CN1479790A - 微生物快速分型方法及所用试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了快速分型酵母、寄生虫和细菌的方法。该方法包括以下步骤：a)利用只包含缓冲液、去污剂、螯合剂和氢键断裂试剂的试剂盒的方法，在5－60分钟内制备完整的固定化DNA。b)利用CHEF(Contour Clamped HomogeneousElectric Field)和TAFE(Transversal Alternating FieldElectrophomsis)***的脉冲场电泳微型设备，在2.5－7小时内分离完整的DNA分子或其限制性片段。c)通过预先模拟该凝胶中将得到的电泳图的方法，选***iCHEF应用的最适条件。d)不需利用大小标志，而是利用分析迁移距离的方法，提供重定向时间、迁移速度和分子大小。

Description

微生物快速分型方法及所用试剂盒
说明性回溯
国际专利分类号：C12N 1/00
技术领域
本发明涉及分子生物学。特别提供了方法。该方法包括微生物快速分型的方法和程序的应用、以及试剂盒。待分型的微生物可以是酵母、寄生虫以及革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。在CHEF或TAFE***的微型装置中，利用脉冲场微型凝胶电泳进行微生物分型。
发明背景
过去数年中，传染性疾病增多，并出现多药耐药性(multi-drugresistance)微生物(Acar J和Courvalein P pp  50-53；Aubry-Damon H和Andremot A，pp 54-55；Trieu-Cout P和Poyart C，pp62-66，in’La Recherche’，vol 314，1998)。
传染性疾病的爆发，需要对致病微生物进行分型。分型是指将特定属的不同种微生物分类为不同的亚群或亚类的方法(Busch U和Nitschko H，J Chromatogr B，  1999，722：263-278)。从流行病学观点来看，分型对于识别传染病爆发、确定健康中心的医院源性病原体的传播途径以及检测传染源是重要的。分型也用于鉴定新毒株和监测接种程序。如果满足以下标准，则认为分型方法是适当的(MaslowJN等人，Clin Infect Dis，1993，17：153-164)：
1.为分析的每个分离物给出明确结果。
2.给出可重复性结果。
3.区分种内无关株。
有几种微生物分型方法，其中一些基于表型特征分析(表型方法)，其它基于基因型特征分析(基因型方法)。表型方法检测微生物的表达特征，基因型方法则证明微生物DNA之间的差别。因此，表型方法的缺点在于，提供遗传背景变化的间接测定。使用基因型方法则没有该缺点。
脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE)是最广泛使用的基因型分型方法之一。该方法据认为是微生物分子分型的金标准。通过在凝胶中分离受到两个不同方向的电脉冲作用的DNA分子进行PFGE分型。电泳之后，微生物分离物DNA分子的条带图高度可重现、有差别，明确地表征其DNA(Oliver DM和Bean P，JClin Microbiol，1999，37(6)：1661-1669)。另外，能够在单个凝胶中比较多个分离物的全基因组。因此，PFGE已被认为是最佳的分型方法(Maslow JN，Mulligan ME和Arbeit RD，Clin Infect Dis，1993(17)：153-164；Busch U和Nitschko H，J Chromatogr B，1999(722)：263.278)。PFGE的结果取决于DNA分离应用的实验条件以及所研究的微生物的属和种。因此，a)如果该微生物具有几条低于10Mb(1Mb＝1 000 000碱基对)的线性染色体，则获得其染色体的条带图。该条带谱称作‘电泳染色体组型’。例如，该微生物可以是酵母、单细胞寄生虫等。
b)如果该微生物具有一个单一的大的环状染色体，则获得该环状DNA大限制性片段的条带图。这些图称作脉冲型，是在特定的实验条件下获得的。例如，该微生物可以是细菌，如大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等。
比较不同菌株的电泳染色体组型，可以对其进行特性鉴定和鉴别。细菌DNA的限制性片段也是如此。因此，分子染色体组型和脉冲型均可用于真菌、细菌和寄生虫的比较研究。医学微生物学常规使用PFGE，使得需要改善其样品制备方法。还需要预先设计充分分离分子的运行条件，并分析产生的电泳图。
利用PFGE的微生物分型方法一般包含以下步骤和程序：
1)制备样品：在营养液中培养微生物，在凝胶中包埋细胞，获得固定化、去蛋白的完整DNA分子。
2)设计电泳运行：选择PFGE装置上设定的实验条件，以获得分子间最好的分离。
3)样品上样凝胶中，进行脉冲场凝胶电泳，以分离DNA分子。
4)分析电泳后得到的条带图，比较不同微生物分离物的结果。
分析当前用于通过PFGE进行微生物分型的装置和程序。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳(PFGE)开始于1984年，当时Schwartz和Cantor(Cell，37，67-75，1984；US专利NO.4,473,452)观察到，应用按相对琼脂糖凝胶的某个角度周期性转换方向的电脉冲，可以将大的完整DNA分子解析为条带图。
作者还确定，分子的分离基本上取决于电脉冲的持续时间。后来，场力线形成的角度、电场强度、实验温度、缓冲液的离子强度、琼脂糖凝胶的浓度以及包埋样品的琼脂糖胶块(plug)的厚度，被确定为影响DNA分子分离的最重要因素(Birren B.和Lai E.PulsedField Gel Electrophoresis：a practical guide.AcademicPress.New York，1993，p 107，111，129，131，135；López-Cánovas L.等人，J.of Chromatogr.A，1998，806，123-139；López-Cánovas L.等人，J.of Chromatogr.A，1998，806，187-197)。
已经开发了不同***进行PFGE。它们具有电极布置不同的特征性槽。这些槽包括配置电极的OFAGE(Orthogonal Field AlternatingGel Electrophoresis，Carle C.F.和Olson M.V.Nucleic AcidsRes.1984，12，5647-5664)，CHEF(‘Contour Clamped HomogeneousElectric Field’，Chu G. Science 234，1986，1582-1585)，TAFE(‘Transversal Alternating Field Electrophoresis’，US专利NO.4,740,283)，FIGE(‘Field Inversion Gel Electrophoresis’，Carle G.F.和Olson M.V的US专利NO.4,737,251)，以及微型槽MiniTAFE和MiniCHEF(Riverón，A.M.等人，Anal.Lett，1995，28，1973-1991；欧洲专利申请EP 0 745 844，Bula.1996/49；US专利申请08/688,607，1995；古巴专利RPI Nro.02/95，1995)。
利用PFGE进行微生物分型的常用***。
CHEF和TAFE是以DNA分析为基础通过PFGE进行微生物分型的最常用***。它们在凝胶的每个泳道产生整齐的条带图谱，因此可以对单次运行或不同电泳运行的结果进行比较。
CHEF***的电极围绕凝胶放置成六角形阵列，钳在其中的电压保证整个凝胶的电场均匀。在整个槽产生均匀电场，可获得整齐条带，以及在凝胶泳道上的可重现迁移。CHEF槽中极性相反的电极间相隔33.5cm。其使用长宽可达21×14cm的水下凝胶。水平放置凝胶(CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System.Instruction Manual and Application Guide.Catalog Numbers170-3670 to 170-3673，BloRad，pp 11，1995)。如前述，CHEF***已经广泛用于微生物分型。例如，细菌(Beverly，S，AnalBiochem，1989，177：110-114；Dingwall A和Shapiro L，ProcNatl Acad Sci USA，1989，86：119-123；Ferdows MS和BarbourAG，Proc Natl Acad Sci USA，1989，86：5960-5973；Kohara Y，Akiyma K和Isono K，Cell，1987，50：495-508；Ohki M和SmithCl，Nucleic Acids Res，1989，17：3479-3490；Schoenline PV，Gallman LM和Ely B，Gene，1989，70：321-329；Ventra L和Weiss AS，Gene，1989，78：29-36)，假单胞菌属(Pseudomonas)(Bautsch W，Grothues D和Tummler B，FEMSMicrobiol Lett，1988，52：255-258；Romling U和Tummler B，JClin Microbiol，2000，38(1)：464-465)，啤酒糖酵母(S.cerevisiae)(Albig W和Entian KD，Gene，1988，73：141-152；Zerva L等人，J Clin Microbiol，1996，34(12)：3031-3034)，溶组织内阿米巴(E.histolytica)(Petter R等人，Infect Immun，1993，61(8)：3574-3577)，肺炎链球菌(S.pneumoniae)(McEllistrem MC等人，J Clin Microbiol，2000，38(1)：351-353)，金黄色葡萄球菌(S.aureus)(Wicheihaus TA等人，J Clin Microbiol，1999，37(3)：690-693)，结核杆菌(M.tuberculosis)(Singh SP等人，J Clin Microbial，1999，37(6)：1927-1931)，溶血性巴斯德杆菌(P.haemolytica)(Kodjo A等人，J Clin Microbial，1999，37(2)：380-385)，等等。
由于CHEF槽的尺寸较大，覆盖电极平台需要大量缓冲液。因此，即使应用低电场强度时，槽中电流强度也可以达到很高的值。所以，CHEF实验需要高额定功率输出的电源。此外，槽中产生大量热量，不能通过增大电场减少运行时间。为将啤酒糖酵母染色体(分子小于1.6Mb。1Mb＝106碱基对)分离成11条带的特征图，以分型酵母的不同菌株，CHEF槽需要电泳至少20小时(Zerva L等人，JClin Microbial，1996，34(12)：3031-3034)。CHEF槽分离细菌DNA分子的大限制性片段需很长时间，需要20小时或更多。(vanBelkum A等人，J Clin Microbiol 1998，36(6)：1653-1659；Marchadin H等人，Antimicrob Agents Chemother，2000，44(1)：213-216；Romling U和Tummler B，J Clin Microbiol，2000，38(1)：464-465)。同样地，研究寄生虫，例如溶组织内阿米巴，也需要较长的运行时间。分离其染色体至少需要24小时(PatterR等人，Infect Immun，1993，61(8)：3574-3577)。
当前使用的CHEF装置的优点在于，单次运行有可能分析40个样品。该高通量样品形式便于对比分析多个分离物样品的电泳图。
KJ Gardiner，W Laas和D Patterson在发表于Somatic CellMol Genet，1986(12)：185的文章中提出TAFE***。他们起初将该***称作″垂直脉冲场电泳″(Vertical Pulsed FieldElectrophoresis，VPFE)，并开发了装置，受到1988年4月26日US专利4,740,283的保护。
在TAFE***中，两个电极对平行放置于水下凝胶(10×7.6×0.64cm，长×宽×厚)的两面，即在槽中垂直放置。所述电极配置产生的电场力线横穿凝胶，迫使分子在每次脉冲过程中迁移通过凝胶的厚度。在TAFE中，相似大小的分子移动的距离相似，并在凝胶中迁移到相同高度留下整齐的轨迹，而与凝胶中小孔(样品上样其中)的位置无关。因此，该***便于对比分析多个分离物样品的电泳图谱，可用于微生物分型。
根据这些原理，Beckman Instruments制造了称为″Geneline I，或Transverse Alternating Field Electrophoresis  System(横向交变场电泳***)″的装置(Beckman，The Geneline SystemInstruction Manual，ed.Spinco Division of BeckmanInstruments Inc.，1988)，也称为TAFE。该***使用可以上样20个样品的凝胶(11×7.2×0.6cm，长×宽×厚)。然而，TAFE也需要大量的缓冲液(3.5L)和生物样品。该装置分离溶组织内阿米巴染色体需要至少20小时(Báez-Camargo M等人，Mol Gen Genet 1996，253：289-296)。因此，在微生物分型上，TAFE与CHEF的缺点相同。
结论是，最常使用的表征微生物和寄生虫基因组的商品化装置，需要长的运行时间以及大量的试剂和生物样品，将DNA大分子分离成条带图。
FIGE***已经用于细菌的快速分型(Goering RV和Winters MA，J Clin Microbiol，30(3)：577-580，1992；Grothues D等人，JClin Microbiol，26(10)：1973-1977 1988)。然而，已有记述在FIGE实验中DNA的电泳迁移率倒置(inversion)。DNA迁移率倒置妨碍正确判断大小，并难以解释和比较多个样品给出的图。与该现象有关的难题是，不可能预测何时发生DNA迁移率倒置(Birren B和LaiE.Pulsed Field Gel Electrophoresis：a practical guide，pp10，Academic Press，Inc.San Diego，California.1993)。迁移率倒置的主要缺点在于，不可能明确鉴别给定条带中的分子。为此，应该转移该条带并与特异性探针杂交。杂交显著增加了分析费用及所需时间，因此该分型方法更费钱费时。
企图通过提高电极上的电压，降低当前CHEF装置(例如GeneNavigator(Amersham-Pharmacia-LKB，Pharmacia Molecularand Cell Biology Catalogue，Pulsed Field GelElectrophoresis，Nucleic Acids Electrophoresis.1998，pp77-79)、CHEF DRII和CHEF Mapper(CHEF Mapper XA Pulsed FieldElectrophoresis System.Instruction Manual and ApplicationGuide.Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673.Bio-Rad，pp 11，1995))的电泳时间，这几乎是不可能的。这是由于电源输出和冷却***的限制。因此，制造商推荐该装置应用的最大电场为9V/cm(CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System.Instruction Manual and Application Guide.Catalog Numbers170.3670 to 170-3673.Bio-Rad，pp 2，1995)。所以，CHEF***无法通过增加电场强度而降低电泳时间。当前的TAFE装置有类似问题。
PFGE微型装置
1995年报告了微型PFGE(MiniPFGE)装置，微型CHEF(miniCHEF)和微型TAFE(miniTAFE)形式(Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995，vol.28，pp 1973-1991；欧洲专利申请EP 0745 844，Bull.1996/49；US专利申请08/688,607，1995；古巴专利RPI 02/95，1995)。微型装置克服了PFGE装置提及的大部分缺点。在微型胶(4×4×0.5cm；长×宽×厚)中上样7个样品，4-6小时内进行脉冲场电泳实验。MiniCHEF应用的电场强度可以达到16V/cm，2.7小时内提供良好分离的电泳条带图。相反极性的电极之间距离短，可制作小槽并使用少量缓冲液覆盖电极。通过在miniCHEF和CHEF槽上施加指定的电压(某一电场强度值‘E’)，微型槽产生的热量总是少于商品化CHEF产生的热量(Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995 vol.28，pp.1973-1991)。
微型TAFE装置容许22V/cm完成条带分离(Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995 vol.28，pp.1973-1991)。MiniTAFE可在5小时内获得啤酒糖酵母的电泳染色体组型。相反电极之间距离短(7.8cm)的MiniTAFE槽较小，使用少量缓冲液。然而，如果上样微型胶的样品超过0.1cm厚，则需要较长的运行时间，以获得良好分离的电泳图。根据以前的报告，样品厚度影响电泳运行时间(López-Cánovas等人，J.Chromatogr.A，1998，806，pp.187-197)。样品较厚时，为获得相同条带图，需要较长的凝胶。然而，报道的miniCHEF微型胶只容许7个样品，而miniTAFE支持13个样品。它们是临床实验室对微生物分离物进行分型的低通量样品形式。
尽管miniPFGE装置优于当前使用的***，但miniCHEF和MiniTAFE两者均未用于微生物分型。这可能屈从于企图使用与常规凝胶同样厚的样品。此外，没有选择微型装置运行参数的简单方法。
制备固定化DNA
为了在当前装置或微型装置中利用PFGE进行微生物分型，制备完整DNA分子的方法必不可少。先前报道的在溶液中分离和纯化DNA的方法，引起分子剪切(Schwartz DC和Cantor CR，Cell，1984，37，pp.66-75)。Schwartz和Cantor提出制备PFGE样品的方法学，只去除了小于1 Mb(106碱基对)的分子。该方法学包括收集培养细胞、洗涤细胞并包埋于琼脂糖胶块中。在后续步骤中，‘原位’形成原生质球(如果存在细胞壁)，并进一步在该胶块中溶解。最后利用蛋白酶K使固定化的DNA分子脱去蛋白质。该方法有效用于制备不同属、种和来源的微生物样品。然而，如果该微生物具有细胞壁，则需要形成原生质球，形成原生质球所需的酶以及蛋白酶都很昂贵。该报告的方法要求样品两次温育过夜，样品制备需要32小时(US专利NO.4,473,452，1984年9月25日)。
新近，Gardner(Gardner DCJ等人，Yeast，1993，9，1053-1055)从不形成原生质球的细胞获得了啤酒糖酵母染色体的条带图。同时，Higginson等人(Higginson D.等人，Anal.Lett.，1994，27：7，1255-1264)表明，啤酒糖酵母DNA可以利用8M脲而非蛋白酶K脱去蛋白质。然而，由于使用蛋白酶脱去DNA的蛋白质，Gardner描述的方法仍很昂贵，Higginson描述的方法便宜，但温育耗费72小时，时间很长。后来，制备啤酒糖酵母样品而没有使用酶：胶块依次与LETK(10mM Tris、500mM EDTA、600mM KCI、pH7.5)温育4小时，NDS(10mM Tris、500mM EDTA、1％十二烷基肌氨酸钠(sarcosyl)、pH 9.5)2小时，以及NDS外加4M脲(NDSU)2小时。该方法需要10小时进行样品制备(López-Cánovas L，等人，Anal.Lett，1996，29：12，2079-2084)。还描述了快速制备固定化DNA的方法，但是使用酶(例如Guidet F和Langridge P，Biotech，1992，12：2，222-223)。
按常规，用于PFGE实验的固定化的DNA需要形成原生质球，并利用蛋白酶去蛋白。这些要求与所研究的细胞类型(细菌、酵母等)无关(Maule J，Mol.Biotech.1998，9：107-126；Olive DM和BeanP，J.Clin.Microbiol，1996，37：6，1661-1669)。例如，据报道通过溶葡萄球菌素固定细胞、去污剂温育胶块，可在2小时内制备固定化的金黄色葡萄球菌DNA，而粪链球菌(StreptococcusFecalis)需要在固定化之前与溶菌酶和变溶菌素温育(Goering RV.和Winter MA.，J.Cl in.Microbiol，1992，30：3，577-580)。在所述工作中，作者没有利用蛋白酶K温育样品。然而Matushek等人报道(Matushek MG等人，J.Clin.Microblol，1996，34：10，2598-2600)，如果样品不与蛋白酶k温育则不能获得条带图。作为代替，他们提出了利用蛋白酶K快速制备固定化DNA样品的方法。最近，McEllistrem等人(McEllistrem MC等人，J.Clin.Microbiol，2000，38；1，351-353)报告了制备肺炎链球菌固定化DNA的完全无酶方法。但该方法耗费6小时，作者将该方法的成功归因于链球菌自溶素的活化。目前，只有啤酒糖酵母和肺炎链球菌完整DNA分子的制备方法中去除了原生质球形成酶和蛋白酶，但完成制备分别需要10和6小时，时间很长。微生物样品制备中去除原生质体形成酶和蛋白酶K的可行性并不存在。因此，当前方法费钱费时。
大部分上述方法依据具有细胞壁的微生物必须在酶处理之前固定化的假定。Goering和Winter发表的文章有一例外(Goering RV和Winter MA，J.Cl in.Microbiol，1992，30：3，577-580)。作者在固定化之前将细胞悬浮于包含溶菌酶和变溶菌素(形成原生质球的两种酶)的溶液中。但是，尚无一般的无酶方法，在包埋入琼脂糖凝胶之前处理具有细胞壁的微生物。这种方法应该比当前的样品制备方法更便宜、更简单。
报道了在溶液中分离核酸的方法，该方法从在引起微生物细胞壁通透性的试剂参与下加热的细胞开始(欧洲专利0,657,530，1994，bulletin 95/24；US专利158,940，1993)。该方法释放微生物未降解核酸的大片段，而无需物理上破坏完整细胞壁。该方法不需要水解酶。但是由于在溶液中分离DNA，而不能获得完整的DNA分子；而且，作者没有提出获得所述微生物分子染色体组型或脉冲型的方法。作者报道，所获DNA适于杂交，但未说明利用核酸内切酶限制性酶切DNA的可能性。总之，该方法不能保证获得完整的DNA分子，尚不了解其利用限制性酶消化的可能性。
因此，尚无一般方法，在短时间内通过无酶方法制备酵母、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及寄生虫的固定化完整DNA。
制备固定化DNA样品需要形成该样品的模具(mold)。这些模具可以是可重复使用的或一次性。可重复使用的模具应该能允许灭菌。这对于处理致病微生物样品是重要的。使用一次性模具要求连续供应，对于低预算的实验室，这是限制因素。
以下为已知模具：
a)形成独立的类似胶块的模具(US专利4,473,452，1984年9月25日)；
b)形成长条状(其可切成独立胶块)的模具；
c)形成长方形‘面条’或长的琼脂糖棒(其可切成独立胶块)的模具(Birren B和Lai E.Pulsed Field Gel Electrophoresis：a practical guide，Academic Press，Inc.San Diego，California，1993，pp 29-30)。
一般而言，所述模具产生的样品尺寸大于凝胶的狭槽。为此，需要用刀片或其它装置切割条带、面条等，以获得与狭槽尺寸相似的胶块。(CHEF Mapper XA Pulsed Field Electrophoresis System.Instruction Manual and Application Guide pp40，Section 7.Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673.Bio-Rad.1995)。然而，切割条带或面条造成胶块的大小和尺寸不均匀，其影响电泳图的质量。凝胶中DNA分子的分离取决于样品厚度。因此难于比较凝胶不同泳道获得的图。难以比较条带图是微生物分型的缺点。
1995年10月10日的US专利5,457,050公开了在琼脂糖凝胶中包埋细胞并处理胶块的模具。根据制作材料，该模具可以一次性或可重复使用的。要求保护模具装置为，在该模具内部形成并处理样品。但有缺点：如果温育过程中胶块留在模具内，获得适于PFGE分析的样品所需时间大大延长。由于胶块和温育溶液之间的接触面积至少减小一半，溶解及去蛋白溶液的效应分子不能充分到达细胞内的靶分子。
选择PFGE实验条件
实验条件的选择较为复杂。已经报道了选择PFGE运行条件的方法。
例如，Bio-Rad的CHEF Mapper可选自动算法(auto-algorithm)及另一交互式算法(CHEF Mapper XA Pulsed FieldElectrophoresis System.Instruction Manual and ApplicationGuide.pp 31-40 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673.Bio-Rad.1995)。两种选择可以计算脉冲时间、脉冲斜坡(ramp)持续时间、重定向(reorientation)角度、电场以及最佳运行时间，以分离指定样品的DNA分子。与假设固定实验条件的自动算法不同，交互式算法允许改变输入的缓冲液类型、温度和浓度、以及琼脂糖类型和浓度。两种算法均以5年经验中收集的实验和理论数据为基础。(Bio-Rad Catalogue.Life Science Research Products.Bio-RadLaboratories，ppl85.1998/99)。然而，制造商推荐DNA大小小于或大于预期的样品分子时使用自动算法。此外，如果输入自动算法以及交互性程序的大小范围太宽，可产生错误结果，例如凝胶中部的条带倒置。
提出了另一经验表达式，可给出分离大小介于给定值和称作RSL(Resolution Size Limit，分离大小限制)的较高值之间的一组分子的电脉冲持续时间(Smith DR.Methods I，1990，195-203)。然而该表达式只在特定实验条件下有效，不能预测任意两个分子之间的分离。提出了另一关系式。它提供了分离给定的一组分子所需电场和脉冲时间的近似条件(Gunderson K和Chu G，Mol.Cell.Biol.，1991，11：3348-3354)。然而该关系式只可以粗略估计所述两个变量，而不提供任何实验条件下的分子迁移。
尽管对PFGE过程中的DNA分子重定向进行了各种理论研究(Noolandi J，Adv.Electrophoresis，1992，5：1-57；Maule J，Mol.Biotech.1998，9：107-126)，所述研究尚未给出在实验室中实用有效的结果。这些研究没有产生使得PFGE使用者可以选择并设置分离待分析的分子所需要的实验条件的方法。
López-Cánovas等人提出的方程式(López-Cánovas L等人，J.Chromatogr.A，1998，806：123-139)，描述了DNA在PFGE中的迁移，没有用于预测改变脉冲时间斜坡、电场、温度和运行时间所应获得的条带图。在微生物分型中通常改变这些变量。
PFGE条带图分析
从PFGE凝胶获取图象数据的计算机化***可用于条带图分析(Gerner-Smidt P等人，J.Clin.Microbiol，1998，37(3)：876-877；Tenover F等人，J.Clin.Microbiol，1995，33(9)：2233-2239；van Belkum A等人，J.Clin.Microbiol，1998，36(6)：1653-1659)。然而比较限制性图仍是主观过程，不能完全简化为严格算法(Tenover F等人，J.Clin.Microbiol，1995，33(9)：2233-2239)。尽管进行了基于计算机的分析，图的最终解释必须服从于先前可见的观察。
自动和非自动条带图分析得到条带数目以及条带中分子大小的结果。这一般通过比较未知DNA迁移与分子量标志的迁移而实现。但是PFGE相对较新，并不一定总能得到DNA大小范围较宽的大小标志。因此，以PFGE条带图解释为基础进行细菌分型的标准是，确定所比较微生物的DNA经消化而获得的不同限制性片段的数目。
根据在1.5％琼脂糖、Lachema以及0.5X TBE(1X TBE：89mMTris、89mM硼酸、2mM EDTA)的实验中收集的电泳数据，提出方程式，其描述DNA分子在单脉冲斜坡、不同电场强度和不同温度下的迁移(López-Cánovas L等人，J.Chromatogr.A，1998，806：123-139)。但是，没有扩展并应用该方程式以分析施加脉冲时间斜坡后的条带图的方法。在微生物的比较研究中经常施加脉冲时间斜坡。
利用PFGE进行微生物分型的现有方法。
微生物分型的全过程需要长时间和许多资源。电泳需要约20小时，制造商推荐或文献报道的样品制备方法需要大量酶(例如80mg/mL蛋白酶k)和长的温育时间(CHEF Mapper XA Pulsed FieldElectrophoresis System. Instruction Manual and ApplicationGuide.pp 40-43 Catalog Numbers 170-3670 to 170-3673.Bio-Rad.1995)。使用PFGE进行微生物分型的限制因素是完成分离物分析所需的时间，为2-3天，从而降低了实验室分析多个样品的能力(Olive DM和Bean P，J.Clin.Microbiol，1999，37：6，1661-1669)。
发明详述
本发明提供了在一个工作日(7-13小时)进行微生物分离物分型的方法和试剂盒。通过在微型装置中利用脉冲场凝胶电泳分离DNA分子，获得特有的条带图，进行分型。特别地：
i)此处提供了在至多60分钟内制备凝胶小块中包埋的完整DNA样品的方法和相关试剂盒。该方法基于利用不包含水解酶的溶液处理细胞。所述处理可以在凝胶包埋该细胞之前或之后进行。该细胞可能是酵母、寄生虫、革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。利用由可灭菌的柔软材料制成的模具包埋细胞。其产生大小均匀的微胶块。根据所用模具的尺寸，微胶块的厚度为0.03-0.1cm。
ii)提供了预测线性DNA迁移的方法。该方法以理论公式为基础，可计算在电场、温度、脉冲持续时间斜坡以及电泳持续时间的任何条件下，线性DNA分子在CHEF***中的迁移。这些方法可以选择作用于凝胶的最佳电泳条件，并分析电泳后获得的条带图。
iii)此处提供了分离并分析微生物DNA分子的方法。在脉冲场凝胶电泳微型装置中进行分离。miniCHEF微型装置在2.5-5小时内产生条带图，而MiniTAFE为5-7小时。该方法可以研究多达27个固定化的微生物DNA样品。所述样品为：a)利用无酶方法制备；b)在微型装置的微型胶中，于通过预测方法辅助下选择的最佳电泳条件下分离，c)分析估计DNA分子的大小。利用线性DNA迁移分析方法的辅助，对微型胶小孔中上样的、经过微型装置中两种电场作用的所有DNA分子进行估计。在分析以前，通过任何染色方法检测凝胶中的DNA分子。
本发明提供的样品制备方法花费至多60分钟，简单、便宜，溶液中既不需要水解酶，也不需要蛋白酶，以温育微生物细胞并产生固定化的完整DNA。可以利用限制性酶消化完整的DNA分子，如果对其进行脉冲场凝胶电泳，完整的DNA分子或其限制性片段在微型胶中迁移，形成对应于微生物的分子染色体组型或脉冲型的条带图。
该方法基于化学改变细菌壁，使微生物溶解，或者小的效应分子向细胞中的靶分子扩散。在制备过程中，还通过透析去除不想要的细胞内成分。结果在包埋细胞的微胶块中获得完整的DNA分子。
该方法包含以下一般步骤：
1)最初从住院病人的液体、或者生物技术收集物、或者分子生物学、遗传学或其它普通实验室所做的实验中分离微生物细胞。
2)细胞在对每种微生物成分合适的液体或固体培养基中生长。
3)通过离心收集细胞，并进一步洗涤。
4)细胞a)包埋入凝胶中并与无酶溶液温育，或者b)与所述溶液温育再包埋入凝胶中。在‘a’的情况下，包含固定化细胞的微胶块首先在无酶溶液中50℃温育5-30分钟。在‘b’的情况下，细胞与该无酶溶液50℃温育5-30分钟，然后包埋入琼脂糖微胶块中。
5)如果要进行电泳，则包含细胞的微胶块对电泳缓冲液透析；或者，如果要保存微胶块，则对保存缓冲液透析；或者，如果要消化DNA分子，则对限制性内切酶缓冲液透析。
啤酒糖酵母、多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和金黄色葡萄球菌为能够在固定化之前在无酶溶液中温育的生物。铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、大肠杆菌和溶组织内阿米巴应该首先固定化，再于无酶溶液中温育。最有效的细胞洗涤液列于表I。
                表I.制备固定化DNA的最有效细胞洗涤液。
收集的微生物 洗涤液成分
酵母 0.05M EDTA，pH7.5
溶组织内阿米巴 PBS，pH7.4
铜绿假单胞菌 0.15M NaCl
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 0.15M NaCl，0.01M EDTA，pH8.0
温育细胞或包含细胞的微胶块的无酶溶液，含有阴离子去污剂、金属螯合剂、能够竞争氢键形成的试剂以及Tris缓冲液。最有效的溶液包含：1％肌氨酰(sarkosyl)、0.1M EDTA、0.01M Tris碱、4M脲、pH9.5(NDSU)。为温育革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的细胞，加入NP-40(nonidet P-40)(NDSUPlus)。
某些微生物，例如大肠杆菌应该首先在无酶溶解液中37℃温育10分钟。其中包含1％肌氨酰、1％NP-40、0.1M EDTA、0.01MTris碱、pH8.0。进一步其在NDSUPlus溶液中温育半小时。
包含固定化DNA的微胶块的保存缓冲液为TE-100(0.01M Tris碱、0.1M EDTA、pH8.0)。
在琼脂糖微胶块中包埋细胞的方法，是使用可灭菌的柔软材料制成的模具。该模具是多达0.5cm宽的聚硅氧烷、橡胶或其它柔软材料(参见实施例，实施例1)制成的薄片。薄片上刻有若干方形凹槽。凹槽可能达到0.3cm宽、0.03-0.1cm深。为灌注琼脂糖-细胞悬液，将模具放在42C加热表面上，在该温度下预热，然后将悬浮液灌注模具，借助刮刀使其均匀分布于凹槽中。然后用盖子(可由玻璃、丙烯酸、塑料或其它任何材料制成)盖住模具，4-15℃温育，直至微胶块***。抓住模具周边，在包含处理微胶块的无酶溶液的容器中弯曲模具，从柔性模具中取出大小均匀的微胶块。每个0.3×0.07cm大小的微胶块包埋0.12-3×108细菌细胞、8×107酵母细胞或6×104溶组织内阿米巴营养体，制备悬浮液。所述微生物都可以使用这种模具制备。总之，这种模具可用于制备包含其它任何种类细胞的微胶块。
在本发明中，选择应用于微型装置的最佳电泳条件的方法，是基于计算线性DNA分子的迁移。利用描述线性DNA分子在miniCHEF微型胶中的迁移、重定向时间以及迁移速度的一组理论公式，进行计算。该公式中输入电场和温度值，其应该分别为1-20V/cm和4-30℃。为了应用该公式，假定在1.5％琼脂糖中进行电泳，电泳缓冲液应为44.5mM Tris、44.5mM硼酸、1mM EDTA、pH8.3(TBE0.5X)。描述DNA迁移的理论公式如下： D = Σ r = 1 n { vr t p r Γ r ( t p r - tr ) N p r + vm ( t p r - tr ) [ 1 - Γ r ( t p r - tr ) ] N p r } - - - Eq . 1 vr＝0.0207[QEU1.45/(8πηL1.35)]                                             Eq.2vm＝0.665[QE1.76/(8πηL1.08)]                                               Eq.3tr＝0.134(L1.14/vr)0.926                                                     Eq.4如果(tpr-tr)≤0则Гr(tpr-tr)＝1以及如果(tpr-tr)＞0则Гr(tpr-tr)＝0    Eq.5其中：tr：重定向时间(s)，vr：重定向过程中的迁移速度(cm/s)，vm：重定向之后的迁移速度(cm/s)，Q：1e-×bp(DNA净电荷，e-：电子电荷(静电库仑))，L：0.34nm×bp(DNA外形长度(cm))，E：电场强度(静电伏特/cm)，η：缓冲液的粘度(Poises)，通过在有关水的粘度和温度的多项式函数中内插实验温度(℃)，计算η。D：DNA分子在CHEF微型胶中总的迁移(cm)，d：每次脉冲的迁移(cm)，n：脉冲时间斜坡数.Npr：斜坡‘r’的脉冲数，tpr：斜坡‘r’的脉冲持续时间(s)，选择最佳电泳条件的方法，包括以下步骤：I.计算将要用于斜坡的脉冲持续时间(tpr)。为此：
1)将选择的电场和温度值输入该公式。还应给出最小和最大的线性DNA分子的大小。
2)通过使用公式4，估计最小和最大的线性DNA分子的重定向时间。
3)如果希望在单个图中包括大小介于最大和最小分子之间的DNA分子，则计算两个重定向时间的平均值(单个tpr或tp1)。
4)计算脉冲持续时间的数字序列(tpr)。其开始于比最小分子的重定向时间低1.5倍的脉冲持续时间，结束于比最大分子的重定向时间高1.5倍。脉冲持续时间线性增加，用于计算的tpr的数字序列。
5)为进行电泳，可以利用步骤(3)计算的tp，否则使用步骤(4)计算的tpr数字序列。II.计算总的运行时间。根据计算的最小线性DNA分子的迁移估计总的电泳运行时间。如下进行：
1)将电场和电泳缓冲液温度值输入公式2和3。
2)估计最小分子的重定向时间和迁移速度。将步骤I估计的电脉冲持续时间(tpr)输入公式1。固定脉冲数的初始值。
3)每个斜坡‘r’的脉冲数逐一增加，每次利用公式1和5估计最小分子的迁移。重复该迭代，直至分子到达距离微型胶底部0.1-1cm的位置III.通过使用公式1-5，针对‘n’斜坡计算欲分离分子迁移，然后在选择的电场、温度、斜坡数″r″、电脉冲的持续时间以及脉冲数(Npr)条件下，预测这些分子在miniCHEF微型胶中的条带图。该计算包括以下步骤：
1)假定在1.5％琼脂糖凝胶和0.5X TBE缓冲液中进行电泳。
2)按公式2和3定义电场和缓冲液温度值(将用于真正的实验)。
3)根据上述步骤估计的数值，定义公式1的斜坡总数(n)、每个斜坡应用的脉冲数(NPr)以及每个斜坡的脉冲持续时间(tpr)。
4)指定待分析的分子大小。
5)通过使用公式1-5，计算(欲分析的)DNA分子在指定电泳条件下将要迁移的距离。
6)以数字或图形的形式，表示计算的线性DNA分子的迁移。
7)重复步骤2-6，直至预测的图显示线性DNA分子最佳分离。IV.根据以上结果，选择使线性DNA分子最佳分离的实验条件。然后将这些数据输入电源、电泳控制装置以及冷却***。应用该方法优选计算机程序，便于模拟不同大小DNA分子在miniCHEF中的分离。该程序可计算DNA分离的最佳实验条件。该程序也将提供完成所需计算的快速方法，以实施本发明这一部分。编制了模拟条带图的程序。该程序允许使用者改变以下变量：
1-凝胶中欲分离的DNA片段或完整DNA分子的大小。
2-缓冲液温度。
3-电压。
4-每个斜坡应用的脉冲时间和电脉冲数。
5-脉冲时间斜坡数，包含1-1000个斜坡。输入所述数值，该程序提供以下结果。
1-在DNA重定向过程之中或之后的DNA分子速度(cm/s)。
2-每个DNA分子的重定向时间(秒)。
3-选定的运行时间内，每个分子在凝胶中的迁移。
4-每个分子的迁移以及电泳图示意图。如下以图形表示线性DNA分子在指定电泳条件下的迁移距离：
i)绘制与真实微型胶尺寸相同的微型胶，以及假定样品上样的小孔。
ii)在每个小孔下划线。代表不同大小DNA分子分离后形成的条带。每条线与小孔同宽。按DNA分子在真实微型胶中迁移离开小孔的距离划线。
iii)给每条线、或假定的条带指定一种颜色。颜色随该条带包含的分子大小而变化。即，使用鉴别指定大小的分子的颜色代码。
该程序建立了选择合适实验条件的方法，通过在miniCHEF中脉冲场凝胶电泳分离完整染色体大小的DNA分子或大的DNA片段。该程序如果输入不同的实验变量值，则获得不同的电泳图，从而可以鉴别在CHEF和miniCHEF中分离目的分子的实验条件。该方法不消耗试剂和生物样品。它是以描述线性DNA在miniCHEF中迁移的理论公式为基础。该公式是利用真实的miniCHEF实验获得的线性DNA的迁移数据拟合而成。因此，其正确描述了该分子电泳时的迁移。此外，其不在凝胶中间产生迁移率倒置的异常结果。
本发明申请了通过在miniCHEF和miniTAFE微型装置中电泳分离DNA而进行快速微生物分型。将利用无酶方法制备的啤酒糖酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和溶组织内阿米巴细胞样品上样微型胶中。也可以上样利用常规酶法制备的这些微生物或其它任何微生物的样品。
使用MiniCHEF和miniTAFE微型槽获得染色体组型或脉冲型。miniCHEF和MiniTAFE中极性相反电极对之间的距离分别为大约11.6cm和7.8cm。miniCHEF和miniTAFE应用的电场强度达到20V/cm和22V/cm。
实施本发明这一部分所选择的电泳装置，包括先前由Riverón等人1995年描述的miniCHEF和miniTAFE微型槽(Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995，28：1973-1991；欧洲专利申请EP 0,745,844，Bull，1996/49；US专利申请08/688,607，1995；古巴专利RPI Nro.02195，1995)，该发明内容此处全文引入供参考。略微改变miniCHEF槽的底板，以支持4-7cm宽的琼脂糖微型胶。该微型胶可上样12-27个样品。略微加宽miniTAFE槽，以支持7cm宽的微型胶。miniTAFE微型胶可上样27个样品。
微型胶的琼脂糖浓度可以为0.8-1.5％，优选值1.5％。1X TBE缓冲液为0.089M Tris碱、0.089M硼酸和0.002M EDTA(乙二胺四乙酸的钠盐)，可使用的浓度范围为0.25-1X，优选0.5X。缓冲液温度可以在4-30℃之间变化。也可使用1X TAE缓冲液(0.04MTris-乙酸和0.001M EDTA)。为了钳住miniCHEF电极的电压并改变miniCHEF和miniTAFE槽的电场方向，可以使用任何定制装置，包括Riverón AM等人，Anal.Lett，1995，28(5)：845-860；以及Riverón AM等人，Anal.Lett.，1995，28(11)：1973-1991描述的装置。
可以使用最大输出300瓦的任何电源给电极通电。
将琼脂糖微胶块装入微型胶的小孔中。由用于灌注微型胶的梳齿形成小孔。可使用不同的梳子装载较宽或较窄的微胶块。这取决于所灌注的微胶块的尺寸。
使用溴化乙锭染色微型胶各个条带中的分子。用紫外线(紫外线透射仪)照射微型胶，利用550nm滤光片的照相机拍摄图像。也可使用其它任何染色方法。
电场强度、缓冲液温度、脉冲时间斜坡、电泳时间以及每个斜坡中设置的电脉冲数来自于该模拟程序(或者选择分离分子最佳条件的方法)结果，或来自使用者采用的另一方法(包括他的实验经验)的结果。使用模拟程序时，缓冲液的浓度应该是0.5X TBE，琼脂糖(Lachema)凝胶必须是1.5％，电场必须达到20V/cm，温度必须为4-30℃，并且必须是miniCHEF槽。使用模拟程序但希望使用miniTAFE时，可以使用该模拟程序给定的相同的电场和温度条件，但是每个斜坡的脉冲数应该增加1.5倍，脉冲持续时间增加1.2倍。
在其它的电场强度和温度条件下，也可以在微型装置中获得待分离样品所含分子的典型条带图。
本发明分析电泳后所得条带图的优选方法是根据测定线性DNA分子在微型胶中的迁移距离，以及利用公式1-5计算分子大小。该方法要求，在电场为1-20V/cm、温度4-30℃、1.5％琼脂糖(Lachema)、0.5X TBE缓冲液以及任意脉冲时间斜坡数‘n’(1-1000)和电泳时间下，通过在miniCHEF装置中电泳在微型胶中获得条带图。该方法包括：：
i)在电泳及染色微型胶中的条带之后，测定线性DNA分子在微型胶中的迁移距离。
ii)将电场、缓冲液温度、斜坡数(n)、每个斜坡应用的脉冲数(NPr)以及每个斜坡的脉冲持续时间(tpr)的数值输入公式1-5。
iii)将电泳之后条带迁移的实际距离(D，cm)输入程序。
iv)由迁移距离计算每个条带的分子大小。如下进行：
1)限定假定的DNA分子的初始大小为1000对碱基。
2)使用公式2、3和4分别估计假定的DNA分子的vr、vm和tr。
3)利用公式1和5，估计假定的DNA分子在实验所用电泳条件下的理论迁移(Dt，cm)。
4)比较D和Dt。如果Dt大于D，则将假定的分子的大小增加1000bp。
5)重复步骤2)-4)，直至估计的假定的DNA分子的迁移小于或等于实际分子在微型胶中的迁移距离(D)。
6)认为条带中的DNA分子与满足4)中所提条件的假定的DNA分子大小相同。也认为估计的假定分子的tr、vr和vm值与实际分子相同。
7)利用测定的所有条带的距离，重复步骤1)-6)；即微型胶中分离的所有分子。
利用电泳图和矩阵描述电泳。其在行中包含每个片段或所分离分子的序数；列中为所分离分子的大小、重定向时间和迁移速度。
计算机程序可提供实践本发明这一部分的优选方法。该程序将提供进行计算的快速方法，以估计电泳中分离的片段或完整DNA分子的大小和动力学参数。编制程序，允许使用者改变以下变量：
1-分子的迁移距离，即在凝胶中每个条带图的位置。
2-缓冲液温度。
3-电泳槽设置的电压。
4-每个斜坡设置的脉冲时间和电脉冲数。
5-斜坡数(限于1-1000)
将所述数值输入该程序，产生以下结果：
1-在重定向过程之中或之后的DNA速度(cm/s)。
2-每个分子的重定向时间(s)。
3-分子大小(kb)。
将miniCHEF电泳条件以及得到的分子迁移距离输入程序，该程序可以计算凝胶中每个条带所含分子的大小和动力学参数。通常，鉴定条带的分子不需要分子量标志。该分析可以根据其动力学特性分类DNA片段或分子。借助于通常使用的另外方法也可描述电泳结果。
实施例
实施例1.制备样品微胶块的可灭菌模具。
图1示意图中显示了柔性材料(聚硅氧烷、橡胶或其它任何材料)制成的可灭菌模具的例子。该模具用于制备琼脂糖包埋的DNA样品。薄片(1)具有49个凹槽(2)。在模具或薄片上灌注琼脂糖-细胞悬液，并用特殊的刮刀(4)分布于模具。然后用盖子(3)盖住薄片(1)，得到包含包埋有细胞的微胶块(5)。利用熔化的聚硅氧烷制作实际模具的薄片。将其注入另一模具，直至形成薄片(1)。本实施例中，微胶块尺寸为3×3×0.7mm(长、宽×厚)。拿住薄片的边缘，在含有溶液的容器中弯曲，取出薄片(1)上的微胶块(5)。于是微胶块从薄片上脱落，掉入溶液中。
其它模具变体的凹槽宽度可以从1.5mm直至微型胶宽度，而厚度为0.5mm-1.5mm不等。薄片上刻压的凹槽数目也可变化。
实施例2.从液体培养基的细胞培养物开始，无酶制备琼脂糖包 埋的酵母完整DNA。
酵母(啤酒糖酵母、多形汉逊酵母或巴斯德毕赤酵母)在液体YPG培养基中(YPG：10g酵母抽提物、20g葡萄糖和10g蛋白胨，溶于1L蒸馏水)生长，30℃振摇至晚对数期。离心收集细胞，用0.05M EDTA、pH7.5(洗涤液，表I)洗涤。利用以下两种不同方法获得琼脂糖包埋的完整DNA：
方法1：细胞于包埋入琼脂糖微胶块之前温育。
方法2：细胞包埋入琼脂糖微胶块中，再温育微胶块。
两种方法均在先溶于0.125M EDTA的1.5％低熔点琼脂糖中制备1.3×1010细胞/ml的细胞悬液，由此将细胞包埋于琼脂糖。将细胞悬液灌注图1所示的薄片模具(1)，然后用盖子(3)盖住模具，使琼脂糖***，直至形成样品微胶块(5)。
在方法1中，从100ml液体培养物获得细胞团，重悬于5mlNDSU中，50℃温育5分钟。悬浮液进一步在TE-100中稀释5倍。离心收集细胞，如上所述包埋于琼脂糖微胶块。
在方法2中，收集细胞、洗涤再包埋于琼脂糖微胶块(见表I)。含细胞的琼脂糖微胶块在NDSU中45℃温育半小时。
将微胶块在TE-100中(0.01M Tris碱、0.1M EDTA、pH8.0)洗涤两次，5分钟，再4℃保存于新鲜的TE-100中。利用两种方法之任何一种处理微胶块，并于电泳以前，在运行温度下将微胶块于TBE中温育10分钟。
分离为条带图的啤酒糖酵母染色体(12)及线粒体(13)DNA的微型胶(10)照片如图2所示。将细胞包埋于微胶块中，并与NDSU温育，制备样品(方法2)。miniCHEF使用的微型胶宽7cm，可上样最多27个样品(11)。电泳运行条件为，10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖、0.5XTE、脉冲时间50秒以及电泳4小时。
分离为条带图的多形汉逊酵母染色体(17)及线粒体(18)DNA的miniCHEF微型胶泳道(16)照片也如图2所示。根据方法2制备多形汉逊酵母的染色体。在miniCHEF中，按10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖、0.5X TBE、脉冲时间120秒以及电泳4小时进行分离。
如图2所示，还在miniTAFE(20)微型胶中分离啤酒糖酵母染色体。也显示了染色体(21)及线粒体(22)DNA的条带图。利用方法1制备样品，即在琼脂糖包埋之前温育细胞。在由梳子形成的13个狭槽(23)中上样该样品。该微型胶为7cm宽。在miniTAFE中应用10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖、0.5X TBE、脉冲时间60秒以及电泳6小时。
实施例3.从液体和固体培养基中生长的铜绿假单胞菌无酶制备 琼脂糖包埋的完整DNA。
从血琼脂平板分离铜绿假单胞菌的两个克隆。其一接种于5mlLB培养基(每升蒸馏水含10g酵母提取物、5g氯化钠和10g细菌用胰蛋白胨)，另一划线于LB平板(LB添加1.2％细菌用琼脂)。
两种培养物均37℃温育过夜。液体培养物振摇温育，平板则保持静止。液体中生长的细胞通过离心收集，而平板则用合适的洗涤液(表I所示)洗涤，再离心收集。
利用表I所示溶液洗涤在液体或固体培养基中生长的细胞，离心收集，按浓度2×109细胞/mL重悬于溶于0.15M NaCl的1.5％低熔点琼脂糖中。将琼脂糖-细胞混合物灌注图1所示的薄片模具(1)，然后用盖子(3)盖住薄片，使琼脂糖静置，直至形成胶块(5)。将微胶块与NDSUPlus 50℃温育半小时。然后用TE-100于50℃洗涤微胶块两次，10分钟，并4℃保存于新鲜的TE-100中。限制性酶消化之前，洗涤微胶块，并在Xba I限制性酶缓冲液中温育10分钟。每个微胶块用20U Xba I 37℃消化2小时。在10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖和0.5X TBE下于miniCHEF中分离限制性片段，分别应用20、15、10、5和3秒的脉冲斜坡(ramp)以及5、15、320、1020和100次脉冲。
在miniCHEF微型胶(25)中分离的条带图如图3所示。由液体LB培养基的培养物制备铜绿假单胞菌微胶块(27)，由LB平板的培养物制备微胶块(28)。分离的DNA片段的大小也如图所示。
实施例4.从固体培养基生长的金黄色葡萄球菌无酶制备琼脂糖 包埋的完整DNA。 
从血琼脂培养基分离金黄色葡萄球菌的一个克隆，划线于Mueller-Hinton平板(Oxoid)。该平板于37℃温育过夜。用洗涤液(0.15M NaCl、0.01M EDTA、pH8.0，表I)洗涤平板表面，离心收集细胞。
利用以下两种不同方法制备琼脂糖包埋的完整DNA：
方法1：在包埋入琼脂糖微胶块之前温育细胞。
方法2：细胞包埋入琼脂糖微胶块中，再温育该微胶块。
两种方法均在溶于洗涤液(表I)的1.5％低熔点琼脂糖中制备4×1010细胞/ml的细胞悬液，将细胞包埋于琼脂糖。将细胞悬液灌注图1所示的薄片模具(1)，然后用盖子(3)盖住薄片，使琼脂糖***，直至形成微胶块(5)。
在方法1中，细胞团重悬于3ml NDSUPlus中，50℃温育30分钟。然后悬浮液在TE-100中稀释5倍。离心收集细胞，包埋于琼脂糖微胶块中。
在方法2中，收集细胞、洗涤再包埋于琼脂糖微胶块。琼脂糖微胶块与NDSUPlus于50℃温育1小时。
利用两种方法之任何一种处理以后，将微胶块于TE-100中50℃洗涤两次，10分钟。在限制性酶消化之前洗涤微胶块，并与Sma I限制性酶缓冲液冰上温育10分钟。每个微胶块用20 U Sma I 37℃消化2小时。分离在微型胶(30)条带图(31)中的金黄色葡萄球菌DNA大限制性片段，如图4所示。根据方法2制备微胶块(32)，通过方法1制备微胶块(33)。运行条件为10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖、0.5XTBE以及脉冲斜坡1、5、9、13、17和21秒。所有斜坡均应用130次脉冲。分离的DNA片段的大小也如图所示。
实施例5.无酶制备琼脂糖包埋的溶细胞内阿米巴完整DNA
溶细胞内阿米巴(克隆A)营养体在TYI-S-33培养基中生长至对数期。冷冻培养瓶、离心沉淀细胞，收集营养体。沉淀经冷的PBS洗涤，按每毫升溶液2.5×106营养体的比例，与冷的高渗溶液(0.5MNaCl、0.05M EDTA、0.01M Tris、pH7.0)温育15分钟。108营养体进一步重悬于1ml溶于高渗溶液中的2％低熔点琼脂糖。将悬浮液灌注图1所示柔性聚硅氧烷模具，使微胶块于4℃***。微胶块与NDSU(0.01M Tris碱、0.1M EDTA、1％肌氨酰(w/v)、4M脲、pH9.5)于45℃温育1小时。电泳之前，将微胶块与0.5 X TBE在运行温度下温育10分钟。为了保存，用TE-100(0.01M Tris碱、0.1M EDTA、pH8.0)洗涤微胶块两次，每次5分钟，并4℃保存于新鲜的TE-100中。
溶细胞内阿米巴(38)、啤酒糖酵母(37)以及λ-DNA聚体(39)的DNA条带图(36)，如图5所示。在电场9.03V/cm、脉冲时间120秒、20℃、1％琼脂糖(Seakem)、0.5X TBE运行缓冲液以及电泳6小时下进行电泳。上样0.1cm厚的微胶块。
实施例6设计miniCHEF的电泳运行条件。利用模拟程序(选择 DNA最佳分离条件的方法)设置实验条件。
模拟在miniCHEF槽中(其极性相反的电极间距为11.6cm)分离啤酒糖酵母染色体所需的脉冲时间斜坡。目的在于获得显示由啤酒糖酵母所有染色体形成的11条带图。假定在1.5％琼脂糖凝胶和0.5X TBE运行缓冲液中进行电泳。采用Goffeau报道的啤酒糖酵母染色体的大小值(Goffeau A等人，Science，1996，274：546)：230kb(chrom.I)，270kb(chrom.VI)，315kb(chrom.III)，440kb(chrom.IX)，589kb(chrom.VIII)，577kb(chrom.V)，667kb(chrom.XI)，745kb(chrom.X)，784kb(chrom.XIV)，813kb(chrom.II)，924kb(chrom.XIII)，948kb(chrom.XVI)，1091kb(chrom，VII and chrom.XV)，1554kb(chrom.IV)和2352 kb(chrom.XII)。
该模拟程序预测4个脉冲时间斜坡，每个斜坡的脉冲时间为5、40、75和110s以及42次脉冲，以在电场强度10V/cm和20℃达到单一图的最佳的啤酒糖酵母染色体分离。迁移的结果，用于鉴别每条染色体的重定向时间、迁移速度和颜色代码，如表II所示。
表II.使用模拟程序获得的定量结果。根据模拟程序的颜色代码，为啤酒糖酵母染色体指定大小(kb)和颜色。
啤酒糖酵母染色体大小(kb) 颜色代码 tr(s) vr×105(cm/s) vm×104(cm/s) D模拟程序预测值(cm) D实验值(cm)
250 蓝 4.9 8.8843 2.7462 2.45 2.67
270 绿 5.5 8.6482 2.7293 2.40 2.67
315 红 6.8 8.1940 2.6959 2.28 2.46
440 青 10.8 7.2894 2.6247 1.95 2.22
577 洋红 15.6 6.6297 2.5684 1.59 1.85
589 暗灰 16.1 6.5821 2.5642 1.57 1.85
667 棕 19.1 6.3017 2.5388 1.42 1.66
745 浅蓝 22.2 6.0625 2.5165 1.27 1.49
784 浅绿 23.9 5.9551 2.5062 1.19 1.35
813 浅红 25.1 5.8799 2.4989 1.13 1.18
924 浅青 29.9 5.6223 2.4735 0.92 0.92
948 浅洋红 31.0 5.5721 2.4684 0.89 0.92
1091 白 37.6 5.3047 2.4408 0.73 0.6
1554 黑 61.3 4.6870 2.3727 0.52 0.4
2352 蓝 108.6 4.0542 2.2953 0.46 0.17
D实验值：图6微型胶(40)中的分子迁移距离。
D预测值：在图6实验所用运行条件下，根据模拟程序预测的分子迁移距离。
vr：重定向过程中的分子迁移速度。
vm：重定向之后的分子迁移速度。
Tr：分子的重定向时间。
具有在利用模拟程序预测的条件下，于miniCHEF中获得啤酒糖酵母196-2染色体(41)的条带图的真实微型胶(40)的照片如图6所示。也显示了在假定的微型胶(42)中模拟的、由模拟程序绘制的条带图，这两个图类似。在真实实验中分离的、琼脂糖包埋的啤酒糖酵母196-2完整DNA分子，是根据本发明公开的无酶方法制备。
本发明公开的部分模拟程序的流程图，如图7所示。流程图中显示了以迁移数据或预先已知的大小数据为基础，估计脉冲斜坡的计算方法。
如果使用者在该方法中输入迁移数据，则模拟程序先根据该数据估计分子大小，并进一步估计线性脉冲时间斜坡的设置。如果使用者在该方法中输入大小数据，则模拟程序直接估计脉冲时间斜坡。脉冲数递增结束的标准是，使最小分子迁移2.5cm的脉冲数。
最后，通过程序计算脉冲斜坡并应用于使用者指定的一组分子，模拟程序提供使用者应该在凝胶中观察到的结果(参见图6所示微型胶43的真实条带图以及假定的微型胶42的模拟图)。该程序还提供定量数据。由于该方案无关紧要而没有显示这部分图形。
实施例7：分析电泳染色体组型或脉冲型。
图8显示酿酒酵母的电泳染色体组型(61)，其是所述染色体经1.5％琼脂糖、0.5X TBE、10V/cm、20℃、2.95秒和453次脉冲、以及21.56秒和453次脉冲分离之后在miniCHEF中得到的。测定了该染色体组型中每个条带的迁移(62-66)。
将每个条带的迁移数据、电场强度、脉冲持续时间和数目以及运行缓冲液的温度输入迁移分析方法中。
此处公开的方法可以计算每个条带中所分离的分子的大小、重定向时间和迁移速度。这些结果如表III所示。此即为本发明这一部分公开的迁移分析方法所提供的结果形式。
表III.每个条带中分子的大小、重定向时间和迁移速度。应用脉冲斜坡以后，通过将凝胶中每个条带的位置输入该方法进行估计。
  10V/cm，20℃
                       真实大小
  2.95s/453脉冲；                  估计值条带                       (kb)
  21.56s/453脉冲
  D实验值  D理论值                大小(kb)  vr×103cm vm×103cm tr(s)62    2.36    2.23          230       210        0.09443    0.2785     3.963    2.29    2.14          270       226        0.09204    0.2768     4.364    1.97    1.96          315       302        0.08310    0.2705     6.465    1.55    1.42          440       401        0.07530    0.2644     9.566    0.84    0.82          577       564        0.06683    0.2573     15.2
D实验值：图8微型胶中的分子迁移距离。
D理论值：在图8实验的运行条件下，各种大小的真实分子应该迁移的距离。
vr：重定向过程中的分子迁移速度。
vm：重定向之后的分子迁移速度。
tr：重定向时间。
DNA迁移分析方法的流程图如图9所示。所给出的是处理单一大小分子的流程图，重复该步骤则可以分析所有分子。
如果将迁移数据输入实施例7所述方法，该方法可如同本实施例所述方法一样，估计分子大小。
实施例8.大肠杆菌分离物的miniCHEF分型。
按大肠杆菌表型水平的特征，从血琼脂平板上每个分离物(INN3和INN7)提取一个单一克隆。进一步将其在5ml LB培养基中(每升蒸馏水含10g酵母提取物、5g氯化钠、10g细菌用胰蛋白胨)再培养。每个培养物37℃振摇温育过夜。
洗涤每个培养物的细胞(洗涤液参见表I)、离心，按每ml溶于0.15M NaCl的1.5％低熔点琼脂糖2×109细胞的比例重悬沉淀。将每个琼脂糖细胞混合物灌注图1所示模具薄片(1)。用盖子(3)盖住薄片，使琼脂糖***，直至形成微胶块(5)。将两组微胶块与NDSUPlus于50℃温育半小时。然后洗涤微胶块，与Xba I限制性酶消化缓冲液温育10分钟，每个微胶块用20 U Xba I于37℃消化2小时。
miniCHEF微型胶(86)中分离的条带图(87)如图10所示。在miniCHEF中分离Xba I消化的大肠杆菌分离物INN3(88)和INN7(89)总DNA，可以鉴别它们之间的6条共有片段(90)。然后根据Tenover方法(Tenover F等人，J.Clin.Microbiol.，1995，33：9，2233-2239)其分成两个不同的大肠杆菌亚型。在miniCHEF中，于10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖和0.5X TBE、分别应用25、20、15和5秒脉冲斜坡以及35、40、50、140和800次脉冲条件下分离DNA限制性片段。
附图简述
图1.灌注微胶块的模具图。下图所示灌注琼脂糖-细胞悬液的刻有凹槽的薄片。上图所示模具的盖子及微胶块。右侧还展示了分布琼脂糖-细胞悬液的刮刀。
图2.在miniCHEF和miniTAFE微型胶中分离的啤酒糖酵母和多形汉逊酵母染色体条带图的照片。上图：7cm宽的miniCHEF微型胶、其27个狭槽以及啤酒糖酵母染色体的条带图。图中部所示4cm宽的微型胶以及多形汉逊酵母染色体的条带图。通过将包含固定化细胞的微胶块与NDSU温育，无酶方法制备样品。运行条件：10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖、0.5X TBE、脉冲时间50秒以及电泳4小时。下图所示带有啤酒糖酵母染色体条带图的miniTAFE微型胶。MiniTAFE使用10V/cm、1.5％琼脂糖、0.5X TBE、脉冲时间60秒以及电泳6小时。通过将细胞与NDSU温育，然后包埋于琼脂糖微胶块中，制备样品。
图3.在miniCHEF中获得的铜绿假单胞菌Xba I大限制性DNA片段的条带图。左侧为由液体LB培养基生长的细胞制备铜绿假单胞菌微胶块，而右侧为由LB平板生长的细胞制备的微胶块。于10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖以及0.5X TBE使用MiniCHEF，分别施加20、15、10、5和3秒的脉冲斜坡以及5、15、320、1020和100次脉冲。
图4.MiniCHEF产生的金黄色葡萄球菌Sma I大限制性DNA片段的条带图。通过将包含细胞的微胶块与NDSUPlus温育、通过无酶方法制备的样品的条带图如左侧所示。通过将细胞与NDSUPlus温育、然后包埋于琼脂糖微胶块中制备的样品的条带图如右侧所示。在两种样品制备物中，细胞皆在平板上培养。运行条件为10V/cm、20C、1.5％琼脂糖、0.5X TBE，脉冲时间为1、5、9、13、17和21。每个斜坡作用130次脉冲。
图5.溶组织内阿米巴、酿酒酵母和λ-噬菌体串联体DNA条带图的照片。在miniTAFE微型胶中进行电泳，电场强度9.03V/cm、脉冲时间120 s、20℃、1％琼脂糖(SeaKem)、0.5X TBE缓冲液以及电泳6小时。上样0.1cm厚样品。从左至右，泳道1：啤酒糖酵母196-2的微胶块；泳道2、3、4和5：包含溶组织内阿米巴营养体的微胶块与NDSUPlus在45℃分别温育0.5、1、2和16小时，泳道6：λDNA序列梯(ladders)。
图6.用于获得啤酒糖酵母196-2染色体条带图的真实miniCHEF微型胶(40)的照片(左侧)，由模拟程序预测的假定的微型胶(42)的图形(右侧)。在模拟程序预测的条件下进行真实的电泳。利用本发明公开的无酶方法，制备在此电泳运行中进行分析的、固定化的啤酒糖酵母196-2完整DNA分子。对于电场强度10V/cm以及缓冲液温度20℃，利用模拟程序预测的运行条件为5、40、75和110秒4次脉冲斜坡、每斜坡42次脉冲。迁移数据和用于鉴别分子大小的颜色代码如表II所示。
图7.miniCHEF微型胶中模拟DNA条带图的方法的流程图。图中使用以下参数和变量：DNA大小(kb)、DNA重定向时间(tr)、miniCHEF重定向过程之中(vr)和之后(vm)的DNA迁移速度。另外，tpr：每个斜坡的脉冲时间，Npr：每个斜坡的脉冲数，获得的g0、g1、g2、g3、g4系数以描述实验温度的函数粘度(η)，Dt：利用该方法预测的理论距离，n：斜坡数，E：电场，L：DNA外形长度，bp：碱基对，Q：DNA净电荷。
图8.miniCHEF获得的啤酒糖酵母染色体的电泳染色体组型(61)。电泳条件：10V/cm、1.5％琼脂糖凝胶、0.5X TBE、20℃、2.95秒和453次脉冲、以及21.56秒和453次脉冲。
图9.需要填入迁移距离以估计大小(kb)、重定向时间(tr)、miniCHEF分离的分子在重定向过程之中(vr)和之后(vm)的迁移速度的方法流程图。tpr：每个斜坡的脉冲时间，NPr：每个斜坡的脉冲数，获得系数g0、g1、g2、g3、g4，描述粘度(η)为实验温度(T)的函数，D：DNA分子在凝胶中的迁移距离，Dt：利用该模拟程序预测的理论迁移距离，n：扫描数，E：电场，L：DNA外形长度，bp：碱基对，Q：DNA净电荷。
图10.Xba I限制性消化INN3和INN7大肠杆菌分离物DNA分子后，进行MiniCHEF分型。使用无酶方法制备样品。运行条件为：10V/cm、20℃、1.5％琼脂糖凝胶和0.5X TBE，分别应用25、20、15、10和5秒的脉冲斜坡以及35、40、50、140和800次脉冲。点(90)标记两种分离物所共同具有的限制性片段。
本公开方案的优点
1-在5分钟至1小时内，制备包埋任意凝胶的薄微胶块中的微生物完整DNA分子。制备无需使用酶，快速完成，成本低。
2-使用液体或固体培养基中生长的细胞，无酶制备用于PFGE的DNA样品，效率高。某些种类的细胞可以在包埋之前于无酶溶液中温育。这种改变减少了样品制备所需时间。
3-利用本公开方法制备的凝胶包埋DNA分子，无限制性内切酶抑制剂。这些分子利用限制性内切酶消化2小时，在微型装置中进行脉冲场凝胶电泳实验，给出其典型的条带图。
4-获得大小均匀的包含固定化微生物DNA的微胶块，因而无需在电泳之前进行切割。同样的微胶块保证了结果的重现性。
5-在2.5至7小时的运行时间内，获得多个样品(多达27个)的分子染色体组型或脉冲型。缓冲液和分离基质的消耗低。分离所需时间取决于所研究的微生物和所用的微型装置，以及使用的电场、运行温度和脉冲时间斜坡。
6-在微型装置中通过脉冲场微型胶电泳分析微生物基因组所使用的装置，需要的实验台空间小。
7-可以在进行实验以前，按要求多次在计算机上模拟条带图。此模拟可选择产生分子间最佳分离的电场、温度和脉冲时间斜坡，而不需试剂和生物样品的费用。
8-利用基于描述DNA分子在miniCHEF微型胶中迁移的公式的方法，选择脉冲斜坡。然后，选择斜坡的方法产生分子间分离的最佳图片。
9-为估计DNA分子的大小、重定向时间和迁移速度，大小标志并不必要。此处公开的估计这些参数的方法，以分子在凝胶中的迁移距离为基础，提供了上述信息。使用任意条件的脉冲斜坡以及电场强度1-20V/cm、温度4-30℃进行电泳，都可以应用该方法，但是要求在1.5％琼脂糖凝胶和0.5X TBE中进行实验。
10-电泳图中分离的条带可由每个条带中迁移的分子大小、该分子的重定向时间及其迁移速度所确定。
11-此处公开的方法节省时间、化学试剂和生物样品。
12-该方法，包括27个微生物的DNA样品制备和基因组分析，需要一个工作日。
13-提供了试剂盒，简化微生物完整DNA的制备。

Claims (32)

1.利用脉冲场凝胶电泳的微生物快速分型方法，其包括以下步骤：
(i)利用相关试剂盒，通过无酶方法，制备包埋于凝胶微胶块中的微生物的完整DNA分子，
(ii)利用脉冲场凝胶电泳微型槽分离微胶块中包含的DNA分子，所述微型槽为TAFE或CHEF，
(iii)利用一种方法根据槽中设定的电场以及温度，选择脉冲斜坡和电泳时间的合适值，脉冲斜坡和电泳时间的合适值应使该DNA片段或完整DNA分子的分离最好，
(iv)设置步骤(iii)计算的微型槽的温度、电场强度和脉冲斜坡持续时间，分离DNA分子的混合物，
(v)一旦在CHEF微型胶中进行电泳，则利用一种方法分析微型胶中线性DNA分子的迁移距离。
2.权利要求1的利用脉冲场凝胶电泳的微生物快速分型方法，其中按照以下步骤制备包埋于微胶块中的完整DNA分子：
(i)收集液体或固体培养基中生长的微生物细胞，
(ii)在包含去污剂、螯合剂和氢键断裂试剂的缓冲液中温育该细胞，
(iii)根据所选微生物，选择于温育之前或之后在微胶块中固定细胞。
3.权利要求1和2的利用脉冲场凝胶电泳的微生物快速分型方法，其中利用模具将细胞固定于微胶块中，该模具为表面压有多个凹槽的软片，凹槽决定微胶块的尺寸；该片由聚硅氧烷、橡胶或其它柔软物质制成，可以或不可以灭菌。
4.权利要求3的利用脉冲场凝胶电泳的微生物快速分型方法，其中该模具的凹槽为任意宽度、长度0.3cm，深度0.03-0.1cm，因此根据所选微生物，可以在每个产生的微胶块中固定大约106-108细胞。
5.权利要求1和2的利用脉冲场凝胶电泳的微生物快速分型方法，其中在包含去污剂、螯合剂和氢键断裂试剂的缓冲液中温育细胞所需时间为5-60分钟，而温育体积为‘c·v·20’mL；‘v’为微胶块的体积(mL)，‘c’为待温育的微胶块数目。
6.权利要求1的方法，其中利用无酶方法制备酵母细胞的固定化DNA样品需要包含1％肌氨酰、100mM EDTA、4M脲、10mMTris、pH9.5的溶液，在45℃温育该固定化细胞30-60分钟，导致固定化的完整DNA，其在与适当的限制性内切酶缓冲液温育10分钟之后，能够利用限制性内切酶任意消化。
7.权利要求1的方法，其中利用无酶方法制备细菌细胞的固定化DNA样品需要包含1％肌氨酰、1％NP-40、100mM EDTA、4M脲、10mM Tris、pH9.5的溶液，在50℃温育该固定化细胞30-60分钟，导致固定化的完整DNA，其在与适当的限制性内切酶缓冲液温育10分钟之后，能够利用限制性内切酶任意消化。
8.权利要求1的方法，其中利用无酶方法制备大肠杆菌细胞的固定化DNA样品需要两种不同溶液依次温育该固定化细胞；第一种溶液包含1％肌氨酰、1％NP-40、100mM EDTA、10mM Tris、pH8.0的，在37℃温育该固定化细胞10分钟，第二种溶液包含1％肌氨酰、1％NP-40、4M脲、10mM Tris和100mM EDTA、pH9.5，在50℃温育该固定化细胞30分钟，导致固定化的完整DNA，其在与适当的限制性内切酶缓冲液温育10分钟之后，能够利用限制性内切酶任意消化。
9.权利要求1的方法，其中利用无酶方法制备溶组织内阿米巴细胞的固定化DNA样品需要首先在包含0.5M NaCl、10mM Tris和100mM EDTA、pH7.0的高渗溶液中冰浴非固定化营养体15分钟，然后在微胶块中完成细胞固定化，并在包含1％肌氨酰、4M脲、10mM Tris和100mM EDTA、pH9.5的溶液中，45℃温育该微胶块1小时，导致固定化的完整DNA，其在与适当的限制性内切酶缓冲液温育10分钟之后，能够利用限制性内切酶任意消化。
10.权利要求1的方法，其中利用无酶方法制备酵母啤酒糖酵母、巴斯德毕赤酵母或多形汉逊酵母细胞的固定化DNA可如下进行：在包含1％肌氨酰、0.5M NaCl、4M脲、10mM Tris和100mMEDTA、pH9.5的溶液中，50℃温育5-30分钟非固定化细胞，该细胞进一步在微胶块中固定化，导致固定化的完整DNA，其在与适当的限制性内切酶缓冲液温育10分钟之后，能够利用限制性内切酶任意消化。
11.权利要求1的利用脉冲场凝胶电泳的微生物快速分型方法，其中在微型装置的微型凝胶中通过脉冲场电泳分离其完整DNA分子或其限制性片段，由所获条带图中包含的信息进行菌株区分或分离微生物的分型，该微型装置为：
(i)miniCHEF槽，其极性相反的电极间最大间距为11.6cm，使微型胶可达7cm，
(ii)miniTAFE(横向交变场电泳)槽，其极性相反的电极间最大间距为7.8cm，使微型胶可达7cm。
12.权利要求11的微生物快速分型方法，其中利用0.5-1.5％琼脂糖凝胶，1X TBE电泳缓冲液(1 X TBE为89mM Tris、89mM硼酸、2mM EDTA、pH8.3)、或1/2或1/4所述浓度的相同缓冲液，在CHEF或TAFE***的脉冲场凝胶电泳微型装置中分离DNA分子，以区分或分型微生物分离物或菌株；使用者通过计算方法或经验方法或任何其它方法选择缓冲液温度、电场和脉冲斜坡，进行分离，包含的实验变量为4-30℃、miniCHEF为1-20V/cm、miniTAFE为1-25V/cm以及任意电脉冲持续时间。
13.权利要求1的微生物快速分型方法，该方法利用如下预先给定的公式，其描述在miniCHEF微型装置的微型胶中线性DNA分子每一脉冲的迁移‘d’(cm)：
d＝vr tpГ(tp-tr)+vm(tp-tr)[1-Г(tp-tr)]
vr＝0.0207[QE1.45/(8πηL1.35)]
vm＝0.665[QE1.76/(8πηL1.08)]
tr＝0.134(L1.14/vr)0.926
如果(tp-tr)≤0则Г(tp-tr)＝1以及如果(tp-tr)＞0则Г(tp-tr)＝0
‘tr’为线性DNA分子的重定向时间(秒)，‘vr’和‘vm’分别为DNA重定向之中及之后的迁移速度(cm/秒)，‘Q’为DNA净电荷(静电库仑)，按1e- x bp计算，其中‘e-’为电子电荷，‘bp’为碱基对，‘L’为DNA外形长度(cm)，按0.34nm x bp计算，‘E’为电场强度(静电伏特/cm)，‘η’为缓冲液粘度(Poises)，通过在实验温度(℃)和水的粘度相关多项式中内插实验温度值计算，
其中本方法提供并使用了基于所述公式的计算方法，如果在miniCHEF微型胶中应用‘n’脉冲时间斜坡分离，该方法能够预测线性DNA分子所给出的条带图，该方法也能分析应用‘n’脉冲时间斜坡进行电泳结束后获得的条带图，该方法适用于‘n’、电场和温度分别为1-1000、1-20V/cm以及4-30℃，在1.5％琼脂糖和包含44.5mM Tris、44.5mM硼酸、1mM EDTA、pH8.4的缓冲液中进行电泳。
14.权利要求1和13的微生物快速分型方法，其中提供了计算方法，该方法能够确定最佳脉冲时间斜坡，并分析‘n’脉冲时间斜坡后获得的条带图，其中所述方法通过预测应用‘n’脉冲斜坡时线性DNA分子在微型胶中的迁移‘D’而进行计算，通过下式计算每个分子的迁移‘D’： D = Σ r = 1 n d r · N p r
其中‘Npr’为作用于斜坡‘r’的脉冲数，‘tpr’为斜坡‘r’的脉冲持续时间(秒)，‘dr’为给定分子在每个斜坡‘r’中每一脉冲的迁移，‘dr’按下式给定：
dr＝vr tprГr(tpr-tr)+vm(tpr-tr)[1-Гr(tpr-tr)]
如果(tpr-tr)≤0则Гr(tpr-tr)＝1以及如果(tpr-tr)＞0则Гr(tpr-tr)＝0
15.权利要求14的微生物快速分型方法，其中确定最佳脉冲斜坡的方法包含以下步骤：
(i)在公式中输入实验中应用的电场和温度值以及待研究分子的大小，
(ii)计算斜坡中使用的脉冲持续时间，
(iii)根据微型胶中最小分子的迁移，计算总的电泳运行时间，
(iv)计算微型胶中所有分子的迁移，进一步预测在选择的电场和温度、步骤(iii)计算的运行时间、计算的电脉冲持续时间以及各个斜坡的脉冲数下，该分子在CHEF微型装置的微型胶中给出的条带图，
(v)选择模拟图中产生线性DNA分子的带之间最佳分离的条件为miniCHEF的设定条件。
16.权利要求15的微生物快速分型方法，其中根据计算最小线性DNA分子在miniCHEF微型胶中的迁移，计算总的电泳运行时间；在描述miniCHEF中线性DNA分子迁移的公式中，输入‘n’斜坡应用的电场、温度和电脉冲持续时间(tpr)的值，计算运行时间；进一步固定每个斜坡电脉冲‘Npr’的初始值，所有‘Npr’的初始推荐值为1，然后所有‘r’的‘Npr’值增加1，按 D = Σ r = 1 n d r · N p r 估计最小分子的迁移‘D’；当‘D’值显示该分子到达距离微型胶底部0.1-1cm的位置时，‘Npr’不再增加，按 2 · Σ r = 1 n t p r · N p r 计算总运行时间。
17.权利要求15的微生物快速分型方法，其中计算微型胶分离线性DNA分子的脉冲时间斜坡所用的电脉冲持续时间，包含以下步骤：
(i)在描述miniCHEF微型胶中线性DNA分子每次脉冲迁移‘d’的公式中，输入选择的电场、温度值以及将要分析的最小(A)和最大(B)的分子的大小，
(ii)通过该公式计算两种线性DNA分子的重定向时间(分别为trA和trB)，
(iii)计算所用斜坡，如果希望单个图形中包含大小介于最大和最小之间的DNA分子，则单脉冲持续时间为最小和最大分子重定向时间的平均值(0.5·[trA+trB])，
(iv)计算所用斜坡，‘n’项脉冲时间斜坡的持续时间是数字序列，其开始于比最小分子的重定向时间低1.5倍的数值，结束于比最大分子的重定向时间高1.5倍的数值，该数字序列按线性增量增加，因此：tp1＝trA/1.5，tp2＝tp1+Δ，tp3＝tp1+2Δ，…，tpn＝1.5·trB，其中Δ＝|(tp1-tpn)|/(n-1)，n＝te/(tp1+tpn)；‘te’为运行时间，
(v)选择步骤(iii)或(iv)的计算值为实验所用电脉冲持续时间。
18.权利要求15的微生物快速分型方法，其中计算线性DNA分子在miniCHEF微型胶中的迁移，并预测所述DNA分子在该微型胶中的条带图，包含以下步骤：
(i)假定在1.5％琼脂糖和0.5X TBE缓冲液中进行电泳，
(ii)为该公式定义电泳中使用的电场和缓冲液温度值，以及假定的电泳中分离的分子大小，
(iii)定义斜坡数‘n’、每个斜坡应用的脉冲数(Npr)、每个斜坡的脉冲持续时间(tpr)以及待分析的分子大小，
(iv)计算该分子在指定电泳条件的迁移距离；按 D = Σ r = 1 n d r · N p r 计算，
(v)显示数字或图形结果，
(vi)重复步骤(i)-(v)，直到预测图显示DNA分子之间的最好分离。
19.权利要求1和13的微生物快速分型方法，其中提供了分析在miniCHEF微型胶中电泳结束后线性DNA分子迁移距离的方法，该方法中替换了公式 D = Σ r = 1 n d r · N p r 中每条带从迁移起点分离的距离‘D’；通过逆插法从该替换计算，产生每个条带包含的分子大小、迁移速度和该分子的重定向时间，如果在电场强度1-20V/cm、温度4-30℃、1.5％琼脂糖凝胶、0.5X TBE缓冲液进行电泳，并应用‘n’脉冲时间斜坡，其中‘n’为1-1000，可应用该方法，计算方法包括以下步骤：
(i)测定电泳结束时条带与迁移起点的分离距离(D)，
(ii)为公式 D = Σ r = 1 n d r · N p r 定义电场(E)、缓冲液温度、脉冲时间斜坡数(n)、每个斜坡应用的脉冲数(Npr)、每个斜坡的脉冲时间(tpr)以及每个条带从迁移起点分离的距离(D)，
(iii)计算凝胶每个条带中包含的分子大小；计算步骤包括：(a)估计1000bp DNA分子在指定电泳条件下假定的迁移(Dt)，(b)如果估计的假定迁移(Dt)大于该分子在凝胶中迁移的实际距离(D)，即(Dt＞D)，则将DNA分子的大小增加1000bp，(c)重复步骤(a)和(b)，直至该DNA分子的假定的迁移低于或等于测定的实际距离(Dt≤D)，(d)认为条带中包含的DNA分子与满足(c)中条件的DNA分子大小相似，(e)对微型胶中的所有条带重复整个程序，
(iv)计算大小时，每个分析的条带中所包含分子的重定向时间和迁移速度为步骤(iii)提供的‘dr’值，以使 D t = Σ r = 1 n d r · N p r ≤ D ,
(v)显示数字形式的结果。
20.权利要求18的微生物快速分型方法，其中提供了线性DNA在指定电泳条件下迁移的图形表示法，该图形表示法包含：
(i)绘制与实际微型胶大小成比例的矩形，在该矩形中绘制各种较小的矩形，其代表假定的上样DNA样品的狭槽，
(ii)在每个小矩形或狭槽下端画线，线代表在微型胶中分离的各个大小分子的条带，线离开狭槽的距离与各个大小分子在实际微型胶中迁移的距离成比例，
(iii)根据DNA分子的大小给每条线指定颜色，即利用颜色代码确认假定包含于划线所示条带中的分子大小。
21.实现无酶方法制备DNA样品的试剂盒，其是权利要求1的利用脉冲场凝胶电泳的微生物快速分型方法的一部分，其包含：
(a)灌注细胞悬液并获得包埋于凝胶中的细胞的模具；
(b)细胞洗涤溶液；
(c)细胞包埋溶液；
(d)DNA去蛋白化溶液；
(e)样品保存溶液；以及
(f)微胶块洗涤溶液。
22.权利要求21的试剂盒，其中酵母细胞的洗涤溶液包含0.05M EDTA、pH7.5。
23.权利要求21的试剂盒，其中金黄色葡萄球菌或大肠杆菌细胞的洗涤溶液包含0.15M NaCl和0.01M EDTA、pH8.0。
24.权利要求21的试剂盒，其中铜绿假单孢菌细胞的洗涤溶液包含0.15NaCl。
25.权利要求21的试剂盒，其中使用两种溶液洗涤溶组织内阿米巴，其一包含PBS、pH7.4，另一为包含0.5M NaCl、0.01MTris和0.05M EDTA、pH7.0的高渗溶液。
26.权利要求21-25的试剂盒，其中所述微生物的细胞包埋溶液包含在该细胞的洗涤溶液中制备的1.5-2.0％低熔点琼脂糖。
27.权利要求21-25的试剂盒，其中DNA去蛋白化溶液包含缓冲液、金属螯合剂、去污剂和氢键断裂剂。
28.权利要求27的试剂盒，其中啤酒糖酵母、多形汉逊酵母或溶组织内阿米巴的DNA分子的去蛋白化溶液包含1％十二烷基肌氨酸钠、4M脲、0.01M Tris和0.1M EDTA、pH9.5。
29.权利要求27的试剂盒，其中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或铜绿假单胞菌DNA分子的去蛋白化溶液包含1％十二烷基肌氨酸钠、1％Nonidet、4M脲、0.01M Tris和0.1M EDTA、pH9.5。
30.权利要求21的试剂盒，其中用于在去蛋白溶液处理之后洗涤微胶块的溶液包含10mM Tris、100mM EDTA、pH8.0。
31.权利要求21的试剂盒，其中用于在限制性内切酶DNA消化之前洗涤微胶块的溶液包含10mM Tris、0.5mM EDTA、pH8.0。
32.权利要求21的试剂盒，其中用于保存包含固定化DNA分子的微胶块的溶液为0.1M EDTA、pH8.0。
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