模型装置无菌连接完成后，向其中的发酵罐内接种实验菌株混合连续培养，由pH控制仪维持其pH的平衡，恒速加入人工唾液培养基BM-5，作为实验菌的主要营养来源。待各菌生长稳定后(连续两日培养液比浊与活菌计数无显著性差异)；由蠕动泵将发酵罐中的菌悬液引入各个并联的恒流培养室中，并持续加入BM-5培养基，介导在羟磷灰石片上形成实验生物膜。根据实验目的的不同可通过向其中定时加入不同的药物溶液，以观察对实验生物膜的影响。4.人工唾液

本实验采用的人工唾液配方为生物膜改良培养基BM-5：

III型猪胃粘蛋白(Hog gastric mucin，Type III，Sigma)             2.50g/l

肽胨(Proteose peptone，Fluka)                                   2.00g/l

胰酶分解的酪蛋白胨(Peptone from casein，tryptic digest，Fluka)  1.00g/l

酵母提取物(Yeast extract，Oxoid)                                1.00g/l

氯化钾                                                          2.50g/l

葡萄糖(Sucrose)                                                 0.50g/l

胱氨酸盐酸盐(Cystiene-Hydrochloride，Sigma)                     0.10g/l

氯化血红素(Heamin，上海东风生化技术公司)                        1.00mg/l

磷酸氢二钾                                                      0.114g/l

磷酸二氢钾                                                      0.20g/l

用1N NaOH溶液调整其pH值为7.0。121℃，15psi，消毒70min。5.实验结果示例

本例为研究天然药物蜂房对实验生物膜的影响

A实验分组

当恒流培养室中细菌生长稳定后，每12小时加样1次，每次10ml，使其达到一定终浓度，由蠕动泵及分配器控制。根据对恒流培养室中加样的不同，分为以下各组：

阳性对照组：250mM蔗糖溶液，培养室中的终浓度约为25mM。

阴性对照组：不含任何糖类的蒸馏水作为空白对照。

实验组：含4mg/ml的蜂房提取物的250mM蔗糖溶液。

B连续培养中pH的动态变化

如图2所示，在6次定时加药的过程中，阴性对照组由于加入的为蒸馏水，因此其pH并未见明显的波动。在阳性对照组中，由于加入了终浓度约25mM的蔗糖溶液，从第三次给药起，其pH值就持续抑制在较低范围内。而在实验组中，尽管有同样浓度的蔗糖的加入，但由于同时加入了蜂房提取物，从而仅在加药初期，其pH可见明显下降，而4-5小时后，随着代谢产物的逐步清除，其pH值每次均能逐步恢复到正常范围，曲线呈规则的波浪形。

C实验生物膜的活菌计数

由图6可见，随着6次蔗糖溶液的每12小时定时加入，生物膜上变形链球菌，血链球菌及内氏放线菌的活菌记数与阴性对照组(蒸馏水加入组)相比多有明显的增长(P＜0.05)。蜂房对变形链球菌在生物膜上的生长，与加入同样浓度蔗糖的阳性对照组相比有着显著的抑制表现(P＜0.05)。如图4、5所示，可以发现对于不同实验菌尽管其在生物膜附着数量上有着一定的差异，但在其构成上未见有显著变化。

D实验生物膜的扫描电镜观察

在对实验生物膜的扫描电镜观察中如图7可见阳性对照组中，大量胞外多糖的存在使之呈绒毛样表现，而在阴性对照组中，如图8可见，各菌细胞间界限清晰，胞外基质较少。含蜂房溶液的蔗糖加入组所成图像如图9可见则介于两者之间。

实验结果表明

由此实验可见，随着蔗糖溶液的定时补充，羟磷灰石片上生物膜胞外基质明显增多，细菌间结合更为紧密，而各菌数量上也有明显的增多，这从另一个方面验证了菌斑致龋化假说，即随着碳水化合物的大量摄入，成熟菌斑中酸性代谢产物大量累积，长期处于低pH环境下，各致龋菌的量会有显著增加，产酸进一步增多，从而使正常菌斑向致龋性菌斑转变。但蜂房粗提取物溶液的加入，则可显著减少变形链球菌在羟磷灰石片上粘附的量，在扫描电镜的观察中也表现出胞外基质的减少，提示蜂房溶液的加入可能对菌斑的致龋化转变有一定的抑制作用。

Claims (8)

1、口腔生物膜模型装置，其特征在于该装置由碱液罐(1)、培养基罐(2)、发酵罐(3)、恒流培养室(4)和加样瓶(7)组成，碱液罐(1)和培养基罐(2)安装在发酵罐(3)的前极，发酵罐(3)和加样瓶(7)安装在恒流培养室(4)的前极，通过管路***及其连接件将各装置和器件连接构成整体。

2、按照权利要求1所述口腔生物膜模型装置，其特征在于碱液罐(1)通过蠕动泵P1与发酵罐(3)连接，培养基罐(2)通过蠕动泵P2与发酵罐(3)连接，发酵罐(3)通过滤器F2和泵P4引入惰性气体N2和CO2，发酵罐(3)通过蠕动泵P5和过滤器F1向外排出废液、废气，发酵罐(3)通过蠕动泵P6和多个恒流培养室(4)连接，每个恒流培养室(4)通过蠕动泵P7和过滤器F3向外排出废液、废气，培养基罐(2)和加样瓶(7)分别通过蠕动泵P2，P3与多个恒流培养室(4)连接。

3、按照权利要求1所述口腔生物膜模型装置，其特征在于发酵罐(3)为夹层，夹层设循环水浴进口与出口，罐内置pH控制仪电极，发酵罐(3)置于电磁搅拌器(8)上。

4、按照权利要求1所述口腔生物膜模型装置，其特征在于发酵罐为玻璃、塑料或金属制作。

5、按照权利要求1所述口腔生物膜模型装置，其特征在于每个恒流培养室(4)内置羟磷灰石片(5)，羟磷灰石片垂直固定于平台(6)上，恒流培养室内还设有多通道pH测量记录仪(10)电极和废液、废气排出口，恒流培养室(4)置于恒温培养箱(9)内恒温孵育，由循环管经蠕动泵P8保持模拟口腔环境内唾液的流动循环。

6、按照权利要求1所述口腔生物膜模型装置、其特征在于恒流培养室和平台为玻璃、塑料或金属制作。

7、按照权利要求1-6所述口腔生物膜的形成方法，其特征在于：

1)模型装置无菌连接完成后将发酵罐(3)置于电磁搅拌器(8)上，获得30-100rpm的搅拌转速，温度由循环水保持37℃左右，碱液罐(1)提供碱液使发酵罐内的pH＝7.0左右，由PH控制仪和蠕动泵P1调节，待各菌生长稳定后备用；

2)培养基罐(2)内盛人工唾液培养基作为实验菌的主要营养来源，由蠕动泵P2向发酵罐(3)和恒流培养室(4)内恒速加入；

3)加样瓶(7)内盛药物和蔗糖，向恒流培养室(4)内实验生物膜提供致龋的底物蔗糖以及所需研究的防龋药物，根据研究目的的差别可采用不同药物及浓度；

4)恒流培养室(4)置于密封的恒流培养箱内，由循环管经蠕动泵P8保持50～100ml/min模拟口腔环境内唾液的流动环境。

8、按照权利要求7所述口腔生物膜的形成方法，其特征在于人工唾液培养基为BM系列生物膜培养基。

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